JP7075896B2 - マントル細胞リンパ腫の評価及びそれに関連する方法 - Google Patents
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Description
関連出願の相互参照
本特許出願は、2016年4月20日に出願された米国仮特許出願番号第62/325,213号（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）についての利益を主張する。
本特許出願は、2016年4月20日に出願された米国仮特許出願番号第62/325,213号（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）についての利益を主張する。
連邦支援研究開発に関連する陳述
本発明は、国立衛生研究所による補助金番号CA157581の下での政府の支援を受けて為された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所による補助金番号CA157581の下での政府の支援を受けて為された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
電子的に提出された資料の参照による取り込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に取り込まれる：2017年4月19日付作成の「728352_ST25.txt」という名前の35,236バイトのASCII（テキスト）ファイル1件。
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に取り込まれる：2017年4月19日付作成の「728352_ST25.txt」という名前の35,236バイトのASCII（テキスト）ファイル1件。
発明の背景
マントル細胞リンパ腫 (MCL)は、多岐に亘る臨床的及び生物学的特徴を伴う、治療不能なB細胞悪性腫瘍である。大多数の症例では、サイクリンD1の過剰発現及び細胞周期の異常調節に繋がる、t(11；14)(q13；q32)転座がみられる。殆んどの患者は、即時治療が必要な進行性の疾患を有するが、疾患の進行が遅く、治療なしで数年間観察することができる患者の群が存在する。最近、MCLには（各々が異なる生態（biology）を有する）2つのサブタイプ：従来型のMCL、並びにリンパ球増加症、脾腫、リンパ節腫脹が無い（又は最小）及び進行が遅い臨床的経過によって特徴付けられる非結節性変異型の白血病が包含されることが認識された。現時点では、普遍的に受け入れられているMCLの治療レジメン（resimen）は存在しない。殆んどのセンターでは、患者の年齢に基づいて、より若い患者に集中的なレジメンを行う治療決定を下している。
マントル細胞リンパ腫 (MCL)は、多岐に亘る臨床的及び生物学的特徴を伴う、治療不能なB細胞悪性腫瘍である。大多数の症例では、サイクリンD1の過剰発現及び細胞周期の異常調節に繋がる、t(11；14)(q13；q32)転座がみられる。殆んどの患者は、即時治療が必要な進行性の疾患を有するが、疾患の進行が遅く、治療なしで数年間観察することができる患者の群が存在する。最近、MCLには（各々が異なる生態（biology）を有する）2つのサブタイプ：従来型のMCL、並びにリンパ球増加症、脾腫、リンパ節腫脹が無い（又は最小）及び進行が遅い臨床的経過によって特徴付けられる非結節性変異型の白血病が包含されることが認識された。現時点では、普遍的に受け入れられているMCLの治療レジメン（resimen）は存在しない。殆んどのセンターでは、患者の年齢に基づいて、より若い患者に集中的なレジメンを行う治療決定を下している。
MCLについて多くの予後診断ツールが開発されている。最も著名なものはMCL国際予後指標（MIPI）であり、患者を低リスク、中間リスク又は高リスク群に割り当てるための臨床的及び実験的な値を組合せている。MIPIは、無作為化臨床試験において評価されている。2003年、リンパ腫／白血病分子プロファイリングプロジェクト(LLMPP)コンソーシアムによって、MCLにおける遺伝子発現プロファイリングが行われ、増殖と関連する遺伝子発現の調整されたシグネチャ（signature）が、生存の最も強い分子的予測因子であり、他の分子マーカーの予後診断能力を補完することが実証された。
しかしながら、新鮮な凍結（FF）材料を必要とし、マイクロアレイベースのプラットフォームを使用する、この増殖シグネチャは臨床的実務に浸透していない。免疫組織化学 (IHC)を使用して測定したKi67増殖指標 (PI)は、増殖シグネチャの代理の評価基準として提案されており、多くの研究において、それ単独で及びMIPIとの組み合わせの両方において予後診断的であることを示している。しかしながら、リンパ腫及び他の悪性腫瘍におけるKi-67 PIの分析的妥当性に関して、特に実験室間及び観察者間で、ばらつきがあることに関して、深刻な懸念が持ち上がっている。
最近、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE)組織に由来するRNA中の、遺伝子発現を確実に定量するための技術が開発されており、それによって臨床に関連する、中間の密度（intermediate density）、遺伝子発現ベースのアッセイの開発が可能になっている。MCLの予後をより良く予測する、一貫していて再現性のあるスコアを提供するために、これらの技術を使用したより良い方法が必要とされている。本発明はそのような方法を提供する。
発明の要旨
本発明は、MCLを有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が、対象由来の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データが本明細書に記載された1以上の遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに、該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアが、1以上の遺伝子の各々についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は、遺伝子のシグナル値又はシグナル値の対数変換と、該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は本明細書に記載された通りである）、及び1超の乗算の積がある場合は該乗算の積を合計することによって決定される）を含む、方法を提供する。
本発明は、MCLを有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が、対象由来の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データが本明細書に記載された1以上の遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに、該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアが、1以上の遺伝子の各々についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は、遺伝子のシグナル値又はシグナル値の対数変換と、該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は本明細書に記載された通りである）、及び1超の乗算の積がある場合は該乗算の積を合計することによって決定される）を含む、方法を提供する。
本発明はまた、MCLを有するヒト対象の生存転帰を予測する方法であって、本明細書に記載された通り、対象の生存予測スコアを決定すること；並びに該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：良好な予後、中間の予後及び不良な予後、の一つに属するとして分類することを含む方法も提供する。
本発明はまた、MCLを有するヒト対象についての治療を選択する方法であって、本明細書に記載された通り、該対象を分類すること；対象の分類に基づいて対象の治療を選択すること；及び対象に治療を提供することを含む方法も提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、MCLを有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が、対象由来の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、以下の表1の1以上の遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに、該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアは1以上の遺伝子の各々についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は、遺伝子のシグナル値の対数変換と該遺伝子についての係数値との数学的積である）、及び1超の乗算の積がある場合は該乗算の積を合計することによって決定される）を含む、方法を提供する。
本発明は、MCLを有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が、対象由来の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、以下の表1の1以上の遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに、該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアは1以上の遺伝子の各々についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は、遺伝子のシグナル値の対数変換と該遺伝子についての係数値との数学的積である）、及び1超の乗算の積がある場合は該乗算の積を合計することによって決定される）を含む、方法を提供する。
別の実施形態においては、本発明はまた、MCLを有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が、対象由来の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、以下の表1の1以上の遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに、該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアは1以上の遺伝子の各々についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は遺伝子のシグナル値と該遺伝子についての係数値との数学的積である）、及び1超の乗算の積がある場合は該乗算の積を合計することによって決定される）を含む、方法も提供する。
別の実施形態においては、本発明はまた、MCLを有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が、対象由来の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、以下の表1の各遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに、該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアは以下の表1の各遺伝子についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は遺伝子のシグナル値の対数変換と該遺伝子についての係数値との数学的積である）、及び該乗算の積を合計することによって決定される）を含む、方法も供する。
別の実施形態においては、本発明はまた、MCLを有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が、対象由来の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、以下の表1の各遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに、該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアは以下の表1の各遺伝子についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は遺伝子のシグナル値と該遺伝子についての係数値との数学的積である）、及び該乗算の積を合計することによって決定される）を含む、方法も提供する。
別の実施形態においては、本発明は、MCLを有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が、対象由来の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、以下の表1の1以上の遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに、該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアは1以上の遺伝子の各々についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は遺伝子のシグナル値の対数変換と該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は以下の表1において列記された通りである）、及び1超の乗算の積がある場合は該乗算の積を合計することによって決定される）を含む、方法を提供する。
