JP7075170B2 - 延長された単一ガイドｒｎａ及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、延長されたガイドＲＮＡ及びこれを含む塩基校正用組成物；及び該塩基校正用組成物を用いた塩基校正方法及び遺伝子改変動物又は植物の製造方法に関する。
遺伝子編集技術は、バクテリオファージの感染によってバクテリオファージの断片をＤＮＡとして記憶しているが、２次感染された時、遺伝子ハサミの役割を担うヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９：ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）で該当のＤＮＡを切り除く免疫システムで始まった。これは、ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ，ｇＲＮＡ）が特定塩基配列を認識すると、Ｃａｓ９タンパク質が該当の部位を切って直し得る遺伝子校正技術へと発展した（Ｒａｎ ＦＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，８：２２８１－２３０８，２０１３，Ｗｏｏ ＪＷ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３：１１６２－１１６４，２０１５）。
既存のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子ハサミを変形して作られた塩基校正遺伝子ハサミ（Ｂａｓｅ－ｅｄｉｔｏｒ）は、ＤＮＡの両鎖を切らずに特定塩基を変えることができるという点で最近注目を受けている技術である。塩基校正遺伝子ハサミは、標的ＤＮＡと相補的な配列を有するｓｇＲＮＡによって標的位置に結合した後、反対側に露出される単一鎖ＤＮＡに作動可能なデアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）によってシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に、又はアデニン（Ａ）をヒポキサンチン（Ｉ）に変える。変わった塩基はＤＮＡ修復過程及び複製過程中にチミン（Ｔ）とグアニン（Ｇ）に変わり、結果的にシトシン（Ｃ）－＞チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）－＞グアニン（Ｇ）にＤＮＡ特定塩基を校正することができる。この時、遺伝子ハサミ（Ｂａｓｅ－ｅｄｉｔｏｒ）が作動可能な塩基校正範囲（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ）は、ＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）からプロトスペーサー（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）方向に１３～１７番目離れた位置と知られており、これを外れた範囲では効率が非常に低下する（図１ａ）。
そこで、本発明者らは、上記の問題点を補完するために、塩基校正遺伝子ハサミの標的位置を指定するｓｇＲＮＡの形態及び長さを変形させる場合、塩基校正遺伝子ハサミの作動範囲をより拡張させ得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、塩基校正遺伝子ハサミの作動範囲をより拡張させることができる延長されたガイドＲＮＡを提供することにある。
本発明の他の目的は、デアミナーゼ、標的特異的ヌクレアーゼ、及び延長されたガイドＲＮＡを含む、塩基校正遺伝子ハサミの作動範囲をより拡張させることができる塩基校正用組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記塩基校正用組成物を用いた塩基校正方法に関する。
本発明のさらに他の目的は、前記塩基校正用組成物を用いた遺伝子改変動物又は植物の製造方法に関する。
前記目的を達成するために、本発明は、標的配列とハイブリダイズ可能な延長されたガイドＲＮＡであって、５’末端に１～３個のグアニン（Ｇ）及び１～１０個のヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする塩基校正用ガイドＲＮＡを提供する。
本発明はまた、（ｉ）デアミナーゼ又はこれをコードする遺伝子、（ｉｉ）ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ又はこれをコードする遺伝子、及び（ｉｉｉ）標的配列とハイブリダイズ可能な延長されたガイドＲＮＡ又はこれをコードする遺伝子を含む塩基校正用組成物であって、前記延長されたガイドＲＮＡは５’末端に１～３個のグアニン（Ｇ）及び１～１０個のヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする塩基校正用組成物を提供する。
本発明はまた、前記塩基校正用組成物を細胞に導入させる段階を含む塩基校正方法を提供する。
本発明はまた、（ａ）前記塩基校正用組成物を哺乳動物の胚又は真核植物の胚に導入させる段階；及び（ｂ）前記胚を成長させて成体を得る段階を含む、突然変異が誘発されたヒト以外の哺乳動物又は真核植物の成体の作製方法を提供する。
ｓｇＲＮＡ長による塩基校正遺伝子ハサミ（Ｂａｓｅ－Ｅｄｉｔｏｒ）作動を模式的に示す図である。既存方法であるＧＸ１９ ｓｇＲＮＡ（ａ）を使用した時と拡張されたｓｇＲＮＡ（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｇＲＮＡ）（ｂ）を使用した時、標的位置に結合した後に露出される単一鎖ＤＮＡに脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）が起こり得る。拡張されたｓｇＲＮＡ（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｇＲＮＡ）を使用すると、ＰＡＭから５’方向に露出される単一鎖ＤＮＡが増え、より広い範囲で脱アミノ化が現れる。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株においてそれぞれの活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）をディープシークエンシング（ｄｅｅｐ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いて測定したｓｇＲＮＡ長による塩基校正範囲（ｂａｓｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ）の変化を示す図であり、図２ａは、ＨＥＫ２部位（ＨＥＫ２ ｓｉｔｅ）でｓｇＲＮＡ長によるＡＢＥ７．１０置換活性（ＡＢＥ７．１０ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を塩基位置（ｂａｓｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）別に示すグラフであり、図２ｂは、ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時と比較して相対的な置換活性［ｇＸ２０～３０活性／ＧＸ１９活性］を示すグラフであり、図２ｃは、最も頻繁に現れる突然変異対立遺伝子（ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｌｌｅｌｅ）を示すものであり（ＷＴ配列において変異が導入された部分を赤色で表示）、図２ｄは、ＨＢＢ部位（ＨＢＢ ｓｉｔｅ）でｓｇＲＮＡ長によるＢＥ３置換活性を塩基位置別に示すグラフであり、図２ｅは、ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時と比較して相対的な置換活性［ｇＸ２０～３０活性／ＧＸ１９活性］を示すグラフであり、図２ｆは、最も頻繁に現れる突然変異対立遺伝子を表記したものである（ＷＴ配列において変異が導入された部分を赤色で表示）（ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時に効率よく作動する位置として知られた塩基校正範囲を空色で表示）。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株においてそれぞれの活性をディープシークエンシングを用いて測定した、追加のミスマッチＧを１個又は２個含んでいるｓｇＲＮＡを使用した時、塩基校正範囲の変化を示す図であり、図３ａ及び図３ｃは、ｓｇＲＮＡ長によるＢＥ３置換活性を塩基位置別にＦＡＮＣＦ部位（ＦＡＮＣＦ ｓｉｔｅ）（ａ）とＨＢＢ部位（ｃ）で確認した結果であり、図３ｂ及び図３ｄは、ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時と比較して相対的な置換活性［ｇＸ２０～３０活性／ＧＸ１９活性］をＦＡＮＣＦ部位（ｂ）とＨＢＢ部位（ｄ）で示すグラフである。