JP7082610B2 - ＡＳＧＲ１発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクトおよびその使用方法 - Google Patents

ＡＳＧＲ１発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクトおよびその使用方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／３８０，２１６号明細書の利益を主張するものであり、その出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を包含し、その配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年７月２５日に作成された、コンピュータ可読フォーマットの配列表のコピーは、名称がＡ－２０９４－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＴ２５であり、サイズが１．４９メガバイトである。
本発明は、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）の肝臓での発現を調節するための組成物および方法に関する。詳細には、本発明は、ＲＮＡ干渉を介してＡＳＧＲ１発現を低減するための核酸をベースにした治療薬、および心血管疾患を治療または予防するためにそのような核酸をベースにした治療薬を使用する方法に関する。
最近の数年にわたって出現した多くの進歩および新たな治療薬にもかかわらず、心血管疾患は、世界中で主要な死因のままである。米国では、成人の３人に１人は、冠動脈疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全および卒中を含む何らかの心血管疾患を有している（Ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ－２０１６ ｕｐｄａｔｅ：ａ ｒｅｐｏｒｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１３３：ｅ３８－ｅ３６０，２０１６）。２０１３年には、全世界で１７３０万人および米国で１４０万人が何らかの心血管疾患で死亡し、その年の全世界の死者の３１％および米国における全死者の５４％を占めた（Ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ－２０１６ ｕｐｄａｔｅ）。現在、心血管疾患は、毎年、次に主要な２つの死因である癌および慢性下気道疾患を合わせたものよりも多くの生命を奪っている（Ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ－２０１６ ｕｐｄａｔｅ）。したがって、心血管疾患の治療のためのさらなる治療薬の必要性が残っている。
アシアロ糖タンパク質受容体は、末端ガラクトースおよびＮ－アセチルガラクトサミン残基を有するリガンドに結合することにより、血清からの脱シアル化糖タンパク質の除去および分解に寄与する、肝細胞の表面に発現されるカルシウム依存性受容体である（Ｗｅｉｇｅｌ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，Ｖｏｌ．１６：５１９－５２４，１９９４；Ｓｔｏｃｋｅｒｔ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．７５：５９１－６０９，１９９５）。ヘテロオリゴマーのアシアロ糖タンパク質受容体は、４８ｋＤａのアシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）主サブユニットおよび４０ｋＤａのアシアロ糖タンパク質受容体２（ＡＳＧＲ２）副サブユニットの２つの異なるタンパク質で構成されている（例えば、Ｓｔｏｃｋｅｒｔ，１９９５を参照されたい）。アシアロ糖タンパク質受容体は、低密度リポタンパク質およびカイロミクロンレムナントのクリアランスに関与していることが示されており、これは、リポタンパク質代謝における受容体に関する役割を示唆している（Ｗｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，Ｖｏｌ．２７６（Ｐｔ １）：７９－８７，１９９１；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１：２２４２２－２２４２７，１９９６）。近年、アシアロ糖タンパク質受容体のＡＳＧＲ１サブユニットの機能欠損型バリアントアレルのヒト保因者は、非保因者と比べて非高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの血清レベルが低く、かつ冠動脈疾患および心筋梗塞のリスクが低いと報告された（Ｎｉｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３７４（２２）：２１３１－２１４１，２０１６）。したがって、ＡＳＧＲ１機能を標的とした治療薬は、非ＨＤＬコレステロールのレベルを低減し、かつ心血管疾患、特に冠動脈疾患を治療する新たな方策となる。
Ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ－２０１６ ｕｐｄａｔｅ：ａ ｒｅｐｏｒｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１３３：ｅ３８－ｅ３６０，２０１６ Ｗｅｉｇｅｌ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，Ｖｏｌ．１６：５１９－５２４，１９９４ Ｓｔｏｃｋｅｒｔ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．７５：５９１－６０９，１９９５ Ｗｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，Ｖｏｌ．２７６（Ｐｔ １）：７９－８７，１９９１ Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１：２２４２２－２２４２７，１９９６ Ｎｉｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３７４（２２）：２１３１－２１４１，２０１６
本発明は、ＡＳＧＲ１遺伝子を標的化し、かつ肝臓細胞におけるＡＳＧＲ１発現を低減するＲＮＡｉコンストラクトの設計および生成に部分的に基づく。ＡＳＧＲ１発現の配列特異的阻害は、心血管疾患などのＡＳＧＲ１発現と関連する病態を治療または予防するのに有用である。したがって、一実施形態では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、アンチセンス鎖は、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列と相補的な配列を有する領域を含む、ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。ある種の実施形態では、アンチセンス鎖は、表１、表６または表８に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するアンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。これらおよび他の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、約１５～３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つの平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。このようなヌクレオチドオーバーハングは、１～６個の不対ヌクレオチドを含み得、かつセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置し得る。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含み、かつセンス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リボース環、核酸塩基またはホスホジエステル骨格への修飾を有するヌクレオチドを含む１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－修飾ヌクレオチドを含む。このような２’－修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環性核酸（ＢＮＡ）またはこれらの組み合わせを含むことができる。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、ヌクレオチド間またはヌクレオシド間の修飾された結合などの少なくとも１つの骨格修飾を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’または５’末端に配置され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、表１、６または８に列記されるアンチセンス配列およびセンス配列からの配列を含むかまたはそれからなり得る。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表１～１０のいずれか１つに列記される二重鎖化合物のいずれか１つであり得る。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－１０９８、Ｄ－１１７６、Ｄ－１２００、Ｄ－１２０６、Ｄ－１２３５、Ｄ－１２４６、Ｄ－１３７３、Ｄ－１３８９、Ｄ－１８１３、Ｄ－１８１５、Ｄ－１９８３、Ｄ－２０００、Ｄ－２０４５、Ｄ－２１４２、Ｄ－２１４３、Ｄ－１４３８、Ｄ－１４９４、Ｄ－２３５７、Ｄ－２３５９、Ｄ－２３６１、Ｄ－２３６５、Ｄ－２４６１、Ｄ－３０３６、Ｄ－３０３７、Ｄ－３０５１、Ｄ－３０５３、Ｄ－３０５７、Ｄ－３７７９、Ｄ－３７８０、Ｄ－３７８２、Ｄ－３７８８、Ｄ－３７９１、Ｄ－３７９５、Ｄ－３７９９またはＤ－３８００である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－１２００、Ｄ－１２０６、Ｄ－１２３５、Ｄ－１８１５、Ｄ－２１４３、Ｄ－２３５９、Ｄ－２３６１、Ｄ－２３６５、Ｄ－２１４２、Ｄ－１１７６、Ｄ－３７７９、Ｄ－３７８２、Ｄ－３７８８、Ｄ－３７９９またはＤ－３８００である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－２３５９である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－１８１５である。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－１２３５である。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－２１４３である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－２３６１である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－３７８２である。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－３７９９である。
ＲＮＡｉコンストラクトは、肝臓細胞などの特定の組織または細胞へのＲＮＡｉコンストラクトの送達または取り込みを促進するリガンドをさらに含み得る。ある種の実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトの肝細胞への送達を標的化する。これらおよび他の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミンまたはＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含み得る。ある種の実施形態では、リガンドは、三価または四価のガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ部分などの多価ガラクトースまたは多価ＧａｌＮＡｃ部分を含む。リガンドは、必要に応じてリンカーを介して、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’または３’末端に共有結合的に結合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載の式Ｉ～ＸＸＩＸのいずれかによる構造を有するリガンドおよびリンカーを含む。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩ、式ＸＶＩ、式ＸＸＶＩまたは式ＸＸＩＸによる構造を有するリガンドおよびリンカーを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、式ＸＶＩ（式中、ｎ＝１およびｋ＝３である）による構造を有するリガンドおよびリンカーを含む。
ある種の実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み得る。ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’または３’末端は、抗体または抗原結合断片の軽鎖または重鎖におけるアミノ酸残基の側鎖を介して抗体または抗原結合断片に共有結合的に結合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、必要に応じてリンカーを介して、抗体またはその抗原結合断片の重鎖または軽鎖に存在するシステイン残基の側鎖に共有結合的に結合される。一実施形態では、抗ＡＳＧＲ１抗体－ＲＮＡ分子コンジュゲートは、干渉ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）の少なくとも１つのコピーを含む。別の実施形態では、抗ＡＳＧＲ１抗体－ＲＮＡ分子コンジュゲートは、干渉ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）の２つのコピーを含む。
本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトと、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤のいずれかとを含む医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、特に、ＡＳＧＲ１発現の低減を、それを必要とする患者の細胞（例えば、肝臓細胞）において行うのに有用である。本発明の医薬組成物を投与され得る患者は、心筋梗塞の病歴を有する患者、冠動脈疾患もしくは他の形態の心血管疾患と診断されるか、またはそのリスクを有する患者および非ＨＤＬコレステロールの上昇したレベルを有する患者を含むことができる。したがって、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトまたは医薬組成物を投与することにより、心血管疾患の治療または予防を、それを必要とする患者において行う方法を含む。ある種の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトまたは医薬組成物を投与することにより、非ＨＤＬコレステロールの低減を、それを必要とする患者において行う方法を提供する。
本明細書に記載の方法のいずれかにおけるまたは本明細書に記載の方法による投与のための医薬の調製のための、ＡＳＧＲ１を標的化するＲＮＡｉコンストラクトの使用が具体的に検討される。例えば、本発明は、冠動脈疾患または心筋梗塞を含む心血管疾患の治療または予防を、それを必要とする患者において行う方法における使用のための、ＡＳＧＲ１を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを含む。本発明は、非ＨＤＬコレステロールの低減を、それを必要とする患者において行う方法における使用のための、ＡＳＧＲ１を標的化するＲＮＡｉコンストラクトも含む。いくつかの実施形態では、本発明は、心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法における使用のための、ＡＳＧＲ１を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを提供する。
本発明は、冠動脈疾患または心筋梗塞を含む心血管疾患の治療または予防を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、ＡＳＧＲ１を標的化するＲＮＡｉコンストラクトの使用も包含する。ある種の実施形態では、本発明は、非ＨＤＬコレステロールの低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、ＡＳＧＲ１を標的化するＲＮＡｉコンストラクトの使用を提供する。ある種の他の実施形態では、本発明は、心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、ＡＳＧＲ１を標的化するＲＮＡｉコンストラクトの使用を提供する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖は、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列に対して相補的な配列を有する領域を含み、前記領域は、表１、表６または表８に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉコンストラクト。
（項目２）
前記センス鎖は、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成する前記アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む、項目１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目３）
前記二重鎖領域は、約１７～約２４塩基対長である、項目２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目４）
前記二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である、項目２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目５）
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、それぞれ約１５～約３０ヌクレオチド長である、項目２～４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目６）
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、それぞれ約１９～約２７ヌクレオチド長である、項目５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目７）
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、それぞれ約２１～約２５ヌクレオチド長である、項目５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目８）
少なくとも１つの平滑末端を含む、項目１～７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目９）
１～４個の不対ヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む、項目１～７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目１０）
前記ヌクレオチドオーバーハングは、２個の不対ヌクレオチドを有する、項目９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目１１）
前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の３’末端または前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む、項目９または１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目１２）
前記ヌクレオチドオーバーハングは、５’－ＵＵ－３’ジヌクレオチドまたは５’－ｄＴｄＴ－３’ジヌクレオチドを含む、項目９～１１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目１３）
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、項目１～１２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目１４）
前記修飾ヌクレオチドは、２’－修飾ヌクレオチドである、項目１３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目１５）
前記修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレ
オチド、二環性核酸（ＢＮＡ）またはこれらの組み合わせである、項目１３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目１６）
前記修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせである、項目１５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目１７）
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖中のヌクレオチドの全ては、修飾ヌクレオチドである、項目１３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目１８）
前記修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせである、項目１７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目１９）
少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目２０）
前記アンチセンス鎖の３’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、項目１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目２１）
前記アンチセンス鎖の３’末端および５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、かつ前記センス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、項目１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目２２）
前記アンチセンス鎖は、表１、表６または表８に列記される前記アンチセンス配列から選択される配列を含む、項目１～２１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目２３）
前記アンチセンス鎖は、配列番号１６０６、配列番号１６８４、配列番号１７０８、配列番号１７１４、配列番号１７４３、配列番号１７５４、配列番号１８８１、配列番号１８９７、配列番号２３２１、配列番号２３２３、配列番号２４９１、配列番号２５０８、配列番号２５５３、配列番号２６５０、配列番号２６５１、配列番号１９４６、配列番号２００２、配列番号２８６５、配列番号２８６７、配列番号２８６９、配列番号２８７３、配列番号２９６９、配列番号３７０１、配列番号３７０２、配列番号３７１６、配列番号３７１８、配列番号３７２２、配列番号４６１８、配列番号４６１９、配列番号４６２１、配列番号４６２７、配列番号４６３０、配列番号４６３４、配列番号４６３８または配列番号４６３９から選択される配列を含む、項目２２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目２４）
前記センス鎖は、表１、表６または表８に列記されるセンス配列から選択される配列を含む、項目２２または項目２３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目２５）
前記センス鎖は、配列番号１０３、配列番号１８１、配列番号２０５、配列番号２１１、配列番号２４０、配列番号２５１、配列番号３７８、配列番号３９４、配列番号８１８、配列番号８２０、配列番号９８８、配列番号１００５、配列番号１０５０、配列番号１１４７、配列番号１１４８、配列番号４４３、配列番号４９９、配列番号１３６２、配列番号１３６４、配列番号１３６６、配列番号１３７０、配列番号１４６６、配列番号３０５０、配列番号３０５１、配列番号３０６５、配列番号３０６７、配列番号３０７１、配列番号４４４３、配列番号４４４４、配列番号４４４６、配列番号４４５２、配列番号４４５５、配列番号４４５９、配列番号４４６３または配列番号４４６４から選択される配
列を含む、項目２４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目２６）
（ａ）前記センス鎖は、配列番号１８１の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号１６８４の配列を含むか、
（ｂ）前記センス鎖は、配列番号２０５の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号１７０８の配列を含むか、
（ｃ）前記センス鎖は、配列番号２１１の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号１７１４の配列を含むか、
（ｄ）前記センス鎖は、配列番号２４０の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号１７４３の配列を含むか、
（ｅ）前記センス鎖は、配列番号８２０の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号２３２３の配列を含むか、
（ｆ）前記センス鎖は、配列番号１１４７の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号２６５０の配列を含むか、
（ｇ）前記センス鎖は、配列番号１１４８の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号２６５１の配列を含むか、
（ｈ）前記センス鎖は、配列番号１３６４の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号２８６７の配列を含むか、
（ｉ）前記センス鎖は、配列番号１３６６の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号２８６９の配列を含むか、または
（ｊ）前記センス鎖は、配列番号１３７０の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号２８７３の配列を含む、項目２２～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目２７）
表１～１０のいずれか１つに列記される二重鎖化合物のいずれか１つである、項目１～２６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目２８）
Ｄ－１０９８、Ｄ－１１７６、Ｄ－１２００、Ｄ－１２０６、Ｄ－１２３５、Ｄ－１２４６、Ｄ－１３７３、Ｄ－１３８９、Ｄ－１８１３、Ｄ－１８１５、Ｄ－１９８３、Ｄ－２０００、Ｄ－２０４５、Ｄ－２１４２、Ｄ－２１４３、Ｄ－１４３８、Ｄ－１４９４、Ｄ－２３５７、Ｄ－２３５９、Ｄ－２３６１、Ｄ－２３６５、Ｄ－２４６１、Ｄ－３０３６、Ｄ－３０３７、Ｄ－３０５１、Ｄ－３０５３、Ｄ－３０５７、Ｄ－３７７９、Ｄ－３７８０、Ｄ－３７８２、Ｄ－３７８８、Ｄ－３７９１、Ｄ－３７９５、Ｄ－３７９９またはＤ－３８００である、項目２７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目２９）
Ｄ－１２００、Ｄ－１２０６、Ｄ－１２３５、Ｄ－１８１５、Ｄ－２１４３、Ｄ－２３５９、Ｄ－２３６１、Ｄ－２３６５、Ｄ－２１４２、Ｄ－１１７６、Ｄ－３７７９、Ｄ－３７８２、Ｄ－３７８８、Ｄ－３７９９またはＤ－３８００である、項目２８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目３０）
対照ＲＮＡｉコンストラクトとインキュベートされた肝臓細胞におけるＡＳＧＲ１発現レベルと比較して、前記ＲＮＡｉコンストラクトとのインキュベーション後の肝臓細胞におけるＡＳＧＲ１の発現レベルを低減する、項目１～２９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目３１）
前記肝臓細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞またはヒト初代肝細胞である、項目３０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目３２）
インビトロのＨｅｐ３Ｂ細胞において、５ｎＭでＡＳＧＲ１発現の少なくとも４５％を阻害する、項目１～２９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目３３）
約１０ｎＭ未満のＩＣ５０でＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＡＳＧＲ１発現を阻害する、項目１～２９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目３４）
約１ｎＭ未満のＩＣ５０でＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＡＳＧＲ１発現を阻害する、項目１～２９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目３５）
リガンドをさらに含む、項目１～３４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目３６）
前記リガンドは、コレステロール部分、ビタミン、ステロイド、胆汁酸、葉酸部分、脂肪酸、炭水化物、グリコシドまたは抗体もしくはその抗原結合断片を含む、項目３５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目３７）
前記リガンドは、前記ＲＮＡｉコンストラクトの肝細胞への送達を標的化する、項目３５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目３８）
前記リガンドは、ヒトＡＳＧＲ１に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、項目３７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目３９）
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、システインアミノ酸による少なくとも１つのアミノ酸の置換を含み、前記センス鎖は、前記システインアミノ酸の側鎖を介して前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に共有結合的に結合される、項目３８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目４０）
前記リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミンまたはＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む、項目３５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目４１）
前記リガンドは、多価ガラクトース部分または多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む、項目４０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目４２）
前記多価ガラクトース部分または前記多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分は、三価または四価である、項目４１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目４３）
前記リガンドは、必要に応じてリンカーを介して、前記センス鎖に共有結合的に結合される、項目３５～４２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目４４）
前記リガンドは、前記センス鎖の３’末端または５’末端に共有結合的に結合される、項目４３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目４５）
項目１～４４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトと、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物。
（項目４６）
ＡＳＧＲ１の発現の低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、項目１～４４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを前記患者に投与することを含む方法。
（項目４７）
肝細胞におけるＡＳＧＲ１の発現レベルは、前記ＲＮＡｉコンストラクトを受容していない患者のＡＳＧＲ１発現レベルと比較して、前記ＲＮＡｉコンストラクトの投与後の前記患者において低減される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記患者は、冠動脈疾患と診断されるか、または冠動脈疾患のリスクを有する、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記患者は、非ＨＤＬコレステロールの上昇したレベルを有する、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記患者は、心筋梗塞の病歴を有する、項目４６に記載の方法。
（項目５１）
非ＨＤＬコレステロールの低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、項目１～４４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを前記患者に投与することを含む方法。
（項目５２）
前記非ＨＤＬコレステロールは、ＬＤＬコレステロールである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
心血管疾患の治療または予防を、それを必要とする患者において行う方法であって、項目１～４４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを前記患者に投与することを含む方法。
（項目５４）
前記心血管疾患は、冠動脈疾患または心筋梗塞である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、項目１～４４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを前記患者に投与することを含む方法。
（項目５６）
前記患者は、冠動脈疾患と診断される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記患者は、非ＨＤＬコレステロールの上昇したレベルを有する、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
前記ＲＮＡｉコンストラクトは、非経口の投与経路を介して前記患者に投与される、項目４６～５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記非経口の投与経路は、静脈内または皮下である、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
非ＨＤＬコレステロールの低減を、それを必要とする患者において行う方法における使用のための、項目１～４４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目６１）
前記非ＨＤＬコレステロールは、ＬＤＬコレステロールである、項目６０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目６２）
心血管疾患の治療または予防を、それを必要とする患者において行う方法における使用のための、項目１～４４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目６３）
前記心血管疾患は、冠動脈疾患または心筋梗塞である、項目６２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目６４）
心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法における使用のための、項目１～４４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目６５）
前記患者は、冠動脈疾患と診断される、項目６４にＲＮＡｉコンストラクト。
