JP7088507B2

JP7088507B2 - 結晶構造解析システム及び結晶構造解析方法

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Publication number: JP7088507B2
Application number: JP2018123904A
Authority: JP
Inventors: 功治米倉; 裕介西山
Original assignee: Jeol Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Jeol Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: EP3588069A2; US10955366B2; US20200003710A1; EP3588069A3; JP2020003375A

Description

本発明は、試料の結晶構造を解析するシステム及び方法に関する。

結晶構造を解析する場合において、１０～１００μｍ程度の大きさを有する単結晶が得られる場合、一般的には、単結晶Ｘ線回折法によって結晶構造が特定される。単結晶Ｘ線回折法においては、試料へのＸ線の入射角を変化させながら回折像を取得することで、３次元逆格子空間が観察される。実空間におけるフーリエマップは、分子置換法又は直接法などを用いることで逆格子空間から得られる。また、単結晶Ｘ線回折法を用いるには小さすぎる１μｍ以下の微結晶であっても、混ざり物のない微結晶粉末試料が得られれば、粉末Ｘ線回折法によって結晶構造が特定される場合もある。

いずれの場合も測定で得られる物理量は回折パターンであり、逆格子空間の位置情報が得られない。そのため、分子置換法又は直接法等による構造解析が必要となる。単結晶Ｘ線回折法では、３次元逆格子空間の強度が３次元データとして得られるため、３次元の実空間の構造が比較的容易に得られる。一方で、粉末Ｘ線では２θ軸への射影のみが得られる。そのため、粉末Ｘ線回折法では、単結晶Ｘ線回折よりも構造解析のために、より多くの仮定が必要となり、その結果、構造が特定されない場合もある。また、粉末試料に混ざり物が含まれている場合、粉末試料では構造解析は実質的にできない。また、いずれの手法も、電子密度の低い水素原子からの散乱強度が弱いため、水素原子の観察は容易ではない。水素原子の位置は、中性子回折によって決定することができるが、単結晶Ｘ線回折法に用いられる単結晶よりも更に大きな単結晶が必要となる。また、バックグラウンドを低減するために重水素が必要になる場合がある。

特許文献１には、透過型電子顕微鏡によって得られた蛋白質立体形状情報を用いることで、蛋白質立体形状データベースから、類似機能を有する蛋白質を検索する装置が記載されている。

特開２００５－２５０７２１号公報

ところで、結晶構造を解析するための手法として、例えば、単結晶Ｘ線回折法、粉末Ｘ線回折法、単結晶中性子回折法、電子回折法、及び、固体ＮＭＲ（Nuclear Magnetic Resonance：核磁気共鳴）測定法等が知られている。

単結晶Ｘ線回折法によって結晶構造を解析するためには、上述したように、１０～１００μｍ程度の大きな単結晶を用いる必要があり、１μｍ程度の大きさの単結晶しか得られない場合には、結晶構造を解析することができない。また、互いに原子番号の近い元素同士を区別することが困難な場合がある。また、水素原子等のように電子密度の小さい軽い元素を観測することも難しい。

粉末Ｘ線回折法によって結晶構造を解析するためには、上述したように、混ざり物のない純粋な微結晶粉末を用いる必要がある。そのため、錠剤等のように混ざり物が含まれる試料の結晶構造を解析することができない。また、分子に含まれる自由度が多すぎる場合、結晶構造を解析することができない。また、互いに原子番号の近い元素同士を区別することが困難であり、水素原子等のように電子密度の小さい軽い元素を観測することも難しい。

単結晶中性子回折法によって結晶構造を解析するためには、上述したように、単結晶Ｘ線回折法に用いられる単結晶よりも更に大きな単結晶を用いる必要がある。また、バックグラウンドを低減するために重水素置換が必要となる。また、大規模な中性子施設が必要となる。

電子回折法では、多重散乱の影響が大きくなるため、得られる回折パターンの質がＸ線回折法によって得られる回折パターンの質よりも劣る。そのため、水素原子の位置を特定することができず、また、互いに原子番号の近い元素同士を区別することが困難である。

固体ＮＭＲ測定法によれば、原子核間の距離を測定することができるため、原理的には結晶構造を解析することができる。しかし、一般的には、結晶の全体構造を特定することが困難である。また、同位体ラベルされた試料が必要になる場合がある。

上述した手法では、例えば、１μｍ以下の大きさを有する結晶の構造の特定、水素の位置の特定、及び、互いに原子番号の近い元素同士の区別等ができない場合がある。

本発明の目的は、電子回折法とＮＭＲ測定法とを用いた新たな結晶構造の解析技術を提供することにある。

本発明の１つの態様は、電子回折によって試料の結晶の全体構造を測定する電子回折装置と、ＮＭＲ測定によって前記結晶の局所構造を測定するＮＭＲ装置と、前記全体構造と前記局所構造とを組み合わせることで前記結晶の構造を特定する解析装置と、を含むことを特徴とする結晶構造解析システムである。