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株においてそれぞれの活性をディープシークエンシング方法で測定した、４個の個別の部位でｓｇＲＮＡ長による塩基校正範囲の変化を示す図であり、図４ａは、４個の部位でＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時と比較して相対的なＡＢＥ７．１０の置換活性［ｇＸ２０～３０活性／ＧＸ１９活性］を確認した結果を示すグラフであり、図４ｂは、ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時と比較して相対的なＢＥ３の置換活性［ｇＸ２０～３０活性／ＧＸ１９活性］を確認した結果を示すグラフである（ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時に効率よく作動する位置として知られた塩基校正範囲を空色で表示。）。 活性をディープシークエンシングを用いて分析した、油彩と豆においてｓｇＲＮＡ形態による塩基校正範囲の変化を示す図であり、図５ａは、油彩のプロトプラストにおいてｇＸ１９ ｓｇＲＮＡ及びｇＸ２０ ｓｇＲＮＡをＡＩＤ２シトシン塩基校正遺伝子ハサミ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｂａｓｅ－ｅｄｉｔｏｒ）と共に使用した時、シトシン位置による置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）効率を測定した結果であり、図５ｂは、ｓｇＲＮＡ形態によって最も頻繁に現れる変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）が導入された対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）の変化を示し（ｇＸ２０ ｓｇＲＮＡを使用した時にのみＴＡＧ終止コドンが作られることが確認できる。）、図５ｃは、豆のプロトプラストにおいてｇＸ１９ ｓｇＲＮＡ及びｇＸ２０ ｓｇＲＮＡをＡＩＤ２シトシン塩基校正遺伝子ハサミ（ＡＩＤ２ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ）と共に使用した時、シトシン位置による置換効率を測定した結果であり、図５ｄは、ｓｇＲＮＡ形態によって最も頻繁に現れる変異が導入された対立遺伝子の変化を示すものである（ｇＸ２０ ｓｇＲＮＡを使用した時にのみＴＡＧ終止コドンが作られることが確認できる。）。 マウスにおいてｓｇＲＮＡ形態による塩基校正範囲の変化を示す図であり、図６ａは、マウスの胚（ｅｍｂｒｙｏ）に種々のｓｇＲＮＡと共にＡＢＥ ７．１０ ｍＲＮＡを微細注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した後、胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）段階でディープシークエンシングによって置換活性を分析した結果であり、図６ｂは、ＧＸ２１ ｓｇＲＮＡを使用してＡＢＥ ７．１０ ｍＲＮＡと共に胚に微細注入を行って得た仔マウス（ｐｕｐ）を分析した結果であり、所望のＨ４２０Ｒ突然変異を持つ３匹の仔マウスが得られた。
特に定義されない限り、本明細書で使われた全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。
本発明では塩基校正遺伝子ハサミの標的位置を指定するｓｇＲＮＡの形態及び長さを変形させることによって、塩基校正遺伝子ハサミの作動範囲をより拡張させることができる技術を提案する（図１ｂ）。
図１に示すように、既存方法であるＧＸ１９ ｓｇＲＮＡ（ａ）を使用した時と拡張されたｓｇＲＮＡ（ｂ）を使用した時、標的位置に結合した後に露出される単一鎖ＤＮＡに脱アミノ化が起こり得る。拡張されたｓｇＲＮＡを使用すると、ＰＡＭから５’方向に露出される単一鎖ＤＮＡが増え、より広い範囲で脱アミノ化が現れる。
通常のｓｇＲＮＡはＰＡＭから５’方向への２０個のヌクレオチド（ｎｔ）の配列を用いるＧＸ１９又はｇＸ１９形態であったが、新しい方法ではＰＡＭから５’方向への２０個のヌクレオチドの前にミスマッチグアニン（Ｇ）を２個さらに付けたｇｇＸ２０形態、又は２１個から３０個のヌクレオチド配列を用いたｇＸ２１～ｇＸ３０形態の拡張されたｓｇＲＮＡを用いて実験した。ＡＢＥ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ）と拡張されたｓｇＲＮＡを用いてＨＥＫ２部位に対してＨＥＫ２９３Ｔ細胞で実験した結果、既存のＧＸ１９ ｓｇＲＮＡではＰＡＭから１３～１７番目のアデノシンにおいて変異が現れ、ｇＸ２０／ｇＸ２１／ｇＸ２２ｓｇＲＮＡを使用した時は、１８～１９番目のアデノシンも変わったことが確認できた（図２ａ、図２ｂ、及び図２ｃ参照）。ｇＸ２０／ｇＸ２１／ｇＸ２２ｓｇＲＮＡを使用して導入された１８～１９番目のアデノシン変異の効率は、ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡに現れる効率よりも１０倍以上増加したことが確認できる（図２ｂ）。同様に、ＣＢＥ（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ）と拡張されたｓｇＲＮＡを用いてＨＢＢ部位で確認した結果、ｇＸ２０／ｇＸ２２ｓｇＲＮＡを使用した時、２０、２１、２３番目位置のシトシンに変異が導入されることを確認した（図２ｄ、図２ｅ、及び図２ｆ参照）。のみならず、ミスマッチグアニンをさらに持っているｇｇＸ２０ ｓｇＲＮＡを使用した時、２０～２３番目位置のシトシンにおいてＣＢＥによる変異が約３倍増加することが見られた（図３参照）。４個の個別の標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）でＣＢＥとＡＢＥに対してそれぞれ実験した時、ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡの代わりに拡張されたｓｇＲＮＡを使用すれば、既存の塩基校正範囲（ＰＡＭから５’方向に１３～１７番目）よりも遠い地域である１８～２３番目の位置まで作動でき、その効率が最大で５倍～６０倍増加することを確認した（図４参照）。
したがって、本発明は、一観点において、標的配列とハイブリダイズ可能な延長されたガイドＲＮＡであって、５’末端に１～３個のグアニン（Ｇ）及び１～１０個のヌクレオチド（それぞれ独立してＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧから選択可能）をさらに含むことを特徴とする塩基校正用ガイドＲＮＡに関する。
本発明の延長されたガイドＲＮＡは、単一鎖形態（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）であり得る。前記延長されたガイドＲＮＡは、通常のガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ（標的化配列が２０ｎｔである；このうち、５’末端の最初のヌクレオチドは、対応ＤＮＡ標的部位配列とマッチング（相補的）であるグアニン（Ｇ）又はミスマッチング（非相補的）であるグアニン（ｇ）である）の５’末端に１～１０個のヌクレオチド（それぞれ独立してＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧの中から選択され得る；一例において、対応ＤＮＡ標的配列と相補的配列であり得る）をさらに含むことができる。このような延長された形態のｓｇＲＮＡはそうでない場合と比較して塩基校正頻度及び／又は校正効率を増加させることができる。
また、前記延長されたｓｇＲＮＡは、５’末端に１～３個のマッチング（対応ＤＮＡ標的配列と相補的）又はミスマッチング（対応ＤＮＡ標的配列と非相補的）のグアニン（Ｇ）をさらに含むことができる。前記５’末端にさらに含まれる１～１０個の任意のヌクレオチドは、該当の標的部位の標的ＤＮＡ配列と相補的配列であり得、これによって、標的部位においてＰＡＭから５’方向に露出される単一鎖ＤＮＡの長さを伸ばしてより広い範囲で遺伝子校正（脱アミノ化）が起こるようにすることができる（例えば、標的部位においてＰＡＭから５’方向に１８～３０ｎｔ又は１８～２２ｎｔ位置でも変異（塩基校正）が導入され得る）（図１ｂ参照）。
他の観点において、本発明は、（ｉ）デアミナーゼ又はこれをコードする遺伝子、（ｉｉ）ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ又はこれをコードする遺伝子、及び（ｉｉｉ）標的配列とハイブリダイズ可能な延長されたガイドＲＮＡ又はこれをコードする遺伝子を含む塩基校正用組成物に関する。
本発明の一態様としては、（１）デアミナーゼ、及びこれをコードする遺伝子、（２）標的特異的ヌクレアーゼ（ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ）又はこれをコードする遺伝子、及び（３）標的遺伝子の標的部位とハイブリダイズ可能な（又は、相補的核酸配列を有する）ガイドＲＮＡ又はそのコーディングＤＮＡ（又は、コーディングＤＮＡを含む組換えベクター）を含む塩基校正用組成物を提供する。この時、前記ガイドＲＮＡは、前述したように、通常のガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡの５’末端に１～１０個のヌクレオチド（それぞれ独立してＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧの中から選択され得る；例えば、対応標的配列と相補的配列である。）をさらに含むものであり得、それに加えて、任意に、ｓｇＲＮＡの５’末端に１～３個のマッチング又はミスマッチングのグアニン（Ｇ）をさらに含む延長されたガイドＲＮＡであり得る。
