JP7102390B2 - Apoa1の投与のための組成物及び投薬形態 - Google Patents
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Description
本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療で使用するための特定の投薬レジメンを用いる、ダイマー又はマルチマー形態のアポリポタンパク質の経口投与のための新規組成物に関する。
心筋梗塞、卒中、不安定狭心症及び心臓性突然死は、ひとまとめにして世界的な死亡の主因に相当し、発生率が高まっている。これらのCVDの最も一般的な原因は、大きな及び中程度の大きさの動脈にプラーク又はアテロームと呼ばれる病変が形成される緩徐進行性疾患であるアテローム性動脈硬化症である。アテローム形成プロセスは、動脈の限局的領域、特に、血流の乱れを特徴とする解剖学的部域(例えば、分岐、湾曲など)におけるコレステロール含有血漿リポタンパク質の内皮下貯留によって引き起こされる。
HDLコレステロールの高血漿レベルと心血管疾患の間に見つかった逆相関は、HDL及びその主な成分であるApoA1タンパク質がコレステロール逆輸送(RCT現象)において有する役割に帰せられる。RCTの効率は、ApoA1タンパク質が細胞からのコレステロールの流出を促進する、脂質に結合する、レシチン-コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)を活性化する、及び特異的受容体と相互作用し、それを排除するタンパク質を血漿流から肝臓まで移行させる成熟HDLを形成する能力に依存する。
本発明の発明者らは、WO2008/017906に記載されている植物の種子から抽出されたミルクによって、及び様々な細胞及び動物モデルでそれらの活性を評価することによって、経口投与を効果的に使用する可能性を検証した。
しかし、本発明の発明者らは、WO2008/017906に記載されている植物の種子から抽出されたミルクの投与が、上記の特許出願で示唆されるものよりも10~100倍低い投薬量でin vivoにおいて有効であったこと、及びアッセイした経口組成物による治療の間に、高コレステロール化食に付された動物において、抗アテローム性動脈硬化の治療効果も観察可能であったことを驚くべきことに発見している。
高コレステロール食で処理したマウスにおけるin vivo実験では、前記組成物は、治療前後に高コレステロール化食に付された動物においても、アテローム性動脈硬化性プラークの進行を予防することができるだけでなく、その領域を有意に低減させることもできることを驚くべきことに証明した。
本明細書で報告されるデータでは、大動脈洞のレベルで約50%のプラークの低減、及び大動脈弓におけるプレート領域の40%の低減が示される。
そのようなデータは、さらに、高コレステロール食を与えたマウスについて得られ、これは、食事レベルで特に規則を守らされていない患者の、はるかに現実的に可能な食事レジメンを反映している。
本文中では、「Apo」は、その野生型形態が配列40に報告されているApoA-1を常に意味する。
したがって上記のように、本発明の目的とするものはアポリポタンパク質A1(ApoA-1)のダイマー及び/又はマルチマー形態の1種又は2種以上のムテインを含む組成物であり、前記ムテインは、植物種子においてダイマー及び/又はマルチマー形態で生成され、前記組成物は、前記植物の種子から抽出されたミルク及び/又はその誘導体を含み、前記ムテインは、アテローム性動脈硬化症の治療で使用するために、体重1kg当たり0.2~4mgの1日投薬量で患者に経口投与される。
上記の発現カセットを構成する要素は、5’→3’の方向で、上に列挙した順序で機能的に結合される必要がある。