上記の構成によれば、電子回折によっては特定することができない結晶の局所構造がＮＭＲ測定によって特定され、ＮＭＲ測定によっては特定することができない結晶の全体構造が電子回折によって特定される。それらの測定結果を組み合わせることで、結晶の全体構造及び局所構造を特定することができる。結晶の全体構造は、電子回折によって得られる回折パターンに基づいて特定される。結晶の局所構造は、ＮＭＲ測定によって得られるＮＭＲパラメーターに基づいて特定される。また、後述するように、量子化学計算が用いられてもよい。例えば、電子回折、ＮＭＲ測定及び量子化学計算を組み合わせることで、結晶の構造を特定してもよい。

前記解析装置は、更に、前記全体構造に対して量子化学計算を適用することで前記結晶の構造を最適化し、最適化された前記全体構造と前記局所構造とを組み合わせてもよい。

前記解析装置は、前記組み合わせにおいて、電子回折によって得られた前記結晶のポテンシャルマップに、ＮＭＲ測定によって得られた原子Ｘの帰属を当てはめてもよい。

前記ＮＭＲ装置は、ＮＭＲ測定によって前記結晶における原子Ｘと水素原子との双極子相互作用を測定することで、原子Ｘと水素原子との間の距離を測定し、前記解析装置は、前記組み合わせにおいて、前記距離に基づいて前記全体構造における水素原子の位置を特定してもよい。

前記ＮＭＲ装置は、ＮＭＲ測定によって前記結晶における原子Ｘと水素原子との相関測定を行い、前記解析装置は、前記組み合わせにおいて、前記相関測定の結果に基づいて、原子Ｘに水素原子が結合しているか否かを判断してもよい。

前記解析装置は、更に、ＮＭＲ測定によって得られた前記結晶の化学シフトテンソル又は等方化学シフトに基づいて、電子回折によって測定された前記全体構造を評価してもよい。

前記解析装置は、量子化学計算によって計算された前記結晶の化学シフトテンソル又は等方化学シフトと、ＮＭＲ測定によって得られた前記結晶の化学シフトテンソル又は等方化学シフトとを比較することで、前記全体構造を評価してもよい。

前記組み合わせによって複数の構造が推定される場合、前記解析装置は、前記全体構造の評価を行ってもよい。

前記解析装置は、更に、電子回折によって得られた前記結晶の３次元の逆格子空間を再構成することで前記全体構造を特定してもよい。

前記電子回折装置は、前記試料を回転させながら電子回折による測定を実行してもよい。

前記電子回折装置は、前記試料を回転させつつ電子線を傾斜させて前記試料に照射することで電子回折による測定を実行してもよい。

また、本発明の１つの態様は、電子回折によって試料の結晶の全体構造を測定し、ＮＭＲ測定によって前記結晶の局所構造を測定し、前記全体構造と前記局所構造とを組み合わせることで前記結晶の構造を特定する、ことを特徴とする結晶構造解析方法である。

前記全体構造に対して量子化学計算を適用することで前記結晶の構造を最適化し、最適化された前記全体構造と前記局所構造とを組み合わせてもよい。

ＮＭＲ測定によって前記結晶における原子Ｘと水素原子との双極子相互作用を測定することで、原子Ｘと水素原子との間の距離を測定し、前記組み合わせにおいて、前記距離に基づいて前記全体構造における水素原子の位置を特定してもよい。

ＮＭＲ測定によって前記結晶における原子Ｘと水素原子との相関測定を行い、前記組み合わせにおいて、前記相関測定に基づいて、原子Ｘに水素原子が結合しているか否かを判断してもよい。

量子化学計算によって計算された前記結晶の化学シフトテンソル又は等方化学シフトと、ＮＭＲ測定によって得られた前記結晶の化学シフトテンソル又は等方化学シフトとを比較することで、前記全体構造を評価してもよい。

本発明によれば、電子回折法とＮＭＲ測定法とを用いた新たな結晶構造の解析技術を提供することができる。

本発明の実施形態に係る結晶構造解析システムを示すブロック図である。本実施形態に係る解析処理の流れを示す図である。試料のＴＥＭ（Transmission Electron Microscope）像を示す図である。試料のポテンシャルマップを示す図である。試料のコンホメーションの一例を示す図である。試料のコンホメーションの一例を示す図である。試料のコンホメーションの一例を示す図である。計算で得られた化学シフトと実測の化学シフトとの比較結果を示す図である。計算で得られたエネルギーを示す図である。