前記塩基校正用組成物は、真核細胞において塩基校正（例えば、塩基置換）活性を有するものであり得る。前記真核細胞は真核動物の細胞、例えば胚細胞、又は真核植物（例えば、藻類、単子葉植物、双子葉植物など）の細胞であり得、一具体例において、哺乳動物細胞、例えば哺乳動物の胚細胞、又は真核植物の細胞であり得る。本明細書に用いられたコーディング遺伝子は、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ又はこれを含む組換えベクター、又はｍＲＮＡの形態で使用され得る。
前記デアミナーゼは、真核細胞において特定塩基からアミン基を除去する活性を有する酵素を総称するものであり、例えば、シチジンをウリジンに転換させるシチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼであり得る。一例において、前記デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ１（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｅｄｉｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ １）、ＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ｔａｄＡ（ｔＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）などからなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。このような塩基転換（例えば、シチジンをウリジンに転換）によって真核細胞において単一ヌクレオチド置換を誘導することができる。
一例において、前記塩基校正用組成物は、（１）デアミナーゼ又はこれをコードする遺伝子（ｍＲＮＡ又はコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、（２）ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ又はこれをコードする遺伝子（ｍＲＮＡ又はコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、及び（３）延長されたガイドＲＮＡ又はこれをコードする遺伝子（ＤＮＡ）に加えて、（４）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）又はこれをコードする遺伝子、及び／又は（５）核局在化配列（ＮＬＳ）又はこれをコードする遺伝子をさらに含むことができる。
本発明の前記塩基校正用組成物において、前記デアミナーゼ、ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ、及び任意にＵＧＩ及び／又はＮＬＳが連結された融合タンパク質又はそれらのコーディング遺伝子が連結された融合遺伝子形態で用いられる場合、それぞれのタンパク質又は遺伝子の間のうち一つ以上、例えば、前記デアミナーゼとＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼとの間、ヌクレアーゼとＵＧＩとの間、及びＵＧＩとＮＬＳとの間のうち一つ以上に適切なリンカー（融合タンパク質の場合、ペプチドリンカー（３～３０、又は３～２０アミノ酸）、融合遺伝子の場合、オリゴヌクレオチドリンカー（９～９０又は９～６０ｎｔ））をさらに含むことができる。
一例において、前記ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼは、遺伝子二重鎖切断活性を喪失するように変形された変形ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼであり得る。
前記変形ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼは、標的遺伝子の一方の鎖を切断（ニック（ｎｉｃｋ）生成）するよう変形された変形Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）又は変形Ｃｐｆ１（プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ１（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）由来ＣＲＩＳＰＲ）システムであり得る。一例において、前記変形ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ ｎｉｃｋａｓｅ；ｎＣａｓ９）又は触媒活性欠乏Ｃａｓ９（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｓ９；ｄＣａｓ９）などからなる群から選ばれるものであり得る。
本発明において、前記塩基校正用組成物がデアミナーゼコーディング遺伝子及びＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼコーディング遺伝子を含む場合、前記コーディング遺伝子はコーディングＤＮＡ又はｍＲＮＡであり得る。また、前記デアミナーゼコーディング遺伝子及びＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼコーディング遺伝子はｍＲＮＡの形態で含まれたり、或いは前記遺伝子（ＤＮＡ）をそれぞれ別個のベクターに含む組換えベクター（すなわち、デアミナーゼコーディングＤＮＡを含む組換えベクター及びＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）又は一つのベクターに共に含む組換えベクターの形態で含まれ得る。
前記ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの複合体）を含む二重ガイドＲＮＡ、又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。一例において、前記塩基校正用組成物は、デアミナーゼ及び変形ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとガイドＲＮＡを含んだり、或いはデアミナーゼ及び変形ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼとガイドＲＮＡを含むリボ核酸タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮＰ）を含むことができる。前記リボ核酸タンパク質は、デアミナーゼ及び変形ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼとガイドＲＮＡを混合物の形態で含んだり、或いはデアミナーゼ及び変形ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼとガイドＲＮＡが結合した複合体の形態で含むことができる。
本発明はさらに他の観点において、前記塩基校正用組成物を細胞に導入させる段階を含む塩基校正方法に関する。
他の例は、前記塩基校正用組成物を細胞に導入させる段階を含む、塩基校正方法を提供する。前記細胞は真核細胞であり得、前記塩基校正方法は真核細胞において塩基校正（例えば、塩基置換）を行うものであり得る。
前記真核細胞は、真核動物の細胞、例えば、真核動物の胚細胞、及び／又は真核植物細胞であり得、一具体例において、哺乳動物細胞、例えば哺乳動物の胚細胞、及び／又は真核植物細胞であり得る。前記塩基校正方法によって真核細胞（例えば、真核動物の胚細胞及び／又は真核植物細胞）において４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上又は１００％の塩基転換率（塩基置換率）を達成することができる。また、前記塩基校正方法は、塩基置換によって遺伝子（例えば、コーディング配列）内に終結コドンを生成して前記遺伝子を不活性化（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）させたり、或いはタンパク質を生成しない非コーディングＤＮＡ配列に変異を導入するなど、様々な突然変異を誘発させることができる。
