JP7088713B2

JP7088713B2 - 細胞培養容器

Info

Publication number: JP7088713B2
Application number: JP2018059239A
Authority: JP
Inventors: 進路金村
Original assignee: Kitagawa Iron Works Co Ltd
Current assignee: Kitagawa Iron Works Co Ltd
Priority date: 2018-03-27
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2038-03-27
Also published as: JP2019170167A

Description

本発明は、クリノスタットを用いた細胞培養における細胞培養容器に関する。

植物や細胞などの重力応答を研究する装置として、特許文献１の図１に示すようなクリノスタットが用いられている。この装置によれば、直交する二軸が回転することで搭載した細胞の重力を均等に分散させ、模擬的に微小重力環境を生成することができる。
上述のクリノスタットには装置の特性上、一般的に、特許文献２の図１に示すような培養容器が用いられている。この培養容器は、培養フラスコに密閉キャップを備えることで傾けても培養液がこぼれない構造となっている。
このような培養容器を用いて培養する場合、培養容器内にエアが残留していると、培養容器の回転や傾きによって容器内で培養液の対流が起こり、それが起因として細胞にストレスを与えてしまう。
したがって、培養容器内の培養液は、液密にすることが好ましい。

換言すると、培養フラスコに培養液を充填する際、培養液の量が僅かでも少ない場合、エアが残留し液密にはならない。その状態でクリノスタットに搭載すると回転によって培養液の対流が生じ、細胞へのストレスが発生する恐れがある。
一方で、液密にするためにエアが残留しないように細心の注意を払って培養液を入れたとしても、キャップを閉める際に培養液が溢れ出す恐れがある。その場合、コンタミネーション（カビや細菌の繁殖など）の原因になる恐れもある。
したがって、エアを残留させずに培養液を液密になるように充填する作業は熟練を要している。
そこで本出願人は、特許文献３に示すような容器の封止構造を発明した。この発明の培養容器によれば、培養容器内にエアを残留させずに培養液を充填する作業を誰でも容易に行うことができる。したがって、クリノスタットを用いた培養においても残留エアによる培養液の対流を無くし、細胞へのストレスを抑制することができる。

特開２００３－９８５２号公報（図１）特開平１０－１７９１３７号公報（図１）特開２０１６－２０８９２０号公報

しかしながら、細胞培養においては培養液を充填する際の残留エアによって発生する気泡だけでなく、培養中の細胞の代謝物や培養液の温度変化によって発生する気泡がある。また、培養液の蒸発などの起因によって培養容器内に発生する気泡がある。したがって、特許文献３に示す容器の封止構造では、培養液を充填する際の残留エアによって発生する気泡を抑制することはできるが、培養中に発生した気泡に対しては考慮されておらず、顕著な効果は薄い。
そのため、クリノスタットを用いた培養において、上述の気泡による培養液の対流による細胞へのストレスを完全には抑制することができない。

そこで本発明の目的は、クリノスタットを用いた細胞培養において、充填が簡単に行えるとともに、培養容器内に気泡によって生じる培養液の対流やそれによる細胞へのストレスを抑制することができる細胞培養容器を提供することにある。

本発明の細胞培養容器は、培養液を入れる充填口と、細胞を培養させる培養エリアと、培養エリア内の気泡を隔離させる隔離エリアと、培養エリア内の気泡を隔離エリアに誘導するとともに、隔離された気泡を隔離エリアに留まらせる誘導留め機構と、を備えていることを特徴とする。
この構成によると、培養エリア内に気泡が発生したとしても、その気泡を隔離エリアに誘導させながら移動させるとともに、隔離エリアに移動した気泡を隔離エリア内に留まらせておくことができる。
また、培養液を入れる際に残留したエアによる気泡も同様に隔離エリアに誘導させながら移動させるとともに、隔離エリアに移動した気泡を隔離エリア内に留まらせておくことができる。
よって、培養液の充填が簡単に行え、気泡を隔離エリアに移動させるとともに留まらせておくことができるため、培養エリア内には気泡による対流を抑制することができ、結果、細胞へのストレスを緩和することができる。

本発明によれば、クリノスタットを用いた細胞培養において、充填が簡単に行えるとともに、培養容器内に気泡によって生じる培養液の対流やそれによる細胞へのストレスを抑制することができる細胞培養容器を提供することができる。