以下、図１を参照して、本発明の実施形態に係る結晶構造解析システムについて説明する。図１は、本実施形態に係る結晶構造解析システムの一例を示す。

本実施形態に係る結晶構造解析システム１０は、一例として、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ装置）１２、ＮＭＲ装置（核磁気共鳴装置）１４、及び、解析装置１６を含む。透過型電子顕微鏡１２、ＮＭＲ装置１４及び解析装置１６は、例えば、ネットワーク等の通信経路によって互いに接続されている。透過型電子顕微鏡１２及びＮＭＲ装置１４として、それぞれ公知の装置が用いられる。なお、透過型電子顕微鏡１２は、電子回折装置の一例に相当する。

透過型電子顕微鏡１２は、電子銃、電子レンズ、偏向系、試料支持台及び電子線検出器等を含む。電子銃から射出された電子ビームは、電子レンズ及び偏向系を介して、試料支持台によって支持されている試料上に収束されて試料を透過する。試料を透過した電子は電子線検出器によって検出される。その検出によって生成された信号は増幅及びＡＤ変換され、その後、解析装置１６に送信される。試料支持台の傾きを変えることで、試料に照射される電子線の照射方向を変えてもよい。また、試料への電子線の入射角を変えることで、電子線の照射方向を変えてもよい。もちろん、試料支持台の傾き及び電子線の入射角の両方を変えてもよい。本実施形態では、透過型電子顕微鏡１２によって電子回折法が実行されることで、試料の結晶の全体構造が測定される。ここで得られる全体構造には、後述するように不確定さがあり、１つの構造を特定することができない。この点については後で詳しく説明する。電子回折法として、例えば、制限視野電子回折（ＳＡＥＤ：Selected Area Electron Diffraction）、極微電子回折法（ＮＢＤ：Nano Beam electron Diffraction）、又は、収束電子回折法（ＣＢＥＤ：Convergent Beam Electron Diffraction）等が実行される。これらは一例に過ぎず、他の電子回折法が実行されてもよい。

ＮＭＲ装置１４は、静磁場中に配置された試料に高周波信号を照射し、その後、試料から出る微小な高周波信号（ＮＭＲ信号）を検出し、ＮＭＲ信号に含まれる分子構造情報を抽出することで分子構造を解析する装置である。ＮＭＲ装置１４によって各種のＮＭＲパラメーターが取得され、当該各種のＮＭＲパラメーターは解析装置１６に送信される。本実施形態では、ＮＭＲ装置１４によるＮＭＲ測定によって、試料の結晶の局所構造が測定される。ＮＭＲ測定によれば、原子が存在する局所的な構造を特定することができるが、結晶の全体構造を特定することは困難である。この点については後で詳しく説明する。

解析装置１６は、透過型電子顕微鏡１２による電子回折によって測定された結晶の全体構造と、ＮＭＲ装置１４によって測定された当該結晶の局所構造とを組み合わせることで、当該結晶の分子構造を決定するように構成された装置である。解析装置１６は、例えば第一原理に基づく量子化学計算を実行することで、結晶構造の最適化及び評価を行ってもよい。量子化学計算として、例えば公知の計算方法が用いられる。解析装置１６は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing unit）等のプロセッサ、メモリ又はハードディスク等の記憶装置、及び、ユーザーインターフェース等を備えたコンピュータである。ユーザーインターフェースは、例えば、ディスプレイと、キーボード等の入力装置とによって構成されている。解析装置１６による解析処理は、一例として、ハードウェアとソフトウェアとの協働によって実現される。例えば、プロセッサが、記憶装置に記憶されているプログラムを読み出して実行することで、解析装置１６による解析処理が実現される。別の例として、解析装置１６による解析処理は、電子回路又はＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）等のハードウェアにより実現されてもよいし、ＤＳＰ（Digital Signal Processor）又はＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）等によって実現されてもよい。解析装置１６による解析結果を示す情報が、ディスプレイに表示されてもよい。

以下、図２を参照して、結晶構造解析システム１０の動作（結晶構造解析方法）について詳しく説明する。図２は、結晶構造解析システム１０による処理の流れの一例を示す。本実施形態では、大別して、（１）電子回折による全体構造の特定、（２）ＮＭＲ測定によるパラメーターの収集（局所構造の特定）、及び、（３）量子化学計算による構造の最適化と評価が行われる。

以下、（１）電子回折による全体構造の特定について説明する。まず、透過型電子顕微鏡１２によって試料のＴＥＭ像を撮影する。当該ＴＥＭ像は、例えば解析装置１６に表示される。測定者は、当該ＴＥＭ像に表された結晶を参照し、構造決定の対象となる微結晶を選択する（ステップＳ１）。次に、透過型電子顕微鏡１２によって当該微結晶に電子回折法が適用されることで当該微結晶の全体構造を表す回折パターンが得られ、当該回折パターンが解析されることで３次元逆格子が得られる（ステップＳ２）。当該解析は、透過型電子顕微鏡１２によって行われてもよいし、解析装置１６によって行われてもよい。