別の実施形態においては、本発明はまた、MCLを有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が、対象由来の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、以下の表1の1以上の遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；及び該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアは1以上の遺伝子の各々についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は遺伝子のシグナル値と該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は以下の表1において列記された通りである）、及び1超の乗算の積がある場合は該乗算の積を合計することによって決定される）を含む、方法も提供する。
別の実施形態においては、本発明はまた、MCLを有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が、対象由来の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、以下の表1の各遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに、該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアは以下の表1の各遺伝子についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は遺伝子のシグナル値の対数変換と該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は以下の表1において列記されている）、及び該乗算の積を合計することによって決定される）を含む、方法も提供する。
別の実施形態においては、 本発明はまた、MCLを有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が、対象由来の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、以下の表1の各遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに、該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアは以下の表1の各遺伝子についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は遺伝子のシグナル値と該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は以下の表1において列記されている）、及び該乗算の積を合計することによって決定される）を含む、方法も提供する。
本発明の方法は、ヒト対象に由来する、例、対象由来の生検試料、例えば、対象由来の新鮮な組織、瞬間凍結した生検試料、又は対象由来のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料等から、十分量のRNAの遺伝子発現産物を単離することを含む。当業者に理解される通り、表現「対象由来の瞬間凍結した生検試料」は、まず生検試料を対象から採取し、その後に瞬間凍結したこと意味し、表現「対象由来のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料を取得する（obtaining）又は提供する（providing）」は、まず生検試料を対象から採取し、その後にホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋することを意味する。MCL試料については、例えば、腫瘍は任意の解剖学的な部位にあり得るので、生検は任意の組織由来であり得る。
遺伝子発現産物は、RNA、例えば、細胞の全mRNAである。RNAの遺伝子発現産物は、任意の好適な様式で対象から取得し得る。例えば、1以上の生検試料は、MCLを有すると診断されている患者から取得し得、生検試料は、当該分野において公知であるプロトコールを使用してホルマリン固定及びパラフィン包埋し得るか、又は市販されている（例、参照により本明細書に取り込まれる、Keirnan, J.（編）、Histological and Histochemical Methods：Theory and Practice、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press (2008)を参照）。RNAの遺伝子発現産物は、当該分野において公知である方法を使用して、FFPE生検試料から抽出し得るか、又は市販されている（例、参照により本明細書に取り込まれるHuangら、Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 19：973-977 (2010)；QIAGEN AllPREP DNA/RNA FFPEキット、RNAEASYTMFFPEキット (Qiagen, Venlo, Netherlands) を参照）。
本発明の方法は、単離されたRNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得することを更に含む（該遺伝子発現データは、遺伝子発現シグネチャにおける遺伝子についてのデータを含む）。本明細書で用いられる場合、表現「遺伝子発現データ」は、RNAの遺伝子発現産物の相対的又は絶対的なレベルの発現に関する情報を指す。「遺伝子発現データ」は、個々の細胞について、又は例えば腫瘍若しくは生検試料等の一群の細胞について取得し得る。本発明において使用するための遺伝子発現データを取得するために、少なくとも1の遺伝子、遺伝子セット又は一群の遺伝子セットの発現を定量化する、任意の効果的な方法を使用し得る。例えば、遺伝子発現データは、1以上のマイクロアレイを使用して、測定又は推定しても良い。
一般的に、核酸マイクロアレイは、個々の遺伝子に由来し、支持体上に規則的な配列で配置された核酸プローブを含む。例えば、この支持体は、ガラス製のスライド、ナイロンメンブレン又はシリコンのウェハーであっても良い。試料中の遺伝子発現のパターンは、マイクロアレイを、試料由来のRNAの遺伝子発現産物とハイブリダイズすることによって取得される。試料由来のRNAの遺伝子発現産物は、検出を可能にする放射性、蛍光性又は他の標識を用いて標識する。ハイブリダイゼーションに引き続き、マイクロアレイを洗浄し、マイクロアレイ上の各核酸プローブへのRNAの遺伝子発現産物のハイブリダイゼーションを検出し、例えばホスホイメージャー（phosphorimager）又は走査型共焦点顕微鏡等の検出装置を使用して定量化する。
マイクロアレイは、cDNAマイクロアレイ又はオリゴヌクレオチドマイクロアレイであっても良い。cDNAアレイは、固体支持体上に固定化した数百又は数千のcDNAプローブからなり、詳細は、例、Southernら、Genomics, 13：1008-1017 (1992)；Southernら、Nucl. Acids. Res., 22：1368-1373 (1994)；Gressら、Oncogene, 13：1819-1830 (1996)；Pietuら、Genome Res., 6：492-503 (1996)；Schenaら、Science, 270：467-470 (1995)；DeRisiら、Nat. Genet., 14：457-460 (1996)；Schenaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93：10614-10619 (1996)；Shalonら、Genome Res., 6：639-645 (1996)；DeRisiら、Science, 278：680-686 (1997)；Hellerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94：2150-2155 (1997)；及びLashkariら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94：13057-13062 (1997)に記載されている。オリゴヌクレオチドアレイは、プローブが20～25merのオリゴヌクレオチドである点で、cDNAアレイと異なる。一般的に、オリゴヌクレオチドアレイは、フォトリソグラフィマスキング（photolithographic masking）技術を併用して、in situオリゴヌクレオチド合成によって製造される（例、Peaseら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91：5022-5026 (1994)；Lipshutzら、Biotechniques, 19：442-447 (1995)；Cheeら、Science, 274：610-14 (1996)；Lockhartら、Nat. Biotechnol., 14：1675-1680 (1996)；及びWodickaら、Nat. Biotechnol., 15：1359-1367 (1997)を参照）。典型的には、オリゴヌクレオチドアレイ用の固体支持体はガラス又はシリコンの表面である。
アレイの合成及び使用に適用可能な方法及び技術は、例えば、米国特許第5,143,854号、第5,242,974号、第5,252,743号、第5,324,633号、第5,384,261号、第5,424,186号、第5,445,934号、第5,451,683号、第5,482,867号、第5,491,074号、第5,527,681号、第5,550,215号、第5,571,639号、第5,578,832号、第5,593,839号、第5,599,695号、第5,624,711号、第5,631,734号、第5,795,716号、第5,831,070号、第5,837,832号、第5,856,101号、第5,858,659号、第5,936,324号、第5,968,740号、第5,974,164号、第5,981,185号、第5,981,956号、第6,025,601号、第6,033,860号、第6,040,193号、第6,090,555号及び第6,410,229号、並びに米国特許出願公開第2003/0104411号に記載されている。機械的な合成方法を使用してマイクロアレイを合成する技術は、例えば、米国特許第5,384,261号及び第6,040,193号に記載されている。マイクロアレイは、ビーズ、ゲル、ポリマーの表面、例えば光ファイバー等の繊維、ガラス又は任意の他の適切な基材上の核酸であり得る（例、米国特許第5,708,153号、第5,770,358号、第5,789,162号、第5,800,992号及び第6,040,193号を参照）。
マイクロアレイは、診断用途を可能にするような様式でパッケージしても良く、又はそれらは、包括的な装置であっても良い（例、米国特許第5,856,174号及び第5,922,591号を参照）。様々な目的に向けたマイクロアレイは、例、Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)から市販されている。
一実施形態においては、シグナル値はデジタルカウントを含む。遺伝子発現データは、例、例えば遺伝子発現連続分析 (SAGE)（例、Velculescuら、Science, 270(5235)：484-487 (1995)を参照）、SuperSAGE（例、Matsumuraら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 (26)：15718-15723 (2003)を参照）、デジタルノーザン分析（例、Caoら、Breast Cancer Research, 10：R91(2008)を参照）及びRNA-seq（例、MortazaviらNat Methods, 5(7):621-628 (2008)を参照）等の当該分野において公知である様々なデジタルの手法を使用して、取得及び分析し得る。一実施形態においては、遺伝子発現（RNA）データは、NanoString Technologies（登録商標）社 (Seattle, WA, USA)から入手できるNanoString Technologies（登録商標）nCounter（登録商標）アッセイを使用して取得する。