本発明の一態様では、これに基づき、ｓｇＲＮＡ長を伸ばすことによってより広い範囲で塩基校正が可能であることを、油彩（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）と豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）で調べてみた。油彩の子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）に由来のプロトプラストにおいて除草剤抵抗性遺伝子であるＡＬＳ遺伝子を標的できるｇＸ１９及びｇＸ２０ ｓｇＲＮＡをＡＩＤ２塩基校正遺伝子ハサミ（Ｂａｓｅ－Ｅｄｉｔｏｒ）に形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その結果、ｇＸ２０ ｓｇＲＮＡを使用した時、２０番目位置のシトシンがチミンに変わり（図５ａ）、この場合にのみ終止コドンが生じて当該遺伝子が不活性化された（図５ｂ）。他の作物である豆のカルス（ｃａｌｌｕｓ）から得たプロトプラストに形質感染してＡＬＳ遺伝子を標的した時、同様に、ｇＸ２０ ｓｇＲＮＡを使用した時、２０番目位置のシトシンがチミンに変わる効率が増加することを確認した（図５ｃ及び図５ｄ参照）。最後に、マウスのチロシナーゼ遺伝子に白皮症誘発突然変異（ａｌｂｉｎｉｓｍ－ｃａｕｓｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ）と知られたＨ４２０Ｒ置換（Ｈ４２０Ｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｉｏｎ）を導入するためにＡＢＥを使用した。チロシナーゼを標的するｓｇＲＮＡの形態を替えてＡＢＥ ｍＲＮＡと共にマウス胚（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ）に微細注入した後、胚盤胞段階で分析した結果、ｇＸ１９に比べてＧＸ２０やＧＸ２１ ｓｇＲＮＡを使用した時、１８番目位置のアデノシンが変わる効率が増加することが見られた（図６ａ）。所望のＨ４２０Ｒ突然変異を導入するためには１８番目アデノシンが変わらなければならず、当該位置を最も高い効率で変え得るＧＸ２１ ｓｇＲＮＡを用いて仔マウスを得た。このうち、３匹の仔マウスでＨ４２０Ｒ突然変異を持っていることが確認できた（図６ｂ）。このように既存の塩基校正範囲外の５’方向の塩基を校正しなければならない場合、一般ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡよりは拡張されたｓｇＲＮＡを使用する方がより効率的であることが確認できた。
したがって、本発明は、さらに他の観点において、（ａ）前記塩基校正用組成物を哺乳動物の胚又は真核植物の胚に導入させる段階；及び（ｂ）前記胚を成長させて成体を得る段階を含む突然変異が誘発されたヒト以外の哺乳動物又は真核植物の成体の作製方法に関する。
特に、本発明の前記塩基校正用組成物は、哺乳動物の胚又は真核植物の胚に適用され、所望する遺伝子が不活性化されたり所望する突然変異が誘発された哺乳動物又は真核植物の成体作製に有用に適用することができる。
前記細胞に塩基校正用組成物を導入する段階は、前記細胞にデアミナーゼ又はデアミナーゼコーディング遺伝子、ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ又はＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼコーディング遺伝子、及び延長されたガイドＲＮＡ又は延長されたガイドＲＮＡコーディング遺伝子を導入させる段階であり得る。前記コーディング遺伝子の一つ以上はそれぞれ別個の又は一つの組換えベクターに含まれて導入され得る。
一例において、前記細胞に塩基校正用組成物を導入する段階は、
１）前記細胞をデアミナーゼコーディングＤＮＡ、ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼコーディングＤＮＡ、及び延長されたガイドＲＮＡコーディング遺伝子をそれぞれ含んだり、或いはこれらのうち２つ以上を含む組換えベクターで形質感染させたり、
２）前記細胞にデアミナーゼ、ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ、及び延長されたガイドＲＮＡ（例えば、デアミナーゼ、ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ、及び延長されたガイドＲＮＡを含む混合物又は複合体形態のリボ核酸タンパク質）を直接注入したり、或いは
３）前記細胞にデアミナーゼコーディングｍＲＮＡ、ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼコーディングｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの混合物又はこれらのそれぞれを直接注入して行うことができる。
前記直接注入は、前記２）のデアミナーゼ、ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ、及び延長されたガイドＲＮＡ（例えば、デアミナーゼ、ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ、及び延長されたガイドＲＮＡを含む混合物又は複合体形態のリボ核酸タンパク質）、又は３）のデアミナーゼコーディングｍＲＮＡ、ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼコーディングｍＲＮＡ及び延長されたガイドＲＮＡが、組換えベクターを使用することなく、細胞膜及び／又は核膜を通過して遺伝体（ｇｅｎｏｍｅ）に伝達されることを意味でき、例えば、電気穿孔法、リポフェクション、微細注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などによって行われ得る。
本発明の他の例は、前記塩基校正方法によって校正された塩基を含む遺伝子変形細胞を提供する。前記遺伝子変形細胞は、前記塩基校正によって標的遺伝子に塩基置換、例えば単一塩基置換又は点突然変異が発生した細胞であり得る。前記細胞は真核細胞であり得る。前記真核細胞は真核動物の細胞、例えば胚細胞、及び／又は真核植物細胞であり得、一具体例において、ヒトを含む又はヒト以外の哺乳動物細胞、例えばヒトを含む又はヒト以外の哺乳動物の胚細胞、及び／又は真核植物細胞であり得る。
他の例は、塩基校正用組成物が注入された哺乳動物の胚又は前記塩基校正方法によって校正された塩基を含む遺伝子改変哺乳動物の胚を哺乳動物の卵管に移植して、遺伝子改変動物を生産する段階を含む、遺伝子改変動物の作製方法を提供する。前記遺伝子改変哺乳動物は、前記塩基校正によって標的遺伝子に塩基置換、例えば単一塩基置換又は点突然変異が発生した胚から発生した動物であり得る。
前記胚細胞が卵管に移植される哺乳動物は、前記胚細胞が由来する哺乳動物と同種の哺乳類（委託母）であり得る。
他の例は、前記遺伝子変形細胞から得られた遺伝子改変動物を提供する。前記遺伝子改変動物は、前記遺伝子改変動物の作製方法によって作製されたものであり得る。前記動物は、真核動物、例えばヒトを含む又はヒト以外の哺乳動物であり得る。
本明細書において、前記塩基校正用組成物が適用される細胞は、真核細胞、例えば、真核動物細胞であり得る。前記真核動物は、ヒトなどの霊長類、マウスなどの齧歯類を含む哺乳動物であり得る。前記真核動物細胞は哺乳動物の胚であり得る。例えば、前記胚は、過排卵誘導された雌哺乳動物（例えば、ＰＭＳＧ（Ｐｒｅｇｎａｎｔ Ｍａｒｅ Ｓｅｒｕｍ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）、ｈＣＧ（ｈｕｍａｎ Ｃｈｏｉｒｉｎｉｃ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）などのような生殖腺ホルモン注入による過排卵誘導など）と雄哺乳動物を交配して得られた受精された胚を前記雌哺乳動物の卵管から採取したものであり得る。前記塩基校正用組成物が適用（注入）される胚は、受精された１－細胞期の胚（ｚｙｇｏｔｅ）であり得る。
本明細書に用いられた通り、用語“塩基校正（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）”は、標的遺伝子内の標的部位に点突然変異（遺伝子レベル又は遺伝子レベルの点突然変異による単一アミノ酸変異など）を誘発する塩基変異（置換、欠失又は付加）を意味するものであり、少数の塩基（１つ又は２つの塩基、例えば１つの塩基）だけが変異されるという点で比較的多数の塩基の変異を伴う遺伝子校正（ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）と区別され得る。前記塩基校正は、遺伝子の二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ）を伴わないものであり得る。
本明細書で提供される塩基校正用組成物又は方法によれば、ニックが形成されたＤＮＡ鎖（ＰＡＭ配列が位置する鎖と反対鎖、ガイドＲＮＡが結合（ハイブリダイズ）する鎖）の反対鎖（すなわち、ＰＡＭ配列が位置する鎖）において塩基校正（塩基変形又は塩基置換；Ａ又はＣの脱アミノ化による変異）が起こり得る。通常の長さのガイドＲＮＡを使用する場合には、例えば、ＰＡＭから５’方向に１７番目のヌクレオチドにおいて塩基校正（塩基変形又は塩基置換）が起こるが、本明細書で提供される延長されたガイドＲＮＡを使用すると、ＰＡＭから５’方向に１７番目以降の部位、例えば、ＰＡＭから５’方向に１８番目から３０番目、１８番目から２５番目、又は１８番目から２２番目までの拡張された範囲でも塩基校正が起こり得る。