電子回折による構造決定は、３次元逆格子空間から再構築される。逆格子は、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかの方法によって透過型電子顕微鏡１２によって測定された回折パターンから得られる。
（ａ）電子線照射の下で連続的に試料を回転させながら回折パターンを測定する。
（ｂ）試料を回転させる、電子線を傾斜させる、又は、試料の回転と電子線の傾斜との組み合わせによって、試料と電子線の配置を様々に変化させ、それぞれの配置における回折パターンを測定する。
（ｃ）試料を回転させる、電子線を傾斜させる、又は、試料の回転と電子線の傾斜との組み合わせによって、試料と電子線の配置を様々に変化させ、その上で、電子線を小さな角度で振動、歳差運動又は回転させて回折パターンを測定する。
（ｄ）電子線照射の下で連続的に試料を回転させながら、電子線を小さな角度で振動、歳差運動又は回転させて回折パターンを測定する。

次に、上記のようにして得られた３次元逆格子に対して公知の結晶構造解析及び構造最適化を適用する（ステップＳ３）。これにより、測定対象の微結晶の全体構造が得られる。例えば、当該全体構造のポテンシャルマップが得られる。３次元逆格子からポテンシャルマップを得る方法として、公知の方法を用いることができる。ステップＳ３の処理は、透過型電子顕微鏡１２によって行われてもよいし、解析装置１６によって行われてもよい。

ステップＳ１にて複数の微結晶が選択され、当該複数の微結晶のそれぞれに対してステップＳ２の処理が実行されてもよい。

次に、ステップＳ３にて得られた全体構造（例えばポテンシャルマップ）に対して、仮に、炭素原子、窒素原子、酸素原子及び水素原子を、試料の分子構造に基づいて配置する（ステップＳ４）。この配置は、解析装置１６によって自動的に行われてもよいし、測定者によるマニュアル操作によって行われてもよい。その配置を自動的に行う公知のソフトウェアが用いられてもよい。自動配置処理とマニュアル操作とを組み合わせてもよい。例えば、自動配置処理によって各原子が自動的に配置された後に、マニュアル操作によって各原子の配置が変更されてもよい。

上記のようにして得られる構造にはいくつかの不確定さがある。例えば、有機物を例に挙げると、炭素原子、窒素原子及び酸素原子といった互いに原子番号の近い元素同士を見分けることができず、分子のコンホメーション（conformation）を１つに確定することができない。また、水素原子の位置を特定することができないため、可能性のある（確からしい）構造の数が更に増えてしまう。従って、電子回折によれば、微結晶の全体構造について複数の候補が生成される場合がある。

なお、ステップＳ４の処理にて、後述するＮＭＲ測定によって得られた原子間距離の情報を原子の配置処理に反映させることで、各原子を全体構造に配置してもよい。例えば、解析装置１６は、全体構造（ポテンシャルマップ）において、ＮＭＲ測定によって得られた原子Ｘ、Ｙ間の距離を有する構造の部分に、原子Ｘ及び原子Ｙを配置する。

以下、（２）ＮＭＲ測定によるパラメーターの収集（局所構造の特定）について説明する。ＮＭＲ装置１４によって、試料の局所的な構造情報が反映されたＮＭＲパラメーターを測定する。固体ＮＭＲ測定として、例えば、双極子相互作用の測定による原子間距離の測定、化学シフトテンソルの測定、等方化学シフトの測定、相関測定、四極子テンソルの測定、及び、ＮＭＲピーク位置の測定の中の少なくとも１つの測定が行われる。もちろん、これら以外のＮＭＲパラメーターが測定されてもよい。これらのＮＭＲパラメーターは、原子が存在する局所的な構造に非常に敏感であることが知られている。また、ＮＭＲ信号の帰属を行うことで（ＮＭＲスペクトル中の各信号がどの原子に由来するのか帰属することで）、それぞれのＮＭＲパラメーターが分子のどの位置の局所情報を含んでいるのかを同定することができる。また、ＮＭＲ信号の帰属と局所情報とから電子回折で得られた全体構造の確からしさを検証することができる。ＮＭＲ信号を用いた上記の解析は、例えば解析装置１６によって行われる。なお、固体ＮＭＲ測定によれば、試料の局所的な構造を得ることができるが、試料の全体構造を得ることは困難である。