nCounter（登録商標）アッセイは、単一の反応において、800までの遺伝子の発現を、広い範囲の発現レベルに亘って高い感受性及び直線性を伴って検出し得る。nCounter（登録商標）アッセイは、標的特異的な色分けされたプローブ対を使用した、目的のmRNA分子の直接的なデジタル検出に基づいており、逆転写によるmRNAからcDNAへの変換、又は結果として得られたcDNAのPCRによる増幅を必要としない。目的の各標的遺伝子は、35～50ヌクレオチドの標的特異的な配列を有する、一対のレポータープローブ及びキャプチャプローブを使用して検出する。更に、各レポータープローブは、その5’末端に目的の遺伝子の分子バーコーディングを可能にする特有のカラーコードを有する一方で、キャプチャプローブは全て、その3’末端に、その後のデジタル検出を促進するための標的遺伝子への付着用の分子ハンドルを提供するビオチン標識を有する。標的mRNAとレポーター-キャプチャプローブ対との間の液相ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを除き、プローブ／標的複合体をnCounter（登録商標）カートリッジ中において整列させ、固定化し、次いで、画像の取得及びデータ処理のためのデジタルアナライザーに置く。目的のmRNA標的を指定する数十万のカラーコードは、カートリッジの表面上で直接的に画像化される。遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の色分けされたバーコードが検出される回数をカウントすることによって測定され、次いで、バーコードのカウントが集計される。NanoString Technologies（登録商標）技術及びデジタルの遺伝子発現データの分析は、例、参照により本明細書に取り込まれるKulkarni, M. M.「Digital Multiplexed Gene Expression Analysis Using the NanoString Technologies（登録商標）nCounter（登録商標）System」Current Protocols in Molecular Biology. 94：25B.10.1-25B.10.17 (2011)；参照により本明細書に取り込まれるGeissら、Nature Biotechnology, 26：317-325 (2008)；及び参照により本明細書に取り込まれる米国特許第7,919,237号に詳細に記載されている。
本明細書で用いられる場合、用語「遺伝子発現シグネチャ」は、協調的に発現された一群の遺伝子を指す。特定のシグネチャを構成する遺伝子は、特異的な細胞系統や分化段階において、又は特定の生物学的な応答の間に発現し得る。遺伝子は、それらが発現している腫瘍の生物学的な特徴、例えば、がんの起源細胞、生検中の非悪性細胞の性質及びがんの原因となる発癌機構等を反映し得る（例、参照により本明細書に取り込まれるShafferら、Immunity, 15：375-385 (2001)を参照）。遺伝子発現シグネチャの例としては、リンパ節（Shafferら（上記）を参照）、増殖（例、参照により本明細書に取り込まれるRosenwaldら、New Engl. J. Med., 346：1937-1947 (2002)を参照）、MHCクラスII、ABC DLBCL high、B細胞分化、T細胞、マクロファージ、免疫応答-1、免疫応答-2及び胚中心B細胞が挙げられる。
本発明の遺伝子発現シグネチャの遺伝子は、それぞれの係数値及び標的DNA配列と共に、表1に示される。RNAを使用して遺伝子発現を検出する場合、検出された配列は、DNA標的配列の、RNA配列（該DNA配列でチミンがウラシルに置換されている）である。
一実施形態においては、生存予測スコアを決定するために使用した式は(式1)：
（前記式中：yは生存予測スコアであり、ciは遺伝子iの係数値であり、xiは遺伝子iのシグナル値である）である。別の実施形態においては、生存予測スコアを決定するために使用した式は(式2)：
（y、ci、xi及びiは、式1について上記で定義した通りである）である。本モデルにおいて、標準化したカウント又は生のカウントのいずれも使用し得ることに留意する。
一実施形態においては、生存予測スコアを生成するために使用した係数が改良されても良く、患者を細分化するために使用した生存予測スコアのカットポイントが改良されても良い。例えば、表1中のものと同じ遺伝子と共に、本明細書に記載された方法を使用して、各遺伝子の係数が、例、異なるシグナル値を提供する異なる型の生検 (例、新鮮)の使用又は異なるマイクロアレイの使用に基づいて、表1に列記されたものとは異なるように決定される場合がある。一実施形態においては、上記方法を、他の方法、例えば、参照により本明細書に取り込まれる国際特許出願公開番号第WO 2015/069790号に記載されているBayesian法に取り込んでも良い。別の実施形態においては、本明細書に記載された方法と併用して、他の関連する臨床的な変数を使用しても良い。これらの変数としては、例えば、（年齢、血清乳酸脱水素酵素 (LDH)レベル、白血球カウント及びECOGパフォーマンスステータスを含む）MIPIスコアの構成要素が挙げられ得る。他の臨床的な変数は、各々の構成要素及び本明細書に記載された遺伝子発現（増殖）を含む、加重モデルに含めることによって、生存予測スコアを改善し得る。
本発明はまた、MCLを有するヒト対象の生存転帰を予測する方法であって、本明細書に記載された通り、対象の生存予測スコアを決定すること；及び該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：良好な予後、中間の予後及び不良な予後の一つに属するとして分類することを含む方法も提供する。本発明はまた、MCLを有するヒト対象についての治療を選択する方法であって、本明細書に記載された通り、該対象を分類すること；対象の分類に基づいて対象の治療を選択すること；及び対象に治療を行うことを含む方法も提供する。一実施形態においては、本発明は、新規の剤及びレジメンの臨床試験において、患者を選択するために使用し得る。
一実施形態においては、本発明はまた、MCLを有するヒト対象の生存転帰を予測する方法であって、本明細書に記載された通り、対象の生存予測スコアを決定すること；及び該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：良好な予後（yが-143未満として計算される）、中間の予後（yが-143～-28の間として計算される）及び不良な予後（yが-28超として計算される）の一つに属するとして分類することを含む方法も提供する。そのような実施形態は、上記で定義した通り式1を使用する。
一実施形態においては、本発明はまた、MCLを有するヒト対象の生存転帰を予測する方法であって、本明細書に記載された通り、対象の生存予測スコアを決定すること；及び該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：良好な予後（yが約-100000未満として計算される）、中間の予後（yが約-100000～約-32000の間として計算される）及び不良な予後（yが約-32000超として計算される）の一つに属するとして分類することを含む方法も提供する。そのような実施形態は、上記で定義した通り式2を使用する。
一実施形態においては、本発明はまた、マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存転帰を予測する方法であって、対象由来のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料を取得又は提供すること；該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、表1の各遺伝子iについての発現レベルを表すシグナル値を含む）；及び該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定することを含み、該生存予測スコアは以下の式：
（前記式中：yは生存予測スコアであり、ciは表1に列記された遺伝子iの係数値であり、xiは遺伝子iのシグナル値である）によって決定される、方法も提供する。
一実施形態においては、本発明は、異なる予後を有する臨床的に関連する群に細分するために、MCLの遺伝子発現をプロファイリングする目的のために、NanoString Technologies（登録商標）プラットフォームを使用して、特定のmRNA種の存在量を測定することができる、核酸プローブのセットの開発を必然的に伴う。この実施形態においては、標準的な市販のキットを使用して、例、FFPE生検からRNAを抽出し、次いでハイブリダイズし、検出する。結果として得られたデジタルのRNAカウントは、様々な遺伝子から転写されたmRNAの相対的な存在量を反映する。次いで、これらの発現レベルは、該患者の全生存期間と強く関連する生存予測スコアを生成するために、統計的アルゴリズムでまとめられる。
一実施形態においては、本発明はまた、MCLを有するヒト対象についての治療を選択する方法であって、本明細書に記載された通り、該対象を分類すること；対象の分類に基づいて対象の治療を選択すること；及び対象に治療を行うことを含む方法も提供する。該方法は、MCLの対象由来の生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること、及び単離されたRNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得することを含み得る。本発明の他の実施形態との関連で、本明細書で記載されたRNAの遺伝子発現産物、遺伝子発現データ及び遺伝子発現シグネチャの記載もまた、MCLを有することが既に診断されている対象の治療を選択するための上述の本発明に係る方法の同じ態様に適用できる。
選択した治療は、MCLの治療における有効性を示す、任意の好適な治療レジメン又は治療剤を含み得る。MCLの治療としては、例えば、化学療法（例、CHOP (シクロフォスファミド（cyclophosphamide）、ヒドロキシダウノルビシン（hydroxydaunorubicin）、オンコビン（oncovin）(ビンクリスチン（vincristine）)及びプレドニゾン（prednisone）)、免疫ベースの治療 (例、リツキシマブ（rituximab）)、放射線免疫療法、生物学的薬剤（例、プロテアソーム（protoesome）阻害剤、BTK阻害剤、IMiD及びmTor阻害剤）並びに地固め的な自己幹細胞移植が挙げられる。治療はまた、R-CHOP (リツキシマブとCHOP)又はベンダムスチン（bendamustine）＋リツキシマブ（参照により本明細書に取り込まれる、Rummelら、Lancet, 381(9873):1203-10 (2013)）も含む。
本発明の一実施形態においては、自己幹細胞移植あり又は無しで、R-CHOPを用いた治療の後に、生存予測スコアによって、患者をそれぞれ1.1、2.6及び8.6年の生存期間中央値を有する不良な生存群、中間の生存群及び良好な生存群に割り当てる。
MCLは、様々な臨床的な挙動を示すリンパ腫の異質なグループであると認識され、一部の患者は、即座の治療を必要としない緩やかな進行性の疾患を有する一方で、他の患者は、非常に積極的な（aggressive）治療にも関わらず急速に進行する疾患を有する。一実施形態においては、例えば、対象が良好な予後を有すると分類される場合は、治療が遅らされる。別の実施形態においては、例えば、対象が不良な予後を有すると分類される場合は、即座に治療を施す。
一実施形態においては、本発明は、本明細書に記載された、標的配列に対するプローブからなる組成物を提供する。別の実施形態においては、本発明はまた、プローブを含むキット、例えば、NanoString Technologies（登録商標）nCounter（登録商標）デジタル遺伝子発現アッセイを行うために好適な構成要素を含むキットも提供する。
以下に、本発明の特定の態様を挙げる。
態様1．マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が以下：
(a) 対象由来のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料を取得又は提供すること；
(b) 該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；
(c) 該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、表1の各遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに
(d) 該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアが、
表1の各遺伝子についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は該遺伝子のシグナル値の対数変換と該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は表1中に列記されている）及び
該乗算の積を合計すること
によって決定される）
を含む、方法。
態様1．マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が以下：
(a) 対象由来のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料を取得又は提供すること；
(b) 該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；
(c) 該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、表1の各遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに
(d) 該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアが、
表1の各遺伝子についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は該遺伝子のシグナル値の対数変換と該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は表1中に列記されている）及び