（項目６６）
前記患者は、非ＨＤＬコレステロールの上昇したレベルを有する、項目６４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
（項目６７）
非ＨＤＬコレステロールの低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、項目１～４４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトの使用。
（項目６８）
前記非ＨＤＬコレステロールは、ＬＤＬコレステロールである、項目６７に記載の使用。
（項目６９）
心血管疾患の治療または予防を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、項目１～４４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトの使用。
（項目７０）
前記心血管疾患は、冠動脈疾患または心筋梗塞である、項目６９に記載の使用。
（項目７１）
心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、項目１～４４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトの使用。
（項目７２）
前記患者は、冠動脈疾患と診断される、項目７１に記載の使用。
（項目７３）
前記患者は、非ＨＤＬコレステロールの上昇したレベルを有する、項目７１に記載の使用。
ヒトＡＳＧＲ１の転写物バリアント１のヌクレオチド配列を示す（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１６７１．４；配列番号１）。転写物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として示される。 ヒトＡＳＧＲ１の転写物バリアント２のヌクレオチド配列を示す（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１１９７２１６．２；配列番号２）。転写物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えたｃＤＮＡ配列として示される。 マウスＡｓｇｒ１の転写物バリアント１のヌクレオチド配列を示す（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００９７１４．２；配列番号３０１１）。転写物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として示される。 ラットＡｓｇｒ１の転写物のヌクレオチド配列を示す（配列番号３０１２）。転写物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として示される。 マカク（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＡＳＧＲ１の転写物のヌクレオチド配列を示す（ＮＣＢＩ参照配列番号ＸＭ＿００５５８２６９８．１；配列番号３０１３）。転写物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として示される。 本発明のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかに組み込むことができる四価のＧａｌＮＡｃ部分のための合成スキームを示す。 ヒトＡＳＧＲ１をコードするＡＡＶを注射し、示されたＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの５ｍｇ／ｋｇの皮下注射で処理した、ＡＳＧＲ１ノックアウトマウスの肝臓におけるヒトＡＳＧＲ１の発現レベルの棒グラフである。ヒトＡＳＧＲ１発現をｑＰＣＲによって測定し、ヒトＡＳＧＲ１をコードするＡＡＶを注射したＡＳＧＲ１ノックアウト動物であったが、別の方法で処理されなかったＡＡＶのみの対照動物に対する発現レベルとして報告する。発現レベルをＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの投与後８日目（ｄ８）および１５日目（ｄ１５）で示す。野生型（ＷＴ）マウスおよびＡＳＧＲ１ノックアウト（ＫＯ）動物が対照として含まれた。 図６Ａで記載される動物からのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の血清レベルの棒グラフである。示されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの投与後８日目（ｄ８）および１５日目（ｄ１５）に血清を得た。 ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖の３’末端にブロモアセチルリンカーを付加する反応を示す概略図である。 抗ＡＳＧＲ１抗体にｓｉＲＮＡ二重鎖を結合するコンジュゲーション反応を示す概略図である。 ３５４９（ＲＮＡとＡｂとの比率は１である）および３５５０（ＲＮＡとＡｂとの比率は２である）抗ＡＳＧＲ１ ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートによって観察されるヒト初代肝細胞におけるＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ用量依存的なノックダウンを示す棒グラフである。非コンジュゲート抗ＡＳＧＲ１ ｃｙｓ ｍＡｂ（ＰＬ－５３５１５）を対照として使用した。 示された時点（２、４、８および１５日目）で測定された全ての用量群における野生型マウス由来の肝臓におけるＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされた同じｓｉＲＮＡ（化合物１４１８）を陽性対照として使用した。５ｍｐｋの１４１８におけるｓｉＲＮＡ量は、２つのｓｉＲＮＡ／ｍＡｂを有する３０ｍｐｋの３５５０化合物におけるｓｉＲＮＡ量と均等である。 示された時点（２、４、８および１５日目）で測定された全ての用量群における野生型マウス由来の肝臓におけるＡＳＧＲ１のタンパク質発現を示す線グラフである。ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされた同じｓｉＲＮＡ（化合物１４１８）を陽性対照として使用した。５ｍｐｋの１４１８におけるｓｉＲＮＡ量は、２つのｓｉＲＮＡ／ｍＡｂを有する３０ｍｐｋの３５５０化合物におけるｓｉＲＮＡ量と均等である。 示された時点（２、４、８および１５日目）で測定された全ての用量群における野生型マウス由来の血清アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を示す棒グラフである。ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされた同じｓｉＲＮＡ（化合物１４１８）を陽性対照として使用した。５ｍｐｋの１４１８におけるｓｉＲＮＡ量は、２つのｓｉＲＮＡ／ｍＡｂを有する３０ｍｐｋの３５５０化合物におけるｓｉＲＮＡ量と均等である。
本発明は、細胞または哺乳動物におけるアシアロ糖タンパク質受容体の発現を調節するための組成物および方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡを標的化し、かつ細胞または哺乳動物におけるＡＳＧＲ１発現を低減するＲＮＡｉコンストラクトを含む。このようなＲＮＡｉコンストラクトは、例えば、非ＨＤＬコレステロールの血清レベルを低減し、かつ冠動脈疾患または心筋梗塞を発症するリスクを低減することなどにより、様々な形態の心血管疾患を治療または予防するのに有用である。
本明細書で使用する場合、用語「ＲＮＡｉコンストラクト」は、細胞に導入された際にＲＮＡ干渉機構を介して標的遺伝子（例えば、ＡＳＧＲ１）の発現を下方制御することができるＲＮＡ分子を含む薬剤を指す。ＲＮＡ干渉は、核酸分子が、例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、配列特異的な様式で標的のＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡまたはｍＲＮＡ分子）の切断および分解を誘導するプロセスである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、互いに十分に相補的であり、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成する連続したヌクレオチドの２本の逆平行鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子を含む。「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」は、典型的には、２つのポリヌクレオチドにおける相補的な塩基間の水素結合（例えば、ワトソン－クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合）を介した相補的なポリヌクレオチドの対合を指す。標的配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）と実質的に相補的な配列を有する領域を含む鎖は、「アンチセンス鎖」と称される。「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む鎖を指す。いくつかの実施形態では、センス鎖は、標的配列と実質的に同一の配列を有する領域を含み得る。
二本鎖ＲＮＡ分子は、本明細書に記載のものまたは当技術分野で知られるものなど、リボース糖、塩基またはリボヌクレオチドの骨格構成要素に対する修飾を含む、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）で使用されるような任意のそのような修飾は、本開示の目的のための用語「二本鎖ＲＮＡ」によって包含される。
本明細書で使用する場合、生理的条件などのある種の条件下において、第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖領域を形成することができる場合、第１の配列は、第２の配列に「相補的」である。他のそのような条件は、当業者に知られる中程度のまたはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含むことができる。第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドとミスマッチすることなく１つまたは両方のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対形成する場合、第１の配列は、第２の配列と完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。配列が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％標的配列と相補的である場合、配列は、標的配列と「実質的に相補的」である。相補性パーセントは、第２の配列または標的配列の対応する位置の塩基と相補的な第１の配列の塩基の数を第１の配列の全体長で割ることによって計算することができる。２つの配列がハイブリダイズするとき、３０塩基対の二重鎖領域にわたって５、４、３または２個以下のミスマッチが存在する場合、配列は他方の配列に対して実質的に相補的であると言われ得る。一般に、本明細書に定義される任意のヌクレオチドオーバーハングが存在する場合、このようなオーバーハングの配列は、２つの配列間の相補性の程度の決定において考慮されない。例として、ハイブリダイズして、各鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する１９塩基対二重鎖領域を形成する、２１ヌクレオチド長のセンス鎖および２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖は、この用語が本明細書に使用される場合、完全に相補的であるとみなされる。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の領域は、標的ＲＮＡ配列（例えば、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ）の領域と完全に相補的な配列を含む。このような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と完全に相補的な配列を含み得る。他のこのような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と実質的に相補的な配列、例えばセンス鎖およびアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域に１、２、３、４または５個のミスマッチを有する配列を含み得る。ある種の実施形態では、任意のミスマッチが末端領域内（例えば、鎖の５’および／または３’末端の６、５、４、３または２ヌクレオチド以内）に生じることが好ましい。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖から形成される二重鎖領域における任意のミスマッチは、アンチセンス鎖の５’末端の６、５、４、３または２ヌクレオチド以内に生じる。
ある種の実施形態では、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するが、この領域を除いて繋がっていない２つの別々の分子であり得る。２つの別々の鎖から形成されるこのような二本鎖ＲＮＡ分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」または「短い干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）と称される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｉＲＮＡを含む。
他の実施形態では、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の一部であり得、すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の自己相補的領域の一部である。そのような場合、単一ＲＮＡ分子は、二重鎖領域（ステム領域とも称される）およびループ領域を含む。センス鎖の３’末端は、ループ領域を形成することになる不対ヌクレオチドの隣接配列によってアンチセンス鎖の５’末端に結合される。アンチセンス鎖がセンス鎖と塩基対形成して二重鎖またはステム領域を形成することができるように、ループ領域は、通常、ＲＮＡ分子がそれ自体で折り返すことを可能にする十分な長さのものである。ループ領域は、約３～約２５、約５～約１５または約８～約１２個の不対ヌクレオチドを含むことができる。少なくとも部分的に自己相補的な領域を有するこのようなＲＮＡ分子は、「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）と称される。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｈＲＮＡを含む。単一の少なくとも部分的に自己相補的なＲＮＡ分子の長さは、約３５ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約８５ヌクレオチドまたは約５０～約６０ヌクレオチドであり得、本明細書に列挙される長さをそれぞれ有する二重鎖領域およびループ領域を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＡＳＧＲ１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と実質的にまたは完全に相補的な配列を有する領域を含む。本明細書で使用する場合、「ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列」は、任意の種（例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒト）に由来するＡＳＧＲ１タンパク質のバリアントまたはアイソフォームを含むＡＳＧＲ１タンパク質をコードするスプライスバリアントを含む任意のメッセンジャーＲＮＡ配列を指す。ＡＳＧＲ１タンパク質（ＨＬ－１、ＡＳＧＰＲ Ｈ１、ＡＳＧＰＲ１およびＣＬＥＣ４Ｈ１としても知られる）は、本明細書で使用する場合、アシアロ糖タンパク質受容体の主サブユニットを指す。ヒトでは、ＡＳＧＲ１は、染色体１７ｐ１３．２上に見出され、約２９１アミノ酸の長いアイソフォーム（Ｈ１ａまたはアイソフォームＡ）および約２５２アミノ酸の短い可溶性アイソフォーム（Ｈ１ｂまたはアイソフォームＢ）の２つの異なるアイソフォームとして発現される。
ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列は、その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として発現される転写物配列も含む。ｃＤＮＡ配列は、ＲＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、ウラシルおよびシトシン）ではなく、ＤＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、チミンおよびシトシン）として表されるｍＲＮＡ転写物の配列を指す。したがって、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、標的ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列またはＡＳＧＲ１のｃＤＮＡ配列と実質的にまたは完全に相補的な配列を有する領域を含み得る。ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列のＮＭ＿００１６７１．４（ヒト；図１Ａ、配列番号１）、ＮＭ＿００１１９７２１６．２（ヒト；図１Ｂ、配列番号２）、ＮＭ＿００９７１４．２（マウス；図２、配列番号３０１１）およびＸＭ＿００５５８２６９８．１（カニクイザル；図４、配列番号３０１３）または図３のラット配列（配列番号３０１２）から選択される任意のＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列を含むことができるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列は、参照配列ＮＭ＿００１６７１．４（図１Ａ；配列番号１を参照されたい）としてＮＣＢＩデータベースに収載されるヒト転写物バリアント１である。別の実施形態では、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列は、参照配列ＮＭ＿００１１９７２１６．２（図１Ｂ；配列番号２を参照されたい）としてＮＣＢＩデータベースに収載されるヒト転写物バリアント２である。
アンチセンス鎖の領域は、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと実質的に相補的または完全に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖が相補性の領域を含むＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列の標的領域は、約１５～約３０個の連続したヌクレオチド、約１６～約２８個の連続したヌクレオチド、約１８～約２６個の連続したヌクレオチド、約１７～約２４個の連続したヌクレオチド、約１９～約２５個の連続したヌクレオチド、約１９～約２３個の連続したヌクレオチドまたは約１９～約２１個の連続したヌクレオチドの範囲であり得る。ある種の実施形態では、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列と実質的にまたは完全に相補的な配列を含むアンチセンス鎖の領域は、いくつかの実施形態では、表１、表６または表８に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、アンチセンス配列は、表１、表６または表８に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個または少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。例えば、いくつか実施形態では、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列と実質的にまたは完全に相補的な配列を含むアンチセンス鎖の領域は、配列番号１６０６、配列番号１６８４、配列番号１７０８、配列番号１７１４、配列番号１７４３、配列番号１７５４、配列番号１８８１、配列番号１８９７、配列番号２３２１、配列番号２３２３、配列番号２４９１、配列番号２５０８、配列番号２５５３、配列番号２６５０、配列番号２６５１、配列番号１９４６、配列番号２００２、配列番号２８６５、配列番号２８６７、配列番号２８６９、配列番号２８７３、配列番号２９６９、配列番号３７０１、配列番号３７０２、配列番号３７１６、配列番号３７１８、配列番号３７２２、配列番号４６１８、配列番号４６１９、配列番号４６２１、配列番号４６２７、配列番号４６３０、配列番号４６３４、配列番号４６３８または配列番号４６３９から選択される少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、通常、２本の鎖が生理的条件下でハイブリダイズして二重鎖領域を形成するようにアンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。「二重鎖領域」は、ワトソン－クリック塩基対合または他の水素結合相互作用のいずれかによって互いに塩基対形成して、２つのポリヌクレオチド間で二重鎖を生成する２つの相補的または実質的に相補的なポリヌクレオチドの領域を指す。ＲＮＡｉコンストラクトの二重鎖領域は、例えば、ダイサー酵素および／またはＲＩＳＣ複合体が結合することにより、ＲＮＡｉコンストラクトがＲＮＡ干渉経路に入ることを可能にする十分な長さのものであるべきである。例えば、いくつかの実施形態では、二重鎖領域は、約１５～約３０塩基対長である。この範囲内の二重鎖領域の他の長さ、例えば約１５～約２８塩基対、約１５～約２６塩基対、約１５～約２４塩基対、約１５～約２２塩基対、約１７～約２８塩基対、約１７～約２６塩基対、約１７～約２４塩基対、約１７～約２３塩基対、約１７～約２１塩基対、約１９～約２５塩基対、約１９～約２３塩基対または約１９～約２１塩基対も好適である。一実施形態では、二重鎖領域は、約１７～約２４塩基対長である。別の実施形態では、二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である。
センス鎖およびアンチセンス鎖が２種の別々の分子である（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含む）実施形態について、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二重鎖領域の長さと同じ長さである必要はない。例えば、一方または両方の鎖は、二重鎖領域よりも長いことができ、二重鎖領域に隣接している１個以上の不対ヌクレオチドまたはミスマッチを有し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドオーバーハング」は、鎖の末端における不対ヌクレオチドまたは二重鎖領域を越えて延在するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドオーバーハングは、通常、一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延在する場合または一方の鎖の５’末端が他方の鎖の３’末端を越えて延在する場合に生成される。ヌクレオチドオーバーハングの長さは、一般に、１～６ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～４ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～５ヌクレオチドまたは２～４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１、２、３、４、５または６ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１～４ヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、２ヌクレオチドを含む。オーバーハングにおけるヌクレオチドは、本明細書に記載されるようなリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、５’－ウリジン－ウリジン－３’（５’－Ｕ－Ｕ－３’）ジヌクレオチドを含む。このような実施形態では、ＵＵジヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、例えば２’－修飾ヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、オーバーハングは、５’－デオキシチミジン－デオキシチミジン－３’（５’－ｄＴｄＴ－３’）ジヌクレオチドを含む。
ヌクレオチドオーバーハングは、一方または両方の鎖の５’末端または３’末端に存在することができる。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の５’末端および３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端および３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトは、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の末端に単一ヌクレオチドオーバーハングを含み、かつ他の末端に平滑末端を含み得る。「平滑末端」は、分子の末端においてセンス鎖およびアンチセンス鎖が完全に塩基対形成しており、二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチドが存在しないことを意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、かつセンス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、かつアンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、二本鎖ＲＮＡ分子の両端に平滑末端を含む。このような実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、二重鎖領域は、センス鎖およびアンチセンス鎖と同じ長さである（すなわち、分子は、その全長にわたって二本鎖である）。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１５～約３０ヌクレオチド長、約１８～約２８ヌクレオチド長、約１９～約２７ヌクレオチド長、約１９～約２５ヌクレオチド長、約１９～約２３ヌクレオチド長、約２１～約２５ヌクレオチド長または約２１～約２３ヌクレオチド長であり得る。ある種の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４または約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトが２つのヌクレオチドオーバーハングを有するように、センス鎖およびアンチセンス鎖は、同じ長さを有するが、これらの鎖よりも短い二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖およびアンチセンス鎖、（ｉｉ）１９塩基対長である二重鎖領域ならびに（ｉｉｉ）センス鎖の３’端およびアンチセンス鎖の３’端の両方における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖およびアンチセンス鎖、（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域ならびに（ｉｉｉ）センス鎖の３’端およびアンチセンス鎖の３’端の両方における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、二本鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないように、センス鎖およびアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、その長さ全体にわたって二重鎖領域を形成する。このような一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖およびアンチセンス鎖ならびに（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域を含む。別のこのような実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖およびアンチセンス鎖ならびに（ｉｉ）２３塩基対長である二重鎖領域を含む。
他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトが少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含むように、センス鎖またはアンチセンス鎖は、他方の鎖よりも長く、この２つの鎖は、短い方の鎖の長さに等しい長さを有する二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）１９ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２１ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域および（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’端における２個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）２１ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２３ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域および（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’端における２個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、表１、表６または表８に列記されるアンチセンス配列、これらのアンチセンス配列のいずれかのヌクレオチド１～１９の配列またはこれらのアンチセンス配列のいずれかのヌクレオチド２～１９の配列のいずれか１つの配列を含むことができる。表１、表６または表８に列記されるアンチセンス配列の各々は、２ヌクレオチドのオーバーハング配列に加えて、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列と相補的な少なくとも１９個の連続したヌクレオチド（５’末端から数えて最初の１９個のヌクレオチド）の配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１５０８～３０１０、３６６５～４３１５または４５１３～４６８７のいずれか１つのヌクレオチド１～１９の配列を含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１５０８～３０１０、３６６５～４３１５または４５１３～４６８７のいずれか１つのヌクレオチド２～１９の配列を含む。さらに他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１５０８～３０１０、３６６５～４３１５または４５１３～４６８７から選択される配列を含む。ある種の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１６０６、配列番号１６８４、配列番号１７０８、配列番号１７１４、配列番号１７４３、配列番号１７５４、配列番号１８８１、配列番号１８９７、配列番号２３２１、配列番号２３２３、配列番号２４９１、配列番号２５０８、配列番号２５５３、配列番号２６５０、配列番号２６５１、配列番号１９４６、配列番号２００２、配列番号２８６５、配列番号２８６７、配列番号２８６９、配列番号２８７３、配列番号２９６９、配列番号３７０１、配列番号３７０２、配列番号３７１６、配列番号３７１８、配列番号３７２２、配列番号４６１８、配列番号４６１９、配列番号４６２１、配列番号４６２７、配列番号４６３０、配列番号４６３４、配列番号４６３８または配列番号４６３９から選択される配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１６８４、配列番号１７０８、配列番号１７１４、配列番号１７４３、配列番号２３２３、配列番号２６５０、配列番号２６５１、配列番号２８６７、配列番号２８６９、配列番号２８７３、配列番号４６１８、配列番号４６２１、配列番号４６２７、配列番号４６３８または配列番号４６３９から選択される配列を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１７４３、配列番号２３２３、配列番号２６５１、配列番号２８６７、配列番号２８６９、配列番号４６２１または配列番号４６３８を含むかまたはそれからなる。
これらおよび他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、表１、表６または表８に列記されるセンス配列、これらのセンス配列のいずれかのヌクレオチド１～１９の配列またはこれらのセンス配列のいずれかのヌクレオチド２～１９の配列のいずれか１つの配列を含むことができる。表１、表６または表８に列記されるセンス配列の各々は、２ヌクレオチドのオーバーハング配列に加えて、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列と同一かつ対応するアンチセンス配列と相補的な少なくとも１９個の連続したヌクレオチド（５’末端から数えて最初の１９個のヌクレオチド）の配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号５～１５０７、３０１４～３６６４または４３１９～４５１２のいずれか１つのヌクレオチド１～１９の配列を含む。他の実施形態では、センス鎖は、配列番号５～１５０７、３０１４～３６６４または４３１９～４５１２のいずれか１つのヌクレオチド２～１９の配列を含む。さらに他の実施形態では、センス鎖は、配列番号５～１５０７、３０１４～３６６４または４３１９～４５１２から選択される配列を含む。ある種の実施形態では、センス鎖は、配列番号１０３、配列番号１８１、配列番号２０５、配列番号２１１、配列番号２４０、配列番号２５１、配列番号３７８、配列番号３９４、配列番号８１８、配列番号８２０、配列番号９８８、配列番号１００５、配列番号１０５０、配列番号１１４７、配列番号１１４８、配列番号４４３、配列番号４９９、配列番号１３６２、配列番号１３６４、配列番号１３６６、配列番号１３７０、配列番号１４６６、配列番号３０５０、配列番号３０５１、配列番号３０６５、配列番号３０６７、配列番号３０７１、配列番号４４４３、配列番号４４４４、配列番号４４４６、配列番号４４５２、配列番号４４５５、配列番号４４５９、配列番号４４６３または配列番号４４６４から選択される配列を含むかまたはそれからなる。ある種の他の実施形態では、センス鎖は、配列番号１８１、配列番号２０５、配列番号２１１、配列番号２４０、配列番号８２０、配列番号１１４７、配列番号１１４８、配列番号１３６４、配列番号１３６６、配列番号１３７０、配列番号４４４３、配列番号４４４６、配列番号４４５２、配列番号４４６３または配列番号４４６４から選択される配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号２４０、配列番号８２０、配列番号１１４８、配列番号１３６４、配列番号１３６６、配列番号４４４６または配列番号４４６３を含むかまたはそれからなる。