本発明の一実施形態における細胞培養容器の構成を模式的に示した斜視図である。図１の細胞培養容器の構成を示した図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は正面図を夫々示した図である。図２に示した細胞培養容器の断面図であり、（ａ）はＡ－Ａ線断面、（ｂ）はＢ－Ｂ線断面、（ｃ）はＣ－Ｃ線断面、（ｄ）はＤ－Ｄ線断面を夫々示した図である。図２の細胞培養容器における培養エリア内の気泡が隔離エリアに移動する様を示した図である。図２の細胞培養容器における隔離エリア内の回転時における気泡の動作を示した一例の部分拡大図である。本発明の変形例１における細胞培養容器の構成を模式的に示した断面図である。本発明の変形例２における細胞培養容器の構成を模式的に示した断面図である。本発明の変形例３における細胞培養容器の構成を模式的に示した断面図である。

以下、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。また、本発明の効果を奏する範囲を逸脱しない範囲で、適宜変更は可能である。

図１は、本発明の一実施形態における細胞培養容器の構成を模式的に示した斜視図である。図１では、一例として一方に蓋１０を設け、他方に蓋を設けていない構成としているが、実際の使用では両方に蓋１０を取り付けて行うものである。
図１に示すように、細胞培養容器１００は、模擬的に微小重力環境を生成することができるクリノスタット（図示せず）などに搭載される。その場合、クリノスタットによって回転するようになっている。また、クリノスタットに搭載する際は、容器内面に細胞を接着させての培養や培養液内に細胞を浮遊させながらの培養が可能である。

図２は、図１の細胞培養容器の構造を示した図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は正面図を夫々示している。

また、図３は、図２に示した細胞培養容器の断面図であり、（ａ）はＡ－Ａ線断面図、（ｂ）はＢ－Ｂ線断面図、（ｃ）はＣ－Ｃ線断面図、（ｄ）はＤ－Ｄ線断面図を夫々示している。

なお、本実施形態では、細胞培養容器の起立状態（例えば、図２（ｂ））で天井を「上」、底を「下」とし、一対の蓋を結ぶ方向を左右方向とし、図面の右側を「右」、反対側を「左」と定義する。
また、以下では、残留エアによって発生するもの、培養中の細胞の代謝物や培養液の温度変化によって発生するもの、および、培養液の蒸発などの起因によって発生するもの、を総じて「気泡」として呼んでいる。
図２及び図３に示すように、細胞培養容器１００の基本構成は、充填口１、培養エリア２、隔離エリア３、および誘導留め機構４などを備えている。

充填口１は、円筒形状を有しており、培養液を培養エリア２に入れるための入口として培養エリア２の上面に設けられている。円筒状の先端側は、雄ネジ山を有する外周面が設けられており、その雄ネジ山には蓋１０が螺合するようになっている。

培養エリア２は、細胞を培養させるエリアであり、略断面円形状の第１の培養エリア２ａと、その一部（左側）の外縁から外方に矩形状に突出した第２の培養エリア２ｂとからなっている。

隔離エリア３は、気泡を前記培養エリア２と隔離させるためのエリアであり、第１の培養エリア２ａに対して、第２の培養エリア２ｂと対向した位置に第２の培養エリア２ｂと同形状のエリアが設けられている。
また、この隔離エリア３には、充填口１と同等の培養液を入れるための充填口６が設けられており、上端部は蓋１１が螺合可能となっている。

誘導留め機構４は、隔離エリア３と、培養エリア２内の気泡を隔離エリア３に誘導するとともに、隔離された気泡を隔離エリア３に留まらせるための機構であり、培養エリア２から隔離エリア３への開口部を狭めるような漏斗形状の間切り壁５を設けている。

詳細に説明すると、図３（ｃ）及び図３（ｄ）に示すように、間切り壁５は、第１の培養エリア２ａと隔離エリア３との境目から中心線Ｊに向けて両エリアの上下方向を遮断しながら一対の円弧状の誘導壁５ａが設けられている。そして、一対の誘導壁５ａが所定の間隔を有した状態の中心付近から隔離エリア３に向けて上下方向を遮断しながら右方向に中心線Ｊと平行な直線状の一対の留め壁５ｂが一体に設けられている。
この構成によって、詳細は後述するが、クリノスタットに搭載中されている際、細胞培養容器１００は回転することとなるが、その容器内にの気泡を誘導壁５ａで隔離エリア３の方に誘導し、例え、回転したとしても隔離エリア３に隔離された気泡を留め壁５ｂによって、培養エリア２に戻らないように留めておくことが可能となっている。