該乗算の積を合計すること
によって決定される）
を含む、方法。
態様2．生存予測スコアが以下の式：
（前記式中：yは生存予測スコアであり、ciは遺伝子iの係数値であり、xiは遺伝子iのシグナル値である）によって決定される、態様1の方法。
態様3．NanoString Technologies（登録商標）nCounter（登録商標）アッセイを使用して、遺伝子発現（RNA）データを取得する、態様1又は2の方法。
態様4．マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存転帰を予測する方法であって、以下：
(a) 態様1～3のいずれか1つにより対象の生存予測スコアを決定すること；並びに
(b) 該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：(i)良好な予後、(ii)中間の予後及び(iii)不良な予後の一つに属するとして分類すること
を含む、方法。
(a) 態様1～3のいずれか1つにより対象の生存予測スコアを決定すること；並びに
(b) 該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：(i)良好な予後、(ii)中間の予後及び(iii)不良な予後の一つに属するとして分類すること
を含む、方法。
態様5．マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存転帰を予測する方法であって、以下：
(a) 態様4により対象の生存予測スコアを決定すること；並びに
(b) 該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：(i)良好な予後（yが-143未満として計算される）、(ii)中間の予後（yが-143～-28の間として計算される）及び(iii)不良な予後（yが-28超として計算される）の一つに属するとして分類すること
を含む、方法。
(a) 態様4により対象の生存予測スコアを決定すること；並びに
(b) 該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：(i)良好な予後（yが-143未満として計算される）、(ii)中間の予後（yが-143～-28の間として計算される）及び(iii)不良な予後（yが-28超として計算される）の一つに属するとして分類すること
を含む、方法。
態様6．マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の治療を選択する方法であって、以下：
(a) 態様4又は5により対象を分類すること；
(b) 対象の分類に基づいて対象の治療を選択すること；及び
(c) 任意選択で、対象に治療を行うこと
を含む、方法。
(a) 態様4又は5により対象を分類すること；
(b) 対象の分類に基づいて対象の治療を選択すること；及び
(c) 任意選択で、対象に治療を行うこと
を含む、方法。
態様7．対象が良好な予後を有すると分類され、任意選択の治療が遅らせられる、態様6の方法。
態様8．対象が不良な予後を有すると分類され、任意選択の治療が即座に施される、態様6の方法。
態様9．治療が、R-CHOP (リツキシマブ、シクロフォスファミド、ヒドロキシダウノルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン)の投与を含む、態様6～8のいずれか1つの方法。
態様10．マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が以下：
(a) 対象由来のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料を取得又は提供すること；
(b) 該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；
(c) 該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、表1の各遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに
(d) 該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアが、
表1の各遺伝子についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は遺伝子のシグナル値と該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は表1中に列記されている）及び
該乗算の積を合計すること
によって決定される）
を含む、方法。
(a) 対象由来のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料を取得又は提供すること；
(b) 該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；
(c) 該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、表1の各遺伝子についての発現レベルを表すシグナル値を含む）；並びに
(d) 該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアが、
表1の各遺伝子についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は遺伝子のシグナル値と該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は表1中に列記されている）及び
該乗算の積を合計すること
によって決定される）
を含む、方法。
態様11．生存予測スコアが以下の式：
（前記式中：yは生存予測スコアであり、ciは遺伝子iの係数値であり、xiは遺伝子iのシグナル値である）によって決定される、態様10の方法。
態様12．遺伝子発現（RNA）データがNanoString Technologies（登録商標）nCounter（登録商標）アッセイを使用して取得される、態様10又は11の方法。
態様13．マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存転帰を予測する方法であって、以下：
(a) 態様10～12のいずれか1つにより対象の生存予測スコアを決定すること；並びに
(b) 該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：(i)良好な予後、(ii)中間の予後及び(iii)不良な予後の一つに属するとして分類すること
を含む、方法。
(a) 態様10～12のいずれか1つにより対象の生存予測スコアを決定すること；並びに
(b) 該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：(i)良好な予後、(ii)中間の予後及び(iii)不良な予後の一つに属するとして分類すること
を含む、方法。
態様14．マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存転帰を予測する方法であって、以下：
(a) 態様13により対象の生存予測スコアを決定すること；並びに
(b) 該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：(i)良好な予後（yが約-100000未満として計算される）、(ii)中間の予後（yが約-100000～約-32000の間として計算される）及び(iii)不良な予後（yが約-32000超として計算される）の一つに属するとして分類すること
を含む、方法。
(a) 態様13により対象の生存予測スコアを決定すること；並びに
(b) 該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：(i)良好な予後（yが約-100000未満として計算される）、(ii)中間の予後（yが約-100000～約-32000の間として計算される）及び(iii)不良な予後（yが約-32000超として計算される）の一つに属するとして分類すること
を含む、方法。
態様15．マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の治療を選択する方法であって、以下：
(a) 態様13又は14により対象を分類すること；
(b) 対象の分類に基づいて対象の治療を選択すること；及び
(c) 任意選択で、対象に治療を行うこと
を含む、方法。
(a) 態様13又は14により対象を分類すること；
(b) 対象の分類に基づいて対象の治療を選択すること；及び
(c) 任意選択で、対象に治療を行うこと
を含む、方法。
態様16．対象が良好な予後を有すると分類され、任意選択の治療が遅らされる、態様15の方法。
態様17．対象が不良な予後を有すると分類され、任意選択の治療が即座に施される、態様15の方法。
態様18．治療が、R-CHOP (リツキシマブ、シクロフォスファミド、ヒドロキシダウノルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン)の投与を含む、態様15～17のいずれか1つの方法。
態様19．マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存転帰を予測する方法であって、以下：
(a) 対象由来のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料を取得又は提供すること；
(b) 該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；
(c) 該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは表1の各遺伝子iについての発現レベルを表すシグナル値を含む）；及び
(d) 該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定することを含み、該生存予測スコアが以下の式：
(a) 対象由来のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料を取得又は提供すること；
(b) 該生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；
(c) 該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは表1の各遺伝子iについての発現レベルを表すシグナル値を含む）；及び
(d) 該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定することを含み、該生存予測スコアが以下の式：
（前記式中：yは生存予測スコアであり、ciは表1に列記された遺伝子iの係数値であり、xiは遺伝子iのシグナル値である）によって決定される、方法。
先の記載は実施形態の単なる例に過ぎないことに留意すべきである。他の例示的な実施形態は、本明細書の記載の全体から明らかである。これらの実施形態の各々が、本明細書で提供された他の実施形態との様々な組合せで使用され得ることは、当業者によっても理解される。
以下の実施例は本発明を更に説明するが、当然、決してその範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
本実施例は、本発明の実施形態に従って、MCLを有する患者を、異なる予後を有する臨床的に意義のある群に細分化することについて実証する。
方法
試験設計及び患者集団
MCLにおける増殖シグネチャについてのアッセイを開発し、特徴付ける方法についての全体の設計を図1に示す。試験は、MCLを有する患者由来の試料の後方視的な（retrospective）遺伝子発現プロファイリングを含んでおり、専門家の病理コンセンサスレビューによって確認した。新しいアッセイのトレーニングに寄与する生検は、LLMPPの臨床サイトから集めた追加的な51個（43個は凍結、8個はFFPE）の生検に加えて、Rosenwaldら（参照により本明細書に取り込まれるCancer Cell, 3:185-197 (2003)）に記載された80個の生検を含んでいた。腫瘍の含有量が少なくとも60%であるこれらの生検は、後に様々な治療レジメンを受けた患者から取得した。
方法
試験設計及び患者集団
MCLにおける増殖シグネチャについてのアッセイを開発し、特徴付ける方法についての全体の設計を図1に示す。試験は、MCLを有する患者由来の試料の後方視的な（retrospective）遺伝子発現プロファイリングを含んでおり、専門家の病理コンセンサスレビューによって確認した。新しいアッセイのトレーニングに寄与する生検は、LLMPPの臨床サイトから集めた追加的な51個（43個は凍結、8個はFFPE）の生検に加えて、Rosenwaldら（参照により本明細書に取り込まれるCancer Cell, 3:185-197 (2003)）に記載された80個の生検を含んでいた。腫瘍の含有量が少なくとも60%であるこれらの生検は、後に様々な治療レジメンを受けた患者から取得した。