本発明のある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号５～１５０７、３０１４～３６６４もしくは４３１９～４５１２、配列番号５～１５０７、３０１４～３６６４もしくは４３１９～４５１２のいずれか１つのヌクレオチド１～１９または配列番号５～１５０７、３０１４～３６６４もしくは４３１９～４５１２のいずれか１つのヌクレオチド２～１９から選択される配列を含むセンス鎖、および（ｉｉ）配列番号１５０８～３０１０、３６６５～４３１５もしくは４５１３～４６８７、配列番号１５０８～３０１０、３６６５～４３１５もしくは４５１３～４６８７のいずれか１つのヌクレオチド１～１９または配列番号１５０８～３０１０、３６６５～４３１５もしくは４５１３～４６８７のいずれか１つのヌクレオチド２～１９から選択される配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号１０３、配列番号１８１、配列番号２０５、配列番号２１１、配列番号２４０、配列番号２５１、配列番号３７８、配列番号３９４、配列番号８１８、配列番号８２０、配列番号９８８、配列番号１００５、配列番号１０５０、配列番号１１４７、配列番号１１４８、配列番号４４３、配列番号４９９、配列番号１３６２、配列番号１３６４、配列番号１３６６、配列番号１３７０、配列番号１４６６、配列番号３０５０、配列番号３０５１、配列番号３０６５、配列番号３０６７、配列番号３０７１、配列番号４４４３、配列番号４４４４、配列番号４４４６、配列番号４４５２、配列番号４４５５、配列番号４４５９、配列番号４４６３または配列番号４４６４から選択される配列を含むかまたはそれからなるセンス鎖、および（ｉｉ）配列番号１６０６、配列番号１６８４、配列番号１７０８、配列番号１７１４、配列番号１７４３、配列番号１７５４、配列番号１８８１、配列番号１８９７、配列番号２３２１、配列番号２３２３、配列番号２４９１、配列番号２５０８、配列番号２５５３、配列番号２６５０、配列番号２６５１、配列番号１９４６、配列番号２００２、配列番号２８６５、配列番号２８６７、配列番号２８６９、配列番号２８７３、配列番号２９６９、配列番号３７０１、配列番号３７０２、配列番号３７１６、配列番号３７１８、配列番号３７２２、配列番号４６１８、配列番号４６１９、配列番号４６２１、配列番号４６２７、配列番号４６３０、配列番号４６３４、配列番号４６３８または配列番号４６３９から選択される配列を含むかまたはそれからなるアンチセンス鎖を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号１８１、配列番号２０５、配列番号２１１、配列番号２４０、配列番号８２０、配列番号１１４７、配列番号１１４８、配列番号１３６４、配列番号１３６６、配列番号１３７０、配列番号４４４３、配列番号４４４６、配列番号４４５２、配列番号４４６３または配列番号４４６４から選択される配列を含むかまたはそれからなるセンス鎖、および（ｉｉ）配列番号１６８４、配列番号１７０８、配列番号１７１４、配列番号１７４３、配列番号２３２３、配列番号２６５０、配列番号２６５１、配列番号２８６７、配列番号２８６９、配列番号２８７３、配列番号４６１８、配列番号４６２１、配列番号４６２７、配列番号４６３８または配列番号４６３９から選択される配列を含むかまたはそれからなるアンチセンス鎖を含む。さらに他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号２４０、配列番号８２０、配列番号１１４８、配列番号１３６４、配列番号１３６６、配列番号４４４６または配列番号４４６３から選択される配列を含むかまたはそれからなるセンス鎖、および（ｉｉ）配列番号１７４３、配列番号２３２３、配列番号２６５１、配列番号２８６７、配列番号２８６９、配列番号４６２１または配列番号４６３８から選択される配列を含むかまたはそれからなるアンチセンス鎖を含む。
ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ａ）配列番号１８１の配列を含むセンス鎖および配列番号１６８４の配列を含むアンチセンス鎖、（ｂ）配列番号２０５の配列を含むセンス鎖および配列番号１７０８の配列を含むアンチセンス鎖、（ｃ）配列番号２１１の配列を含むセンス鎖および配列番号１７１４の配列を含むアンチセンス鎖、（ｄ）配列番号２４０の配列を含むセンス鎖および配列番号１７４３の配列を含むアンチセンス鎖、（ｅ）配列番号８２０の配列を含むセンス鎖および配列番号２３２３の配列を含むアンチセンス鎖、（ｆ）配列番号１１４７の配列を含むセンス鎖および配列番号２６５０の配列を含むアンチセンス鎖、（ｇ）配列番号１１４８の配列を含むセンス鎖および配列番号２６５１の配列を含むアンチセンス鎖、（ｈ）配列番号１３６４の配列を含むセンス鎖および配列番号２８６７の配列を含むアンチセンス鎖、（ｉ）配列番号１３６６の配列を含むセンス鎖および配列番号２８６９の配列を含むアンチセンス鎖または（ｊ）配列番号１３７０の配列を含むセンス鎖および配列番号２８７３の配列を含むアンチセンス鎖を含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、表１～１０に列記される二重鎖化合物（ヌクレオチド配列および／または化合物の化学修飾を含む）のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表１に列記される二重鎖化合物のいずれかである。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表６に列記される二重鎖化合物（ヌクレオチド配列および／または化合物の化学修飾を含む）のいずれかである。さらに他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表８に列記される二重鎖化合物（ヌクレオチド配列および／または化合物の化学修飾を含む）のいずれかである。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－１０９８、Ｄ－１１７６、Ｄ－１２００、Ｄ－１２０６、Ｄ－１２３５、Ｄ－１２４６、Ｄ－１３７３、Ｄ－１３８９、Ｄ－１８１３、Ｄ－１８１５、Ｄ－１９８３、Ｄ－２０００、Ｄ－２０４５、Ｄ－２１４２、Ｄ－２１４３、Ｄ－１４３８、Ｄ－１４９４、Ｄ－２３５７、Ｄ－２３５９、Ｄ－２３６１、Ｄ－２３６５、Ｄ－２４６１、Ｄ－３０３６、Ｄ－３０３７、Ｄ－３０５１、Ｄ－３０５３、Ｄ－３０５７、Ｄ－３７７９、Ｄ－３７８０、Ｄ－３７８２、Ｄ－３７８８、Ｄ－３７９１、Ｄ－３７９５、Ｄ－３７９９またはＤ－３８００である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－１２００、Ｄ－１２０６、Ｄ－１２３５、Ｄ－１８１５、Ｄ－２１４３、Ｄ－２３５９、Ｄ－２３６１、Ｄ－２３６５、Ｄ－２１４２、Ｄ－１１７６、Ｄ－３７７９、Ｄ－３７８２、Ｄ－３７８８、Ｄ－３７９９またはＤ－３８００である。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－１２３５である。別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－２１４３である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－２３６１である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－１８１５である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－２３５９である。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－３７８２である。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－３７９９である。
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列の特定の領域を標的化し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、配列番号１に記載のヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド６９２～７２１、配列番号１に記載のヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド６９２～７１６または配列番号１に記載のヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド６９２～７１０と実質的に相補的または完全に相補的な配列を含む。このような実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、この領域を標的化するアンチセンス鎖と実質的に相補的または完全に相補的なセンス鎖を含み得る。したがって、これらの実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド６９２～７２１、ヌクレオチド６９２～７１６またはヌクレオチド６９２～７１０と同一の配列を含み得る。
他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、配列番号１に記載のヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド３９６～４２５、配列番号１に記載のヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド３９６～４２０または配列番号１に記載のヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド３９６～４１４と実質的に相補的または完全に相補的な配列を含む。このような実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、この領域を標的化するアンチセンス鎖と実質的に相補的または完全に相補的なセンス鎖を含み得る。したがって、これらの実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド３９６～４２５、ヌクレオチド３９６～４２０またはヌクレオチド３９６～４１４と同一の配列を含み得る。
さらに他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、配列番号１に記載のヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド８８６～９１５、配列番号１に記載のヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド８８６～９１０または配列番号１に記載のヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド８８６～９０４と実質的に相補的または完全に相補的な配列を含む。このような実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、この領域を標的化するアンチセンス鎖と実質的に相補的または完全に相補的なセンス鎖を含み得る。したがって、これらの実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド８８６～９１５、ヌクレオチド８８６～９１０またはヌクレオチド８８６～９０４と同一の配列を含み得る。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環またはホスフェート基に対する１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。本明細書で使用する場合、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸およびシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチドならびにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸およびデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを包含しない。しかしながら、ＲＮＡｉコンストラクトは、修飾ヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子の一方または両方の鎖への修飾ヌクレオチドの組み込みは、例えば、ヌクレアーゼおよび他の分解プロセスに対する分子の感受性を低下させることにより、ＲＮＡ分子のインビボ安定性を向上させることができる。標的遺伝子の発現を低減するためのＲＮＡｉコンストラクトの効力を修飾ヌクレオチドの組み込みによって増強することもできる。
ある種の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。このような糖修飾は、ペントース環の２’および／または５’位における修飾ならびに二環性糖修飾を含むことができる。２’－修飾ヌクレオチドは、ＨまたはＯＨ以外の置換基を２’位に有するペントース環を有するヌクレオチドを指す。このような２’－修飾は、２’－Ｏ－アルキル（例えば、Ｏ－Ｃ１－Ｃ１０またはＯ－Ｃ１－Ｃ１０置換アルキル）、２’－Ｏ－アリル（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル（ＯＣＨ３）、２’－Ｏ－メトキシエチル（Ｏ－（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、２’－ＯＣＦ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、２’－Ｏ－アミノアルキル、２’－アミノ（例えば、ＮＨ２）、２’－Ｏ－エチルアミンおよび２’－アジドを含むが、これらに限定されない。ペントース環の５’位置における修飾は、５’－メチル（ＲまたはＳ）、５’－ビニルおよび５’－メトキシを含むが、これらに限定されない。
「二環性糖修飾」は、ペントース環の修飾を指し、この場合、架橋が環の２つの原子を接続して、二環性糖構造をもたらす第２の環を形成する。いくつかの実施形態では、二環性糖修飾は、ペントース環の４’および２’炭素間の架橋を含む。二環性糖修飾を有する糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書では二環性核酸またはＢＮＡと称する。例示的な二環性糖修飾は、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）二環性核酸（ＢＮＡ）；β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ（ロックド核酸またはＬＮＡとも称される）；エチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ；アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；オキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ；メチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束エチル（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ）またはｃＥｔとも称される）；メチレン－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ；メチレン－アミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；メチル炭素環式（４’－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－２’）ＢＮＡ；プロピレン炭素環式（４’－（ＣＨ２）３－２’）ＢＮＡ；およびメトキシ（エチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＭｅ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束ＭＯＥ（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ＭＯＥ）またはｃＭＯＥとも称される）を含むが、これらに限定されない。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるこれらおよび他の糖修飾ヌクレオチドは、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書およびＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環性核酸（ＢＮＡ）またはこれらの組み合わせを含む。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含む。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、センス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。ある種の他の実施形態では、センス鎖中の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。これらおよび他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖におけるアデノシンヌクレオチドの前にある全てのピリミジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。例えば、いずれかの鎖で配列５’－ＣＡ－３’または５’－ＵＡ－３’が現れる場合、シチジンおよびウリジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。ある種の実施形態では、センス鎖中の全てのピリミジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）であり、アンチセンス鎖において存在する全ての配列５’－ＣＡ－３’または５’－ＵＡ－３’の５’ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）である。他の実施形態では、二重鎖領域における全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。このような実施形態では、修飾ヌクレオチドは、好ましくは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせである。
ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであり得る。一実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシチミジンである。別の実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。例えば、いくつかの実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせである。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾されたヌクレオチド間結合も含み得る。本明細書で使用する場合、用語「修飾されたヌクレオチド間結合」は、元から存在する３’－５’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間の結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート（例えば、メチルホスホナート、３’－アルキレンホスホナート）、ホスフィナート、ホスホロアミダート（例えば、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダート）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートなどのリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、２’－５’ホスホジエステル結合である。他の実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、リン非含有ヌクレオチド間結合であり、したがって、修飾されたヌクレオシド間結合と称される場合もある。このようなリン非含有結合は、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン結合（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン結合；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル結合；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－）およびメチレンヒドラジノ結合；スルホナートおよびスルホンアミド結合；アミド結合；ならびに混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有する他のものを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、修飾されたヌクレオシド間結合は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；および同第５，７１９，２６２号明細書に記載されているものなど、ペプチド核酸またはＰＮＡを生成するためのペプチドに基づく結合（例えば、アミノエチルグリシン）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおいて使用され得る他の好適な修飾されたヌクレオチド間およびヌクレオシド間結合は、米国特許第６，６９３，１８７号明細書、同第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書ならびにＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖において存在し得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに他の実施形態では、両方の鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の３’末端、５’末端または３’末端および５’末端の両方に１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば、ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の３’末端に約１個～約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の５’末端に約１個～約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、かつアンチセンス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む（すなわちアンチセンス鎖の３’末端の第１および第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合）。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、かつセンス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、かつセンス鎖の３’末端および５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む（すなわちアンチセンス鎖の５’末端および３’末端の第１および第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、およびセンス鎖の５’末端および３’末端の第１および第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合）。一方または両方の鎖が１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む実施形態のいずれかにおいて、鎖内の残りのヌクレオチド間結合は、元から存在する３’－５’ホスホジエステル結合であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである。
ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング中の不対ヌクレオチドの２つ以上は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合され得る。ある種の実施形態では、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の３’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。他の実施形態では、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の５’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。さらに他の実施形態では、任意のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一方または両方の鎖に組み込まれる修飾ヌクレオチドは、核酸塩基（本明細書では「塩基」とも称される）の修飾を有する。「修飾核酸塩基」または「修飾塩基」は、天然に存在するプリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）以外の塩基を指す。修飾核酸塩基は、合成的な修飾または天然に存在する修飾であり得、かつユニバーサル塩基、５ーメチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン（Ｘ）、ヒポキサンチン（Ｉ）、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニンならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルならびに他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオ、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンを含むことができるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、修飾塩基は、ユニバーサル塩基である。「ユニバーサル塩基」は、結果として生じる二重鎖領域の二重らせん構造を変えることなく、ＲＮＡおよびＤＮＡの天然の塩基の全てと無差別に塩基対を形成する塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基は、当業者に知られており、イノシン、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチルおよび他の芳香族誘導体、アゾールカルボキサミドならびに３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドールおよび６－ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含むが、これらに限定されない。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる他の好適な修飾塩基は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１０：２９７－３１０，２０００およびＰｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７６：７２９５－７３００，２０１１に記載されているものを含み、これらの文献の両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。グアニン、シトシン、アデニン、チミンおよびウラシルは、上述の修飾核酸塩基などの他の核酸塩基により、そのような置換核酸塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの塩基対特性を実質的に変えることなく置換され得ることを当業者は十分に認識している。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、１つ以上の脱塩基ヌクレオチドを含み得る。「脱塩基ヌクレオチド」または「脱塩基ヌクレオシド」は、リボース糖の１’位で核酸塩基を欠いているヌクレオチドまたはヌクレオシドである。ある種の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端に組み込まれる。一実施形態では、センス鎖は、その３’末端、その５’末端またはその３’末端および５’末端の両方で末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、その３’末端、その５’末端またはその３’末端および５’末端の両方で末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む。脱塩基ヌクレオチドが末端ヌクレオチドであるこのような実施形態では、それは、天然の３’－５’ヌクレオチド間結合ではなく、３’－３’ヌクレオチド間結合（すなわち逆方向ヌクレオチド）を介して隣接ヌクレオチドと結合され得る。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトのいくつかの実施形態では、センス鎖、アンチセンス鎖またはアンチセンス鎖およびセンス鎖の両方の５’末端は、ホスフェート部分を含む。本明細書で使用する場合、用語「ホスフェート部分」は、非修飾ホスフェート（－Ｏ－Ｐ＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨ）および修飾ホスフェートを含む末端ホスフェート基を指す。修飾ホスフェートは、ＯおよびＯＨ基の１つ以上がＨ、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）またはアルキルで置換されており、ＲがＨ、アミノ保護基または非置換もしくは置換アルキルであるホスフェートを含む。例示的なホスフェート部分は、５’－モノホスフェート；５’－ジホスフェート；５’－トリホスフェート；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化もしくは非メチル化）；５’－アデノシンキャップまたは任意の他の修飾もしくは非修飾ヌクレオチドキャップ構造；５’－モノチオホスフェート（ホスホロチオエート）；５’－モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート）；５’－α－チオトリホスフェート；５’－γ－チオトリホスフェート；５’－ホスホロアミダート；５’－ビニルホスフェート；５’－アルキルホスホナート（例えば、アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど）；および５’－アルキルエーテルホスホナート（例えば、アルキルエーテル＝メトキシメチル、エトキシメチルなど）を含むが、これらに限定されない。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載の２つ以上の化学修飾を有し得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、リボース糖への修飾および核酸塩基への修飾を有し得る。例として、修飾ヌクレオチドは、２’糖修飾（例えば、２’－フルオロまたは２’－メチル）を含み得、修飾塩基（例えば、５－メチルシトシンまたはプソイドウラシル）を含み得る。他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれたとき、修飾されたヌクレオチド間またはヌクレオシド間結合を生成するであろう、５’ホスフェートへの修飾と組み合わされた糖修飾を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾または二環性糖修飾および５’ホスホロチオエート基などの糖修飾を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一方または両方の鎖は、２’修飾ヌクレオチドまたはＢＮＡおよびホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の鎖は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドおよびホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド間結合を含む例示的なＲＮＡｉコンストラクトを表６および８に示す。
好ましくは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、細胞内、特に肝臓細胞内でのＡＳＧＲ１発現を低減または阻害する。したがって、一実施形態では、本発明は、細胞を本明細書に記載の任意のＲＮＡｉコンストラクトと接触させることにより、細胞内でのＡＳＧＲ１発現を低減する方法を提供する。細胞は、インビトロまたはインビボにあり得る。ＡＳＧＲ１発現は、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ、ＡＳＧＲ１のタンパク質またはアルカリホスファターゼの血清レベルなどのＡＳＧＲ１発現と関連する別のバイオマーカーの量またはレベルを測定することによって評価することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞または動物におけるＡＳＧＲ１発現の低減は、ＲＮＡｉコンストラクトで処理されていないかまたは対照ＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞または動物におけるＡＳＧＲ１発現と比較して決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＳＧＲ１発現の低減は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された肝臓細胞におけるＡＳＧＲ１のｍＲＮＡの量またはレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝臓細胞において発現しないＲＮＡ分子またはナンセンスもしくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクトを対象とするＲＮＡｉ薬剤）またはコンストラクトなしで処理された肝臓細胞におけるＡＳＧＲ１のｍＲＮＡの量またはレベルを測定すること、および（ｃ）（ａ）において処理された細胞から測定されたＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルと、（ｂ）における対照細胞から測定されたＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルとを比較することによって評価される。比較前に、処理された細胞および対照細胞におけるＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルを対照遺伝子（例えば、１８ＳリボソームＲＮＡまたはハウスキーピング遺伝子）に対するＲＮＡレベルに正規化することができる。ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ドロップレットデジタルＰＣＲなどを含む様々な方法によって測定することができる。
他の実施形態では、ＡＳＧＲ１発現の低減は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された肝臓細胞におけるＡＳＧＲ１のタンパク質の量またはレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝臓細胞において発現しないＲＮＡ分子またはナンセンスもしくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクトを対象とするＲＮＡｉ薬剤）またはコンストラクトなしで処理された肝臓細胞におけるＡＳＧＲ１のタンパク質の量またはレベルを測定すること、および（ｃ）（ａ）において処理された細胞から測定されたＡＳＧＲ１のタンパク質レベルと、（ｂ）における対照細胞から測定されたＡＳＧＲ１のタンパク質レベルとを比較することによって評価される。ＡＳＧＲ１のタンパク質レベルを測定する方法は、当業者に知られており、ウエスタンブロット、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）およびフローサイトメトリーを含む。ＡＳＧＲ１のタンパク質発現を評価するための例示的なイムノアッセイに基づく方法を実施例２および７に記載する。実施例３では、ＲＮＡ ＦＩＳＨを用いるＡＳＧＲ１のｍＲＮＡを測定するための例示的な方法を記載し、実施例８では、ドロップレットデジタルＰＣＲを用いるＡＳＧＲ１のｍＲＮＡを評価するための例示的な方法を記載する。ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡまたはタンパク質を測定することができる任意の方法を使用して、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効性を評価することができる。
いくつかの実施形態では、ＡＳＧＲ１の発現レベルを評価するための方法は、自然にＡＳＧＲ１を発現する細胞（例えば、肝臓細胞）またはＡＳＧＲ１を発現するように操作された細胞においてインビトロで実施される。ある種の実施形態では、これらの方法は、肝臓細胞においてインビトロで実施される。好適な肝臓細胞は、初代肝細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類または齧歯類の肝細胞）、ＨｅｐＡＤ３８細胞、ＨｕＨ－６細胞、ＨｕＨ－７細胞、ＨｕＨ－５－２細胞、ＢＮＬＣＬ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞またはＨｅｐＧ２細胞を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、肝臓細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞である。別の実施形態では、肝臓細胞は、ヒト初代肝細胞である。