本明細書に用いられた通り、用語“塩基変異（又は塩基置換）”は、当該塩基を含むヌクレオチドに変異（例えば、置換）が起こったことを意味し、“ヌクレオチド変異（又はヌクレオチド置換）”と同じ意味で使われ得る。このような塩基変異は対立遺伝子の片方又は両方で起こり得る。
一例において、前記塩基変異又はこれを伴う塩基校正は、標的部位に終結コドンを生成させるか、野生型と異なるアミノ酸をコードするコドンを生成させることによって、標的遺伝子を不活性化（Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）させるか、タンパク質を生成しない非コーディングＤＮＡ配列に変異を導入するなどの様々な形態であり得るが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記塩基校正又は塩基変異は生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で行われ得る。
本明細書に用いられた通り、用語“塩基配列”は、当該塩基を含むヌクレオチドの配列を意味するものであり、ヌクレオチド配列又は核酸配列と同じ意味で使われてもよい。
本明細書に用いられた通り、‘標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）’は塩基校正（又は塩基変異）の対象となる遺伝子を意味し、‘標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ）’は、標的遺伝子内の標的特異的ヌクレアーゼによる塩基校正が起こる部位を意味し、一例として、前記標的特異的ヌクレアーゼがＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ；ＲＧＥＮ）を含むものである場合、標的遺伝子内のＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼが認識する配列（ＰＡＭ配列）の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置し、最大長が約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位（二重鎖又は二重鎖のいずれか一方の鎖）を意味する。
一例において、前記標的特異的ヌクレアーゼがＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼを含む場合、前記ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼと共に、標的化配列を含むガイドＲＮＡを含むことができる。前記‘標的化配列（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）’は、標的部位内の連続する約２０個のヌクレオチド（ｎｔ）を含む部位の塩基配列と相補的な塩基配列を含む（ハイブリダイズ可能な）ガイドＲＮＡの部位であり得る。本明細書に記載された延長されたガイドＲＮＡは、５’末端に１～１０個の追加の任意のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇから選択される；例えば、対応標的配列と相補的配列である。）をさらに含んだり、及び／又は５’末端に１～３個の追加のマッチング又はミスマッチングのグアニンを含むことができる。前記５’末端の１～１０個の追加の任意のヌクレオチドはここに該当する延長された標的ＤＮＡ部位の配列と相補的配列であり得、これによって、標的部位においてＰＡＭが５’方向に露出される単一鎖ＤＮＡの長さを伸ばして、より広い範囲で遺伝子校正（脱アミノ化）が起こるようにすることができる。
本発明において前記標的化配列と相補的な塩基配列を含む標的部位の塩基配列を‘標的配列（標的 ｓｅｑｕｅｎｃｅ）’と称することができ、前記標的配列は、ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼが認識するＰＡＭ配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する連続する約２０ｎｔ長の塩基配列又はその相補的鎖の該当部位を意味できる。
前記デアミナーゼは真核細胞において特定塩基からアミン基を除去する活性を有する酵素を総称するものであり、例えば、シチジンをウリジンに転換させるシチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼであり得る。一例において前記デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ （ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｍＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ，ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｌｉｋｅ）酵素、ＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ｔａｄＡ（ｔＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）などからなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。前記ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＩＤ、及びｔａｄＡは大腸菌などの原核動物由来、又はヒトを含む霊長類、マウスを含む齧歯類などの哺乳動物のような真核動物由来のものであり得る。
前記デアミナーゼは、タンパク質、これをコードする遺伝子（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）、又は前記遺伝子を含む組換えベクターの形態で用いられ得る。本明細書に用いられた通り、標的特異的ヌクレアーゼは、遺伝子ハサミ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ）とも呼ばれ、目的の遺伝体ＤＮＡ上の特定位置を認識して切断（単一鎖切断又は二重鎖切断）できる全ての形態のヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）を総称する。
例えば、前記標的特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子の特定配列を認識し、ヌクレオチド切断活性を持ち標的遺伝子でインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ，Ｉｎｄｅｌ）を引き起こし得る全てのヌクレアーゼから選ばれた１種以上であり得る。
例えば、前記標的特異的ヌクレアーゼは微生物兔疫体系のＣＲＩＳＰＲに由来したＲＧＥＮ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ；例えば、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）、Ｃｐｆ１など）などからなる群から選ばれる１種以上を含むことができるが、これに制限されるものではない。
前記標的特異的ヌクレアーゼは原核細胞、及び／又はヒト細胞をはじめとする動植物細胞（例えば、真核細胞）の遺伝体で特定塩基配列を認識して二重螺旋切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ，ＤＳＢ）を起こすことができる。前記二重螺旋切断は、ＤＮＡの二重螺旋を切って、鈍端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）又は付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）を生成させることができる。ＤＳＢは細胞内で相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）又は非相同再接合（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）機序により効率的に修繕できるが、この過程で所望する変異を標的位置に導入することができる。