従って、トレーニングの一部とみなされた3つの異なるデータセットがあった：(a)係数の生成及びカットポイントの生成のために使用した、Rosenwaldの論文由来の80個のAffymetrix試料（凍結）、(b)最初の評価前検証として、及びカットポイントを生成するためのセットの一部として使用した、43個の新しい凍結試料、並びに(c) モデルを調整してAffymetrixとNanostringとの間の相違を説明するために使用した47個のFFPE試料。セット(a)及び(b)は、全体的に相互に独立していたが、セット(c)の39個の試料は、セット(a)又はセット(b)のいずれかにおいてレプリケートしており、そのためセット(c)は8個の新しい試料を提供したのみであった。従って、全体で80個のRosenwaldの試料及び51（43＋8）個の非Rosenwaldの試料が存在した。
ブリティッシュ・コロンビア州がんセンター（BCCA）で治療された患者の独立コホートに由来する110個の治療前の生検を使用して、アッセイを評価した（表2、図2）。
表の略語：
ECOG：米国東海岸がん臨床試験グループ；LDH：乳酸脱水素酵素；MIPI：マントル細胞リンパ腫国際予後指標；UTR：非翻訳領域；R-CHOP：リツキシマブ並びにシクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン。
§：P値は、MCL35スコアによって決定した3つのリスク群の間の比較用である；
*：65歳以下の患者の％；
#：自己幹細胞移植により地固めする意志があった患者の％；
^：自己幹細胞移植により地固めする意志があった患者数に対する、自己幹細胞移植を受けた患者数の、群間での比較。
ECOG：米国東海岸がん臨床試験グループ；LDH：乳酸脱水素酵素；MIPI：マントル細胞リンパ腫国際予後指標；UTR：非翻訳領域；R-CHOP：リツキシマブ並びにシクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン。
§：P値は、MCL35スコアによって決定した3つのリスク群の間の比較用である；
*：65歳以下の患者の％；
#：自己幹細胞移植により地固めする意志があった患者の％；
^：自己幹細胞移植により地固めする意志があった患者数に対する、自己幹細胞移植を受けた患者数の、群間での比較。
BCCAリンパ系がんデータベースを使用して、2003～2012年の間にBCCAで、MCLと診断された患者を特定した。検証コホートに含めることには、60%以上の腫瘍内容物を有するリンパ節の診断切除FFPE生検、並びに診断生検の3ヶ月以内のR-CHOP (リツキシマブ、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン)を用いた治療が必要であった。リンパ腫細胞によってマントル帯の大半が囲まれた生検は除外した。従来のMCLの診断を確認するために、全ての生検を一元的に再検討し、全ての生検は免疫組織化学により、サイクリンD1に対して陽性であった（参照により本明細書に取り込まれる、Swerdlowら、World Health Organization Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.（第4版）Lyon, IARC Press (2008)）。この期間のBCCAの方針は、65歳以下の適切な患者に対して、自己幹細胞移植 (ASCT)による地固めを計画し、R-CHOPレジメンを使用して、MCLを治療することであった。ASCTによる地固めを受けなかった患者に対して、維持のリツキシマブを提供する方針(2年間、3ヶ月毎に375mg/m2を静脈内)は、2011年に導入された。試験は、ブリティッシュ・コロンビア大学-BCCA研究倫理委員会によって承認された。
遺伝子発現プロファイリング
アッセイのトレーニングにおいて使用したFF生検から抽出したRNAの遺伝子発現プロファイリングは、Affymetrix U133 plus 2.0マイクロアレイ (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA)上で行った。データは、www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgiで入手可能である。
製造業者の指示に従って、脱パラフィン後、QIAGEN AllPrep DNA/RNA/DNA FFPEキット (QIAGEN, Hilden, Germany)を使用して、FFPE生検の10 μm切片から核酸を抽出した。nCounterTMPrepStationの「高感度」設定、及びnCounterTMAnalyzer (第二世代)で490視野（又は第一世代のアナライザーを使用した場合は1,155視野）を使用して、NanoStringプラットフォーム (NanoString Technologies, Seattle, WA, USA)上で、200 ngのRNAにおける遺伝子発現を定量化した。18個のハウスキーピング遺伝子の幾何平均を使用して、RNAローディングの標準化を行った。この幾何平均が140より下の値であった試料は、失敗とみなした。
CCND1 3’UTRの状態を評価するために、CCND1のエキソン3及び3’非翻訳領域 (UTR)に対するプローブを使用した（以下を参照）。
アッセイのトレーニングにおいて使用したFF生検から抽出したRNAの遺伝子発現プロファイリングは、Affymetrix U133 plus 2.0マイクロアレイ (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA)上で行った。データは、www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgiで入手可能である。
製造業者の指示に従って、脱パラフィン後、QIAGEN AllPrep DNA/RNA/DNA FFPEキット (QIAGEN, Hilden, Germany)を使用して、FFPE生検の10 μm切片から核酸を抽出した。nCounterTMPrepStationの「高感度」設定、及びnCounterTMAnalyzer (第二世代)で490視野（又は第一世代のアナライザーを使用した場合は1,155視野）を使用して、NanoStringプラットフォーム (NanoString Technologies, Seattle, WA, USA)上で、200 ngのRNAにおける遺伝子発現を定量化した。18個のハウスキーピング遺伝子の幾何平均を使用して、RNAローディングの標準化を行った。この幾何平均が140より下の値であった試料は、失敗とみなした。
CCND1 3’UTRの状態を評価するために、CCND1のエキソン3及び3’非翻訳領域 (UTR)に対するプローブを使用した（以下を参照）。
免疫組織化学及びMIPI
Ventana Benchmark プラットフォーム(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA)上で、組織全体の切片でKi-67 IHC (MIB-1)を行い、参照により本明細書に取り込まれるKlapperら(J. Hematop., 2:103-11, (2009))の推奨に従って、生検毎に200細胞をカウントすることによってスコア化した。Ki-67 PIは、陽性の腫瘍細胞の割合として定義した。TP53 IHC (クローンDO-7)は、生検のFFPEブロックに由来するデュプリケートの0.6 mmのコアを含む組織マイクロアレイ上で行い、腫瘍細胞の核の強く均一な染色を陽性と定義した；全ての陽性の生検は、腫瘍細胞の30%より多くが染色されていた。参照により本明細書に取り込まれるHosterら(Blood, 111:558-565 (2008))によって、MIPIを計算した。
Ventana Benchmark プラットフォーム(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA)上で、組織全体の切片でKi-67 IHC (MIB-1)を行い、参照により本明細書に取り込まれるKlapperら(J. Hematop., 2:103-11, (2009))の推奨に従って、生検毎に200細胞をカウントすることによってスコア化した。Ki-67 PIは、陽性の腫瘍細胞の割合として定義した。TP53 IHC (クローンDO-7)は、生検のFFPEブロックに由来するデュプリケートの0.6 mmのコアを含む組織マイクロアレイ上で行い、腫瘍細胞の核の強く均一な染色を陽性と定義した；全ての陽性の生検は、腫瘍細胞の30%より多くが染色されていた。参照により本明細書に取り込まれるHosterら(Blood, 111:558-565 (2008))によって、MIPIを計算した。
統計分析
検証コホートに由来する遺伝子発現を評価する前に、統計分析の計画を具体化した。群間での患者における差の有意性及び病理学的特徴を調べるために、フィッシャーの直接確率検定及びクラスカル・ウォリスの直接確率検定を使用した。リバースセンサリング（reverse censoring）法（参照により本明細書に取り込まれる、Schemperら、Controlled Clinical Trials, 17:343-346, 1996）を使用して、追跡の中央値を推定した。試験の一次評価項目は、診断日から何らかの原因による死亡日までで計算した、全生存割合 (OS)であった。カプラン・マイヤー法を使用して、OSを推定した。方針として地固めASCTで治療する意志のあった患者に限定して、計画された亜群分析を行った。
検証コホートに由来する遺伝子発現を評価する前に、統計分析の計画を具体化した。群間での患者における差の有意性及び病理学的特徴を調べるために、フィッシャーの直接確率検定及びクラスカル・ウォリスの直接確率検定を使用した。リバースセンサリング（reverse censoring）法（参照により本明細書に取り込まれる、Schemperら、Controlled Clinical Trials, 17:343-346, 1996）を使用して、追跡の中央値を推定した。試験の一次評価項目は、診断日から何らかの原因による死亡日までで計算した、全生存割合 (OS)であった。カプラン・マイヤー法を使用して、OSを推定した。方針として地固めASCTで治療する意志のあった患者に限定して、計画された亜群分析を行った。
連続変数とOSとの間の関係を調べるために、コックスモデルを使用した一変量分析を行った。離散変数とOSとの間の関係を検定するために、ログ・ランク検定を使用した。他の変数と組合せて、変数とOSとの関連を検定するために、コックス比例ハザード回帰モデルスコア検定を使用した。P値＜0.05（片側）を有意とみなすことを予め定めた。
方法に関するより詳細な情報は以下に記載されている。
方法に関するより詳細な情報は以下に記載されている。
増殖シグネチャモデリング
カスタムLymphochipマイクロアレイの要素において既に研究された、80個の新鮮な凍結MCL生検の最初のセット（参照により本明細書に取り込まれる、Rosenwaldら、Cancer Cell, 3:185-197 (2003)）を、U133 plus 2.0プラットフォームを用いて分析し、MAS5.0ソフトウェアを用いて標準化し、log2変換した。各遺伝子について、ワルド検定の統計量を使用してその遺伝子発現と生存率との間の関連を推定し、遺伝子の発現間でピアソン相関を使用し、増殖シグネチャを計算した (図3)。
カスタムLymphochipマイクロアレイの要素において既に研究された、80個の新鮮な凍結MCL生検の最初のセット（参照により本明細書に取り込まれる、Rosenwaldら、Cancer Cell, 3:185-197 (2003)）を、U133 plus 2.0プラットフォームを用いて分析し、MAS5.0ソフトウェアを用いて標準化し、log2変換した。各遺伝子について、ワルド検定の統計量を使用してその遺伝子発現と生存率との間の関連を推定し、遺伝子の発現間でピアソン相関を使用し、増殖シグネチャを計算した (図3)。
増殖シグネチャを、FFPEデータに適用し得る予後ツールに変換するために、新鮮な凍結生検に由来するRNAに関する、対応するAffymetrix遺伝子発現データを伴う39個の生検を含む、47個のFFPE生検を集めた。69個の特徴的な遺伝子 (11個は良好な予後に関連し増殖シグネチャとは反相関であり、58個は不良な生存率と関連し増殖シグネチャとは正の相関があった）、並びに良好に発現し、標準化に使用し得るMCL試料間でのばらつきが小さかった30個のハウスキーパー遺伝子の初期セットを含む、NanoStringのコードセットを設計した。次いで、47個のFFPE試料に由来するRNAをNanoStringプラットフォーム上で分析し、それらの発現レベル、生検間でのばらつき及び対応するAffymetrix発現について一致していることについて、遺伝子を評価した。
これらの観察に基づいて、17個の予測遺伝子 (13個は増殖と相関し、4個は増殖と反相関する)及び18個のハウスキーピング遺伝子を含む、最終の改良されたコードセットを作製した。次いで、最終モデルが基づいたこの改良されたコードセットを用いて、47個のFFPE試料を再分析した。
最終的なFFPEモデルのテンプレートとして、Affymetrix U133 2.0アレイを用いて分析した、Rosenwald ら (Cancer Cell, 3:185-197 (2003))において記載された80個の新鮮な凍結MCL生検のセットについて、予測遺伝子を再評価した。MAS5.0を用いて、シグナル値を生成し、log2変換した。下記の式（式3）：