他の実施形態では、ＡＳＧＲ１の発現レベルを評価するための方法は、インビボで実施される。ＲＮＡｉコンストラクトおよび任意の対照ＲＮＡｉコンストラクトを動物（例えば、齧歯類または非ヒト霊長類）に投与することができ、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを、処理後の動物から採取した肝臓組織において評価することができる。代わりにまたは加えて、ＡＳＧＲ１発現と関連するバイオマーカーまたは機能的表現型を、処理された動物において評価することができる。例えば、上昇した血清アルカリホスファターゼレベルは、ＡＳＧＲ１遺伝子の機能欠損変異を有する個体における非ＨＤＬコレステロールの低下した血清レベルと相関する（Ｎｉｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３７４（２２）：２１３１－２１４１，２０１６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、アルカリホスファターゼまたは非ＨＤＬコレステロールの血清レベルを、本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された動物において測定して、ＡＳＧＲ１発現の低減の機能的有効性を評価することができる。これらの分析のための例示的な方法を実施例６、９および１０に記載する。
ある種の実施形態では、ＡＳＧＲ１の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝臓細胞において少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％低減する。いくつかの実施形態では、ＡＳＧＲ１の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝臓細胞において少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％低減する。他の実施形態では、ＡＳＧＲ１の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝臓細胞において約９０％以上、例えば約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上低減する。ＡＳＧＲ１発現の低減パーセントは、本明細書に記載の方法のいずれかおよび当技術分野で知られる他の方法によって測定することができる。例えば、ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのＨｅｐ３Ｂ細胞において５ｎＭでＡＳＧＲ１発現の少なくとも４５％を阻害する。関連する実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのＨｅｐ３Ｂ細胞において５ｎＭでＡＳＧＲ１発現の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％または少なくとも７５％を阻害する。他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのＨｅｐ３Ｂ細胞において５ｎＭでＡＳＧＲ１発現の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％または少なくとも９８％を阻害する。
いくつかの実施形態では、ＩＣ５０値を計算して、肝臓細胞におけるＡＳＧＲ１発現の阻害に対する本発明のＲＮＡｉコンストラクトの効力を評価する。「ＩＣ５０値」は、生物学的または生化学的機能の５０％阻害を達成するのに要求される用量／濃度である。任意の特定の物質またはアンタゴニストのＩＣ５０値を、用量反応曲線を作成すること、および任意のアッセイにおける発現レベルまたは機能活性に対する異なる濃度の物質またはアンタゴニストの効果を試験することによって決定することができる。最大の生物学的応答または本来の発現レベルの半分を阻害するのに必要とされる濃度を決定することにより、ＩＣ５０値を所与のアンタゴニストまたは物質について計算することができる。したがって、実施例に記載のイムノアッセイ、ＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイ、ｑＰＣＲまたはドロップレットデジタルＰＣＲなどの任意のアッセイにおいて、肝臓細胞における本来のＡＳＧＲ１の発現レベル（例えば、対照肝臓細胞におけるＡＳＧＲ１の発現レベル）の半分を阻害するのに必要とされるＲＮＡｉコンストラクトの濃度を決定することにより、任意のＲＮＡｉコンストラクトについてＩＣ５０値を計算することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満または約１ｎＭ未満のＩＣ５０で肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞）におけるＡＳＧＲ１発現を阻害し得る。例えば、ＲＮＡｉコンストラクトは、約０．５ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．８ｎＭ～約８ｎＭ、約１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．８ｎＭ～約３ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約０．５０ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約０．１ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約０．０１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．５０ｎＭ、約０．０２ｎＭ～約０．８０ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約１．０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約０．９ｎＭまたは約０．０５ｎＭ～約０．５ｎＭのＩＣ５０で肝臓細胞におけるＡＳＧＲ１発現を阻害する。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、約０．５ｎＭ～約５ｎＭのＩＣ５０で肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞）におけるＡＳＧＲ１発現を阻害する。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、約０．０１ｎＭ～約０．９ｎＭのＩＣ５０で肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞）におけるＡＳＧＲ１発現を阻害する。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、当技術分野で知られる手法、例えば従来の核酸固相合成を使用して容易に作製することができる。ＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチドは、標準のヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体（例えば、ホスホラミダイト）を利用する好適な核酸合成装置上で構築することができる。自動核酸合成装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ）のＭｅｒＭａｄｅ合成装置およびＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ合成装置を含め、いくつかのベンダーによって市販されている。
リボヌクレオシドの５’位で酸解離性ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）とともに２’シリル保護基を使用して、ホスホラミダイト化学を介してオリゴヌクレオチドを合成することができる。最終脱保護条件は、ＲＮＡ産物を著しく分解しないことが知られている。全ての合成は、大規模、中規模または小規模で任意の自動または手動合成装置において行うことができる。合成は、複数のウェルプレート、カラムまたはスライドガラスにおいて実行することもできる。
２’－Ｏ－シリル基は、フッ化物イオンへの曝露を介して除去することができ、フッ化物イオンは、フッ化物イオンの任意の供給源、例えば無機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化セシウムおよびフッ化カリウムまたは有機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウムを含むことができる。クラウンエーテル触媒は、脱保護反応において無機フッ化物と組み合わせて利用することができる。好ましいフッ化物イオン供給源は、フッ化テトラブチルアンモニウムまたはアミンヒドロフルオライド（例えば、双極性非プロトン溶媒、例えばジメチルホルムアミドにおいてトリエチルアミンと水性ＨＦとを組み合わせる）である。
亜リン酸トリエステルおよびホスホトリエステルに対して使用するための保護基の選択により、フッ化物に対するトリエステルの安定性を変えることができる。ホスホトリエステルまたは亜リン酸トリエステルのメチル保護は、フッ化物イオンに対する結合を安定化し、プロセス収率を向上させることができる。
リボヌクレオシドは、反応性の２’ヒドロキシル置換基を有するため、ＲＮＡにおける反応性の２’位を、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル保護基に対して直交性である保護基、例えば酸処理に対して安定であるもので保護することが望ましい場合がある。シリル保護基は、この条件を満たし、最小のＲＮＡ分解をもたらし得る最終のフッ化物脱保護ステップにおいて容易に除去することができる。
テトラゾール触媒は、標準的なホスホラミダイトカップリング反応において使用することができる。好ましい触媒は、例えば、テトラゾール、Ｓ－エチル－テトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、ｐ－ニトロフェニルテトラゾールを含む。
当業者によって理解され得るように、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを合成するさらなる方法は、当業者に明らかである。加えて、様々な合成ステップを代替の順番または順序で実施して所望の化合物を得ることができる。本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの合成において有用な他の合成化学転換、保護基（例えば、塩基に存在するヒドロキシル、アミノなどのための）および保護基の手法（保護および脱保護）は、当技術分野で知られており、例えばＲ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）ならびにそれらの後続版に記載のものなどを含む。ＲＮＡｉ薬剤のカスタム合成も、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、ＡｘｏＬａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含むいくつかの民間のベンダーから入手可能である。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リガンドを含み得る。本明細書で使用する場合、「リガンド」は、別の化合物または分子と直接的または間接的に相互作用することができる任意の化合物または分子を指す。別の化合物または分子とリガンドとの相互作用は、生物学的応答を誘発し得るか（例えば、シグナル伝達カスケードを惹起する、受容体媒介性のエンドサイトーシスを誘導する）、またはまさに物理的会合であり得る。リガンドは、結合する二本鎖ＲＮＡ分子の１つ以上の特性、例えばＲＮＡ分子の薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞内取り込み、電荷および／またはクリアランス特性を改変することができる。
リガンドは、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質、グロブリン）、コレステロール部分、ビタミン（ビオチン、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２）、葉酸部分、ステロイド、胆汁酸（例えば、コール酸）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンもしくはヒアルロン酸）、グリコシド、リン脂質または抗体もしくはその結合断片（例えば、肝臓などの特定の細胞型に対するＲＮＡｉコンストラクトを標的化する抗体もしくは結合断片）を含み得る。リガンドの他の例は、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばアダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、０３－（オレオイル）リトコール酸、０３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン）、ペプチド（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド）、アルキル化剤、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ポリアミノ酸およびポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン）を含む。
ある種の実施形態では、リガンドは、エンドソーム不安定化特性を有する。エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームの溶解および／または本発明のＲＮＡｉコンストラクトもしくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム不安定化リガンドは、ｐＨ依存性膜活性および膜融合性を示すポリカチオンペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。一実施形態では、エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性型コンフォメーションをとる。「活性型」コンフォメーションは、エンドソーム不安定化リガンドが、エンドソームの溶解および／または本発明のＲＮＡｉコンストラクトもしくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進するコンフォメーションである。例示的なエンドソーム不安定化リガンドは、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ． ２６：２９６４－２９７２，１９８７）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１８：１５８１－１５８６，１９９６）およびそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１５５９：５６－６８，２００２）を含む。一実施形態では、エンドソーム不安定化構成要素は、ｐＨの変化に応答して電荷またはプロトン化に変化を起こすことになる化学基（例えば、アミノ酸）を含有し得る。エンドソーム不安定化構成要素は、直鎖状または分枝状であり得る。
いくつかの実施形態では、リガンドは、脂質または他の疎水性分子を含む。一実施形態では、リガンドは、コレステロール部分または他のステロイドを含む。コレステロールコンジュゲート型オリゴヌクレオチドは、それらの非コンジュゲート型の対応物よりも活性であると報告されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２：１０３－２２８，２００２）。核酸分子へのコンジュゲーションのためのコレステロール部分および他の脂質を含むリガンドは、米国特許第７，８５１，６１５号明細書；同第７，７４５，６０８号明細書；および同第７，８３３，９９２号明細書にも記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、リガンドは、葉酸部分を含む。葉酸部分とコンジュゲートしたポリヌクレオチドは、受容体媒介性のエンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれ得る。このような葉酸－ポリヌクレオチドコンジュゲートは、米国特許第８，１８８，２４７号明細書に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＳＧＲ１がアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）の構成要素として肝臓細胞（例えば、肝細胞）の表面において発現されることを考慮すると、ある種の実施形態では、それらの肝臓細胞にＲＮＡｉコンストラクトを特異的に送達することが望ましい。したがって、ある種の実施形態では、リガンドは、以下でより詳細に記載するような様々な手段を用いるＲＮＡｉコンストラクトの肝臓細胞（例えば、肝細胞）への特異的な送達を標的化する。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表面に発現したＡＳＧＲ、ＡＳＧＲ１および／またはＡＳＧＲ２に結合するリガンドにより、肝臓細胞に標的化される。これらの実施形態では、ＡＳＧＲ１の発現は、以前に送達されたＲＮＡｉコンストラクトの効果に起因して低減されるため、この標的化する手段により、肝臓細胞に送達されるＲＮＡｉコンストラクトの量を低減する自己調節システムをもたらすことができると想定される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、肝臓細胞の表面に発現されるタンパク質と結合または相互作用するリガンドを採用することにより、肝臓に特異的に標的化され得る。例えば、ある種の実施形態では、リガンドは、アシアロ糖タンパク質受容体およびＬＤＬ受容体などの肝細胞で発現される受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその結合断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ））含み得る。特定の一実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１および／またはＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体またはその結合断片を含む。別の実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１および／またはＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片を含む。「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（すなわち軽鎖可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ））ならびに１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域および可変領域（ＶＨ）から構成される。別の実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１および／またはＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体の単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ断片）を含む。「ｓｃＦｖ断片」は、抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在し、必要に応じて、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨ領域とＶＬ領域との間のペプチドリンカーを含む。本発明のＲＮＡｉコンストラクトを肝臓に標的化するためのリガンドとして使用することができる、ＡＳＧＲ１に特異的に結合する例示的な抗体およびその結合断片は、米国特許出願第６２／２３４，５４６号明細書および国際公開第２０１７／０５８９４４号パンフレットに記載されており、その両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるリガンドとしての使用に好適である、ＡＳＧＲ１、ＬＤＬ受容体または他の肝臓の表面に発現されるタンパク質に特異的に結合する他の抗体またはその結合断片は、市販されている。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ｃｙｓモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合断片を含む。「ｃｙｓ ｍＡｂ」は、軽鎖もしくは重鎖の少なくとも１つのアミノ酸がシステインアミノ酸で置換されているか、または少なくとも１つのシステインアミノ酸が軽鎖もしくは重鎖の一次配列に挿入されているモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。システインアミノ酸の側鎖における遊離チオール基は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖が共有結合的に結合され得るコンジュゲーション部位を提供する。システイン置換／付加は、抗体または抗原結合断片の軽鎖または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に存在することができる。代わりにまたは加えて、システイン置換／付加は、システインン置換／付加が抗体または抗原結合断片のその標的（例えば、ＡＳＧＲ１）への結合親和性に影響を及ぼさない限り、軽鎖または重鎖の内部の部位に位置することができる。システイン残基で置換され得る抗体の重鎖および軽鎖内の例示的なアミノ酸は、国際公開第２００６／０３４４８８号パンフレットおよび国際公開第２００７／０２２０７０号パンフレットに記載されており、その両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある種の実施形態では、リガンドは、ヒトＡＳＧＲ１に特異的に結合するｃｙｓ ｍＡｂまたはその抗原結合断片を含む。例示的な抗ＡＳＧＲ１ ｃｙｓ ｍＡｂを実施例１０に記載する。一実施形態では、リガンドは、重鎖および軽鎖を有する抗ＡＳＧＲ１抗体を含み、重鎖は、配列番号４６９６の配列を含み、かつ軽鎖は、配列番号４６９７の配列を含む。抗ＡＳＧＲ１ ｃｙｓ ｍＡｂまたはその抗原結合断片は、必要に応じて本明細書に記載のリンカーのいずれかを介して本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’末端または３’末端に共有結合的に結合され得る。いくつかの実施形態では、抗ＡＳＧＲ１抗体－ＲＮＡ分子コンジュゲートは、干渉ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）の１つのコピーを含む（すなわち、抗体に対するＲＮＡｉの比率は、１である）。他の実施形態では、抗ＡＳＧＲ１抗体－ＲＮＡ分子コンジュゲートは、干渉ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）の２つのコピーを含む（すなわち、抗体に対するＲＮＡｉの比率は、２である）。
ある種の実施形態では、リガンドは、炭水化物を含む。「炭水化物」は、各炭素原子に結合される酸素、窒素または硫黄原子を伴う少なくとも６個の炭素原子（鎖状、分岐状または環状であり得る）を有する１つ以上の単糖単位で構成される化合物を指す。炭水化物は、糖（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖および約４、５、６、７、８または９個の単糖単位を含有するオリゴ糖）ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖類ガムなどの多糖を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ペントース、ヘキソースまたはヘプトースから選択される単糖ならびにこのような単糖単位を含む二糖および三糖である。他の実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンおよびＮ－アセチルグルコサミンなどのアミノ糖である。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ヘキソースまたはヘキソサミンを含む。ヘキソースは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコースまたはフルクトースから選択され得る。ヘキソサミンは、フルクトサミン、ガラクトサミン、グルコサミンまたはマンノサミンから選択され得る。ある種の実施形態では、リガンドは、グルコース、ガラクトース、ガラクトサミンまたはグルコサミンを含む。一実施形態では、リガンドは、グルコース、グルコサミンまたはＮ－アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミンまたはＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む。特定の実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンを含む。グルコース、ガラクトースおよびＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含むリガンドは、このようなリガンドが肝細胞の表面に発現されるＡＳＧＲに結合するため、化合物を肝臓細胞に標的化するのに特に有効である。例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ａｎｄ Ｄｅｖａｒａｊａｎ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ．２０３：１２６－１３９，２０１５を参照されたい。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるＧａｌＮＡｃまたはガラクトース含有リガンドの例は、米国特許第７，４９１，８０５号明細書；同第８，１０６，０２２号明細書；および同第８，８７７，９１７号明細書；米国特許出願公開第２００３０１３０１８６号明細書；ならびに国際公開第２０１３１６６１５５号パンフレットに記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある種の実施形態では、リガンドは、多価炭水化物部分を含む。本明細書で使用する場合、「多価炭水化物部分」は、独立して他の分子と結合または相互作用することができる２つ以上の炭水化物単位を含む部分を指す。例えば、多価炭水化物部分は、２つ以上の異なる分子または同じ分子の２つ以上の異なる部位に結合することができる炭水化物で構成される２つ以上の結合ドメインを含む。炭水化物部分の価数は、炭水化物部分内の個々の結合ドメインの数を意味する。例えば、炭水化物部分に関する用語「一価」、「二価」、「三価」および「四価」は、それぞれ１、２、３および４個の結合ドメインを有する炭水化物部分を指す。多価炭水化物部分は、多価ラクトース部分、多価ガラクトース部分、多価グルコース部分、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分、多価Ｎ－アセチル－グルコサミン部分、多価マンノース部分または多価フコース部分を含み得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース部分を含む。他の実施形態では、リガンドは、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む。これらおよび他の実施形態では、多価炭水化物部分は、二価、三価または四価である。このような実施形態では、多価炭水化物部分は、二分岐または三分岐であり得る。特定の一実施形態では、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分は、三価または四価である。別の特定の実施形態では、多価ガラクトース部分は、三価または四価である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトへの組み込みのための例示的な三価または四価のＧａｌＮＡｃ含有リガンドは、以下に詳述される。
リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのＲＮＡ分子に直接的または間接的に結合またはコンジュゲートされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖またはアンチセンス鎖に共有結合的に直接結合される。他の実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖またはアンチセンス鎖にリンカーを介して共有結合的に結合される。リガンドは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド（例えば、センス鎖もしくはアンチセンス鎖）の核酸塩基、糖部分またはヌクレオチド間結合に結合され得る。プリン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションまたは結合は、環内および環外の原子を含む任意の位置で起こり得る。ある種の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位または８位がリガンドに結合される。ピリミジン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションまたは結合も任意の位置で起こり得る。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位および６位がリガンドに結合され得る。ヌクレオチドの糖部分へのコンジュゲーションまたは結合は、任意の炭素原子で起こり得る。リガンドに結合され得る糖部分の例示的な炭素原子は、２’、３’および５’の炭素原子を含む。１’位も脱塩基残基においてなどでリガンドに結合され得る。ヌクレオチド間結合もリガンドの結合を促進する。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートなど）について、リガンドは、リン原子またはリン原子に結合したＯ、ＮもしくはＳ原子に直接結合され得る。アミンまたはアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）について、リガンドは、アミンもしくはアミドの窒素原子または隣接する炭素原子に結合され得る。
ある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの３’または５’末端に結合され得る。ある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端に共有結合的に結合される。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に共有結合的に結合される。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドに結合される。このようなある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’位で結合される。代替的な実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端近傍であるが、１つ以上の末端ヌクレオチドの前（すなわち１、２、３または４個の末端ヌクレオチドの前）に結合される。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの糖の２’位で結合される。
ある種の実施形態では、リガンドは、リンカーを介してセンス鎖またはアンチセンス鎖に結合される。「リンカー」は、リガンドをＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド構成要素に共有結合的に結合する原子または原子の基である。リンカーは、約１～約３０の原子長、約２～約２８の原子長、約３～約２６の原子長、約４～約２４の原子長、約６～約２０の原子長、約７～約２０の原子長、約８～約２０の原子長、約８～約１８の原子長、約１０～約１８の原子長および約１２～約１８の原子長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、通常、２個の官能基を有するアルキル部分を含む二官能性の結合部分を含み得る。官能基の一方が選択されて目的の化合物（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖またはアンチセンス鎖）に結合し、さらに他方が選択されて、本明細書に記載のようなリガンドなどの任意の選択された基に基本的に結合する。ある種の実施形態では、リンカーは、エチレングリコールまたはアミノ酸単位などの繰り返し単位の鎖構造またはオリゴマーを含む。二官能性結合部分において通常採用される官能基の例は、求核性基と反応するための求電子剤および求電子性基と反応するための求核剤を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二官能性結合部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、不飽和（例えば、二重結合または三重結合）などを含む。
リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖またはアンチセンス鎖に結合するために使用され得るリンカーは、ピロリジン、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート、６－アミノヘキサン酸、置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルケニルまたは置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルキニルを含むが、これらに限定されない。このようなリンカーのための好ましい置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルを含むが、これらに限定されない。
ある種の実施形態では、リンカーは、切断可能である。切断可能なリンカーは、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞内への進入後に切断されて、リンカーが一体に保持している２つの部分を放出するものである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、標的細胞中または第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣するか、またはそれに相当するように選択され得る）下において、対象の血液中または第２の参照条件（例えば、血液もしくは血清に見出される条件を模倣するか、またはそれに相当するように選択され得る）下よりも少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍もしくは９０倍以上または少なくとも１００倍速く切断される。
切断可能なリンカーは、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在に対して感受性である。一般に、切断剤は、血清または血液中よりも細胞内部において優勢であるかまたは高いレベルもしくは活性で見出される。このような分解性薬剤の例は、例えば、細胞内に存在して還元によって酸化還元切断可能なリンカーを分解することができる、メルカプタンなどの酸化酵素もしくは還元酵素または還元性薬剤を含む、特定の基質のために選択されるかまたは基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは酸性環境を作ることができる薬剤、例えば５以下のｐＨをもたらすもの；一般的な酸、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）およびホスファターゼとして作用することにより、酸切断可能なリンカーを加水分解または分解することができる酵素を含む。
切断可能なリンカーは、ｐＨに対して感受性のある部分を含み得る。ヒト血清のｐＨは、７．４であるが、平均的な細胞内ｐＨは、わずかにより低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、およそ５．０のさらにより酸性であるｐＨを有する。一部のリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な基を有し、それにより細胞内部または細胞の所望の区画内にリガンドからＲＮＡ分子を放出することになる。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な基の種類は、標的化される細胞に依存する場合がある。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してＲＮＡ分子に結合され得る。肝臓細胞は、エステラーゼに富んでおり、したがって、リンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型においてよりも肝臓細胞において効率的に切断されることになる。エステラーゼに富む他の種類の細胞は、肺、腎皮質および精巣を含む。ペプチド結合を含有するリンカーは、肝臓細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞を標的化する場合に使用され得る。
一般に、切断可能なリンカー候補の適合性は、リンカー候補を切断する分解性薬剤（または条件）の能力を試験することによって評価することができる。血液中または他の非標的組織と接触する場合の切断に抵抗する能力に関しても切断可能なリンカー候補を試験することが望ましい。したがって、標的細胞における切断を示すように選択される第１の条件と、他の組織または生体液、例えば血液または血清における切断を示すように選択される第２の条件との間で切断に対する相対的感受性を決定することができる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養、臓器もしくは組織培養または動物全体において実行することができる。無細胞または培養条件において初期評価を行い、動物全体におけるさらなる評価によって確認することが有用であり得る。いくつかの実施形態では、有用なリンカー候補は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）と比較して細胞（または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）において少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍または１００倍速く切断される。