解析装置１６は、電子回折によって得られた全体構造（ポテンシャルマップ）に、ＮＭＲ測定によって得られた原子Ｘの帰属を当てはめてもよい。上記のように、ＮＭＲパラメーターが分子のどの位置の局所情報を含んでいるのかを同定することができるので、例えば、解析装置１６は、その同定の結果を利用することで、各原子を全体構造に配置してもよい。

また、ＮＭＲ装置１４は、原子Ｘと水素原子との双極子相互作用を測定することで、原子Ｘと水素原子との間の距離を測定し、解析装置１６は、当該距離に基づいて全体構造（ポテンシャルマップ）における水素原子の位置を特定してもよい。

また、ＮＭＲ装置１４は、原子Ｘと水素原子との相関測定を行い、解析装置１６は、当該相関測定の結果に基づいて、原子Ｘに水素原子が結合しているか否かを判断してもよい。

なお、原子Ｘは、特に限定されるものではなく、水素原子であってもよい。

以下、（３）量子化学計算による構造の最適化について説明する。透過型電子顕微鏡１２による電子回折の測定結果を示す情報、及び、ＮＭＲ装置１４による固体ＮＭＲ測定の結果を示す情報は、解析装置１６に出力される。解析装置１６は、電子回折によって得られた１又は複数の全体構造の候補に対して量子化学計算を適用することで、各全体構造の候補を最適化する（ステップＳ５）。解析装置１６は、各全体構造の候補に量子化学計算を適用することで、各候補について原子間距離を計算してもよい。また、解析装置１６は、各全体構造の候補に対して量子化学計算を適用することで、各候補についてＮＭＲパラメーターを計算する（ステップＳ６）。ここで計算されるＮＭＲパラメーターは、上記の複数のＮＭＲパラメーターの中の少なくとも１つである。

次に、解析装置１６は、計算によって得られたＮＭＲパラメーターとＮＭＲ装置１４によって測定されたＮＭＲパラメーター（実測パラメーター）とを比較することで、各候補について、全体構造の確からしさを評価し、その評価結果に基づいて、最終的な構造を決定する（ステップＳ７）。

なお、ステップＳ５の処理（全体構造の最適化）によって、複数の候補から１つの結晶構造が特定されることがある。この場合、ステップＳ６の処理（ＮＭＲパラメーターの計算）及びステップＳ７の処理（比較処理）は行われなくてもよい。例えば、ステップＳ１～Ｓ４の処理によって全体構造の複数の候補が生成され、ステップＳ５の処理によって１つの結晶構造が特定されない場合に、ステップＳ６，Ｓ７の処理が行われてもよい。同様に、ステップＳ６の処理によって得られたＮＭＲパラメーターとＮＭＲ装置１４によって測定されたＮＭＲパラメーターの実測値との比較結果によって、複数の候補から１つの結晶構造が特定されることがある。この場合、ステップＳ５の処理（全体構造の最適化）は行われなくてもよい。

（実施例）
以下、実施例について説明する。一例として、orthorhombic L-histidine（本実施例の試料）の構造を決定するものとする。

まず、透過型電子顕微鏡１２によって当該試料のＴＥＭ像を撮影した。図３は、当該ＴＥＭ像１８を示す。測定者は、当該ＴＥＭ像を観察して、結晶構造の特定処理の対象となる微結晶を選択する。例えば、ＴＥＭ像１８において丸印２０で示された部分の微結晶が選択された。当該微結晶は１μｍ程度の大きさを有する。そして、透過型電子顕微鏡１２によって当該微結晶に電子線を照射し、試料を連続的に回転させながら、一連の回折パターンを得た。ここでは、５つの結晶からの回折パターンを解析することで３次元逆格子を得た。そして、直接法によって３次元逆格子に基づいて構造解析を行うことで、図４に示されているポテンシャルマップ２２を得た。これらの解析は、例えば、解析装置１６によって行われる。

ここで、仮にポテンシャルマップ２２に分子を重ね合わせたとしても、水素原子の位置が定まらない。炭素原子、窒素原子及び酸素原子の区別がつかないという不明瞭性があり、電子回折からは、図５から図７に示されている１２個のコンホメーションがいずれも等しく確からしい。図５から図７には、電子回折から得られたコンホメーションが示されている。図５には、コンホメーション２４Ａ～２４Ｄが示されており、図６には、コンホメーション２６Ａ～２６Ｄが示されており、図７には、コンホメーション２８Ａ～２８Ｄが示されている。イミダゾール環に含まれる２つの窒素原子のうちどちらに水素原子が結合しているのかが特定されず、いずれの構造も確からしい。従って、この点に関する構造の候補として、２つのコンホメーション（２つの選択肢）がとり得る。また、イミダゾール環の向きとして２つの向きが考えられるため、この点に関する構造の候補として、２つのコンホメーション（２つの選択肢）がとり得る。更に、試料がZwitterion（双性イオン）であるか否かが特定されず、この点に関する構造の候補として、３つのコンホメーション（３つの選択肢）がとり得る。従って、電子回折からは、合計で１２個（＝２×２×３）のコンホメーションが、確からしい全体構造として特定され、１つの構造を決定することができない。なお、分子の重ね合わせは、解析装置１６によって行われてもよいし、測定者によって行われてもよい。