さらに、予想外に、ApoA-1Milanoムテインを含むイネのミルクの投与は、高脂肪食を与えたホモ接合型B6.129P2-Apoetm1Unc/Jマウスの肝臓において、CD68マーカー陽性マクロファージ細胞の数も有意に減少させた(図8)。
組成物とともに、患者の体重1kg当たりの活性成分の量の形態で投与される製剤で一般に使用される、適切な1日用量の計算を容易にするデバイスを提供することができる。
本明細書によれば、本発明の組成物は、適切な賦形剤を用いて、医薬組成物、栄養補助食品、医療デバイスに関する指令93/42/EECに記載されているクラスのうちのいずれか1つによる医療デバイス(この用語の機械的な意味の「デバイス」だけでなく、物質も含む)又は医療食品の形態で製造することができる。
本明細書に記載されたことは、必要な変更を加えて、治療方法に援用される。
以下の例は、発明のより詳細な説明を提供することを意図するものであって、特許が希求される対象を限定するものではない。
(例1)
種子ミルクの生成及び植物内で生成したApo A-1 Milanoタンパク質の安定性評価
a.イネ
イネのミルクを、上に及びWO2008/017906に記載されているように生成したイネのトランスジェニック系の種子から得た。成熟時に種子を採取し、イネの研究室用サンプルコーン(G150/R、Colombini)で脱穀した。水中で懸濁液を形成することができる粒子を有する細粉を得るまで、精米した種子を石の粉砕機で製粉した。細粉を10%の量で水に再懸濁し、この懸濁液をアミラーゼの存在下で30分間90℃に加熱して、糖化を促した。糖化プロセスが終了すると、イネのミルクを4℃に保存し、存在するApoA-1Milanoタンパク質の安定性を、時間0(調製の終了)から時間6(+15日)まで2日間隔で評価した。このタンパク質は、ミルクから抽出した総タンパク質の、SDS-PAGEの後に行ったウエスタンの56.000Daにある主要バンドの存在によって示されるように、試験期間の全体を通して安定であることが判明した。イネのミルク中の推定されるApoA-1Milano濃度は、導入遺伝子の発現レベルに応じて、平均して、上記のように調製したミルク1リットル当たり3.5~7mgの範囲にわたり得る。アポリポタンパク質の濃度は、イネの細粉の代わりに抽出したイネ総タンパク質抽出物を使用することによって著しく増大され得、例えば、タンパク質の40、50、60又は70%である。
ダイズのミルクは、1.2Lの水を使用して、100gのダイズ種子から得る。種子を製粉し、同時に、水を10分間80℃にし、次いで、5分間100℃に上げる。そのようにして得られたミルクを濾過して、おから(種子の固形残渣)を除去する。8.3%に相当するタンパク質含量を有するミルクが得られ、これは、市販のものに匹敵する。特に、本発明者らは自動豆乳製造機(より正確には、SoyQuick)を使用した。
特許出願WO2008/017906で教示されるように、(鎖中に導入されたCysの数に応じて)種子でApoA-1ムテインのダイマー及び/又はマルチマーを発現する遺伝子改変イネ植物に由来するミルクを使用することによって、細胞及び動物への抗アテローム形成性ApoA-1ムテインのダイマーの投与を行った。種子で生成され、細胞及び動物に投与されたApoA-1タンパク質は、したがって、ダイマー又はマルチマーを形成するその能力を増大させるために(Ala-Cys変異によって)変異誘発された全長タンパク質からなる。
予想外に、最後に、ApoA-1Milanoムテインを含むイネのミルクの投与は、高脂肪食を与えたホモ接合型B6.129P2-Apoetm1Unc/Jマウスの肝臓において、CD68マーカー陽性マクロファージ細胞の数も有意に減少させた(図8)。
3.1 イネのミルク.