他の実施形態では、酸化還元切断可能なリンカーが利用される。酸化還元切断可能なリンカーは、還元または酸化に際して切断される。還元的に切断可能な基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能なリンカー候補が、好適な「還元的に切断可能なリンカー」であるかどうか、または例えば特定のＲＮＡｉコンストラクトおよび特定のリガンドとともに使用するのに好適であるかどうかを判定するために、本明細書に記載の１つ以上の方法を使用することができる。例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または例えば標的細胞などの細胞中で観察されるであろう切断速度を模倣する当技術分野で知られる他の還元剤とともにインキュベーションすることにより、リンカー候補を評価することができる。リンカー候補は、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下でも評価することができる。特定の実施形態では、リンカー候補は、血液中において最大で１０％切断される。他の実施形態では、有用なリンカー候補は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）と比較して細胞（または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）において少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍または１００倍速く分解される。
さらに他の実施形態では、ホスフェート系の切断可能なリンカー候補は、ホスフェート基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でホスフェート基を加水分解する薬剤の一例は、細胞内におけるホスファターゼなどの酵素である。ホスフェート系の切断可能な基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－および－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－であり、ここで、Ｒｋは、水素またはアルキルであり得る。特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－および－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－を含む。別の特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらのリンカー候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
他の実施形態では、リンカーは、酸性条件下で切断される基である、酸切断可能な基を含み得る。いくつかの実施形態では、酸切断可能な基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境中において、または一般的な酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内において、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨオルガネラは、酸切断可能な基のための切断環境をもたらし得る。酸切断可能な連結基の例は、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルを含むが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏまたは－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。特定の実施形態は、エステルの酸素（アルコキシ基）に結合した炭素がアリール基、置換アルキル基またはジメチル、ペンチルもしくはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
他の実施形態では、リンカーは、細胞中のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断されるエステル系の切断可能な基を含み得る。エステル系の切断可能な基の例は、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルを含むが、これらに限定されない。エステル切断可能な基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらのリンカー候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
さらなる実施形態では、リンカーは、細胞中のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断されるペプチド系の切断可能な基を含み得る。ペプチド系の切断可能な基は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接するアミノ酸の側鎖である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
リガンド、特にＧａｌＮＡｃ部分を含むリガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖に結合するために採用することができる例示的なリンカーを下の式Ａ～Ｋに示す。
一実施形態では、リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖の３’末端に結合するためのリンカーは、以下の式Ａの構造を有し、式中、ｎは、１または２であり、Ｒは、リガンド（例えば、３～４個のＧａｌＮＡｃ単位を含有する部分）であり、かつＲ’は、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端である。
Figure 0007082610000001
別の実施形態では、リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖の３’末端に結合するためのリンカーは、以下の式Ｂの構造を有し、式中、ｎは、１、２または３であり、Ｒは、リガンド（例えば、３～４個のＧａｌＮＡｃ単位を含有する部分）であり、かつＲ’は、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端である。
Figure 0007082610000002
さらに別の実施形態では、リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖の３’末端に結合するためのリンカーは、以下の式Ｃの構造を有し、式中、ｎは、１または２であり、Ｒは、リガンド（例えば、３～４個のＧａｌＮＡｃ単位を含有する部分）であり、Ｒ’は、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端であり、かつＲ’’は、Ｈ、アルキル、官能性アルキルである。
Figure 0007082610000003
ある種の実施形態では、リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖の３’末端に結合するためのリンカーは、以下の式Ｄの構造を有し、式中、Ｒは、リガンド（例えば、３～４個のＧａｌＮＡｃ単位を含有する部分）であり、かつＲ’は、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端である。
Figure 0007082610000004
ある種の他の実施形態では、リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖の３’末端に結合するためのリンカーは、以下の式Ｅの構造を有し、式中、Ｒは、リガンド（例えば、３～４個のＧａｌＮＡｃ単位を含有する部分）であり、かつＲ’は、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端である。
Figure 0007082610000005
いくつかの実施形態では、リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖の３’末端に結合するためのリンカーは、以下の式Ｆの構造を有し、式中、Ｒは、リガンド（例えば、３～４個のＧａｌＮＡｃ単位を含有する部分）であり、かつＲ’は、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端である。
Figure 0007082610000006
他の実施形態では、リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖の３’末端に結合するためのリンカーは、以下の式Ｇの構造を有し、式中、Ｒは、リガンド（例えば、３～４個のＧａｌＮＡｃ単位を含有する部分）であり、かつＲ’は、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端である。
Figure 0007082610000007
ある種の他の実施形態では、リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖の３’末端に結合するためのリンカーは、以下の式Ｈの構造を有し、式中、Ｒは、リガンド（例えば、３～４個のＧａｌＮＡｃ単位を含有する部分）であり、かつＲ’は、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端である。
Figure 0007082610000008
いくつかの実施形態では、リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖の３’末端に結合するためのリンカーは、以下の式Ｊの構造を有し、式中、Ｒは、リガンド（例えば、３～４個のＧａｌＮＡｃ単位を含有する部分）であり、かつＲ’は、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端である。
Figure 0007082610000009
他の実施形態では、リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖の３’末端に結合するためのリンカーは、以下の式Ｋの構造を有し、式中、Ｒは、リガンド（例えば、３～４個のＧａｌＮＡｃ単位を含有する部分）であり、かつＲ’は、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端である。
Figure 0007082610000010
リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖またはアンチセンス鎖に結合するのに好適な他の種類のリンカーが当技術分野で知られており、米国特許第７，７２３，５０９号明細書；同第８，０１７，７６２号明細書；同第８，８２８，９５６号明細書；同第８，８７７，９１７号明細書；および同第９，１８１，５５１号明細書に記載されるリンカーを含むことができ、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖またはアンチセンス鎖に共有結合的に結合されるリガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分、例えば多価のＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、かつセンス鎖の３’末端に結合される。他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、かつセンス鎖の５’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、かつセンス鎖の３’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、かつセンス鎖の５’末端に結合される。本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおける二本鎖ＲＮＡ分子に結合することができる三価および四価のＧａｌＮＡｃ部分ならびにリンカーの例が以下の構造式Ｉ～ＸＸＩＸにおいて提供される。
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式Ｉの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１または２であり、ｊは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000011
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000012
さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の構造式ＩＩＩを有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１または２であり、ｊは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000013
さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＶの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１または２であり、ｊは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000014
さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式Ｖの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１または２であり、ｊは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000015
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１または２であり、ｊは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000016
特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000017
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩＩＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000018
ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＸの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000019
他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式Ｘの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000020
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000021
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＩＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000022
さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＩＩＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000023
ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＩＶの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000024
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＶの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000025
他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＶＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000026
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＶＩＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000027
ある種の他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＶＩＩＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000028
特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＩＸの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000029
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＸの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000030
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＸＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000031
ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＸＩＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000032
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＸＩＩＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000033
ある種の他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＸＩＶの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000034
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＸＶの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000035
ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＸＶＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000036
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＸＶＩＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～９であり、ｍは、１または２であり、かつリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000037
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＸＶＩＩＩの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
Figure 0007082610000038
特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＸＸＩＸの構造を有するリガンドおよびリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
Figure 0007082610000039
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ＲＮＡｉコンストラクトの細胞内発現をコードし、かつ制御するベクターを投与することにより、目的の細胞または組織に送達され得る。「ベクター」（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。多数のベクターが当技術分野で知られており、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。ベクターは、生細胞内で複製され得るかまたは合成的に作製され得る。
一般に、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを発現するためのベクターは、ＲＮＡｉコンストラクトをコードする配列に作動可能に連結された１つ以上のプロモーターを含むことになる。本明細書で使用する場合、語句「作動可能に連結」または「転写制御下」は、プロモーターが適切な位置およびポリヌクレオチド配列に対して適切な向きにあり、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチド配列の発現を制御することを意味する。「プロモーター」は、細胞の合成装置によって認識されるかまたは合成装置に導入され、特定の遺伝子配列の転写を開始するのに必要とされる配列を指す。好適なプロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、Ｈ１またはＵ６ ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＩおよびウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス末端の長い反復配列）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｈ１またはＵ６ ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＩプロモーターが好ましい。そのプロモーターは、組織特異的または誘導性プロモーターであり得る。特に興味深いのは、ヒトα１－アンチトリプシン遺伝子、アルブミン遺伝子、ヘモペキシン遺伝子および肝性リパーゼ遺伝子由来のプロモーター配列などの肝臓特異的なプロモーターである。誘導性プロモーターは、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリンおよびイソプロピル－Ｐ－Ｄ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって調節されるプロモーターを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含むいくつかの実施形態では、２つの別々の鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）は、単一のベクターまたは２つの別々のベクターから発現され得る。例えば、一実施形態では、センス鎖をコードする配列は、第１のベクターのプロモーターに作動可能に連結され、アンチセンス鎖をコードする配列は、第２のベクターのプロモーターに作動可能に連結される。このような実施形態では、第１および第２のベクターは、例えば、感染またはトランスフェクションによって標的細胞に同時に導入され、その結果、センス鎖およびアンチセンス鎖が転写されると、細胞内でハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ分子を形成することになる。別の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、単一のベクター中に配置される２つの別々のプロモーターから転写される。いくつかのこのような実施形態では、センス鎖をコードする配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され、アンチセンス鎖をコードする配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結され、第１および第２のプロモーターは、単一のベクター中に配置される。一実施形態では、ベクターは、ｓｉＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結される第１のプロモーターおよび逆方向の同じ配列に作動可能に連結される第２のプロモーターを含み、その結果、第１のプロモーターからの配列の転写がｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の合成をもたらし、第２のプロモーターからの配列の転写がｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の合成をもたらす。
ＲＮＡｉコンストラクトがｓｈＲＮＡを含む他の実施形態では、単一の少なくとも部分的に自己相補的ＲＮＡ分子をコードする配列は、単一の転写物を生成するプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡをコードする配列は、リンカーポリヌクレオチド配列によって結合される逆方向反復を含み、転写後にｓｈＲＮＡのステムおよびループ構造を生成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトをコードするベクターは、ウイルスベクターである。本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを発現するのに好適な様々なウイルスベクター系は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス）、アデノ随伴ウイルスベクター；単純ヘルペスウイルスベクター；ＳＶ４０ベクター；ポリオーマウイルスベクター；パピローマウイルスベクター；ピコルナウイルスベクター；およびポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス）を含むが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。
本発明における使用に好適な様々なベクター、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子をコードする核酸配列をベクターに挿入する方法およびベクターを目的の細胞に送達する方法は、当業者の技術の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．，Ｖｏｌ．２：３０１－３１０，１９９５；Ｅｇｌｉｔｉｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．６：６０８－６１４，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．，Ｖｏｌ．１：５－１４，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９２：２５－３０，１９９８；Ｒｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．３３：４０１－４０６，２００３；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９６：５５０－５５３，２００２； Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２：２４３－２４７，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：５００－５０５，２００２；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：４９７－５００，２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，Ｖｏｌ．１６：９４８－９５８，２００２；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：５０５－５０８，２００２；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９：５５１５－５５２０，２００２；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９：６０４７－６０５２，２００２を参照されたく、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトと、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物および製剤も含む。このような組成物および製剤は、ＡＳＧＲ１の発現の低減を、それを必要とする対象において行うのに有用である。臨床上の用途を考える場合、医薬組成物および製剤は、目的の用途に適切な形態で作製されることになる。一般に、これは、パイロジェンおよびヒトまたは動物に有害になる可能性のある他の不純物を本質的に含まない組成物を作製することを必然的に伴うことになる。
語句「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、動物またはヒトに投与される場合の有害なアレルギー性のまたは他の不都合な反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤」は、ヒトへの投与に好適な薬剤などの薬剤の製剤化における使用に許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で知られている。任意の従来の媒体または薬剤が本発明のＲＮＡｉコンストラクトと適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分は、それらが組成物のベクターまたはＲＮＡｉコンストラクトを不活性化しないという条件で組成物に組み込むこともできる。
医薬組成物の製剤の組成および方法は、投与経路、治療される疾患もしくは障害の種類および程度または投与される用量を含むがこれらに限定されない、いくつかの条件に依存する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、目的の送達経路に基づいて製剤化される。例えば、ある種の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達のために製剤化される。非経口の送達形態は、静脈内、動脈内、皮下、髄腔内、腹腔内または筋肉内の注射または注入を含む。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内送達のために製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、脂質ベースの送達ビヒクルを含み得る。別の実施形態では、医薬組成物は、皮下送達のために製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、標的化リガンド（例えば、本明細書に記載のＧａｌＮＡｃ含有または抗体含有リガンド）を含み得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、有効量の本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含む。「有効量」は、有利なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象の肝細胞におけるＡＳＧＲ１発現を低減するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、ＡＳＧＲ１発現を、例えばヒトヘテロ接合体における野生型ＡＳＧＲ１アレルの発現に相当するレベルまで部分的にのみ低減するのに十分な量であり得る。機能欠損型のＡＳＧＲ１バリアントアレルのヘテロ接合性ヒト保因者は、非保因者と比べて非ＨＤＬコレステロールの血清レベルが低く、かつ冠動脈疾患および心筋梗塞のリスクが低いと報告された（Ｎｉｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３７４（２２）：２１３１－２１４１，２０１６）。したがって、理論に束縛されることなく、ＡＳＧＲ１発現の部分的な低減は、有利な血清非ＨＤＬコレステロールの低減ならびに冠動脈疾患および心筋梗塞のリスクの低減を実現するのに十分であり得ると考えられる。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重～約７５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約２．５ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重または約５ｍｇ／ｋｇ体重～約１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの１回の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇであり得る。有効量のＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物は、毎週、隔週、毎月、３ヶ月毎または半年毎に投与され得る。有効な投与量および投与頻度であろうと考えられるものの正確な決定は、患者の大きさ、年齢および全身状態、治療される障害の種類（例えば、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患、高コレステロール血症）、採用される特定のＲＮＡｉコンストラクトならびに投与経路を含むいくつかの要因に基づき得る。本発明の任意の特定のＲＮＡｉコンストラクトについての有効用量およびインビボ半減期の推定値は、適切な動物モデルにおける従来の方法および／または試験を用いて確認することができる。
本発明の医薬組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の一般的な経路を介するものであり得る。このような経路は、非経口（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内）、経口、経鼻、頬側、皮内、経皮および舌下経路または肝臓組織への直接注射もしくは肝門脈を介する送達を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口で投与される。例えば、ある種の実施形態では、医薬組成物は、静脈内に投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、皮下に投与される。
水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系などのコロイド分散系は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトまたはそのようなコンストラクトをコードするベクターのための送達ビヒクルとして使用され得る。本発明の核酸を送達するのに好適な市販の脂肪エマルションは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ（Ｈｏｓｐｉｒａ）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ（Ｈｏｓｐｉｒａ）、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）および他の類似の脂質エマルションを含む。インビボにおける送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リポソーム内に封入され得るか、またはリポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成し得る。代わりに、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成し得る。好適な脂質およびリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））ならびにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））を含む。このようなコロイド分散系の調製および使用は、当技術分野でよく知られている。例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号明細書；米国特許第６，２１７，９００号明細書；米国特許第６，３８３，５１２号明細書；米国特許第５，７８３，５６５号明細書；米国特許第７，２０２，２２７号明細書；米国特許第６，３７９，９６５号明細書；米国特許第６，１２７，１７０号明細書；米国特許第５，８３７，５３３号明細書；米国特許第６，７４７，０１４号明細書；および国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットにも記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質製剤に完全に封入されて、例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰまたは他の核酸－脂質粒子を形成する。本明細書で使用する場合、用語「ＳＮＡＬＰ」は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸－脂質粒子を指す。本明細書で使用する場合、用語「ＳＰＬＰ」は、脂質小胞に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内注射後に長期間の循環寿命を示し、かつ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身投与のために極めて有用である。ＳＰＬＰは、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載の封入された縮合剤－核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」を含む。核酸－脂質粒子は、通常、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍまたは約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。加えて、核酸－脂質粒子中に存在する場合の核酸は、水溶液中においてヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸－脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号明細書；同第５，９８１，５０１号明細書；同第６，５３４，４８４号明細書；同第６，５８６，４１０号明細書；同第６，８１５，４３２号明細書；および国際公開第９６／４０９６４号パンフレットにおいて開示される。