次に、本発明の一実施形態における細胞培養容器の作用を説明する。
図４は、図２の細胞培養容器における培養エリア内の気泡が隔離エリアに移動する様を示した図である。（ａ）は重力方向に対して、反対方向側に隔離エリアが位置した状態、（ｂ）は重力方向に対して、同じ方向側に隔離エリアが位置した状態を夫々示している。
図４（ａ）に示すように、クリノスタットにおける細胞培養中に発生した気泡Ｋは、浮力の影響により常に重力と反対の方向に移動する。よって、気泡Ｋは細胞培養容器１００が回転するにつれて、円弧状の誘導壁５ａにならって徐々に隔離エリア３に移動（侵入）していく。その際、隔離エリア３からは、侵入した気泡Ｋと同量の培養液が培養エリア２に流れ込むことで、培養エリア２は常に液密の状態が保たれることとなる。一方、図４（ｂ）に示すように、図４（ａ）の状態からクリノスタットの回転により細胞培養容器１００が１８０度回転した場合、気泡Ｋは浮力の影響により重力と反対の方向に移動するが誘導壁５ａおよび留め壁５ｂによって、培養エリア２に戻らないように隔離エリア３に留められている。

図５は、図１の細胞培養容器における隔離エリア内の気泡の回転時の動作を示した部分拡大図であり、（ａ）は隔離エリアの位置が、培養エリアの位置に対して重力方向側にある状態、（ｂ）～（ｈ）は前の符号の状態から中心軸Ｌを中心に４５°毎反時計周りに回転した状態を夫々示した図である。
図５に示すように、図５（ａ）～図５（ｈ）の回転による細胞培養容器１００がどの状態においても、隔離エリア３内の気泡Ｋは、間切り壁５と隔離エリア３の内壁とによって隔離エリア３内に留まり、培養エリア２には移動しない構造となっているのがわかる。なお、図５（ａ）～図５（ｈ）は４５度毎の動きを示した図であるが、それ以外の角度においても同様のことがいえる。
なお、一対の留め壁５ｂの長さｍ及び間隔ｎは、気泡Ｋの量及び大きさなどに応じて適宜決めることができ、長くするほど、または、狭めるほど気泡Ｋを隔離エリア３内に留めることができる。

本発明の一実施形態における細胞培養容器１００によれば、培養エリア２内の気泡を回転中に徐々に誘導壁５ａによって、誘導させ隔離エリア３内に移動させることができる。また、隔離エリア３内に隔離された気泡を細胞培養容器１００が回転しても留め壁５ｂによって隔離エリア３内に留めておくことができる。それによって、培養エリア２内には気泡がなくなるため、培養エリア２内の培養液が対流しなくなる。したがって、培養エリア２内の細胞にストレスを与えることなく培養することができる。

（変形例１）
図６は、本発明の変形例１における細胞培養容器の構成を模式的に示した断面図である。充填口１、培養エリア２、および隔離エリア３等、基本的構造は、本発明の一実施形態と同じであるため、符号の説明は省略する。

図６に示すように、細胞培養容器２００における隔離エリア３の下側の底部と留め壁５ｂとの当接部は、培養エリア２から隔離エリア３にいくにつれて、上り傾斜となる傾斜部５ｃを設けている。

このように、本発明の変形例１における細胞培養容器２００によれば、傾斜部５ｃによって、培養エリア２内の気泡は、傾斜部５ｃにならって、より隔離エリア３内に誘導されやすくなる。逆に隔離エリア３内に一旦入った気泡は、戻り口が狭くなるため、培養エリア２内には逆戻りしにくくなっており、隔離エリア３内により留めておくことができる。
また、投入時においては、細胞が隔離エリア３内に移動しにくくなり、その結果、培養エリア内に留めることができる。

（変形例２）
図７は、本発明の変形例２における細胞培養容器の構成を模式的に示した断面図である。なお、変形例１と同様に、基本的構造は、本発明の一実施形態と同じであるため、符号の説明は省略する。また、本発明の一実施形態との相違点は、留め壁の構成である。以下、詳細に説明する。

図７に示すように、細胞培養容器３００における一対の留め壁５ｄは、培養エリア２から隔離エリア３にいくにつれて、中心線Ｊに近づきながら傾斜するように構成されている。

このように、本発明の変形例２における細胞培養容器３００によれば、一対の留め壁５ｄによって、培養エリア２内の気泡は、留め壁５ｄにならって、より隔離エリア３内に誘導されやすくなる。逆に隔離エリア３内に一旦入った気泡は、戻り口が狭くなるため、培養エリア２内には逆戻りしにくくなっており、隔離エリア３内により留めておくことができる。