使用したイネのミルクは、Plantechno Srl(Vicomoscano、(CR)、Italy)から凍結乾燥粉末として提供された。遺伝子改変イネのミルク(APO)は、特許出願WO2008/017906に示されるように、及び例1で上に示したように生成した。同じ品種(Rosa-Marchetti)のWTイネのミルクを対照として使用した。in vitro実験については、イネのミルクを無菌条件下で取り扱い、凍結乾燥し、リン酸緩衝食塩水(PBS)中に2.5g/mlの濃度で再懸濁し、Zell-Shield(Minerva Biolabs)を加えた。in vivo実験については、イネのミルクを滅菌水中に2.5g/mlの濃度で再懸濁した。
10%ウシ胎仔血清(Euroclone、熱失活化)、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを加えたRPMI1640培地の懸濁液中で、THP-1単球を培養した。すべての細胞は、37℃で5%CO2のインキュベーター中で維持した。THP-1単球は、1*106細胞/mlの濃度を超えることは決してなかった。
マクロファージへのTHP-1の分化は、ホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート(PMA)50ng/ml及び50mMβ-メルカプトエタノールを48時間にわたって加えることによって行った。
処理の終わりに、スクレーパーを用いて、THP-1マクロファージをプレート表面から機械的に取り出した。改変RIPA緩衝液(TrisHCl 50mM、NaCl 500mM、EDTA 1mM、EGTA 1mM、DTT 1mM、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma Aldrich)、ホスファターゼ阻害剤(カクテル#2及び#3、Sigma Aldrich))を用いて、収集した細胞を溶解した。総タンパク質抽出物を、製造者の指示に従ってブラッドフォード試験(Sigma Aldrich)によって定量化した。製造者の指示に従って、タンパク質抽出物を処理して、NuPAGEビス-トリスミニゲル(Life Technologies)にロードした。iBlot System2(Life Technologies)を使用して、ニトロセルロース膜ブロッティング(Life Technologies)を行った。
処理の終わりに、10%ホルマリン中で細胞を固定した。洗浄した後、細胞を60%イソプロパノールとともにインキュベートし、次いで、乾燥させた。Oil Red O(イソプロパノール中に0.35%w/v、濾過した)を固定した細胞に加えた。インキュベーションの終わりに、ddH20で細胞を洗浄した。次いで、光学カメラ(Motic)を使用して、倒立光学顕微鏡(Motic)で画像を得た。5つの独立した実験を行い、ウェル当たり少なくとも5つの視野を得た。次いで、ImageJプログラム(Schneider CA、Rasband WS、Eliceiri KW.NIH ImageからImageJ:25年間の画像解析(NIH Image to ImageJ:25 years of image analysis.)Nat Methods.2012;9:671~5.)を使用して、画像を定量化した。赤色の閾値を設定し、すべての画像に適用した。
動物でのすべての実験は、実験における動物の使用に関するイタリアの法律(法令26/2014)及び欧州連合指令(2010/63/EU)に、さらに、イタリア保健省によって許可されたプロトコール(プロジェクト08/2014、承認番号202/2015-PR)に従って行った。忍容性研究については、8~10週齢の雄のB6マウス(Charles River、Calco、LC、Italy)を使用した。0日目に、マウスをランダム化し、15日間にわたって、WT又はApoイネのミルク(10ml/kg、1週間につき5日)による経口投与に付した。処理の終わりに、各動物について血液試料を収集し、灌流後に、肝臓及び腎臓を収集した。
血液学的分析は、Milan-Bicocca大学の動物育種学部を支援する研究室で行った。
心臓を固定し、凍結保存した(30%ショ糖)。心尖を除去し、試料をOCT(Sakura Finetek OCT)に浸漬し、直ちに凍結した。クリオスタットを使用して切断するまで、組織を-80℃で保存した。続いて、スライドをヘマトキシリン/エオシンとともにインキュベートした。Oil Red O分析については、大動脈洞の凍結切片化切片を1,2-プロパンジオールに浸漬し、次いで、Oil Red O(1,2-プロパンジオール中に0.5%w/v、濾過した)とともにインキュベートした。次いで、スライドを洗浄し、水性マウント剤でマウントした。
肝臓を収集し、4%パラホルムアルデヒド溶液中で固定した。次いで、組織をパラフィン中に包埋し、標準的手順に従ってミクロトーム切断について処理した。続いて、肝臓切片を脱パラフィンし、アルコール濃度スケールでの後続ステップで再水和した。次いで、pH6のクエン酸ナトリウム溶液(H-3300、Vector Laboratories)における95℃でのインキュベーションによって、切片を抗原アンマスキングに付した。次いで、切片を3%H2O2溶液とともにインキュベートし、市販のキットのImmPRESS(Vector Laboratories)及びImmPACT DAB(Vector Laboratories)を使用して、免疫組織化学について処理した。次いで、Gillヘマトキシリンを用いて切片を対比染色し、VectaMount Permanent Mounting Medium溶液(Vector Laboratories)によって、カバーガラスをマウントした。1:300の濃度で使用する抗CD68一次抗体は、Abcam(ab125212)から購入した。