注射用途に好適な医薬組成物は、例えば、滅菌水溶液または分散体および注射用滅菌溶液または分散体の即時調製のための滅菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は、滅菌済みであり、容易に注射可能である程度の流体である。調製物は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されているべきである。適切な溶媒または分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、好適なその混合物および植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散体の場合に必要とされる粒径の維持および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらすことができる。
注射用滅菌溶液は、活性化合物を適切な量で所望の任意の他の成分（例えば、上で列挙されたような）とともに溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散体は、塩基性分散媒体および所望の他の成分、例えば上で列挙された成分を含有する滅菌ビヒクルに滅菌された様々な活性成分を組み込むことによって調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分および任意の追加の所望の成分の粉末を予め滅菌濾過されたその溶液から生じさせる真空乾燥およびフリーズドライの手法を含む。
本発明の組成物は、一般に、中性または塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）に由来する酸付加塩（遊離アミノ基によって形成される）を含む。遊離カルボキシル基によって形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄）または有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することもできる。
水溶液における非経口投与のために、例えば、溶液は、通常、適切に緩衝化され、液体希釈剤は、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースにより最初に等張にされる。このような水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に使用され得る。好ましくは、特に本開示を考慮すれば、当業者に知られるような滅菌水性媒体が採用される。実例として、単回用量が等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解され、皮下注入液１０００ｍｌに添加されるか、または提案された注入部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８および１５７０－１５８０を参照されたい）。ヒトへの投与に関して、調製物は、ＦＤＡ標準が要件とする無菌性、発熱性、全般的安全性および純度標準を満たすべきである。ある種の実施形態では、本発明の医薬組成物は、滅菌生理食塩水および本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含むかまたはそれらからなる。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトおよび滅菌水（例えば、注射用水、ＷＦＩ）を含むかまたはそれらからなる。さらに他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトおよびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むかまたはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、投与用デバイスでパッケージ化されるかまたはその中に保存される。注射用製剤のためのデバイスは、注射ポート、プレフィルドシリンジ、自動注入装置、注射ポンプ、装着型注射器および注射ペンを含むが、これらに限定されない。エアロゾル化または粉末製剤のためのデバイスは、インヘラー、吸入器、吸引器などを含むが、これらに限定されない。したがって、本発明は、本明細書に記載の障害の１つ以上を治療または予防するための本発明の医薬組成物を含む投与デバイスを含む。
本発明は、ＡＳＧＲ１の発現の低減または阻害を、それを必要とする対象において行う方法、およびＡＳＧＲ１発現もしくは活性と関連する病態、疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。「ＡＳＧＲ１発現と関連する病態、疾患または障害」は、ＡＳＧＲ１の発現レベルが変化するか、またはＡＳＧＲ１の上昇した発現レベルがその病態、疾患または障害の増大した発症リスクと関連する病態、疾患または障害を指す。ＡＳＧＲ１発現と関連する病態、疾患または障害は、コレステロール、脂質、トリグリセリドなどの異常なレベルまたはこれらの分子のクリアランス障害をもたらす変化など、リポタンパク質代謝の異常な変化に起因する病態、疾患または障害も含むことができる。近年、アシアロ糖タンパク質受容体のＡＳＧＲ１サブユニットの機能欠損型バリアントアレルのヒト保因者は、非保因者と比べて非ＨＤＬコレステロールの血清レベルが低く、かつ冠動脈疾患および心筋梗塞のリスクが低いと報告された（Ｎｉｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３７４（２２）：２１３１－２１４１，２０１６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、心血管疾患（例えば、冠動脈疾患および心筋梗塞）ならびにコレステロール関連の障害（例えば、高コレステロール血症）の治療または予防に特に有用である。
本発明の方法に従って治療または予防することができるＡＳＧＲ１発現と関連する病態、疾患または障害は、心筋梗塞、心不全、卒中（虚血性および出血性）、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）、脆弱性プラーク、高コレステロール血症ならびに脂質異常症（例えば、上昇した総コレステロール、上昇した低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、上昇した超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、上昇したトリグリセリドおよび／または高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低いレベルが顕在化すること）などの心血管疾患を含むが、これらに限定されない。
ある種の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することを含む、ＡＳＧＲ１の発現の低減を、それを必要とする患者において行う方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「患者」は、ヒトを含む哺乳動物を指し、用語「対象」と互換的に使用することができる。好ましくは、患者の肝細胞におけるＡＳＧＲ１の発現レベルは、ＲＮＡｉコンストラクトを受容していない患者のＡＳＧＲ１の発現レベルと比較してＲＮＡｉコンストラクトの投与後に低減される。
いくつかの実施形態では、ＡＳＧＲ１発現の低減を必要とする患者は、心筋梗塞を有するリスクのある患者である。心筋梗塞を有するリスクのある患者は、心筋梗塞の病歴を有する患者であり得る（例えば、以前に心筋梗塞に罹患したことがある）。心筋梗塞を有するリスクのある患者は、心筋梗塞の家族性の病歴を有するか、または心筋梗塞の１つ以上のリスク因子を有する患者でもあり得る。このようなリスク因子は、高血圧、非ＨＤＬコレステロールの上昇したレベル、トリグリセリドの上昇したレベル、糖尿病、肥満症または自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、狼瘡）の病歴を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、心筋梗塞を有するリスクのある患者は、冠動脈疾患を有するか、または冠動脈疾患と診断される患者である。これらおよび他の患者における心筋梗塞のリスクは、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することによって低減することができる。したがって、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを患者に投与することを含む、心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法における使用のための、ＡＳＧＲ１を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを提供する。
ある種の実施形態では、ＡＳＧＲ１発現の低減を必要とする患者は、心血管疾患と診断されるか、または心血管疾患のリスクを有する患者である。したがって、本発明は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを投与することにより、心血管疾患の治療または予防を、それを必要とする患者において行う方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、心血管疾患の治療または予防を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、心血管疾患の治療または予防を、それを必要とする患者において行う方法における使用のための、ＡＳＧＲ１を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを提供する。心血管疾患は、心筋梗塞、心不全、卒中（虚血性および出血性）、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）および脆弱性プラークを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って治療または予防される心血管疾患は、冠動脈疾患である。他の実施形態では、本発明の方法に従って治療または予防される心血管疾患は、心筋梗塞である。ある種の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの投与は、非致死性の心筋梗塞、致死性および非致死性の卒中、特定の種類の心臓手術（例えば、血管形成、バイパス）、心不全のための入院、心疾患を有する患者の胸痛ならびに／または所定の心疾患（例えば、心筋梗塞の既往、心臓手術の既往および／もしくは動脈閉塞の徴候を有する胸痛）を有する患者における心血管イベントのリスクを低減する。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従った本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの投与は、再発性の心血管イベントのリスクを低減するために使用することができる。
ある種の他の実施形態では、ＡＳＧＲ１発現の低減を必要とする患者は、非ＨＤＬコレステロールの上昇したレベルを有する患者である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することにより、非ＨＤＬコレステロールの低減を、それを必要とする患者において行う方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、非ＨＤＬコレステロールの低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、非ＨＤＬコレステロールの低減を、それを必要とする患者において行う方法における使用のための、ＡＳＧＲ１を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを提供する。非ＨＤＬコレステロールは、ＬＤＬコレステロール、超低密度リポタンパク質、中間密度リポタンパク質、リポタンパク質（ａ）、カイロミクロンおよびカイロミクロンレムナントを含む全てのコレステロール含有のアテローム生成促進的なリポタンパク質の尺度である。非ＨＤＬコレステロールは、心血管リスクの優れた予測因子であると報告されている（Ｒａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｒｅｐ．，Ｖｏｌ．１４：１３０－１３４，２０１２）。非ＨＤＬコレステロールレベルは、総コレステロールレベルからＨＤＬコレステロールレベルを減算することによって計算することができる。一実施形態では、患者のＬＤＬコレステロールレベルは、ＲＮＡｉコンストラクトの投与後に低減される。別の実施形態では、患者のリポタンパク質（ａ）レベルは、ＲＮＡｉコンストラクトの投与後に低減される。
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って治療される患者は、非ＨＤＬコレステロールの上昇したレベル（例えば、非ＨＤＬコレステロールの上昇した血清レベル）を有する患者である。理想的には、非ＨＤＬコレステロールのレベルは、任意の所与の患者についてのＬＤＬコレステロールの目標値を上回る約３０ｍｇ／ｄＬであるべきである。特定の実施形態では、患者は、その患者が約１３０ｍｇ／ｄＬ以上の非ＨＤＬコレステロールレベルを有する場合、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。一実施形態では、患者は、その患者が約１６０ｍｇ／ｄＬ以上の非ＨＤＬコレステロールレベルを有する場合、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。別の実施形態では、患者は、その患者が約１９０ｍｇ／ｄＬ以上の非ＨＤＬコレステロールレベルを有する場合、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。さらに別の実施形態では、患者は、その患者が約２２０ｍｇ／ｄＬ以上の非ＨＤＬコレステロールレベルを有する場合、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。ある種の実施形態では、患者は、その患者が心血管リスクの評価についての２０１３ ＡＣＣ／ＡＨＡガイドライン（Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＣ／ＡＨＡ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｓｋ：ａ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１３；００：０００－０００）に従って高いかまたは極めて高い心血管疾患のリスクがあり、かつ約１００ｍｇ／ｄＬ以上の非ＨＤＬコレステロールレベルを有する場合、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、患者は、患者が心血管リスクの評価についての２０１３ ＡＣＣ／ＡＨＡガイドライン（本明細書では「２０１３ガイドライン」と称する）に従って中程度以上の心血管疾患のリスクがある場合、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、患者のＬＤＬコレステロールレベルが約１６０ｍｇ／ｄＬより高い場合、患者に投与される。他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、患者のＬＤＬコレステロールレベルが約１３０ｍｇ／ｄＬより高く、かつ患者が２０１３ガイドラインに従って中程度の心血管疾患のリスクを有する場合、患者に投与される。さらに他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、患者のＬＤＬコレステロールレベルが１００ｍｇ／ｄＬより高く、かつ患者が２０１３ガイドラインに従って極めて高い心血管疾患のリスクを有する場合、患者に投与される。
ある種の実施形態では、本発明の方法に従って治療される患者は、脆弱性プラーク（不安定プラークとも称される）を有する患者である。脆弱性プラークは、動脈壁の内皮裏層の下にあるマクロファージおよび主にコレステロールを含有する脂質の蓄積である。これらの脆弱性プラークは、破裂して、場合により動脈を通る血流を遮断し、心筋梗塞または卒中を引き起こす可能性がある血塊の形成をもたらす場合がある。脆弱性プラークは、血管内超音波およびコンピュータ断層撮影を含むがこれらに限定されない当技術分野で知られる方法によって同定することができる（Ｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２５：２０２６－２０３３，２００４；Ｂｕｄｈｏｆｆ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４８：３１９－３２１，２００６；Ｈａｕｓｌｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４８：３１２－３１８，２００６）。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、心血管疾患を治療または予防するための治療薬などの別の治療薬と組み合わせて投与される。一実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、単独でまたは患者が患う病態の治療に有用な他の薬剤と組み合わせて投与される。このような薬剤の例は、タンパク質性および非タンパク質性薬物の両方を含む。複数の治療薬が同時投与される場合、関連技術分野で認識されているように適宜用量が調整され得る。「同時投与」および併用療法は、同時投与に限定されないが、本発明のＲＮＡｉコンストラクトが、患者への少なくとも１つの他の治療薬の投与を含む治療の経過において少なくとも１回投与される治療レジメンも含む。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つの他の治療薬の投与前に投与される。他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つの他の治療薬の投与と同時に投与される。いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つの他の治療薬の投与後に投与される。
本発明の方法のある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、抗ｈＰＣＳＫ９抗体（例えば、Ｒｅｐａｔｈａ（登録商標）（エボロクマブ））などのＰＣＳＫ９アンタゴニストと組み合わせて患者に投与される。別の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つの他のコレステロール低減（血清および／または全身コレステロール）薬と組み合わせて患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＬＤＬＲの発現を増加させる薬剤は、血清ＨＤＬレベルを増加させるか、ＬＤＬレベルを低減するか、またはトリグリセリドレベルを低減することが観察された。例示的な薬剤は、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）、ニコチン酸（ナイアシン）（ＮＩＡＣＯＲ、ＮＩＡＳＰＡＮ（徐放ナイアシン）、ＳＬＯ－ＮＩＡＣＩＮ（徐放ナイアシン））；フィブリン酸（ＬＯＰＩＤ（ゲムフィブロジル）、ＴＲＩＣＯＲ（フェノフィブレート））、胆汁酸捕捉剤（ＱＵＥＳＴＲＡＮ（コレスチラミン）、コレセベラム（ＷＥＬＣＨＯＬ）、ＣＯＬＥＳＴＩＤ（コレスチポール））；コレステロール吸収阻害剤（ＺＥＴＩＡ（エゼチミブ））、ニコチン酸とスタチンとの組み合わせ（ＡＤＶＩＣＯＲ（ＬＯＶＡＳＴＡＴＩＮおよびＮＩＡＳＰＡＮ）、スタチンと吸収阻害剤との組み合わせ（ＶＹＴＯＲＩＮ（ＺＯＣＯＲおよびＺＥＴＩＡ）ならびに／または脂質修飾剤を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、ＰＰＡＲアルファ／ガンマアゴニスト、スクアレンシンターゼ阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤、降圧薬、抗糖尿病剤（スルホニル尿素、インスリン、ＧＬＰ－１アナログ、ＤＤＰＩＶ阻害剤など）、ＡｐｏＢ調節薬、ＭＴＰ阻害剤および／または閉塞性動脈硬化症治療と組み合わされる。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、スタチン、オンコスタチンＭのようなある種のサイトカイン、エストロゲンおよび／またはベルベリンなどのある種の薬草成分など、患者におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質のレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、患者における血清コレステロールレベルを増加させる薬剤（ある種の抗精神病剤（ａｎｔｉ－ｐｓｙｃｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、ある種のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、高フルクトース、スクロース、コレステロールまたはある種の脂肪酸などの食事性因子ならびにＲＸＲ、ＲＡＲ、ＬＸＲ、ＦＸＲに対するある種の核内受容体アゴニストおよびアンタゴニストなど）と組み合わされる。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、スタチンおよび／またはインスリンなど、対象におけるＰＣＳＫ９タンパク質のレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。このような実施形態におけるＲＮＡｉコンストラクトの投与は、ＲＮＡｉコンストラクトが、血清非ＨＤＬコレステロールの増加など、これらの他の薬剤の望ましくない副作用を軽減することを可能にする場合がある。
本明細書に開示される全てのリボ核酸配列は、配列中のウラシル塩基をチミン塩基で置換することにより、デオキシリボ核酸配列に変換することができることが理解される。同様に、本明細書に開示される全てのデオキシリボ核酸配列は、配列中のチミン塩基をウラシル塩基で置換することにより、リボ核酸配列に変換することができる。デオキシリボ核酸配列、リボ核酸配列ならびに本明細書に開示される全ての配列のデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの混合物を含有する配列が本発明に含まれる。
加えて、本明細書に開示される任意の核酸配列は、化学修飾の任意の組み合わせによって修飾され得る。当業者は、特定の場合、修飾ポリヌクレオチドを記載するための「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」のこのような指定が任意であることを容易に理解するであろう。例えば、リボース糖の２’－ＯＨ置換基およびチミン塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、修飾糖を有するＤＮＡ分子（ＤＮＡの天然の２’－Ｈについて２’－ＯＨ）または修飾塩基を有するＲＮＡ分子（ＲＮＡの天然のウラシルについてチミン（メチル化ウラシル））と記載され得る。
したがって、配列表のものを含むがこれらに限定されない本明細書に提供される核酸配列は、修飾核酸塩基を有するそのような核酸を含むが、これらに限定されない天然もしくは修飾ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの任意の組み合わせを含有する核酸を包含するように意図される。さらなる例として、限定するものではなく、配列「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」を有するポリヌクレオチドは、修飾または非修飾にかかわらず、ＲＮＡ塩基、例えば配列「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」を有するもの、ならびに「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」などのいくつかのＤＮＡ塩基およびＲＮＡ塩基を有するもの、ならびに「ＡＴｍｅＣＧＡＵＣＧ」などの他の修飾塩基を有するポリヌクレオチドを含むそのような化合物を含むが、これらに限定されないそのような配列を有する任意のポリヌクレオチドを包含し、配列中、ｍｅＣは、５位にメチル基を含むシトシン塩基を示す。
実施された実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１．ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ配列の選択および設計
ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）を標的化する治療用ｓｉＲＮＡ分子のための最適な配列の同定および選択は、２段階で進行した。最初の第１段階スクリーニングセットに含めるための候補配列を、ヒトＡＳＧＲ１について２つの選択的にスプライスされた転写物のバイオインフォマティクス分析を使用して同定した：より長いアイソフォームＡをコードする転写物バリアント１（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１６７１．４；図１Ａを参照されたい）およびより短いアイソフォームＢをコードする転写物バリアント２（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１１９７２１６．２；図１Ｂを参照されたい）。２つのヒトＡＳＧＲ１転写物配列を、内製のｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムを使用して分析し、それにより、１９塩基長配列内の特定の部位または領域に特定の塩基含有量を有する１９塩基長配列を同定する。配列は、マウス（ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００９７１４．２；図２を参照されたい）、ラット（図３）およびカニクイザル（ＮＣＢＩ参照番号ＸＭ＿００５５８２６９８．１；図４を参照されたい）におけるＡＳＧＲ１配列との同一性についても評価された。１９塩基長配列は、オフターゲット作用を予測するための他のヒト遺伝子配列との配列同一性および既知の１ヌクレオチド多型との重複についても評価された。バイオインフォマティクス分析の結果に基づいて２１１個の配列が第１段階スクリーニングセットに含まれた。ＵＵジヌクレオチドを、選択された１９塩基長のセンス配列およびアンチセンス配列の３’末端に付加して、１９塩基対の二重鎖領域および両方の鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有するｓｉＲＮＡ分子を生成した。
ｓｉＲＮＡ配列選択の第２段階は、バイオインフォマティクス分析の結果として排除された可能性のあるヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡを標的化する追加の活性ｓｉＲＮＡを同定することを目的とした。ヒトＡＳＧＲ１転写物バリアント１および２（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１６７１．４およびＮＭ＿００１１９７２１６．２；図１Ａおよび図１Ｂを参照されたい）由来の全ての重複している１９塩基長配列を抽出し、逆向きの相補するアンチセンス配列を設計した。第１段階に含まれなかった１２８４個の配列が第２段階の配列の一部として含まれた。第１段階の配列と同様に、第２段階の配列を、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端にＵＵジヌクレオチドを付加することによって２１塩基長に変換して、１９塩基対の二重鎖領域および各３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有するｓｉＲＮＡ分子を生成した。第２段階は、再合成および試験のために第１段階において同定された５５個の配列も含んだ。第１段階および第２段階を合わせたスクリーニングセットは、ヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ転写物全体にわたる１４９５個の１９塩基長配列を含んだ。ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列およびアンチセンス配列は、第１段階および第２段階のスクリーニングセットの両方ならびに転写物の末端領域を標的化する８個の追加のｓｉＲＮＡ分子を含み、これらは、下の表１に示される。ｓｉＲＮＡ分子の各々によって標的化されるヒトＡＳＧＲ１転写物の各々の部位も表１に列記される。
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実施例２．ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子のインビトロでの有効性
第１段階および第２段階のスクリーニングセットにおけるｓｉＲＮＡ分子を化学修飾せずに合成した。各ｓｉＲＮＡ分子は、ハイブリダイズして、各鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有して１９塩基対の二重鎖領域を形成する２１ヌクレオチドのセンス鎖および２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖で構成された。ＡＳＧＲ１発現の低減におけるｓｉＲＮＡ分子の各々の有効性を、Ｈｅｐ３ＢまたはＨｅｐＧ２細胞の細胞表面のＡＳＧＲ１タンパク質のレベルを定量する３８４ウェル形式のインビトロイムノアッセイを使用して評価した。
ＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ ３０－２００３）中のｓｉＲＮＡ分子およびＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のトランスフェクション複合体を製造業者の推奨に従って３８４ウェルプレートにおいて調製した。１０％ウシ胎仔血清および１％抗生物質／抗真菌薬を加えたＥＭＥＭ培地中のヒト肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６４）またはＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６５）細胞を各ウェルに添加した。細胞を３７℃および５％のＣＯ２で４日間インキュベートした。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４日後、細胞をホルムアルデヒドに固定し、ウシ血清アルブミンを遮断し、続いて抗ＡＳＧＲ１一次抗体（Ａｍｇｅｎクローン７Ｅ１１、下に提供される軽鎖および重鎖配列（配列番号３および４））を用いて室温で１時間または４℃で一晩のいずれかで染色した。プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。続いて、細胞を、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体および細胞数を評価するために含まれた核染色試薬ＤＲＡＱ５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃６２２５１）とともに室温で４５分間にわたり暗室下においてインキュベートした。ＰＢＳによる３回の洗浄後、プレートを、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントスクリーニングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって４８８および６４０チャネルを用いて画像化して、抗ＡＳＧＲ１抗体染色および核染色をそれぞれ測定した。データを、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ画像分析ソフトウェアおよびＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒソフトウェアを用いて分析して、ＡＳＧＲ１のタンパク質レベル、細胞数および細胞形態のいくつかの測定を各細胞および各ウェル基準で定量化した。
抗ＡＳＧＲ１一次抗体軽鎖アミノ酸配列：
Figure 0007082610000089
 抗ＡＳＧＲ１一次抗体重鎖アミノ酸配列：
Figure 0007082610000090
各ｓｉＲＮＡ分子の活性を、対照細胞集団におけるＡＳＧＲ１発現に対する細胞集団の分析に基づいてＡＳＧＲ１のタンパク質発現を定量化する「正規化されたＡｌｅｘａ ４８８平均強度」読み取り値を使用して測定した。非標的化ｓｉＲＮＡ二重鎖（すなわち、いずれのヒト遺伝子配列に対しても１００％の配列合致を有しないｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトされた細胞を各プレートにおいて対照として使用し、これらの対照細胞から「中心基準値」を計算した。具体的には、「中心基準値」は、非標的化ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を含有する複数のウェルのＡｌｅｘａ ４８８強度の中央値であった。「正規化されたＡｌｅｘａ ４８８平均強度」は、以下のように各ウェルについて計算された。核および細胞質を、ＤＲＡＱ５対比染色を使用して分割した。各細胞（すなわち細胞質および核を含む細胞領域全体）についてＡｌｅｘａ４８８の平均蛍光強度を測定した。個々の細胞の値を平均して、各ウェルについてＡｌｅｘａ ４８８の平均強度値を生成した。続いて、この平均強度値を中心基準値に対して正規化して、対照のパーセントとしてＡＳＧＲ１発現の測定値を表す「正規化されたＡｌｅｘａ ４８８平均強度」を得た。したがって、負の「正規化されたＡｌｅｘａ ４８８平均強度」値は、対照細胞に対して低減したＡＳＧＲ１発現を表す。ＤＲＡＱ５染色によって評価される細胞数も対照細胞の細胞数に対して正規化され、したがって対照のパーセントとして細胞生存率の測定値を表す。
第１段階のｓｉＲＮＡ分子をＨｅｐ３Ｂ細胞およびＨｅｐＧ２細胞の両方におけるインビトロイムノアッセイにおいて３つの異なる濃度（０．３ｎＭ、１．２５ｎＭおよび５ｎＭ）で二重に試験した。各ｓｉＲＮＡ分子について、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において非標的化ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞における発現に対するＡＳＧＲ１の細胞表面での発現の低減を下の表２に示す。細胞数の測定値も提供される。説明を明瞭にするために、最小濃度（０．３ｎＭ）に関するデータおよびＨｅｐＧ２細胞に関するデータは示さない。表２に示されるデータは、各ｓｉＲＮＡの２つの独立したトランスフェクション（例えば、実施１および実施２）からの結果である。
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第１段階で選別された２１１個の非修飾ｓｉＲＮＡ分子のうち、５ｎＭの濃度では、約１６８個のｓｉＲＮＡ分子が対照細胞に対してＡＳＧＲ１の細胞表面での発現を少なくとも３０％低減し、約１１９個のｓｉＲＮＡ分子が対照細胞に対してＡＳＧＲ１の細胞表面での発現を少なくとも５０％低減し、約３０個のｓｉＲＮＡ分子が対照細胞に対してＡＳＧＲ１の細胞表面での発現を少なくとも６０％低減した。一部のｓｉＲＮＡ分子は、対照細胞に対するＡＳＧＲ１の細胞表面での発現の低減を示さないかまたはわずかな低減を示した。