一具体例において、前記標的特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９））、Ｃｐｆ１タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）などのようなタイプＩＩ及び／又はタイプＶのＣＲＩＳＰＲシステムに伴うヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）などからなる群から選ばれる１種以上であり得る。この場合、前記標的特異的ヌクレアーゼは、遺伝体ＤＮＡの標的部位に案内するための標的ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡをさらに含む。前記ガイドＲＮＡは生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写された（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ものであり得、例えばオリゴヌクレオチド二重鎖又はプラスミド鋳型から転写されたものであり得るが、これに制限されない。前記標的特異的ヌクレアーゼは、生体外で又は生体（細胞）内に伝達後に、ガイドＲＮＡに結合されたリボ核酸－タンパク質複合体を形成（ＲＮＡＧｕｉｄｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）してリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）の形態で働くことができる。Ｃａｓタンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要タンパク質構成要素であり、活性化されたエンドヌクレアーゼ又はニッカーゼを形成できるタンパク質である。
Ｃａｓタンパク質又は遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができる。例えば、前記Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカスｓｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、例えば、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１））；カンピロバクター属、例えば、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；ストレプトコッカス属、例えば、ストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）又はストレプトコッカスアウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；ナイセリアメニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、例えば、パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質；フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、例えば、フランシセラノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質などからなる群から選ばれる一つ以上であるが、これに制限されるものではない。
本発明において、Ｃｐｆ１タンパク質は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとは区別される新しいＣＲＩＳＰＲシステムのエンドヌクレアーゼであり、Ｃａｓ９に比べて相対的に大きさが小さく、ｔｒａｃｒＲＮＡが不要であり、単一ガイドＲＮＡによって働くことができる。また、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）が豊富なＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列を認識し、ＤＮＡの二重鎖を切って付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ；ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を生成する。
例えば、前記Ｃｐｆ１タンパク質は、カンジダタス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）属、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）属、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属、ペレグリニバクテリア（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンジダタスメタノプラズマ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ）、又はユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のものであり得、例えば、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＣ２０１７）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＢＶ３Ｌ６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＮＤ２００６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ（２３７）、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｃｅｉｂａｃｔｅｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓなどの微生物由来のものであり得るが、これに制限されない。
前記標的特異的ヌクレアーゼは、微生物から分離されたもの又は組換え的方法又は合成的方法などのように人為的又は非自然的生産されたもの（ｎｏｎｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であり得る。前記標的特異的ヌクレアーゼは生体外であらかじめ転写されたｍＲＮＡ又はあらかじめ生産されたタンパク質の形態、又は標的細胞又は生体内で発現するために組換えベクターに含まれた形態で用いられ得る。一例において、前記標的特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）は組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ；ｒＤＮＡ）によって作られた組換えタンパク質であり得る。組換えＤＡＮは、様々な有機体から得られた異種又は同種の遺伝物質を含むために分子クローニングのような遺伝子組換え方法によって人工的に作られたＤＮＡ分子を意味する。例えば、組換えＤＮＡを適切な有機体で発現させて標的特異的ヌクレアーゼを生産（ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ）する場合、組換えＤＮＡは作製しようとするタンパク質をコードするコドンのうち、前記有機体に発現するのに最適化されたコドンを選択して再構成されたヌクレオチド配列を有するものであり得る。
本明細書で用いられた前記標的特異的ヌクレアーゼは、変異された形態の変異標的特異的ヌクレアーゼであり得る。前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、ＤＮＡ二重鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を喪失するように変異されたものを意味でき、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を喪失し、ニッカーゼ活性を有するように変異された変異標的特異的ヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼ活性とニッカーゼ活性をともに喪失するように変異された変異標的特異的ヌクレアーゼの中から選ばれた１種以上であり得る。
前記変異標的特異的ヌクレアーゼがニッカーゼ活性を有するものである場合、前記デアミナーゼによる塩基転換（例えば、シチジンがウラジンに転換）と同時に又は順序に関係なく順次に、前記塩基転換が起こった鎖又はその反対鎖（例えば、塩基転換が起こった鎖の反対鎖）においてニックが導入され得る（例えば、ＰＡＭが位置する鎖の反対鎖において、ＰＡＭ配列の５’末端方向に３番目ヌクレオチドと４番目ヌクレオチドとの間に該当する位置にニックが導入される）。このような標的特異的ヌクレアーゼの変異（例えば、アミノ酸置換など）は、少なくともヌクレアーゼの触媒活性ドメイン（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＲｕｖＣ触媒ドメイン）で起こるものであり得る。一例において、前記標的特異的ヌクレアーゼがストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１））である場合、前記変異は、触媒活性を有するアスパラギン酸残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅ；１０番目位置のアスパラギン酸（Ｄ１０）など）、７６２番目位置のグルタミン酸（Ｅ７６２）、８４０番目位置のヒスチジン（Ｈ８４０）、８５４番目位置のアスパラギン（Ｎ８５４）、８６３番目位置のアスパラギン（Ｎ８６３）、９８６番目位置のアスパラギン酸（Ｄ９８６）などからなる群から選ばれる一つ以上任意の他のアミノ酸に置換された突然変異を含むことができる。この時、置換される任意の他のアミノ酸はアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であり得るが、これに制限されない。