次に、ＮＭＲ装置１４によって上記試料のＮＭＲパラメーターを測定した。ここでは、１Ｈ／１４Ｎ相関ＮＭＲ測定を行った。この測定によって、orthorhombic L-histidineはZwitterionとなっており、イミダゾール環に含まれる２つの窒素原子のうち１つのみに水素原子が結合していることが確認された（Acta Cryst. (2017). C73, 219-228参照）。これは、１Ｈ／１４Ｎ相関スペクトルに２つの信号のみが観測されたことと（イミダゾール環に含まれる２つの窒素原子のうち１つに水素原子が結合し、もう１つには水素原子が結合していない）、１Ｈ／１４Ｎピークのうち１つが１４Ｎ：－２５０ｐｐｍ付近に観測されたこと（ＮＨ３＋となることにより１４Ｎの四極子定数が小さくなり、シフトが小さくなった）から導き出せる。このことから、上記の１２個のコンホメーションのうちコンホメーション２６Ａ～２６Ｄ，２８Ａ～２８Ｄの可能性を除外することができ、構造の候補を、コンホメーション２４Ａ～２４Ｄの４つの構造に絞ることができる。また、１Ｈ、１３Ｃ及び１４Ｎの等方化学シフトの測定、及び、１Ｈと１５Ｎとの間の原子間距離の測定を行った。なお、電子回折とＮＭＲ測定の順番は特に限定されるものではなく、いずれかが先に行われてもよいし、同じタイミングで行われてもよい。

次に、量子化学計算によって構造の最適化及び評価を行った。コンホメーション２４Ａ～２４Ｄに対して、固体ＮＭＲ測定によって得られた１Ｈと１５Ｎと間の原子間距離を適用することで、固体ＮＭＲ測定によって得られた当該原子間距離を有するコンホメーションを選択した。この処理は、解析装置１６によって行われてもよいし、測定者によって行われてもよい。また、コンホメーション２４Ａ～２４Ｄに量子化学計算を適用することで、コンホメーション２４Ａ～２４Ｄのそれぞれのエネルギー及び化学シフトを計算した。計算で得られた化学シフトと固体ＮＭＲ測定によって得られた化学シフトとを比較し、両者のＲＭＳＤ（Root Mean Square Deviation：平均二乗偏差）を計算した。これらの計算は、解析装置１６によって行われる。

図８は、各コンホメーションについての化学シフトのＲＭＳＤを示す。図９は、各コンホメーションの計算されたエネルギーを示す。図８において、横軸はコンホメーションを示し、縦軸は計算されたＲＭＳＤを示す。図９において、横軸はコンホメーションを示し、縦軸は計算されたエネルギーを示す。

図８は、１３Ｃについての化学シフトのＲＭＳＤ、１Ｈ（proton）についての化学シフトのＲＭＳＤ、及び、１５Ｎについての化学シフトのＲＭＳＤを示す。例えば、符号３０，３２，３４は、コンホメーション２４Ａについての化学シフトのＲＭＳＤを指し示している。符号３０は、１３Ｃについての化学シフトのＲＭＳＤを指し示し、符号３２は、１Ｈについての化学シフトのＲＭＳＤを指し示し、符号３４は、１５Ｎについての化学シフトのＲＭＳＤを指し示している。コンホメーション２４Ｂ～２４Ｄについても同様に、左側から１３Ｃ、１Ｈ及び１５Ｎの順番で、各化学シフトのＲＭＳＤが示されている。

図８を参照すると、１Ｈ（proton）、１３Ｃ及び１５Ｎのいずれにおいても、コンホメーション２４ＡのＲＭＳＤが他のコンホメーションのＲＭＳＤよりも小さくなっている。このことは、コンホメーション２４Ａが最も確からしい構造であることを示している。また、図９を参照すると、コンホメーション２４Ａのエネルギーが他のコンホメーションのエネルギーよりも小さくなっている。このことは、コンホメーション２４Ａが最も安定した構造であることを示している。また、コンホメーション２４Ａに対する量子化学計算によって得られた１Ｈ－１５Ｎ間の距離は、固体ＮＭＲ測定によって得られた距離（実測値）とよく一致した。上記の評価によれば、コンホメーション２４Ａが、試料の最も確からしい構造として特定される。ＲＭＳＤの比較、エネルギーの比較、原子間距離の比較、及び、最も確からしい構造の決定は、解析装置１６によって行われてもよいし、測定者によって行われてもよい。例えば、ＲＭＳＤのグラフ（図８）及びエネルギーのグラフ（図９）が解析装置１６によって作成されてディスプレイに表示されて、測定者が、それらのグラフを参照することで、最も確からしい構造を特定してもよい。