第１段階の分子の最初の選別に由来するｓｉＲＮＡ分子のサブセットをＨｅｐ３Ｂ細胞におけるインビトロ抗ＡＳＧＲ１イムノアッセイにおいて１０点の用量反応構成（０．００４ｎＭ～８３ｎＭ）のさらなる試験のために選択した。これらの５５個のｓｉＲＮＡ分子の各々についてのＩＣ５０値を用量反応曲線から計算し、下の表３に示した。各ｓｉＲＮＡ分子の２つの独立したトランスフェクション（実施１および実施２）からのデータを示す。これらのｓｉＲＮＡ分子の少なくとも１８個は、約０．３０ｎＭ以下のＩＣ５０値を有した。化合物Ｄ－１９８３、Ｄ－１０９８、Ｄ－１４３８、Ｄ－１２４６およびＤ－１４９４は、平均ＩＣ５０値が０．１５ｎＭ未満を有する最も効力のあるものに含まれた。
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ヒトＡＳＧＲ１転写物の５’および３’末端を標的化する８個のｓｉＲＮＡ分子を除く、第２段階のｓｉＲＮＡ分子の全てを２つの異なる濃度（１．２５ｎＭおよび５ｎＭ）でのＨｅｐ３Ｂ細胞におけるインビトロ抗ＡＳＧＲ１イムノアッセイにおいて試験した。各ｓｉＲＮＡ分子について、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において非標的化ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞における発現に対するＡＳＧＲ１の細胞表面での発現の低減を下の表４に示す。細胞数の測定値も提供される。
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第２段階の分子のスクリーニングアッセイからの結果は、５ｎＭで試験した場合、対照細胞に対してＡＳＧＲ１の細胞表面での発現を少なくとも５０％低減した追加の６６３個の効力のあるｓｉＲＮＡ分子を明らかにした。これらのｓｉＲＮＡ分子は、第１段階に含まれず、転写物配列のバイオインフォマティクス分析から同定されなかった。５ｎＭで試験した場合、これらの新たなｓｉＲＮＡ分子の少なくとも２６３個が対照細胞に対してＡＳＧＲ１の細胞表面での発現を少なくとも７０％低減し、少なくとも１４個のｓｉＲＮＡ分子が対照細胞に対してＡＳＧＲ１の細胞表面での発現を少なくとも８０％低減した。
実施例３．ＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイにおける選択したＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子の有効性
ＡＳＧＲ１発現をｍＲＮＡレベルで低減するＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子のサブグループの効力を評価するために、ＩＣ５０値をＡＳＧＲ１のＲＮＡの蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイにおいて各ｓｉＲＮＡについて決定した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６４）は、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １３３７８－１５０）を０．０３５μＬ／反応で使用してｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた。ヒトＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡを、３倍希釈で最終濃度０～８３．３ｎＭの範囲にわたる１０点の用量反応構成において試験した。対照ｓｉＲＮＡは、最終濃度５ｎＭで試験され、中立対照（正規化に使用される）：非標的化ＲｃｓＣ２（ＵＵＡＣＡＵＣＧＵＵＡＡＵＧＣＧＵＵＡ（配列番号４３１６）、阻害因子陽性対照：ヒトＡＳＧＲ１（ＡＣＵＵＣＡＣＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧＧＡ（配列番号４３１７）およびトランスフェクション対照：ヒトＥＩＦ４Ａ３（ＧＣＡＵＣＵＵＧＧＵＧＡＡＡＣＧＵＧＡ（配列番号４３１８）を含んだ。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｒｉｅｒ ＰＤＬコーティング３８４ウェルアッセイプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃６００７５８０）において１反応当たり２０００個の細胞でトランスフェクション複合体上に細胞を播種した。トランスフェクション時間は、９６時間であり、その後、細胞を、メタノールを含有しない最終濃度４％のホルムアルデヒドで固定した。固定の直後に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｖｉｅｗ ＲＮＡ ＨＣスクリーニングアッセイ用の製造業者のプロトコル内の保管または配送用細胞脱水プロトコルに従って細胞をエタノール中で脱水した。プレートを密閉し、－２０℃で保存した。
製造業者のプロトコルに従って細胞の水分を元の状態に戻し、メッセンジャーＲＮＡレベルを定量化するインサイチューハイブリダイゼーション方法であるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｖｉｅｗ ＲＮＡ ＨＣスクリーニングアッセイにおいて処理した。この例では、マルチプレックスアッセイにより、ヒトＡＳＧＲ１（ＮＭ＿００１６７１．４；配列番号１）、ヒトＡＳＧＲ２（ＮＭ＿００８０９１２．３またはＮＭ＿００１１８１．４）およびヒトＰＰＩＢ（ＮＭ＿０００９４２．４）を検出した。このアッセイは、ＱＧ ＶｉｅｗＲＮＡ ＨＣスクリーニングアッセイキットおよびＱＧ ＶｉｅｗＲＮＡ ＨＣスクリーニングシグナル増幅キット（３プレックス）（それぞれＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＱＶＰ００１１およびＱＶＰ０２１３）ならびにヒトＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２およびＰＰＩＢの検出用プローブセット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、それぞれＶＡ６－１９４０１－０１、カスタムのタイプ４プローブ、ＶＡ１－１０１４８－０１）を使用して実行された。各プローブセットを異なるフルオロフォアで標識した。消化ステップ用のプロテアーゼを最終濃度１：８０００で添加した。アッセイ後、核および細胞質を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核染色試薬およびＣｅｌｌ Ｍａｓｋ Ｂｌｕｅ試薬（それぞれ最終濃度１０ｎｇ／μＬおよび４ｎｇ／μＬのＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈ３５７０およびＨ３２７２０）を用いて対比染色した。プレートは、ＵＶチャネル（４８８チャネルではＰＰＩＢ／タイプ１、５５０チャネルではＡＳＧＲ２／タイプ４および６５０チャネルではＡＳＧＲ１／タイプ６）においてＨｏｅｃｈｓｔおよびＣｅｌｌ Ｍａｓｋ Ｂｌｕｅを読み取るＰｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＰｈｅｎｉｘ上で画像化された。画像取得およびデータ分析は、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＣｏｌｕｍｂｕｓソフトウェアパッケージにおいて遂行され、ウェルの正規化／ＩＣ５０値の生成は、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒにおいて遂行された。
アッセイの結果を表５に示す。ＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイにおいて決定されたＩＣ５０値は、実施例２に記載のＡＳＧＲ１のタンパク質レベルのためのイムノアッセイで決定されたものと相関している。しかし、試験した時点では、ＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイにおいて決定されたＩＣ５０値は、イムノアッセイで決定されたものよりも高い。
Figure 0007082610000118
実施例４．修飾ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子の設計および合成
ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子の効力およびインビボ安定性を向上させるために、マウスＡｓｇｒ１のｍＲＮＡおよびカニクイザルＡＳＧＲ１のｍＲＮＡとも配列相同性を有した第１段階選別由来の最も効力のあるＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子の５つを含む、第１段階および第２段階選別由来の最も効力のあるＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子のサブセットに化学修飾を組み込んだ。具体的には、リボース糖の２’－Ｏ－メチルおよび２’－フルオロ修飾をＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ内の特定の位置に組み込んだ。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合もアンチセンス配列および／またはセンス配列の末端に組み込んだ。下の表６は、修飾ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡの各々のセンス配列およびアンチセンス配列における修飾を示す。表６のヌクレオチド配列は、以下の表記法に従って列記される。Ａ、Ｕ、ＧおよびＣ＝対応するリボヌクレオチド；ｄＴ＝デオキシチミジン；ａ、ｕ、ｇおよびｃ＝対応する２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド；Ａｆ、Ｕｆ、ＧｆおよびＣｆ＝対応する２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）リボヌクレオチドである。配列中の「ｓ」の挿入は、２つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）によって結合されることを示す。特に指示がない限り、全ての他のヌクレオチドは、３’－５’ホスホジエステル基によって結合される。表６のｓｉＲＮＡ化合物の各々は、両方の鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する１９塩基対の二重鎖領域を含む。
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化学修飾ｓｉＲＮＡ配列の合成をＧＥ ＡＫＴＡ ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ １００上で実施した。
材料：
アセトニトリル（ＤＮＡ合成等級、ＡＸＯ１５２－２５０５、ＥＭＤ）
キャッピング試薬Ａ（アセトニトリル中の２０％Ｎ－メチルイミダゾール、ＢＩ０２２４－０５０５、ＥＭＤ、ロット番号５６０９０）
キャッピング試薬Ｂ１（アセトニトリル中の２０％無水酢酸、ＢＩ０３４７－０５０５、ＥＭＤ、ロット番号５５０１５）
キャッピング試薬Ｂ２（アセトニトリル中の３０％２，６－ルチジン、ＢＩ０３４９－０５０５、ＥＭＤ、ロット番号５５１７６）
キャッピング試薬Ｂ１およびＢ２を１：１（ｖ／ｖ）で合わせて混合した。
活性化剤（アセトニトリル中の０．３Ｍベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）、ＢＩ０１６６－１００５、ＥＭＤロット番号５５１０６、モレキュラーシーブ上）
脱トリチル化試薬（トルエン中の３％ジクロロ酢酸、ＢＩＯ８３２－２５０５、ＥＭＤ、ロット番号５５３１６）
酸化試薬（９０：１０のピリジン／水中の０．０５Ｍヨウ素、ＢＩＯ４２４－１００５、ＥＭＤ、ロット番号５４３２３）
ジエチルアミン溶液（アセトニトリル中の２０％ＤＥＡ、ＮＣ００１７－０５０５、ＥＭＤ、ロット番号５５２０２）
水酸化アンモニウム（高濃度、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）
チオール化試薬、５０：５０の２－メチルピリジン（ピコリン、Ａｌｄｒｉｃｈ）／Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ａｌｄｒｉｃｈ）中の０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド（ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）（ＰＡＤＳ、Ａｌｄｒｉｃｈ）
チミジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ならびにアデノシン、グアノシン、シトシンおよびウリジンの２’－Ｏ－メチルならびに２’－フルオロホスホラミダイト（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、約１０ｍＬのモレキュラーシーブ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）上のアセトニトリル中において０．１５Ｍ
プライマーサポート５Ｇ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ ３５０、ロット番号１０２３６１６１、３４３μｍｏｌ／ｇ、０．６０ｇ（２０６μｍｏｌ）またはＧａｌＮＡｃクラスターを伴うプライマーサポート５Ｇアミノ
合成：
試薬溶液、ホスホラミダイト溶液および溶媒を機器に接続した。固体支持体をカラム（６．３ｍＬ）に添加し、カラムを機器に取り付けた。カラムをアセトニトリルでフラッシングした。合成は、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアを使用して開始された。ホスホラミダイトおよび試薬溶液ラインをパージした。合成は、脱保護／カップリング／酸化／キャッピングの合成サイクルの反復によって行われた。固体支持体に脱トリチル化試薬を添加して５’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を除去した。固体支持体をアセトニトリルで洗浄した。支持体にホスホラミダイトおよび活性化剤溶液を添加し、その後、再循環して、入ってくるヌクレオチドを遊離の５’－ヒドロキシル基に結合した。支持体をアセトニトリルで洗浄した。支持体に酸化またはチオール化試薬を添加して亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステルまたはホスホロチオエートに変換した。支持体にキャッピング試薬ＡおよびＢを添加して任意の未反応オリゴヌクレオチド鎖を終端させた。支持体をアセトニトリルで洗浄した。最終反応サイクル後、レジンをジエチルアミン溶液で洗浄して２－シアノエチル保護基を除去した。支持体をアセトニトリルで洗浄した。
切断：
合成カラムを合成装置から取り外し、２０分間真空下で乾燥させた。カラムを開き、固体支持体を１００ｍＬのボトルに移した。固体支持体に４０ｍＬの高濃度水酸化アンモニウムを添加した。キャップをボトルに堅く取り付け、混合物を６５℃で一晩加熱した。ボトルを冷凍庫に移動し、フードにおいて開ける前に２０分間冷却した。混合物を６０ｍＬのフリットガラス漏斗に通して濾過した。ボトルおよび固体支持体を２０ｍＬの５０：５０のエタノール／水、次に４０ｍＬの水ですすいだ。
分析および精製：
合わせた濾液の一部を分析し、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。プールした画分をサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩し、イオン対逆相ＨＰＬＣによって分析した。プールした画分を凍結乾燥して白色の非晶質粉末を得た。
分析的アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）：
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００ＲＳ（４．６×５０ｍｍ、４μｍ）
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５
緩衝液Ｂ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５、１Ｍ臭化ナトリウム
流速：４０℃で１ｍＬ／分
勾配：６．２分で２０～６５％Ｂ
分取アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）：
カラム：Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫ Ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１×１５０ｍｍ、１３μｍ
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５
緩衝液Ｂ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５、１Ｍ臭化ナトリウム
流速：８ｍＬ／分
注入量：５ｍＬ
勾配：２０分にわたって３５～５５％Ｂ
分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）：
カラム：ＧＥ Ｈｉ－Ｐｒｅｐ ２６／１０
機器：ＧＥ ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ
緩衝液：２０％エタノール水溶液
流速：１０ｍＬ／分
注入量：試料負荷ポンプを用いて１５ｍＬ
イオン対逆相（ＩＰ－ＲＰ）ＨＰＬＣ：
カラム：Ｗａｔｅｒ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ ＯＳＴ Ｃ１８、２．５μｍ、２．１×５０ｍｍ
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：水中の１５．７ｍＭ ＤＩＥＡ、５０ｍＭ ＨＦＩＰ
緩衝液Ｂ：５０：５０の水／アセトニトリル中の１５．７ｍＭ ＤＩＥＡ、５０ｍＭ ＨＦＩＰ
流速：０．５ｍＬ／分
勾配：６分にわたって１０～３０％Ｂ
アニーリング：
少量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を個々のバイアル内に量り取った。バイアルにｓｉＲＮＡ再構成緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を添加して、乾燥重量を基準として約２ｍＭの濃度にした。実際の試料濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（ｓｓＤＮＡ、吸光係数＝３３μｇ／ＯＤ２６０）上で測定した。次に、２つの鎖を等モル比で混合し、試料を９０℃の水浴で３分間加熱し、室温までゆっくりと冷却した。試料をＡＥＸによって分析した。ＲＮＡ二重鎖は、単鎖よりも分析的ＡＥＸによる保持時間が長いことが観察された。二重鎖を登録し、インビトロ（実施例２および３に記載の方法を参照されたい）およびインビボ（実施例６に記載の方法を参照されたい）試験にかけた。
実施例５．ＧａｌＮＡｃ含有リガンドの合成
本実施例は、本発明のＲＮＡｉコンストラクト中の二本鎖ＲＮＡ分子にコンジュゲートされて、肝臓（例えば、肝細胞）によるＲＮＡｉコンストラクトの送達および取り込みを促進することができる四価のＧａｌＮＡｃ部分の合成について記載する。合成スキームを図５に示す。
レジン結合四分岐ＧａｌＮＡｃ
ステップ１：（Ｓ）－４－（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（トリチルオキシ）プロポキシ）－４－オキソブタン酸（１）
Figure 0007082610000136
 （Ｒ）－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（１－ヒドロキシ－３－（トリチルオキシ）プロパン－２－イル）カルバマート（２０ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（７．２０ｇ、７２ｍｍｏｌ）、ポリスチレン担持ＤＭＡＰ（３ｍｍｏｌ／ｇ、２４ｇ、７２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１０ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７２０ｍＬ）中に溶解させた。懸濁液を室温で１６時間撹拌した。反応をセライトに通して濾過し（ＰＳ－ｄｍａｐを除去するため）、濾塊をＤＣＭ（２００ｍＬ）ですすいだ。合わせた濾液を飽和ＮａＣｌ水溶液（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、さらに精製することなく次のステップで使用される粗製の標題化合物（２３．６ｇ、３６．０ｍｍｏｌ、収率１００％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６７８．２（Ｍ＋Ｎａ）。
ステップ２：
Figure 0007082610000137
 ５０ｍＬコニカルチューブにおいて活性ヘミコハク酸を以下のように調製した。（Ｓ）－４－（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（トリチルオキシ）プロポキシ）－４－オキソブタン酸（０．５ｇ、０．７６３ｍｍｏｌ）およびＴＡＴＵ（３４４ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＤＭＦ中に溶解させ、チューブを３分間旋回させた。ヒューニッヒ塩基（０．４００ｍＬ、２．２９ｍｍｏｌ）を添加した。その間に、レジン（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓのプライマーサポート５Ｇアミノ、０．４６ｍｍｏｌ／ｇ、１．６６ｇ、０．７６３ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬのＤＭＦが入った５０ｍＬファルコンチューブ中で膨潤させた。活性ヘミコハク酸溶液を添加した。チューブを室温において４００ｒｐｍで緩やかに振盪した。反応混合物を濾過し、続いてＤＣＭ（５０ｍＬ）、１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ（５０ｍＬ）、さらにＤＣＭ（５０ｍＬ）ですすぎ、真空下で乾燥させた。無水酢酸（５．６２５ｍＬ、５９ｍｍｏｌ）、ピリジン（１６．６５ｍＬ）およびトリエチルアミン（０．２２５ｍＬ）の溶液を添加することによってレジンをキャップし、室温において４００ｒｐｍで２時間振盪した。レジンを濾過し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）、１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ（５０ｍＬ）およびＤＣＭ（５０ｍＬ）ですすぎ、真空下で乾燥させて中間体２（２．５５ｇ、０．２５５ｍｍｏｌ／ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を得、これを次のステップでそのまま使用した。
ステップ３：
Figure 0007082610000138
 中間体２（２．５５ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）中の２０％４－メチルピペリジン溶液中で懸濁し、５分間撹拌した。溶液を排出し、この処理をさらに２回繰り返して脱保護された中間体を得た。ＤＭＦ（１０ｍＬ）中でＦｍｏｃ保護された６－アミノヘキサン酸（１．４１ｇ、４．０ｍｍｏｌ）およびＴＡＴＵ（１．２８８ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を溶解させることにより、Ｆｍｏｃ保護された６－アミノヘキサン酸の活性溶液を作製した。５分後、ヒューニッヒ塩基（１．０５ｍＬ、６．０５ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を脱保護されたレジンに添加した。混合物を室温において４００ｒｐｍで一晩振盪した。反応を濾過し、レジンをＤＭＦ（３×３０ｍＬ）で洗浄した。同じ手順（脱保護、活性酸の調製およびカップリング）を繰り返して粗製の中間体３（２．４０ｇ、０．１８４ｍｍｏｌ／ｇ、０．４４２ｍｍｏｌ）を得、これを次のステップで使用した。
ステップ４：
Figure 0007082610000139
 中間体３をＤＭＦ（１５ｍＬ）中の２０％４－メチルピペリジン溶液中で懸濁し、５分間撹拌した。溶液を排出し、この処理をさらに２回繰り返して脱保護された中間体を得た。ＤＭＦ（１０ｍＬ）中でビス－Ｆｍｏｃ保護されたリジン（２．０７ｇ、３．５ｍｍｏｌ）およびＴＡＴＵ（１．１３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を溶解させ、５分間撹拌することにより、ビス－Ｆｍｏｃ保護されたリジンの活性溶液を調製した。ヒューニッヒ塩基（０．９６ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を脱保護されたレジンに添加した。懸濁液を室温において４００ｒｐｍで一晩振盪した。反応混合物を濾過し、続いてレジンをＤＭＦ（３×３０ｍＬ）で洗浄した。上記の手順を用いてレジンを脱保護した。ビス－Ｆｍｏｃ保護されたリジンの活性溶液を上記のように調製したが、ただし、ビス－Ｆｍｏｃ保護されたリジンの量は、２．９６ｇ（５．０ｍｍｏｌ）であり、ＴＡＴＵの量は、１．６１ｇ（５．０ｍｍｏｌ）であり、ヒューニッヒ塩基の量は、１．３１ｍＬ（７．５ｍｍｏｌ）であり、室温において４００ｒｐｍで一晩振盪することにより、脱保護されたレジンを活性酸に結合した。レジンをＤＭＦ（３×３０ｍＬ）、続いてＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて粗製の中間体４（２．２８ｇ、０．１６５ｍｍｏｌ／ｇ、０．３７６ｍｍｏｌ）を得た。
ステップ５：
Figure 0007082610000140
 中間体４（０．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍＬ）中の２０％４－メチルピペリジン溶液中で懸濁し、５分間撹拌した。溶液を排出し、この処理をさらに１回繰り返して脱保護された中間体を得た。ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の５－（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ペンタン酸（５、２．６８ｇ、６ｍｍｏｌ）溶液にＴＡＴＵ（１．９２ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を５分間撹拌した。ヒューニッヒ塩基（１．５７ｍＬ、９．０ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、続いて混合物を脱保護された中間体に添加した。懸濁液を室温で一晩保ち、溶媒を排出した。レジンをＤＭＦ（３×３０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で洗浄した。レジンを５％ＴＩＰＳ（２５ｍＬ）とともにＴｏｌ中の３％ジクロロ酢酸で処理し、５分後に溶媒を排出した。この処理をさらに２回繰り返して中間体６を得、これを次のステップで直接使用した（例えば、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’または３’末端へのコンジュゲーション反応）。
実施例２に記載のインビトロイムノアッセイ、実施例３に記載のＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイまたは実施例６に記載のインビボマウスモデルにより、ＡＳＧＲ１発現の低減における有効性について、単体の化学修飾ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされた化学修飾ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡを評価した。
実施例６．ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子のインビボでの有効性
インビボでのＡＳＧＲ１の肝臓発現の低減について化学修飾ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子の有効性を評価するために、修飾ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子（Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）試薬と複合された）またはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの静脈内または皮下に投与する。具体的には、マウスは、緩衝液、示されたｓｉＲＮＡおよび対応する対照ｓｉＲＮＡを０．２５ｍｌの緩衝液中における１～５ｍｇ／ｋｇ体重で０日目に注射される。動物は、さらなる分析のために２日目、４日目および７日目に回収される。回収された動物の肝臓の全ＲＮＡがｑＰＣＲ分析のために処理される。ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡの有効性は、ｓｉＲＮＡ処理された動物の肝臓組織におけるＡｓｇｒ１のｍＲＮＡおよびＡＳＧＲ１タンパク質の量を、緩衝液または対照ｓｉＲＮＡが注射された動物の肝臓組織におけるＡｓｇｒ１のｍＲＮＡおよびＡＳＧＲ１タンパク質の量と比較することによって評価される。
アルカリホスファターゼおよびＬＤＬコレステロールの血清レベルも、ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子のインビボでの有効性を評価するために、ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子または対応する対照の注射後の様々な時点のマウスにおいて測定され得る。上昇した血清アルカリホスファターゼレベルは、非ＨＤＬコレステロールの低下した血清レベルおよび冠動脈疾患の低下したリスクと相関する（Ｎｉｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３７４（２２）：２１３１－２１４１，２０１６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、血清アルカリホスファターゼレベルは、血清非ＨＤＬコレステロールレベルまたは冠動脈疾患のリスクを低減する特定のＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡの有効性の代替バイオマーカーとして使用することができる。有効なＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子は、緩衝液または対照ｓｉＲＮＡを注射された動物におけるレベルと比較して、処理された動物において低下した血清非ＨＤＬコレステロール（例えば、ＬＤＬコレステロール）レベルまたは上昇した血清アルカリホスファターゼレベルをもたらすものである。
実施例７．ＡＳＧＲ１の化学修飾ｓｉＲＮＡ分子のインビトロでの有効性
表６に列記される選択した化学修飾ｓｉＲＮＡ分子を、下で再現される構造の式ＶＩＩに示される三分岐ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした。ＧａｌＮＡｃ部分を、各二重鎖のセンス鎖の３’末端にホスホジエステル結合を介してコンジュゲートした。
Figure 0007082610000141
ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞のトランスフェクションアッセイおよびヒトＡＳＧＲ１ ＣＨＯ細胞の自由取り込みアッセイにおいてそれらのＡＳＧＲ１発現の阻害能について評価された。Ｈｅｐ３Ｂ細胞トランスフェクションイムノアッセイは、上の実施例２に記載される。ヒトＡＳＧＲ１を安定して発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を利用する自由取り込みアッセイを次のように行った。Ｆ－１２Ｋ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ＃１０－０２５－ＣＶ）中のＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡ分子を３８４ウェルプレートにおいて調製した。１０％ウシ胎仔血清および１％抗生物質／抗真菌薬を加えたＦ－１２Ｋ培地中のヒトＡＳＧＲ１を安定して発現するＣＨＯ細胞を各ウェルに添加した。細胞を３７℃および５％のＣＯ２で４日間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ送達の４日後、細胞をホルムアルデヒドに固定し、ウシ血清アルブミンを遮断し、続いて抗ＡＳＧＲ１一次抗体（Ａｍｇｅｎクローン７Ｅ１１、それぞれ配列番号３および４において提供される軽鎖および重鎖）を用いて室温で１時間または４℃で一晩のいずれかで染色した。プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。続いて、細胞を、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体および細胞数を評価するための核染色試薬Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｈ３５７０）とともに室温で４５分間にわたり暗室下においてインキュベートした。ＰＢＳによる３回の洗浄後、プレートを、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントスクリーニングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で４８８／５００～５５０および３７５／４３５～４８０の励起／発光フィルター設定を用いて画像化して、抗ＡＳＧＲ１抗体染色および核染色をそれぞれ測定した。データを、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ画像分析ソフトウェアおよびＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒソフトウェアを用いて分析して、ＡＳＧＲ１のタンパク質レベル、細胞数および細胞形態のいくつかの測定を各細胞および各ウェル基準で定量化した。
ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートをアッセイの各々において０．００００１２～２５μＭの範囲の２２個の異なる用量で試験し、用量反応曲線を作成した。用量反応曲線からＩＣ５０値および最大アンタゴニスト活性値（対照細胞に対する；－１．０の最大アンタゴニスト活性は、完全な阻害を表す）を計算した。アッセイの結果を下の表７に示す。
Figure 0007082610000142
Figure 0007082610000143
Figure 0007082610000144
Ｈｅｐ３Ｂ細胞にトランスフェクトした場合、いくつかのＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、８０％を超えてＡＳＧＲ１発現をノックダウンした。特に、様々な化学修飾パターン（例えば、二重鎖Ｎｏ．３０２６、３０３７、３０５１、３０５３および３０５７）を有するヒトＡＳＧＲ１転写物バリアント１（ＮＭ＿００１６７１．４；配列番号１）の６９２～７１０のヌクレオチドを標的化するＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞にトランスフェクトした場合に低ナノモルのＩＣ５０値を示し、ＣＨＯ細胞の自由取り込みアッセイでは約５０％の最大ノックダウン活性を示した。本明細書に記載の他の三分岐ＧａｌＮＡｃ構造（例えば、式ＸＶＩ）に対するコンジュゲートにおいてＧａｌＮＡｃ部分を変えることにより、自由取り込みアッセイにおけるＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの性能が向上した（データは示さず）。
実施例８．さらなるＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子の設計および有効性
様々なパターンの化学修飾、異なる配列および異なるＧａｌＮＡｃ部分を有したさらなるＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートを作製した。下の表８は、センス配列およびアンチセンス配列における修飾ならびにＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの各々についてのＧａｌＮＡｃ部分に関する構造およびコンジュゲーションの部位を列記する。表８のヌクレオチド配列は、以下の表記法に従って列記される。Ａ、Ｕ、ＧおよびＣ＝対応するリボヌクレオチド；ｄＴ、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ＝対応するデオキシリボヌクレオチド；ａ、ｕ、ｇおよびｃ＝対応する２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド；Ａｆ、Ｕｆ、ＧｆおよびＣｆ＝対応する２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）リボヌクレオチド；Ｐｈｏｓ＝末端ヌクレオチドがその５’末端に一リン酸基を有すること；ｉｎｖＡｂ＝逆向きの脱塩基ヌクレオチド（すなわち隣接するヌクレオチドにその３’位の置換基を介して結合した脱塩基ヌクレオチド（３’－３’結合））である。配列中の「ｓ」の挿入は、２つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）によって結合されることを示す。特に指示がない限り、全ての他のヌクレオチドは、３’－５’ホスホジエステル基によって結合される。ＧａｌＮＡｃ構造は、参照された式において示され、これは、上に示されている。