大動脈全体を収集し、4%パラホルムアルデヒド溶液中で保存した。大動脈の分析手順は、以前に記載されたプロトコール[Beattie JH、Duthie SJ、Kwun IS、Ha TY、Gordon MJ.apoE(-/-)マウスにおける大動脈病変の迅速な定量化(Rapid quantification of aortic lesions in apoE(-/-)mice.)J Vasc Res 2009;46:347~352]に従って行った。大動脈は、血管周囲の外膜を除去すると、切開によって長軸方向に開き、蒸留水及び70%2-プロパノール中で洗浄した。次いで、大動脈をOil Red Oとともにインキュベートし、黒色面上に置き、Sony A3000デジタルフォトカメラで撮影した。次いで、ImageJソフトウェア[C.A.Schneider、W.S.Rasband、K.W.Eliceiri、NIH ImageからImageJ:25年間の画像解析(NIH Image to ImageJ:25 years of image analysis)、Nat.Methods 9(2012)671~675]によって画像を処理し、プラークを大動脈弓の全領域のパーセントとして表した。次いで、大動脈弓を大動脈の残りの部分からさらに細分し、連続的に撹拌しながら、吸収された色素をクロロホルム/メタノール(2:1v/v)中に溶解した。次いで、Oil Red Oの濃度を520nmのマイクロプレートリーダー(BioTek Instruments、USA)で測定し、標準濃度曲線と比較した。
偶数番号の配列2~38は、それぞれヒトタンパク質ApoA1のムテインを表す。これは下記配列40において報告され、すでにWO2008/017906において配列番号40として記載されている:
配列番号40
配列番号2変異R173C、配列番号4変異R123C、配列番号6変異R215C、配列番号8変異R173C-R215C、配列番号10変異R123C-R215C、配列番号12変異R10C、配列番号14変異R61C、配列番号16変異R83C、配列番号18変異R151C、配列番号20変異R10C-R215C、配列番号22変異R61C-R173C、配列番号24変異R61C-R215C、配列番号26変異R61C-R151C、配列番号28変異R83C-R173C、配列番号30変異R83C-R151C、配列番号32変異R83C-R215C、配列番号34変異R151C-R173C、配列番号36変異R151C-R215C、配列番号38変異R10C-R173C。
Claims (10)
- アポリポタンパク質1のダイマー及び/又はマルチマー形態の1種又は2種以上のムテインを含む、アテローム性動脈硬化症の治療で使用するための組成物であって、
前記ムテインは植物種子中でダイマー及び/又はマルチマー形態で生成され、
前記組成物は前記植物の種子から抽出されたミルク及び/又はその誘導体を含み、そして
前記1種又は2種以上のムテインは、アテローム性動脈硬化症の治療で使用するために、体重1kg当たり0.2~4mgの1日投薬量で患者に経口投与され、
前記1種又は2種以上のムテインは、配列番号8を有するムテイン及び配列番号34を有するムテインの群から選択される、上記組成物。 - 1種又は2種以上のムテインが体重1kg当たり0.4~3mgの1日投薬量で患者に経口投与される、請求項1に記載の使用のための組成物。
- 1種又は2種以上のムテインが体重1kg当たり0.5~2mgの1日投薬量で患者に経口投与される、請求項2に記載の使用のための組成物。
- 1種又は2種以上のムテインが体重1kg当たり0.5~1.8mgの1日投薬量で患者に経口投与される、請求項3に記載の使用のための組成物。
- 1種又は2種以上のムテインが体重1kg当たり0.5~1.5mgの1日投薬量で患者に経口投与される、請求項4に記載の使用のための組成物。
- 植物がマメ科植物、穀物又はタバコである、請求項1から5のいずれかに記載の使用のための組成物。
- 植物がイネ、トウモロコシ、コムギ、硬質(デュラム)又は軟質コムギ、オートムギ、スペルトコムギ、オオムギ、ダイズ、エンドウ、マメ、タバコを含む群から選択される、請求項6に記載の使用のための組成物。
- 粉末、錠剤、カプセル、硬質又は軟質ゼラチン、シロップ、スプレー、懸濁液、ミルク剤、溶液の形態の、請求項1から7のいずれかに記載の使用のための組成物。
- ミルクが液体状態であるか、凍結乾燥形態であるか、又は適切な担体に再懸濁されている、請求項8に記載の使用のための組成物。
- 組成物が、医薬組成物の形態、栄養補助食品の形態、医療デバイスの形態又は特別な医療目的のための食品の形態である、請求項1から9のいずれかに記載の使用のための組成物。
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