以上のように、電子回折、固体ＮＭＲ測定、及び、量子化学計算を組み合わせることで、orthorhombic L-histidine（本実施例の試料）の構造を特定することができた。

上記の実施例では、量子化学計算が用いられているが、電子回折と固体ＮＭＲ測定との組み合わせによって構造を決定することができる場合には、量子化学計算は用いられなくても良い。例えば、電子回折によって得られた複数のコンホメーションの中から、固体ＮＭＲ測定によって得られた複数のＮＭＲパラメーター（実測値）を用いて１つのコンホメーションを決定することができる場合、量子化学計算が実行されなくてもよい。試料の構造によっては、水素原子の位置、ＮＭＲピークの位置及び化学シフト等のＮＭＲパラメーターによって、最も確からしい構造を特定することができ、この場合には、量子化学計算は不要である。

本実施形態によれば、１μｍ以下の大きさを有する結晶であっても結晶構造を特定することができる。従って、大きな結晶を作製することが困難な試料であっても結晶構造を特定することができる。

なお、試料の厚さによっては、電子線が試料を透過し難くなる場合がある。その場合には、電子線が試料を透過しやすいにように、厚さの薄い試料を用いればよい。例えば、３μｍ以上の厚さを有する試料は、電子線が透過し難い場合があり、その場合は、より薄い試料を用いればよい。

以上のように、本実施形態によれば、電子回折法を適用することで、大きさが１μｍ以下の微細な結晶の全体構造を特定することができる。電子線の相互作用は、Ｘ線の相互作用よりも圧倒的に強いため、このような非常に小さい微結晶からであっても回折パターンが得られるからである。また、固体ＮＭＲ測定（必要に応じて量子化学計算）を用いることで、電子回折では特定できない水素原子の位置を特定することができる。また、固体ＮＭＲ測定（必要に応じて量子化学計算）を用いることで、電子回折では区別することができない互いに原子番号の近い元素（実施例では、炭素原子、窒素原子、酸素原子）の区別をすることができる。また、電子回折、固体ＮＭＲ測定及び量子化学計算を組み合わせることで、微細な結晶の構造の最適化を行うことができる。また、混ざり物を含む試料であっても、その試料から微細な単結晶を選択し、その選択された単結晶を解析することで、構造を特定することができる。

上記の実施例では、orthorhombic L-histidineが試料として用いられているが、これは一例に過ぎず、他の試料についても、電子回折及びＮＭＲ測定の組み合わせ、又は、電子回折、ＮＭＲ測定及び量子化学計算の組み合わせによって、最も確からしい結晶構造を特定することができる。

例えば、ＭＯＦ（metal organic framework）等の結晶性の高い試料、大きな単結晶を作製することが困難な試料、及び、医薬品の錠剤等のように混ざり物が含まれる試料等が、本実施形態に係る試料として用いられてもよい。このような試料の結晶構造は、従来の粉末Ｘ線回折法又は単結晶Ｘ線回折法では特定することができないが、本実施形態によれば、そのような結晶構造であっても特定することができる。