Figure 0007082610000145
Figure 0007082610000146
Figure 0007082610000147
Figure 0007082610000148
Figure 0007082610000149
Figure 0007082610000150
Figure 0007082610000151
Figure 0007082610000152
Figure 0007082610000153
Figure 0007082610000154
Figure 0007082610000155
Figure 0007082610000156
Figure 0007082610000157
Figure 0007082610000158
Figure 0007082610000159
Figure 0007082610000160
Figure 0007082610000161
ＡＳＧＲ１発現の阻害についてのＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの有効性をＨｅｐ３Ｂ細胞トランスフェクションイムノアッセイ（実施例２に記載される）および／またはヒトＡＳＧＲ１ ＣＨＯ細胞自由取り込みイムノアッセイ（実施例７に記載される）において試験した。アッセイの結果を下の表９に示す。
Figure 0007082610000162
Figure 0007082610000163
Figure 0007082610000164
Figure 0007082610000165
Figure 0007082610000166
Figure 0007082610000167
いくつかのＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートをさらに肝細胞でのＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルのノックダウンにおける有効性について評価した。製造業者のプロトコルに従ってヒト初代肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ／Ｓｅｋｉｓｕｉ ドナーロット番号ＨＣ３－３８）をＯｐｔｉＴｈａｗ培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈカタログ番号Ｋ８０００）中に解凍した。細胞を遠心分離し、培地吸引後、ＯｐｔｉＰｌａｔｅ肝細胞培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈカタログ番号Ｋ８２００）に再懸濁し、９６ウェルのコラーゲンコーティングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒカタログ番号６５５９５０）に蒔いた。２～４時間のインキュベーション時間後、培地を除去し、ＯｐｔｉＣｕｌｔｕｒｅ肝細胞培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈカタログ番号Ｋ８３００）で置き換えた。ＯｐｔｉＣｕｌｔｕｒｅ培地を添加して２～４時間後、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡを自由取り込み（トランスフェクション試薬なし）によって細胞に送達した。細胞を３７℃および５％のＣＯ２で２４～７２時間インキュベートした。続いて、１％２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ－３１４８）を加えたＱｉａｇｅｎのＲＬＴ緩衝液（７９２１６）で細胞を溶解し、溶解物を－２０℃で保存した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴ機器（９００１７９３）およびＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ ９６ ＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴキット（７４１７１）を使用して、製造業者の指示書に従ってＲＮＡを精製した。試料は、ＱＩＡｘｐｅｒｔシステム（９００２３４０）を使用して分析された。
Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（４３６８８１３）を使用してＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成し、反応を製造業者の指示書に従って組み立て、投入するＲＮＡ濃度は、試料によって変動した。逆転写は、ＢｉｏＲａｄの４つ組のサーマルサイクラー（モデル番号ＰＴＣ－０２４０Ｇ）上において以下の条件で実行した：２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５分、その後（任意選択）４℃で保持し続ける。ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を、製造業者の指示書に従ってＢｉｏＲａｄのＱＸ２００ ＡｕｔｏＤＧドロップレットデジタルＰＣＲシステムを使用して実施した。ＢｉｏＲａｄのプローブ用ｄｄＰＣＲスーパーミックス（１８６３０１０）、ＡＳＧＲ１（ＩＤＴ Ｈｓ．ＰＴ．５６ａ．２４７２５３９５、プライマー対プローブ比３．６：１、９ナノモルの各フォワードおよびリバースプライマー（下に列記される配列）、２．５ナノモルの６－ＦＡＭ／ＺＥＮ／ＩＢＦＱ標識プローブ（下に列記されるプローブ）で注文される）ならびにＧＵＳＢ（ＩＤＴ Ｈｓ．ＰＴ．５８ｖ．２７７３７５３８、プライマー対プローブ比３．６：１、９ナノモルの各フォワードおよびリバースプライマー（下に列記される配列）、２．５ナノモルのＨＥＸ／ＺＥＮ／ＩＢＦＱ標識プローブ（下に列記されるプローブ）で注文される）についての蛍光標識ｑＰＣＲアッセイならびにＲＮａｓｅフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９９３７）を使用して、反応をＥｐｐｅｎｄｏｒｆのクリア９６ウェルＰＣＲプレート（９５１０２０３０３）に組み立てた。プライマー／プローブの最終濃度は、それぞれ９００ｎＭ／２５０ｎＭであり、投入するｃＤＮＡ濃度は、ウェル間で変動した。
ドロップレットは、製造業者によって推奨される消耗品（ＢｉｏＲａｄのＤＧ３２カートリッジ１８６４１０８、ＢｉｏＲａｄのチップ８６４１２１、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの青色９６ウェルＰＣＲプレート９５１０２０３６２、ＢｉｏＲａｄのプローブ用ドロップレット生成オイル１８６４１１０およびＢｉｏＲａｄのドロップレットプレート組立品）とともに設置されたＢｉｏＲａｄ Ａｕｔｏ ＤＧドロップレット生成器（１８６４１０１）を使用して形成された。ドロップレットは、ＢｉｏＲａｄのＣ１０００ ｔｏｕｃｈサーマルサイクラー（１８５１１９７）上で次の条件を用いて増幅した：酵素活性化９５℃で１０分、変性９４℃で３０秒、その後６０℃で１分間のアニーリング／エクステンション、２℃／秒のランプ速度を用いる４０サイクル、酵素活性解除９８℃で１０分、その後（任意選択）４℃で保持し続ける。続いて、ＡＳＧＲ１またはＧＵＳＢ濃度のそれぞれに相関したＦＡＭ／ＨＥＸシグナルを測定するＢｉｏＲａｄのＱＸ２００ドロップレットリーダー上で試料を読み取った。データを、ＢｉｏＲａｄのＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアパッケージを使用して分析した。試料をチャネル（蛍光標識）によってゲート制御して、１試料当たりの濃度を決定した。続いて、各試料を、異なる試料負荷量に関して、対照に対する目的の遺伝子（ＡＳＧＲ１）の濃度／ハウスキーピング遺伝子（ＧＵＳＢ）濃度の比として表した。続いて、データをＧｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒにインポートし、ここで、各試験ｓｉＲＮＡを中立対照ウェル（緩衝液のみ）の中央値に正規化し、ＰＯＣ（対照のパーセント）として表した。ＩＣ５０および最大活性を下の表１０に報告する。
ｄｄＰＣＲアッセイ配列
ＡＳＧＲ１：
プライマー１：ＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＴＣＡ（配列番号４６８８）
プライマー２：ＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＡＣＡＧＣＧＡ（配列番号４６８９）
プローブ：５６－ＦＡＭ／ＴＣＴＴＴＣＴＴＣ（配列番号４６９０）／ＺＥＮ／ＣＣＡＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧ（配列番号４６９１）／３ＩＡＢｋＦＱ／
ＧＵＳＢ：
プライマー１：ＧＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧ（配列番号４６９２）
プライマー２：ＧＣＣＣＡＴＴＡＴＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＡ（配列番号４６９３）
プローブ：５ＨＥＸ／ＴＧＣＡＧＧＧＴＴ（配列番号４６９４）／ＺＥＮ／ＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣ（配列番号４６９５）／３ＩＡＢｋＦＱ／
Figure 0007082610000168
試験されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの大部分は、コンジュゲートが効率的に細胞に送達され、かつｓｉＲＮＡが活性であったことを示すヒト初代肝細胞においてＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルを低減した。化合物Ｄ－３７８０、Ｄ－３７８２、Ｄ－３７９１、Ｄ－３７９５およびＤ－３８００が最も効力があり、本アッセイで評価されたコンジュゲートの最も高い最大阻害活性を有した。これらの化合物は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞にトランスフェクトされた場合、ＡＳＧＲ１タンパク質発現の強力な阻害も示した。表９のＨｅｐ３Ｂトランスフェクションアッセイデータを参照されたい。
実施例９．ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートのインビボでの有効性
ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートがインビボでＡＳＧＲ１発現を効率的に停止できたかどうかを評価するために、ｄｄＰＣＲによって測定した際にインビトロで最も高い阻害を示すコンジュゲート（表１０）を、ヒトＡＳＧＲ１遺伝子を発現するＡＳＧＲ１ノックアウトマウスに投与した。１０～１２週齢のＡＳＧＲ１ノックアウトマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は、ヒトＡＳＧＲ１遺伝子をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（ＡＡＶ－ｈＡＳＧＲ１）を１動物当たり１×１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）の用量で静脈内注射された。ＡＡＶ－ｈＡＳＧＲ１注射の２週間後、マウスは、緩衝液または示されるＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート（化合物Ｄ－３７５２、Ｄ－３７７９、Ｄ－３７８０、Ｄ－３７８２、Ｄ－３７８４、Ｄ－３７８５、Ｄ－３７８８、Ｄ－３７９１、Ｄ－３７９５、Ｄ－３７９７、Ｄ－３７９９、Ｄ－３８００およびＤ－３８０１）の皮下注射を０．２５ｍｌ緩衝液中に５ｍｇ／ｋｇ体重で受けた（各群はｎ＝６）。化合物の投与後８日目に、各処理群の３匹の動物を安楽死させ、さらなる分析のために回収した。各処理群において残っている３匹の動物は、化合物の投与後１５日目に回収された。血清および肝臓を全ての動物から採取した。動物の肝臓から単離された全ＲＮＡをｑＰＣＲ分析のために処理して、ヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルを評価した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の血清レベルを臨床分析器（ＡＵ４００化学分析器、Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって測定した。血清におけるＡＬＰの上昇したレベルは、非ＨＤＬコレステロールの低下した血清レベルおよび冠動脈疾患の低下したリスクと相関することが報告されており（Ｎｉｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３７４（２２）：２１３１－２１４１，２０１６）、したがって有用なバイオマーカーとして機能する。
図６Ａに示されるように、いくつかのＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、投与後８日目にヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルを低減した。化合物Ｄ－３７５２、Ｄ－３７７９、Ｄ－３７８２、Ｄ－３７８８、Ｄ－３７９９およびＤ－３８００が特に効果的であった。化合物投与後１５日目のｈＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルの抑制が化合物のいくつかで観察された。この時点では、化合物Ｄ－３７５２およびＤ－３７８８が特に効果的であった。図６Ｂは、同じ時点での血清ＡＬＰレベルを示す。概ね、血清ＡＬＰレベルの上昇は、ｈＡＳＧＲ１のｍＲＮＡのノックダウンと相関した。化合物のいくつか（例えば、Ｄ－３７５２、Ｄ－３７８２）は、ＡＳＧＲ１ノックアウト動物において観察されたものと同様のレベルまで血清ＡＬＰの上昇をもたらし、これは、ＡＳＧＲ１発現の最大阻害を示す。インビボ実験の結果は、ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートが皮下投与された場合に肝臓におけるＡＳＧＲ１遺伝子の発現を効率的に抑制し、冠動脈疾患を治療する有効性のバイオマーカーである血清ＡＬＰを調節することを実証している。
実施例１０．ｓｉＲＮＡ分子のための代替の送達機構としてのＡＳＧＲ１抗体
本実施例に記載の実験の目的は、ＡＳＧＲ１に対するモノクローナル抗体を使用して、ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子を肝臓に送達できたかどうかを判定することであった。ＥＵナンバリングスキームによる重鎖のＥ２７２Ｃ変異を有する抗ＡＳＧＲ１モノクローナル抗体（抗ＡＳＧＲ１ ｃｙｃ ｍＡｂ、２００ｍｇ）をｐＨ７．５～８．５の４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中の２．５ｍＭシスタミンおよび２．５ｍＭシステアミンの５０ｍＬ溶液とともに室温で１５～２０時間インキュベートした。抗ＡＳＧＲ１抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６９６および４６９７として下に提供される。０．２２μｍフィルターを使用して反応混合物を濾過し、ｐＨ５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で２５０ｍＬに希釈した。カチオン交換クロマトグラフィーを実施して、反応混合物からビス－システアミンキャップされた抗ＡＳＧＲ１ ｃｙｓ ｍＡｂを精製した。まず、ｐＨ５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中に希釈された２５０ｍＬの反応混合物を２５ｍＬ ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に５ｍＬ／分でロードした。カラムを２カラム容量（ＣＶ）のｐＨ５の１００ｍＭ酢酸ナトリウムで洗浄し、その後、１０ＣＶにわたってｐＨ５の１．２Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を用いて１００ｍＭ酢酸ナトリウムの０～２０％の勾配をかけた。ビス－システアミンキャップされた抗ＡＳＧＲ１ ｃｙｓ ｍＡｂを含有するメインピークを回収し、透析によって９％スクロースを含むｐＨ５．２の１０ｍＭ酢酸ナトリウムに緩衝液を交換した。
Figure 0007082610000169
Figure 0007082610000170
ＧｆｓｕｓＧｆｇＧｆａＡｆｇＡｆＡｆＡｆｇＡｆｕＧｆａＡｆｇＵｆｕＵｆ（配列番号４６９８）の配列（５’－３’）を有するセンス鎖およびａｓＣｆｓｕＵｆｃＡｆｕＣｆｕｕｕＣｆｕＵｆｃＣｆｃＡｆｃｓＵｆｓｕ（配列番号４６９９）の配列（５’－３’）を有するアンチセンス鎖を含有するｓｉＲＮＡ二重鎖を使用してｍＡｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを生成した。センス配列およびアンチセンス配列の表記法は、上に記載した表６および８中のヌクレオチド配列に使用されたものと同じである。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する１９塩基対の二重鎖領域を有した。ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖は、その３’末端にホモセリン－アミノヘキサン酸（ｈＳｅｒ－Ａｈｘ）修飾を有した。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．４中において９０℃で５分間の加熱の直後に３０分間にわたって室温まで冷却して形成された。３’ｈＳｅｒ－Ａｈｘ ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ブロモ酢酸スクシンイミジル（ＳＢＡ）を使用してブロモアセチル基でさらに官能化された（図７Ａ）。１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．４中の３’ｈＳｅｒ－Ａｈｘ ｓｉＲＮＡ二重鎖を１０～２０当量のＳＢＡとともに室温で１時間インキュベートした。続いて、さらに１０～２０当量のＳＢＡを添加し、反応混合物を室温でさらに１時間インキュベートした。ＬＣ－ＴＯＦを使用して反応をモニターした。５０ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．５によるＡｍｉｃｏｎ－１５ ３ｋスピンコンセントレータを用いた緩衝液交換により、３’－ブロモアセチル－ｓｉＲＮＡから過剰量のＳＢＡを除去した。
ビス－システアミンキャップされた抗ＡＳＧＲ１ ｃｙｓ ｍＡｂ（９％スクロースを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム中で約５ｍｇ／ｍＬ）を３～４当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはトリフェニルホスフィン－３，３’，３’’－トリスルホン酸三ナトリウム塩（ＴＰＰＴＳ）を使用して室温で６０～９０分間部分的に還元した（図７Ｂ）。分析的カチオン交換クロマトグラフィーを使用して反応をモニターした。ＴＣＥＰまたはＴＰＰＴＳを除去し、部分的に還元されたｃｙｓ ｍＡｂを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸ナトリウムに緩衝液交換した。部分的に還元されたｃｙｓ ｍＡｂに６～１０当量のデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）を添加し、微量のみの還元されたｍＡｂ種が観測されるまで（３０～１８０分）、室温で酸化を実行した。ＤＨＡＡを除去することなく６当量のブロモアセチル－ｓｉＲＮＡ二重鎖を反応混合物に添加し、アルキル化を室温で１５～４８時間実行した（図７Ｂ）。０．１７Ｍリン酸カリウム、０．２１Ｍ塩化カリウム、１０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、ｐＨ７の均一濃度流を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって過剰量のｓｉＲＮＡ二重鎖および低分子試薬を除去した。１および２のＲＮＡ－抗体比率（ＲＡＲ）を有する抗ＡＳＧＲ１ ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して分離した。ＳＥＣプールをｐＨ７の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈し、Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードした。カラムを５ＣＶのｐＨ７の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、その後、２０ＣＶにわたって０．４～１ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで勾配溶離した。精製されたＲＡＲ１（化合物３５４９）およびＲＡＲ２（化合物３５５０）生成物を、スピン濃縮を使用してダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に緩衝液交換した。
ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを自由取り込みアッセイにおいて活性について評価して、抗体がｓｉＲＮＡをヒト初代肝細胞に効率的に送達してＡＳＧＲ１発現を阻害できたかどうかを判定した。１個または２個のＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子（それぞれ化合物３５４９および３５５０）にコンジュゲートされた様々な濃度（０．１８ｎＭ～４００ｎＭ）の抗ＡＳＧＲ１ ｍＡｂを４日間ヒト初代肝細胞とともにインキュベートした。ＲＮＡを細胞から単離し、ドロップレットデジタルＰＣＲ分析のために処理して、実施例８に記載のようにＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルを評価した。インビトロアッセイの結果を図８に示す。１個または２個のＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子にコンジュゲートされた抗ＡＳＧＲ１ ｍＡｂにより、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡの４０～６０％のノックダウンが実証された。非コンジュゲート抗ＡＳＧＲ１ ｃｙｓ ｍＡｂ（ＰＬ－５３５１５）を対照として使用した。
次に、抗ＡＳＧＲ１ ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートをインビボでの有効性について試験した。９週齢のＣ５７Ｂｌ／６野生型マウスに化合物３５５０（３０ｍｇ／ｋｇもしくは６０ｍｇ／ｋｇ）またはＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡ対照を皮下または静脈内注射した。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡ対照は、配列番号４６９８の配列を有するセンス鎖および配列番号４６９９の配列を有するアンチセンス鎖を有し、センス鎖の３’末端で三分岐のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされた。化合物の投与後２、４、８および１５日目に動物から血清および肝臓を採取した。動物の肝臓から単離された全ＲＮＡをｑＰＣＲ分析のために処理して、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルを評価した。肝臓におけるＡＳＧＲ１タンパク質発現をＥＬＩＳＡによって測定した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の血清レベルを臨床分析器（ＡＵ４００化学分析器、Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって測定した。
ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート３５５０は、ｓｉＲＮＡをそのインビボにおけるｍＲＮＡ標的に効率的に送達した。最も高いノックダウンレベル（約８０％）は、８日目に測定された野生型マウスにおける３０ｍｐｋの３５５０の静脈内投与から得られた（図９Ａ）。肝臓におけるＡＳＧＲ１タンパク質発現も測定され、ｍＲＮＡノックダウンのレベルと一致する３０ｍｐｋの静脈内投与群においてＡＳＧＲ１タンパク質の８０％を超える低減が達成された（図９Ｂ）。タンパク質ノックダウンの最下点は、静脈内または皮下のいずれかで投与された抗ＡＳＧＲ１ ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートについて８日目であり、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートについて４日目であった。ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート３５５０は、ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質発現の低減に対応して８日目で２～４倍のＡＬＰの上昇をもたらした（図１０）。抗ＡＳＧＲ１抗体単独では、１００ｍｇ／ｋｇでさえいかなるＡＬＰの上昇も誘導しなかった（データは示さず）。
まとめると、これらの実験の結果は、ＧａｌＮＡｃ部分の代わりに抗ＡＳＧＲ１抗体を用いてｓｉＲＮＡ二重鎖を効率的に肝臓に送達できることを実証している。ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、肝臓でのＡＳＧＲ１発現の阻害および標的阻害のバイオマーカーである血清ＡＬＰレベルの上昇の観点から、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートと同等の有効性を示した。
本明細書において議論および引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコルおよび材料に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図されていないことも理解される。
当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識または確認することができるであろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (35)

  1. センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖は、ヒトＡＳＧＲ１のｍＲＮＡ配列に対して相補的な配列を有する領域を含み、前記領域は、（ｉ）配列番号２６５１のヌクレオチド１～１９の配列、（ｉｉ）配列番号２６５１のヌクレオチド２～１９の配列、または（ｉｉｉ）配列番号２６５１の配列を含む、ＲＮＡｉコンストラクト。
  2. 前記センス鎖は、１５～３０塩基対長の二重鎖領域を形成する前記アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  3. 前記二重鎖領域は、１９～２１塩基対長である、請求項２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  4. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、それぞれ１９～２７ヌクレオチド長である、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  5. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、それぞれ２１～２５ヌクレオチド長である、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  6. 少なくとも１つの平滑末端を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  7. １～４個の不対ヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  8. 前記ヌクレオチドオーバーハングは、２個の不対ヌクレオチドを有する、請求項７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  9. 前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の３’末端または前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項７または８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  10. 少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  11. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－修飾ヌクレオチドである、請求項１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  12. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環性核酸（ＢＮＡ）またはこれらの組み合わせである、請求項１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  13. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖中のヌクレオチドの全ては、修飾ヌクレオチドである、請求項１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  14. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせである、請求項１３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  15. 少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  16. 前記アンチセンス鎖の３’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  17. 前記アンチセンス鎖の３’末端および５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、かつ前記センス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  18. 前記センス鎖は、（ｉ）配列番号１１４８のヌクレオチド１～１９の配列、（ｉｉ）配列番号１１４８のヌクレオチド２～１９の配列、または配列番号１１４８の配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  19. （ａ）前記センス鎖は、配列番号１１４８の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号２６５１の配列を含むか、または
    （ｂ）前記センス鎖は、配列番号１１４７の配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号２６５０の配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  20. （ａ）前記センス鎖は、配列番号３０５０に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号３７０１に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含むか；
    （ｂ）前記センス鎖は、配列番号３０５１に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号３７０２に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含むか；
    （ｃ）前記センス鎖は、配列番号３０６５に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号３７１６に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含むか；
    （ｄ）前記センス鎖は、配列番号３０６７に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号３７１８に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含むか；
    （ｅ）前記センス鎖は、配列番号３０７１に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号３７２２に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含むか；
    （ｆ）前記センス鎖は、配列番号４４２０に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号４６００に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含むか；または
    （ｇ）前記センス鎖は、配列番号４６９８に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号４６９９に記載の修飾ヌクレオチドの配列を含む、請求項１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  21. リガンドをさらに含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  22. 前記リガンドは、コレステロール部分、ビタミン、ステロイド、胆汁酸、葉酸部分、脂肪酸、炭水化物、グリコシドまたは抗体もしくはその抗原結合断片を含む、請求項２１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  23. 前記リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、多価ガラクトース部分または多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む、請求項２１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  24. 前記リガンドは、必要に応じてリンカーを介して、前記センス鎖に共有結合的に結合される、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  25. 前記リガンドは、前記センス鎖の３’末端または５’末端に共有結合的に結合される、請求項２４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  26. 請求項１～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトと、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物。
  27. ＡＳＧＲ１の発現の低減を、それを必要とする患者において行うための組成物であって、前記組成物は、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含み、前記組成物が、前記患者に投与されることを特徴とする、組成物。
  28. 前記患者は、冠動脈疾患と診断されるか、または冠動脈疾患のリスクを有するか、あるいは心筋梗塞の病歴を有する、請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記患者は、非ＨＤＬコレステロールの上昇したレベルを有する、請求項２７に記載の組成物。
  30. 非ＨＤＬコレステロールの低減を、それを必要とする患者において行うための組成物であって、前記組成物は、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含み、前記組成物が、前記患者に投与されることを特徴とする、組成物。
  31. 心血管疾患の治療または予防を、それを必要とする患者において行うための組成物であって、前記組成物は、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含み、前記組成物が、前記患者に投与されることを特徴とする、組成物。
  32. 前記心血管疾患は、冠動脈疾患または心筋梗塞である、請求項３１に記載の組成物。
  33. 心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行うための組成物であって、前記組成物は、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含み、前記組成物が、前記患者に投与されることを特徴とする、組成物。
  34. 前記組成物は、非経口の投与経路を介して前記患者に投与されることを特徴とする、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記非経口の投与経路は、静脈内または皮下である、請求項３４に記載の組成物。
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