（前記式中：xijは試料jにおける遺伝子iのlog2変換したAffymetrixのシグナル値であり、ρiは遺伝子iとRosenwaldの増殖シグネチャとの間のピアソン相関であり、Ziは遺伝子iの発現と全生存期間との間の関連についてのワルドのZスコアである）に従って、遺伝子についての個人のモデルスコアを生成した。増殖と正の相関があるとして特定された13遺伝子に亘る合計である、正の予測スコアを生成し、増殖と負の相関があった4遺伝子に亘る合計である、負の予測スコアを生成した。以前に分析されていなかった43個のMCL生検の独立したセットに由来する、Affymetrixマイクロアレイデータに、このモデルを適用した。個々のシグネチャの両方が、この独立したデータセットに強い影響を示したことを確認した後（P<0.001）、123人の患者の全てを単一のデータセットにまとめ、2つのスコアを結合して単一の凍結Affymetrix増殖スコア (FAPS)にするために、コックス比例ハザードモデルを適合させた（fit）。次に、試料を、それらのFAPSに従って、3つの群に分ける、全ての可能な閾値の対を検討した。ログ・ランク検定によって測定されたように、3つの定義された群が、生存率と最も統計的に有意な関連性を有していた、閾値を選択した。243未満のスコアを有していたものを良好な予後群（低リスク）に入るとみなし、243～358の間のスコアを有していたものを中間の予後群（中間のリスク）に入るとみなし；及び358超のスコアを有していたものを不良な予後群（高リスク）に入るとみなした。上記は、FFPE NanoStringベースのモデルを導出したテンプレートとして機能した。
次いで、NanoStringコードセットを使用して、これらの遺伝子を分析した。ハウスキーパー遺伝子のカウントの幾何平均で、各試料のカウントを除算することによって、NanoStringデジタル遺伝子に特異的なカウントを標準化し、次いで、log2変換した。（全ての係数（標準化、増殖及び抗増殖）の合計がゼロになるように、標準化遺伝子についての値を0.75に設定する。このように、全ての遺伝子の均一なシグナルの増大を一定量だけ起こす、遺伝的な材料の増加は、モデルスコアに影響しない。）このデータに基づき、以下の式（式4）：
（前記式中：ρi及びZiは上記の通りであり、hijは試料jにおける遺伝子iについての標準化したNanoStringカウント（log2変換）を表し、λjは対応するNanoStringカウントとAffymetrixシグナル値との間のピアソン相関を表す）に従って、13個の正の相関及び4個の負の相関シグネチャに基づいて、2つのシグネチャを生成した。回帰は、2つのNanoStringベースの予測スコアと、対応する試料についてのFAPSとの間で適合し、それによりFAPSを模倣した最終の「MCL35」シグネチャが得られる。増殖及び抗増殖遺伝子についての値は、表3中で提供される。
上記は、以下の式1：
（前記式中：yは生存予測スコアであり、ciは遺伝子iの係数値であり、xiは遺伝子iのシグナル値である）として書き換えることができる。スコアjはyとして、ciは回帰近似を考慮に入れた係数を掛けたρiZiλjに等しく、hijはlog2(xi)として書き換えることができる。
FFPEモデルの分散が、凍結モデルのそれと一致するように、モデルをスケーリングした。全ての重み（weights）とスケーリングを、係数として表されるものにまとめた。18個の標準化遺伝子の重みを、全ての係数の総計が0と等しくなるように、選択された一定の値に設定し、それは、一定の割合で全ての発現値の均一な増加がスコアに影響しないように、効果的にデータを標準化した。結果として得られたFFPEスコアが386だけシフトすることが見出され、そのため等価的にシフトさせたカットポイントを、FFPEシグネチャに従って、以下の亜群に使用した：-143未満のモデルスコアを有するものの低リスク群；-143～-28の間のモデルスコアについての中間のリスク；及び-28超のモデルスコアについての高リスク。
それにより、FAPSのために最適化した閾値を、それらのMCL35シグネチャによって、試料を低リスク、標準リスク及び高リスク群に分けるために直接的に使用し得る。次いで、遺伝子の係数、調整及び閾値を含むモデルを「固定（locked）」し、患者の独立コホート中で検証した。表4及び5は、それぞれ、独立検証コホートについての転帰のデータ及びMCL35アッセイのデジタル発現データを含む。
CCND1 3’UTR分析
CCND1 mRNA（転写産物）の3’UTRのトランケーションによって、mRNA安定性の増大、より高いレベルのCCND1 mRNAレベル、より高い増殖が導かれる。CCND1転写産物の分解を制御する2つの推定領域の位置は、AREエレメントとmiR-16の予測結合部位である。エキソン3及び3’UTR中の2つの領域に対するプローブを使用して、CCND1のトランケート3’UTR転写産物の検出を行った（図4A及び表5を参照）。簡易には、18個のハウスキーピング遺伝子の幾何平均を使用して、遺伝子発現を標準化し、エキソンプローブの標準化した遺伝子発現カウント（log2）を、3’UTRプローブのそれから引いた。トランケート3’UTRが存在する生検を定義するために使用した閾値を図4B中に示す。低い及びやや低い3’UTR発現を伴う症例のMCL35スコアは、転帰と同様、同等であり、このことは、図5A及び5Bに示された、これらの症例の群分けが正しいという根拠を示した（それぞれ図4C及び4Dを参照）。上流の3’UTRプローブの発現が、エキソンプローブのものと同じレベルである一方で、下流の3’UTRプローブが低い2つの症例があった。これらの症例は、トランケート3’UTRを有するとして定義された群の中に含めなかった。
CCND1 mRNA（転写産物）の3’UTRのトランケーションによって、mRNA安定性の増大、より高いレベルのCCND1 mRNAレベル、より高い増殖が導かれる。CCND1転写産物の分解を制御する2つの推定領域の位置は、AREエレメントとmiR-16の予測結合部位である。エキソン3及び3’UTR中の2つの領域に対するプローブを使用して、CCND1のトランケート3’UTR転写産物の検出を行った（図4A及び表5を参照）。簡易には、18個のハウスキーピング遺伝子の幾何平均を使用して、遺伝子発現を標準化し、エキソンプローブの標準化した遺伝子発現カウント（log2）を、3’UTRプローブのそれから引いた。トランケート3’UTRが存在する生検を定義するために使用した閾値を図4B中に示す。低い及びやや低い3’UTR発現を伴う症例のMCL35スコアは、転帰と同様、同等であり、このことは、図5A及び5Bに示された、これらの症例の群分けが正しいという根拠を示した（それぞれ図4C及び4Dを参照）。上流の3’UTRプローブの発現が、エキソンプローブのものと同じレベルである一方で、下流の3’UTRプローブが低い2つの症例があった。これらの症例は、トランケート3’UTRを有するとして定義された群の中に含めなかった。
一致分析（Concordance analysis）
17個の試料に由来する3レプリケート間のMCL35スコアの平均標準偏差を計算することによって、技術的なばらつき（variability）（実験室内でのばらつき）を評価した（図6）。1つの極度の外れ値のレプリケートが検出され、分析から除去したが、ばらつき全体に対しは無視できる影響であることが見出された（以下を参照）。実験室間のばらつきは、推定された技術的なばらつきによって調整した17個の試料に対する実験室間での平均分散から計算した。バンクーバーのMCL35スコア、並びにバルセロナ及びビュルツブルグのMCL35スコアの平均の間の平均差を計算することによって、バイアス（bias）を推定した。信頼区間は、推定された技術的及び実験室間でのばらつきに基づいて計算した。異なる実験室でレプリケートした、同じ患者の試料間の一致の尤度（likelihood of agreement）をモデル化するために、真のモデルスコアは、検証セット上で観察されたモデルスコアの経験分布に従って、分布すると仮定した。誤差は、（仮定レプリケートの両方におけるばらつきの可能性を説明するために）技術的ばらつき＋実験室間のばらつきの合計に2を掛けたものに等しい分散を伴って正規分布していると仮定した。このモデルに基づいて、この追加的なノイズによって、試料が、一方のリスク群からもう一方へと閾値をまたぐことになる尤度（likelihood that that）を計算した。
17個の試料に由来する3レプリケート間のMCL35スコアの平均標準偏差を計算することによって、技術的なばらつき（variability）（実験室内でのばらつき）を評価した（図6）。1つの極度の外れ値のレプリケートが検出され、分析から除去したが、ばらつき全体に対しは無視できる影響であることが見出された（以下を参照）。実験室間のばらつきは、推定された技術的なばらつきによって調整した17個の試料に対する実験室間での平均分散から計算した。バンクーバーのMCL35スコア、並びにバルセロナ及びビュルツブルグのMCL35スコアの平均の間の平均差を計算することによって、バイアス（bias）を推定した。信頼区間は、推定された技術的及び実験室間でのばらつきに基づいて計算した。異なる実験室でレプリケートした、同じ患者の試料間の一致の尤度（likelihood of agreement）をモデル化するために、真のモデルスコアは、検証セット上で観察されたモデルスコアの経験分布に従って、分布すると仮定した。誤差は、（仮定レプリケートの両方におけるばらつきの可能性を説明するために）技術的ばらつき＋実験室間のばらつきの合計に2を掛けたものに等しい分散を伴って正規分布していると仮定した。このモデルに基づいて、この追加的なノイズによって、試料が、一方のリスク群からもう一方へと閾値をまたぐことになる尤度（likelihood that that）を計算した。
MCL35スコアの外れ値
実験室内でのばらつきを試験するために使用した、トリプリケート・ランの1つに由来する単一のスコアを外れ値と認定した（図6Bの囲ったドット、また図7も参照）。個々のレプリケートの平均値からの差の分布の検討は、4.06ポイントの標準偏差を示した。この外れ値は、そのトリプリケート・ランの平均値から13.8ポイントであったので、それは極端な外れ値 (P<0.001)となった。これが生検の特性であったかどうかを決定するために、生検の独立したスクロール（scrolls）を、バルセロナ及びビュルツブルグの実験室に送付した。これらの実験室でトリプリケート・ランで行ったMCL35スコアによって、予想範囲内に収まった、平均値からの差が示されたので、この外れ値の原因は生物学的というよりむしろ技術的である可能性が高いとした。
実験室内でのばらつきを試験するために使用した、トリプリケート・ランの1つに由来する単一のスコアを外れ値と認定した（図6Bの囲ったドット、また図7も参照）。個々のレプリケートの平均値からの差の分布の検討は、4.06ポイントの標準偏差を示した。この外れ値は、そのトリプリケート・ランの平均値から13.8ポイントであったので、それは極端な外れ値 (P<0.001)となった。これが生検の特性であったかどうかを決定するために、生検の独立したスクロール（scrolls）を、バルセロナ及びビュルツブルグの実験室に送付した。これらの実験室でトリプリケート・ランで行ったMCL35スコアによって、予想範囲内に収まった、平均値からの差が示されたので、この外れ値の原因は生物学的というよりむしろ技術的である可能性が高いとした。
試料スコアが、観察した検証セットと同様に分布したと仮定し、この離れたところにある（outlying）試料で観察されたサイズの誤差でさえ、予測されるクラスの変化は、時間のわずか4.3％に過ぎず、そのため低頻度であるこの強度の外れ値（85試験中に約1）の可能性を含めても、モデルの全体的な推定の再現性において、全体として無視できる影響しかない。
結果
MCL35アッセイの開発
増殖シグネチャは、元々、カスタムLymphochipマイクロアレイ上で、92個のFF組織生検に由来するRNAに基づいて定義された遺伝子発現を使用して、記載された (Rosenwaldら、Cancer Cell, 3:185-197 (2003))。新たなアッセイの生成に向けた第一段階において、Affymetrix U133 plus 2.0マイクロアレイを使用して、基となる92個のFF RNA試料に由来する80個の入手可能な試料で、遺伝子発現を行った。これらのアレイは、コードゲノムのより広い範囲をカバーしているからである。個々の遺伝子の発現と増殖シグネチャとの相関と、遺伝子発現と全生存期間との間の関係性（単変量のコックスモデル由来のZスコアとして表される）との比較を図3に示す。観察された強い関連性（r2＝0.82）により、増殖シグネチャがMCLの遺伝子発現中に存在する多くの予後情報を包含していることが示唆される。更に、元々の増殖シグネチャは、専ら、増殖スコアが高い生検において過剰発現していた遺伝子を含んでいた一方で、多くの遺伝子がこれらの生検中において過小に発現していることは明らかである。それにより「バランスの取れた」遺伝子発現モデルを設計することが可能となる。30個の潜在的なハウスキーピング遺伝子と共に、69個の目的の遺伝子を、本分析、及びMCLにおける遺伝子発現と転帰との間の関係を記載している他の公表された研究 (参照により本明細書に取り込まれる、Kienleら、J. Clin. Oncol., 25:2770-2777 (2007)及びHartmannら、J. Clin. Oncol., 26:4966-4972 (2008))に基づいて、更なるアッセイ開発のために選択した（表6を参照）。
MCL35アッセイの開発