１０結晶構造解析システム、１２透過型電子顕微鏡、１４ＮＭＲ装置、１６解析装置。

Claims

電子回折によって試料の結晶の全体構造を測定する電子回折装置と、
ＮＭＲ測定によって前記結晶の局所構造を測定するＮＭＲ装置と、
前記全体構造と前記局所構造とを組み合わせることで前記結晶の構造を特定する解析装置と、
を含み、
前記解析装置は、更に、前記全体構造に対して量子化学計算を適用することで前記結晶の構造を最適化し、最適化された前記全体構造と前記局所構造とを組み合わせる、
ことを特徴とする結晶構造解析システム。
請求項１に記載の結晶構造解析システムにおいて、
前記解析装置は、前記組み合わせにおいて、電子回折によって得られた前記結晶のポテンシャルマップに、ＮＭＲ測定によって得られた原子Ｘの帰属を当てはめる、
ことを特徴する結晶構造解析システム。
請求項１又は請求項２に記載の結晶構造解析システムにおいて、
前記ＮＭＲ装置は、ＮＭＲ測定によって前記結晶における原子Ｘと水素原子との双極子相互作用を測定することで、原子Ｘと水素原子との間の距離を測定し、
前記解析装置は、前記組み合わせにおいて、前記距離に基づいて前記全体構造における水素原子の位置を特定する、
ことを特徴とする結晶構造解析システム。
請求項１又は請求項２に記載の結晶構造解析システムにおいて、
前記ＮＭＲ装置は、ＮＭＲ測定によって前記結晶における原子Ｘと水素原子との相関測定を行い、
前記解析装置は、前記組み合わせにおいて、前記相関測定の結果に基づいて、原子Ｘに水素原子が結合しているか否かを判断する、
ことを特徴とする結晶構造解析システム。
請求項１又は請求項２に記載の結晶構造解析システムにおいて、
前記解析装置は、更に、ＮＭＲ測定によって得られた前記結晶の化学シフトテンソル又は等方化学シフトに基づいて、電子回折によって測定された前記全体構造を評価する、
ことを特徴とする結晶構造解析システム。
電子回折によって試料の結晶の全体構造を測定する電子回折装置と、
ＮＭＲ測定によって前記結晶の局所構造を測定するＮＭＲ装置と、
前記全体構造と前記局所構造とを組み合わせることで前記結晶の構造を特定する解析装置と、
を含み、
前記解析装置は、更に、ＮＭＲ測定によって得られた前記結晶の化学シフトテンソル又は等方化学シフトに基づいて、電子回折によって測定された前記全体構造を評価する、
ことを特徴とする結晶構造解析システム。
請求項５又は請求項６に記載の結晶構造解析システムにおいて、
前記解析装置は、量子化学計算によって計算された前記結晶の化学シフトテンソル又は等方化学シフトと、ＮＭＲ測定によって得られた前記結晶の化学シフトテンソル又は等方化学シフトとを比較することで、前記全体構造を評価する、
ことを特徴とする結晶構造解析システム。
請求項５から請求項７のいずれか一項に記載の結晶構造解析システムにおいて、
前記組み合わせによって複数の構造が推定される場合、前記解析装置は、前記全体構造の評価を行う、
ことを特徴とする結晶構造解析システム。
請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の結晶構造解析システムにおいて、
前記解析装置は、更に、電子回折によって得られた前記結晶の３次元の逆格子空間を再構成することで前記全体構造を特定する、
ことを特徴とする結晶構造解析システム。
電子回折によって試料の結晶の全体構造を測定する電子回折装置と、
ＮＭＲ測定によって前記結晶の局所構造を測定するＮＭＲ装置と、
前記全体構造と前記局所構造とを組み合わせることで前記結晶の構造を特定する解析装置と、
を含み、
前記解析装置は、更に、電子回折によって得られた前記結晶の３次元の逆格子空間を再構成することで前記全体構造を特定する、
ことを特徴とする結晶構造解析システム。
請求項９又は請求項１０に記載の結晶構造解析システムにおいて、
前記電子回折装置は、前記試料を回転させながら電子回折による測定を実行する、
ことを特徴とする結晶構造解析システム。
請求項９又は請求項１０に記載の結晶構造解析システムにおいて、
前記電子回折装置は、前記試料を回転させつつ電子線を傾斜させて前記試料に照射することで電子回折による測定を実行する、
ことを特徴とする結晶構造解析システム。
電子回折によって試料の結晶の全体構造を測定し、
ＮＭＲ測定によって前記結晶の局所構造を測定し、
前記全体構造と前記局所構造とを組み合わせることで前記結晶の構造を特定し、
前記全体構造と前記局所構造とを組み合わせることにおいては、前記全体構造に対して量子化学計算を適用することで前記結晶の構造を最適化し、最適化された前記全体構造と前記局所構造とを組み合わせる、
ことを特徴とする結晶構造解析方法。
請求項１３に記載の結晶構造解析方法において、
ＮＭＲ測定によって前記結晶における原子Ｘと水素原子との双極子相互作用を測定することで、原子Ｘと水素原子との間の距離を測定し、
前記組み合わせにおいて、前記距離に基づいて前記全体構造における水素原子の位置を特定する、
ことを特徴とする結晶構造解析方法。
請求項１３に記載の結晶構造解析方法において、
ＮＭＲ測定によって前記結晶における原子Ｘと水素原子との相関測定を行い、
前記組み合わせにおいて、前記相関測定に基づいて、原子Ｘに水素原子が結合しているか否かを判断する、
ことを特徴とする結晶構造解析方法。
請求項１３から請求項１５のいずれか一項に記載の結晶構造解析方法において、
量子化学計算によって計算された前記結晶の化学シフトテンソル又は等方化学シフトと、ＮＭＲ測定によって得られた前記結晶の化学シフトテンソル又は等方化学シフトとを比較することで、前記全体構造を評価する、
ことを特徴とする結晶構造解析方法。