他の例において、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９タンパク質と異なるＰＡＭ配列を認識するように変異されたものであり得る。例えば、前記変異標的特異的ヌクレアーゼはストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質の１１３５番目位置のアスパラギン酸（Ｄ１１３５）、１３３５番目位置のアルギニン（Ｒ１３３５）、及び１３３７番目位置のトレオニン（Ｔ１３３７）のうち一つ以上、例えば３個がいずれも異なるアミノ酸に置換され、野生型Ｃａｓ９のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）と異なるＮＧＡ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣの中から選ばれた任意の塩基）を認識するように変異されたものであり得る。
一例において、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、ストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列のうち、
（１）Ｄ１０、Ｈ８４０、又はＤ１０＋Ｈ８４０；
（２）Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７、又はＤ１１３５＋Ｒ１３３５＋Ｔ１３３７；又は
（３）（１）及び（２）残基の両方、でアミノ酸置換が起こったものであり得る。
本明細書に用いられた通り、前記‘他のアミノ酸’は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リシン、前記アミノ酸の公知された全ての変形体のうち、野生型タンパク質が元来の変異位置に有するアミノ酸以外のアミノ酸の中から選ばれたアミノ酸を意味する。一例において、前記‘他のアミノ酸’は、アラニン、バリン、グルタミン、又はアルギニンであり得る。
一例において、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性を喪失（例えば、ニッカーゼ活性を有するか、エンドヌクレアーゼ活性及びニッカーゼ活性をともに喪失）した変形Ｃａｓ９タンパク質、又は野生型Ｃａｓ９と異なるＰＡＭ配列を認識するものであり得る。例えば、前記変形Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質において、
（１）Ｄ１０又はＨ８４０位置に突然変異（例えば、他のアミノ酸への置換）が導入されてエンドヌクレアーゼ活性を喪失しニッカーゼ活性を有する変形Ｃａｓ９、又はストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質に、Ｄ１０及びＨ８４０位置にともに突然変異（例えば、他のアミノ酸への置換）が導入されてエンドヌクレアーゼ活性及びニッカーゼ活性をともに喪失した変形Ｃａｓ９タンパク質；
（２）Ｄ１１３５、Ｒ１３３５及びＴ１３３７の一つ以上又はこれら全部に突然変異（例えば、他のアミノ酸への置換）が導入されて野生型と異なるＰＡＭ配列を認識する変形Ｃａｓ９タンパク質；又は
（３）（１）及び（２）の突然変異がともに導入されてニッカーゼ活性を有し、野生型と異なるＰＡＭ配列を認識するか、エンドヌクレアーゼ活性及びニッカーゼ活性をともに喪失し、野生型と異なるＰＡＭ配列を認識する変形Ｃａｓ９タンパク質であり得る。
例えば、前記ＣＡｓ９タンパク質のＤ１０位置における突然変異は、Ｄ１０Ａ突然変異（Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸のうち１０番目アミノ酸であるＤがＡに置換された突然変異を意味する；以下、Ｃａｓ９に導入された突然変異は同じ方法で表記される。）であり得、前記Ｈ８４０位置における突然変異はＨ８４０Ａ突然変異であり得、Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、及びＴ１３３７位置における突然変異はそれぞれ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、及びＴ１３３７Ｒであり得る。
本明細書において、“ヌクレアーゼ”とは、特に言及がない限り、前述した、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１などのような“標的特異的ヌクレアーゼ”を意味する。
前記ヌクレアーゼは、微生物から分離されたもの又は組換え的方法又は合成的方法などのように人為的又は非自然的生産されたもの（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であり得る。一例において、前記ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）は組換えＤＮＡによって作られた組換えタンパク質であり得る。組換えＤＡＮ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ；ｒＤＮＡ）は、様々な有機体から得られた異種又は同種の遺伝物質を含むために分子クローニングのような遺伝子組換え方法によって人工的に作られたＤＮＡ分子を意味する。例えば、組換えＤＮＡを適切な有機体に発現させてタンパク質（ヌクレアーゼ）を生産（ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ）する場合、組換えＤＮＡは、作製しようとするタンパク質をコードするコドンのうち、前記有機体に発現するのに最適化されたコドンを選択して再構成されたヌクレオチド配列を有するものであり得る。
前記ヌクレアーゼは、タンパク質、これをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡと結合したリボ核酸タンパク質、前記リボ核酸タンパク質をコードする核酸分子、又は前記核酸分子を含む組換えベクターの形態で用いられ得る。
前記デアミナーゼ及びヌクレアーゼ、及び／又はそれらをコードする核酸分子は、核内に伝達、作用、及び／又は核内で発現し得る形態であり得る。
前記デアミナーゼ及びヌクレアーゼは細胞内に導入し易い形態であり得る。一例として、前記デアミナーゼ及びヌクレアーゼは、細胞浸透ペプチド及び／又はタンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）と連結され得る。前記タンパク質伝達ドメインは、ポリアルギニン又はＨＩＶ由来のＴＡＴタンパク質であり得るが、これに制限されない。細胞浸透ペプチド又はタンパク質伝達ドメインは前記記述された例の他にも様々な種類が当業界に公知であり、当業者は前記例に制限されることなく様々な例を適用することができる。
また、前記デアミナーゼ及びヌクレアーゼ、及び／又はこれらをコードする核酸分子は核位置信号（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ，ＮＬＳ）配列又はこれをコードする核酸配列をさらに含むことができる。したがって、前記デアミナーゼコーディング核酸分子及び／又はヌクレアーゼコーディング核酸分子を含む発現カセットは、前記デアミナーゼ及び／又はヌクレアーゼを発現させるためのプロモーター配列などの調節配列、及び任意に、ＮＬＳ配列（ＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＣ：配列番号６１）をさらに含むことができる。前記ＮＬＳ配列は当業界によく知られている。
前記デアミナーゼ及びヌクレアーゼ、及び／又はこれらをコードする核酸分子は、分離及び／又は精製のためのタグ又は該タグをコードする核酸配列と連結され得る。一例として、前記タグは、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓタグなどのような小さいペプチドタグ、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タグ、ＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグなどからなる群から適切に選択され得るが、これに制限されない。
また、本明細書に用いられた塩基校正用組成物は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）又はこれをコードする遺伝子（コーディングＤＮＡを含む組換えベクター形態又は生体外転写されたｍＲＮＡ形態など）をさらに含むことができる。前記塩基校正用組成物がウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤をさらに含む場合、これを含まない場合と比較して、デアミナーゼによる特定塩基置換（例えば、シトシンデアミナーゼによるＣからＴへの置換）の比率が高くなり、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤をさらに含まない場合には、特定塩基置換（例えば、シトシンデアミナーゼによるＣからＴへの置換）以外の形態の塩基置換比率が高くなる（すなわち、様々な形態の塩基置換が起こる）。