増殖シグネチャは、元々、カスタムLymphochipマイクロアレイ上で、92個のFF組織生検に由来するRNAに基づいて定義された遺伝子発現を使用して、記載された (Rosenwaldら、Cancer Cell, 3:185-197 (2003))。新たなアッセイの生成に向けた第一段階において、Affymetrix U133 plus 2.0マイクロアレイを使用して、基となる92個のFF RNA試料に由来する80個の入手可能な試料で、遺伝子発現を行った。これらのアレイは、コードゲノムのより広い範囲をカバーしているからである。個々の遺伝子の発現と増殖シグネチャとの相関と、遺伝子発現と全生存期間との間の関係性（単変量のコックスモデル由来のZスコアとして表される）との比較を図3に示す。観察された強い関連性（r2＝0.82）により、増殖シグネチャがMCLの遺伝子発現中に存在する多くの予後情報を包含していることが示唆される。更に、元々の増殖シグネチャは、専ら、増殖スコアが高い生検において過剰発現していた遺伝子を含んでいた一方で、多くの遺伝子がこれらの生検中において過小に発現していることは明らかである。それにより「バランスの取れた」遺伝子発現モデルを設計することが可能となる。30個の潜在的なハウスキーピング遺伝子と共に、69個の目的の遺伝子を、本分析、及びMCLにおける遺伝子発現と転帰との間の関係を記載している他の公表された研究 (参照により本明細書に取り込まれる、Kienleら、J. Clin. Oncol., 25:2770-2777 (2007)及びHartmannら、J. Clin. Oncol., 26:4966-4972 (2008))に基づいて、更なるアッセイ開発のために選択した（表6を参照）。
選択基準の欄は、遺伝子を含める決定のためのソースを示す。これらには、2稿（Kienleら、J. Clin. Oncol., 25:2770-2777 (2007)及びHartmannら、J. Clin. Oncol., 26:4966-4972 (2008)）並びに上記及び図3に示されたRosenwaldら、Cancer Cell, 3:185-197 (2003)由来の80個の生検の再分析が含まれる。
分析の一部であったが表1の改良した遺伝子リストの一部としては使用されず、それらの非存在又は存在によってセットに僅かな影響を与える可能性がある遺伝子を、以下の表7中に示す。
FF生検由来のRNAに関して、対応するAffymetrix遺伝子発現データを有する、39個全ての好適な生検を含む、47個のFFPE生検から抽出したRNAにおいて、これらの99遺伝子を定量化するために、デジタル遺伝子発現を行った。以下の基準に基づいて、17個の遺伝子を、増殖シグネチャをレプリケートするために選択した：NanoString（FFPE）プラットフォームとAffymetrix（FF）プラットフォームとで高い相関を有すること、NanoStringプラットフォームにおいて中間～高い発現をしていること、及び試料間で大きなばらつきを有すること。18個のハウスキーピング遺伝子もまた、試料間で小さなばらつきを有し、中間～高い発現レベルを有することに基づいて選択した。次いで、これらの35遺伝子を含む、より小さいコードセットを使用して、同じ47個のFFPE RNA試料において、デジタル遺伝子発現を行った。
18個のハウスキーピング遺伝子を用いて標準化した後、Rosenwaldら、Cancer Cell, 3:185-197 (2003)によって記載された増殖シグネチャスコアをレプリケートするために、17個の増殖遺伝子の発現を使用して、モデルを開発した。Rosenwaldら、Cancer Cell, 3:185-197 (2003)由来の80個の生検を含む、123個のFF生検由来のAffymetrixデータを使用して、異なる転帰（即ち、OS）を有する3つの群を定義するための最適な閾値を決定した (図8)。次いで、MCL35アッセイと名付けた、遺伝子係数及び閾値を含む最終モデルを固定し、患者の独立コホートにおいて検証した。
MCL35アッセイはR-CHOPを用いて治療した患者において予後診断的である
次いで、MCL35アッセイを、BCCAにおいて、ASCTあり又はなしで、R-CHOPを用いて治療した110人の患者に由来する、前処理した、FFPEリンパ節の生検に適用した (表2、図2)。生検のうち、108個 (98%)において、十分な遺伝子発現が得られた。連続変数として、MCL35スコアは、OSと有意に関連していた (単変量P<0.001、HarrellのC指標0.74 (95% CI、0.66～0.82))。アッセイによって、28人 (26%)の患者が、高リスク群、31人 (29%)が標準リスク群、49人(45%)が低リスク群に割り当てられた。これらの3つの群間で、転帰は有意に異なっていて、高リスク群、標準リスク群及び低リスク群において、それぞれ1.1年、2.6年及び8.6年のOS中央値であった（傾向ログ・ランク、P＜0.001、図5A）。
形態学的特徴 (多形性及び芽球様異型（pleomorphic and blastoid variants）)、IHCによるTP53陽性並びにトランケート3’UTRを有するCCND1 mRNAの存在 (表2)を含む、認識された高リスクMCLの特徴は、高リスク群で、より頻繁にみられた。計画された亜群分析では、アッセイはまた、R-CHOPに引き続き、地固めASCTを用いて治療する意志があった65歳以下の患者において、有意に異なるOSを有する群も定義した。この群においては、OSの中央値は、高リスク群、標準リスク群及び低リスク群において、それぞれ1.4年、5.9年及び未達であった（傾向ログ・ランク、P<0.001、図5B）。MIPIはまた、総合的な検証コホートにおいて、有意に異なるOSを有する患者の群も特定した（傾向ログ・ランク、P<0.001、HarrellのC-指標0.74 (95% CI、0.66～0.82)）。多変量解析では、MCL35及びMIPIの両方は、変数が連続的であるか又はグループ化されていたかには関わりなく、独立にOSに貢献した (両変数についてP<0.001)。表8を参照のこと。
次いで、MCL35アッセイを、BCCAにおいて、ASCTあり又はなしで、R-CHOPを用いて治療した110人の患者に由来する、前処理した、FFPEリンパ節の生検に適用した (表2、図2)。生検のうち、108個 (98%)において、十分な遺伝子発現が得られた。連続変数として、MCL35スコアは、OSと有意に関連していた (単変量P<0.001、HarrellのC指標0.74 (95% CI、0.66～0.82))。アッセイによって、28人 (26%)の患者が、高リスク群、31人 (29%)が標準リスク群、49人(45%)が低リスク群に割り当てられた。これらの3つの群間で、転帰は有意に異なっていて、高リスク群、標準リスク群及び低リスク群において、それぞれ1.1年、2.6年及び8.6年のOS中央値であった（傾向ログ・ランク、P＜0.001、図5A）。
形態学的特徴 (多形性及び芽球様異型（pleomorphic and blastoid variants）)、IHCによるTP53陽性並びにトランケート3’UTRを有するCCND1 mRNAの存在 (表2)を含む、認識された高リスクMCLの特徴は、高リスク群で、より頻繁にみられた。計画された亜群分析では、アッセイはまた、R-CHOPに引き続き、地固めASCTを用いて治療する意志があった65歳以下の患者において、有意に異なるOSを有する群も定義した。この群においては、OSの中央値は、高リスク群、標準リスク群及び低リスク群において、それぞれ1.4年、5.9年及び未達であった（傾向ログ・ランク、P<0.001、図5B）。MIPIはまた、総合的な検証コホートにおいて、有意に異なるOSを有する患者の群も特定した（傾向ログ・ランク、P<0.001、HarrellのC-指標0.74 (95% CI、0.66～0.82)）。多変量解析では、MCL35及びMIPIの両方は、変数が連続的であるか又はグループ化されていたかには関わりなく、独立にOSに貢献した (両変数についてP<0.001)。表8を参照のこと。
Ki-67 PIとMCL35スコアとの間には有意な正の相関があった (r2＝0.72)。連続的変数として、Ki-67 PIはOSと有意に関連していた (単変量P<0.001；HarrellのC-指標、0.69 [95% CI、0.61～0.77])。既に公開された閾値（参照により本明細書に取り込まれる、Determannら、Blood, 111:2385-2387 (2008)）を適用すると、55個（50%）の生検はKi-67 PI≧30%を有し、38個（35%）の生検は10%～29%のKi-67 PIを有し、17個（15%）の生検はKi-67 PI<10%を有していた。Ki-67 PI≧30%は、より劣ったOS（中央値2.2年；Ki-67 PI 10%～29%に対するログ・ランク、P<0.001）に関連していた一方で、Ki-67 PIが10%～29%及び<10%であった場合は、OSの長さは互いに有意に異なっていなかった（中央値はそれぞれ6年及び7.2年；ログ・ランクP=0.75）。多変量コックスモデルにおいては、MCL35アッセイの結果に関して調整した場合、Ki-67 PI (P＝0.36)は予後診断に役立たなかった一方で、Ki-67 PIに関して調整した場合、MCL35は変数が連続的であるか、又はグループ化されているかに関わりなく（Ki-67 PI群：0％～29％及び≧30％）役立った (P＜0.001)。表9並びに図9A及び9Bを参照のこと。
MCL35アッセイの分析の妥当性
次いで、MCL35アッセイの実験室内及び実験室間での再現性を決定するための実験を行った。MCL35スコアが集団全体に均等に分布していた(図6A)ことに基づいて、17個の生検を選択し、従って、検証コホートにおけるMCL35スコアの分布を代表していた。実験室内比較のために、これらの生検の各々に由来するRNAをトリプリケート・ランでMCL35アッセイに供した（各ランは、様々な一定分量のRNA及び様々なNanoStringカートリッジに対して行った）。結果によって、トリプリケート間で、リスク群割り当ての100％一致が示された（図6B）。1つの外れ値の結果が観察され、遺伝子発現が他のレプリケートと異なっていた。この外れ値の結果は、更なる分析から除外した。検証コホート全体の586ポイントのスコア範囲と比較して、実験室内誤差の標準偏差は4ポイントであった。実験室間の比較に関しては、17個の生検由来の組織のスクロールは、バルセロナ（スペイン）及びビュルツブルグ（ドイツ）の2つの独立した実験室に配布し、そこでRNAを抽出し、MCL35アッセイを行った。リスク群割当の100%一致がみられ、バンクーバー（BC、カナダ）の実験室のトリプリケートの結果の平均と比較して、有意な偏りは見られなかった（偏りの95％信頼区間（CI）：バルセロナ-6.1～0.6；ビュルツブルグ-3.7～3.0ポイント）。実験室間誤差の標準偏差は3ポイントであり、それにより全体的な（実験室内＋実験室間）誤差の標準偏差は5ポイントであった。少数の試料の調査によって集団に対する一致の不正確な推定値が提供されることを踏まえ、本試験におけるMCL35スコアの分布及び計算された誤差の分布を使用して、多数の集団に対して、実験室間のリスク群割当の一致度を推定した（上記を参照）。このモデルによって、生検の1.2%が実験室間でリスク群割当が変化することが推定された。サプリメント（supplement）は、外れ値の結果が保持された場合のこれらの分析を含んでいる。
MCL35アッセイ用のRNA入力の下限を決定するために、同じ17個の生検に由来するRNAを、100 ng、50 ng (デュプリケート)及び25 ngの入力を用いたアッセイに供した（図10A～10C）。200 ngでのトリプリケートの平均値と比較して、100及び50 ngにおいて、有意な偏りは観察されなかった。しかしながら、25 ngでは、MCL35スコアがより高くなる一貫した傾向があった。
次いで、MCL35アッセイの実験室内及び実験室間での再現性を決定するための実験を行った。MCL35スコアが集団全体に均等に分布していた(図6A)ことに基づいて、17個の生検を選択し、従って、検証コホートにおけるMCL35スコアの分布を代表していた。実験室内比較のために、これらの生検の各々に由来するRNAをトリプリケート・ランでMCL35アッセイに供した（各ランは、様々な一定分量のRNA及び様々なNanoStringカートリッジに対して行った）。結果によって、トリプリケート間で、リスク群割り当ての100％一致が示された（図6B）。1つの外れ値の結果が観察され、遺伝子発現が他のレプリケートと異なっていた。この外れ値の結果は、更なる分析から除外した。検証コホート全体の586ポイントのスコア範囲と比較して、実験室内誤差の標準偏差は4ポイントであった。実験室間の比較に関しては、17個の生検由来の組織のスクロールは、バルセロナ（スペイン）及びビュルツブルグ（ドイツ）の2つの独立した実験室に配布し、そこでRNAを抽出し、MCL35アッセイを行った。リスク群割当の100%一致がみられ、バンクーバー（BC、カナダ）の実験室のトリプリケートの結果の平均と比較して、有意な偏りは見られなかった（偏りの95％信頼区間（CI）：バルセロナ-6.1～0.6；ビュルツブルグ-3.7～3.0ポイント）。実験室間誤差の標準偏差は3ポイントであり、それにより全体的な（実験室内＋実験室間）誤差の標準偏差は5ポイントであった。少数の試料の調査によって集団に対する一致の不正確な推定値が提供されることを踏まえ、本試験におけるMCL35スコアの分布及び計算された誤差の分布を使用して、多数の集団に対して、実験室間のリスク群割当の一致度を推定した（上記を参照）。このモデルによって、生検の1.2%が実験室間でリスク群割当が変化することが推定された。サプリメント（supplement）は、外れ値の結果が保持された場合のこれらの分析を含んでいる。