（変形例３）
図８は、本発明の変形例３における細胞培養容器の構成を模式的に示した断面図である。なお、変形例１と同様に、基本的構造は、本発明の一実施形態と同じであるため、符号の説明は省略する。また、本発明の一実施形態と変形例２との相違点は、隔離エリア３内の気泡をより留めさせる構造である。以下、詳細に説明する。

図８（ａ）は、本発明の一実施形態の一対の留め壁５ｂに構成を追加した図を示している。図８（ａ）に示すように、細胞培養容器４００における一対の留め壁５ｂは、この先端から培養エリア２にいくにつれて、中心線Ｊから離れながら傾斜する返し部５ｅを一体に設けている。

また、図８（ｂ）は、本発明の変形例２の一対の留め壁５ｄに構成を追加した図を示している。図８（ｂ）に示すように、細胞培養容器５００における一対の留め壁５ｄは、この先端から培養エリア２にいくにつれて、中心線Ｊから離れながら傾斜する返し部５ｆを一体に設けている。

このように、本発明の変形例３における細胞培養容器４００によれば、一対の返し部５ｅによって、隔離エリア３内に留められている気泡を、より隔離エリア３内に留めておくことができる。
同様に、本発明の変形例３における細胞培養容器５００によれば、一対の返し部５ｆによって、隔離エリア３内に留められている気泡を、より隔離エリア３内に留めておくことができる。

以上、本発明を好適な実施形態および変形例により説明してきたが、こうした記述は限定事項ではなく、もちらん、種々の改変が可能である。例えば、充填口１，６および蓋１０，１１は少なくとも一方が設けられていれば良い。
また、充填口及び蓋の代わりに、本出願人の発明の特許文献３に開示する封止構造を採用しても良い。
また、充填口及び蓋の代わりに、第２の培養エリア２ｂと隔離エリア３との夫々の側面に樹脂製のゴム栓、シリコン栓などのインジェクション（アクセス）ポートを埋め込ませて、そこにシリンジ針を直接差し込み、外部からポンプを作動させて培養液を注入、若しくは、気泡を吸引しても良い。
また、培養エリア２は、略断面円形状の第１の培養エリア２ａと、略矩形状の第２の培養エリア２ｂとからなっているが、第２の培養エリア２ｂとそれに付随する充填口１及び蓋１０を構成から外した、第１の培養エリア２ａのみの構成であっても良い。
また、培養エリア２の第１の培養エリア２ａと第２の培養エリア２ｂの外観形状は、これに限るものではない。
さらに、誘導留め機構４は、漏斗形状の間切り壁５で説明したが、培養エリア２から隔離エリア３に気泡が隔離されれば良く、これに限定するものではない。

１、６充填口
２培養エリア
３隔離エリア
４誘導留め機構
５間切り壁
５ａ誘導壁
５ｂ、５ｄ留め壁
５ｃ傾斜部
５ｅ、５ｆ返し部
Ｊ中心線
Ｋ気泡
１００、２００、３００、４００、５００細胞培養容器

Claims

クリノスタットに搭載され、細胞培養に用いる細胞培養容器であって、
培養液を入れる充填口と、
細胞を培養させる培養エリアと、
前記培養エリア内の気泡を隔離させる隔離エリアと、
前記培養エリア内の気泡を前記クリノスタットの回転中に前記隔離エリアに誘導するとともに、隔離された気泡を隔離エリアに留まらせる誘導留め機構と、
を備え、
前記誘導留め機構は、培養エリアから隔離エリアにいくにつれて開口部が小さくなるような漏斗形状の一対の間切り壁を備え、
前記間切り壁は、円弧状の誘導壁と直線状の留め壁とからなる
ことを特徴とする、クリノスタットに用いる細胞培養容器。
前記留め壁は、中心線と平行に、または、前記培養エリアから前記隔離エリアにいくにつれて、中心線に近づきながら傾斜するように設けられていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
前記留め壁は、該先端から培養エリアにいくにつれて、中心線から離れながら傾斜する返し部を一体に設けていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞培養容器。
前記隔離エリアと前記留め壁との当接部は、培養エリアから隔離エリアにいくにつれて、上り傾斜となる傾斜部が設けられていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容
器。