MCL35アッセイ用のRNA入力の下限を決定するために、同じ17個の生検に由来するRNAを、100 ng、50 ng (デュプリケート)及び25 ngの入力を用いたアッセイに供した（図10A～10C）。200 ngでのトリプリケートの平均値と比較して、100及び50 ngにおいて、有意な偏りは観察されなかった。しかしながら、25 ngでは、MCL35スコアがより高くなる一貫した傾向があった。
考察
有意に異なる死亡リスクの患者群を特定するMCL35アッセイの臨床的信頼性を、均質に治療された患者の独立コホートにおいて実証した。該アッセイは、R-CHOPで治療した患者における強力な予後バイオマーカーであることが実証され、それにより悪い転帰又は優れた転帰を伴う患者のかなりの大きさの群が特定される。更に、アッセイの予後診断能力は、ASCTを用いて地固めする計画があった、より若い患者において維持された。
有意に異なる死亡リスクの患者群を特定するMCL35アッセイの臨床的信頼性を、均質に治療された患者の独立コホートにおいて実証した。該アッセイは、R-CHOPで治療した患者における強力な予後バイオマーカーであることが実証され、それにより悪い転帰又は優れた転帰を伴う患者のかなりの大きさの群が特定される。更に、アッセイの予後診断能力は、ASCTを用いて地固めする計画があった、より若い患者において維持された。
オリジナルの増殖シグネチャと類似して、該アッセイは、芽球様及び多形性の形態、TP53過剰発現、並びにCCND1 mRNA（転写産物）の3’UTRのトランケーションを含む、確立された高リスクの疾患の特徴の効力を構成する。更に、該アッセイの予後診断能力は、MIPIとは独立していた。
本研究は、従来型のMCLを有する患者の大部分を包含する、腫瘍内容物≧60%であるリンパ節生検に限定された。腫瘍内容物が少ないか、又は節外部位に由来する生検におけるアッセイの臨床的信頼性を確立するための更なる研究が求められている。同様に、本研究は、臨床の実験室の大部分で使用されている方法論である、ホルマリン中で固定した生検を専ら使用した。アッセイの成果が、代替的な固定方法によって影響を受けるかどうかを決定するための更なる研究が必要である。末梢血中のMCL細胞の増殖は、普遍的ではないが、典型的には、同程度のリンパ節浸潤物中より低い；この効果は、リンパ節からの退出時に消散する、腫瘍の微小環境によって、悪性細胞のNF-κB経路が活性化されることを反映すると考えられる。異なる腫瘍区分の間での、増殖に関する、この一貫性のない関係によって、アッセイパラメーターの変更が必要となり得、末梢血試料におけるMCL35アッセイの臨床的信頼性に影響する場合がある。同様に、アッセイが、該疾患の稀な白血病非結節性サブタイプにおいて臨床的信頼性を有するかどうかもまた知られていない。
実験室内及び実験室間でのばらつきの両方を試験することによって、アッセイの分析的妥当性が実証され、それにより実験室間で1.2％と推定された非常に低い不一致率を示した。この再現性は、リンパ腫において、実験室間及びオブザーバ間で高い変動性を有する、増殖シグネチャの代理マーカーとしてのKi67 PIに関する公表された文献とは著しく対照的である。本研究は、この代理マーカーを用いた新しいアッセイの臨床的信頼性を直接的に比較するために、設計されておらず、又は機能を提供されなかったが、MCL35アッセイはペアワイズ多変量解析におけるKi67 PIの予後診断能力（prognostic power）を組み込んでいた。最終的に、50 ngにまでRNAローディングを下げても、感知できるほどの明らかな偏りがないことの実証によって、アッセイを、針生検を含む組織生検の大部分に適用することが可能となった。
患者の転帰を改善することによって定義される臨床的有用性は、バイオマーカーの、臨床的管理の指針となる能力に依存する。均質に治療された集団でテストされたので、本研究の設計は、予測バイオマーカーとしてのアッセイを確立しないと理解される。予測バイオマーカーとしてのMCL35アッセイを確立するために、実験的な治療レジメンの有効性をテストする臨床試験から、前向き研究で収集した試料に適用する必要がある。効果的な治療選択肢の範囲が増加するとともに、この疾患における非常に様々な治療の転帰を認識することによって、リスクの層別アプローチが魅力的なものとなり、それにより毒性がある及び／又は高価な治療が、最大の利益が生じる患者に提供される。
本明細書中で引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個別にかつ具体的に参照により本明細書中に組み入れられることが示され、本明細書中にその全体が記載されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を記載する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「a」及び「an」及び「the」及び「少なくとも1つ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数及び複数形の両方を含むものとして解釈されるべきである。1以上の項目の列記が続く、用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「A及びBの少なくとも1つ」）は、本明細書に別段の記載がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、列記された項目から選択された１つの項目（A又はB）、又は列記された項目の2以上の任意の組合せ（A及びB）を意味するものとして解釈されるべきである。「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」及び「含有する（containing）」という用語は、別段の記載がない限り、制限のない用語（open-ended terms）（即ち、「含むが、これに限定されない（including, but not limited to）」を意味する）として解釈されるべきである。また、「含む（comprising）」（又はそれに均等なもの）が記載される全ての箇所において、「含む（comprising）」は、「から本質的になる（consisting essentially of）」及び「からなる（consisting of）」を取り込むとみなされる。従って、（1つの）要素（複数可）を「含む（comprising）」一実施形態は、記載された要素（複数可）「から本質的になる（consisting essentially of）」及び「からなる（consisting of）」実施形態をサポートする。「から本質的になる」が記載される全ての箇所においては、「からなる」がとりこまれているとみなされる。従って、（1つの）要素（複数可）「から本質的になる」実施形態は、記載された要素（複数可）「からなる」実施形態をサポートする。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、単に範囲内の各別個の値を個別に指す簡略方法として役立つことを意図しており、本明細書において個々の値は、それぞれ個別に列挙されているかのように、個々の値は、明細書に取り込まれる。本明細書中に記載された全ての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は特に文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施し得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば「等（such as）」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠であるとして、特許請求されていない任意の要素を示すものと解釈されるべきではない。
本発明を実施するための、本発明者が知るベストモードを含む、本発明の好ましい実施形態は、本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読むことで当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用することを予測し、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図する。従って、本発明は適用法によって許容されるように、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載された主題の全ての改変及び均等物を含む。更に、本明細書中で別段の指示がない限り、又は特に文脈によって明らかに矛盾しない限り、それらの全ての可能な変形における上記要素の任意の組合せが本発明に包含される。
Claims (11)
- マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が以下：
(a) 対象のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；
(b) 該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、以下の表：
(c) 該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコア
は、
(b)の表中に列記された各遺伝子についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は遺伝子のシグナル値の対数変換と該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は(b)の表中に列記されている）及び
該乗算の積を合計すること
によって決定される）
を含む、方法。 - 前記RNAの遺伝子発現データがNanoString Technologies（登録商標）nCounter（登録商標）アッセイを使用して取得される、請求項1に記載の方法。
- マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存転帰の予測を補助する方法であって、以下：
(a) 請求項1又は2に記載される方法により対象の生存予測スコアを決定すること（生存予測スコアは以下の式：
によって決定される）
；並びに
(b) 該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：(i)良好な予後（生存予測スコアが-143未満として計算される）、(ii)中間の予後（生存予測スコアが-143～-28の間として計算される）、及び(iii)不良な予後（生存予測スコアが-28超として計算される）の一つに属するとして分類すること
を含む、方法。 - 前記生検試料がリンパ節のものである、請求項1～3のいずれか１項に記載の方法。
- マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存予測スコアを決定する方法であって、該方法が以下：
(a) 対象のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料からRNAの遺伝
子発現産物を単離すること；
(b) 該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは、以下の表：
(c) 該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（該生存予測スコアは、
(b)の表中に列記された各遺伝子についての乗算の積を計算すること（該乗算の積は遺伝子のシグナル値と該遺伝子についての係数値との数学的積であり、遺伝子についての該係数値は(b)の表中に列記されている）及び
該乗算の積を合計すること
によって決定される）
を含む、方法。 - 前記RNAの遺伝子発現データがNanoString Technologies（登録商標）nCounter（登録商標）アッセイを使用して取得される、請求項5に記載の方法。
- マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存転帰の予測を補助する方法であって、以下：
(a) 請求項5又は6に記載される方法により対象の生存予測スコアを決定すること（生存予測スコアは以下の式：
によって決定される）；並びに
(b) 該対象を、生存予測スコアに基づいて、以下の群：(i)良好な予後（生存予測スコアが-100000未満として計算される）、(ii)中間の予後（生存予測スコアが-100000～-32000の間として計算される）及び(iii)不良な予後（生存予測スコアが-32000超として計算される）の一つに属するとして分類すること
を含む、方法。 - 前記生検試料がリンパ節のものである、請求項5～7のいずれか１項に記載の方法。
- マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存転帰の予測を補助する方法であって、以下：
(a) 対象のホルマリン固定及びパラフィン包埋 (FFPE)の生検試料からRNAの遺伝子発現産物を単離すること；
(b) 該RNAの遺伝子発現産物から遺伝子発現データを取得すること（該遺伝子発現データは以下の表：
(c) 該遺伝子発現データから生存予測スコアを決定すること（生存予測スコアは以下の式：
（前記式中：yは生存予測スコアであり、ciは(b)の表中に列記された遺伝子iの係数値であり、xiは遺伝子iのシグナル値である）
によって決定される）
を含む、方法。 - 前記生検試料がリンパ節のものである、請求項9に記載の方法。
- マントル細胞リンパ腫 (MCL)を有するヒト対象の生存予測スコアを決定するためのキットであって、
以下の表：
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