本発明において、用語“ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）”は、標的遺伝子における標的部位内の特異的な塩基配列（標的配列）にハイブリダイズ可能な標的化配列を含むＲＮＡを意味し、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又は生体（又は細胞）内でＣａｓタンパク質、Ｃｐｆ１などのようなヌクレアーゼと結合してこれを標的遺伝子（又は標的部位）に導く役割を担う。前記ガイドＲＮＡは、複合体を形成するヌクレアーゼの種類及び／又はその由来微生物によって適切に選択され得る。
例えば、前記ガイドＲＮＡは、
標的配列とハイブリダイズ可能な部位（標的化配列）を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；
Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１などのようなヌクレアーゼと相互作用する部位を含むトランス活性化（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）；及び
前記ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位（例えば、標的化配列を含むｃｒＲＮＡ部位及びヌクレアーゼと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡの部位）が融合された形態の単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）からなる群から選ばれる１種以上であり得、
具体的にＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌ ＲＮＡ）、又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。
前記ｓｇＲＮＡは、標的遺伝子（標的部位）内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を有する部分（これを、スぺーサ領域（Ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ）、標的ＤＮＡ認識配列（Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、塩基対合領域（ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）などとも命名する。）及びＣａｓタンパク質結合のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を含むことができる。より具体的に、標的遺伝子内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を含む部分、Ｃａｓタンパク質結合のためのヘアピン構造、及び終了（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）配列を含むことができる。前述された構造は５’から３’への順に順次存在するものであり得るが、これに制限されない。前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分及び標的ＤＮＡの相補的な部分を含む場合であればいかなる形態のガイドＲＮＡも本発明で使用可能である。
例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、標的遺伝子校正のために２つのガイドＲＮＡ、すなわち、標的遺伝子の標的部位とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、及びＣａｓ９タンパク質と相互作用するトランス活性化（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ；Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する。）を必要とし、これらのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは互いに結合した二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の形態、又はリンカーを介して連結されて単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）の形態で用いられ得る。一例において、由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｓｇＲＮＡは、少なくとも前記ｃｒＲＮＡのハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡの一部又は全部と前記Ｃａｓ９のｔｒａｃｒＲＮＡのＣａｓ９タンパク質と相互作用する部位を少なくとも含むｔｒａｃｒＲＮＡの一部又は全部とがヌクレオチドリンカーを介してヘアピン構造（ステムループ（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ）構造）を形成するものであり得る（この時、ヌクレオチドリンカーがループ構造に該当し得る。）。
前記ガイドＲＮＡ、具体的にｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡは、標的遺伝子内標的配列と相補的な配列（標的化配列）を含み、ｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡのアップストリーム部位、具体的にｓｇＲＮＡ又はｄｕａｌＲＮＡのｃｒＲＮＡの５’末端に１つ以上、例えば、１～１０個、１～５個、又は１～３個の追加のヌクレオチドを含むことができる。前記追加のヌクレオチドはグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ，Ｇ）であり得るが、これに制限されるものではない。
他の例において、前記ヌクレアーゼがＣｐｆ１である場合、前記ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含むものであり得、複合体を形成するＣｐｆ１タンパク質の種類及び／又はその由来微生物にしたがって適切に選択され得る。
前記ガイドＲＮＡの具体的配列は、ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）の種類（すなわち、由来微生物）にしたがって適切に選択でき、これは、この発明の属する技術分野における通常の知識を有する者には容易に分かる事項である。
一例において、標的特異的ヌクレアーゼとしてストレプトコッカスビオゲネス由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｓｇＲＮＡは次の一般式１で表現され得る：
一例において、前記ガイドＲＮＡは次の一般式１で表現され得る：
５’－（Ｎｃａｓ９）ｌ－（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）－（オリゴヌクレオチドリンカー）－（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６０）－３’ （一般式１）
前記一般式１において、
（Ｎｃａｓ９）ｌは、Ｎｃａｓ９が標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）の標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）上に結合（ハイブリダイズ）する標的化配列であり、その核酸配列は前記標的部位の配列によって決定され（すなわち、標的部位の配列とハイブリダイズ可能な配列である。）、ｌが前記標的化配列に含まれたヌクレオチド数を示すものであって、２０であり得、５’－末端から最初の核酸は標的部位配列とマッチングであるグアニン（Ｇで表示；標的部位の対応位置がシトシン（Ｃ）である場合）又はミスマッチングであるグアニン（ｇで表示；標的部位の対応位置がシトシン（Ｃ）でない場合）であり；
前記オリゴヌクレオチドリンカーは、３～５個、例えば４個のヌクレオチドを含むものであり得、前記ヌクレオチドは互いに同一でも異なってもよく、Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得る。
例えば、Ｎｃａｓ９が総２０個のヌクレオチドからなる場合、Ｘ２０（Ｘに続く数字は任意のヌクレオチド（Ｘ：Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧから選択）の個数を示す。）と表示したり、５’－末端から最初の核酸にマッチングされるグアニンが位置する場合にはＧＸ１９と表示され、５’－末端から最初の核酸にミスマッチングされるグアニンが位置する場合にはｇＸ１９と表示され得る。
前記ｓｇＲＮＡは３’末端に５個～７個のウラシル（Ｕ）を含む終結部位をさらに含むことができる。
前記延長されたガイドＲＮＡは、前述した一般式１のｓｇＲＮＡの５’末端に１～１０個のヌクレオチドをさらに含むことができる。前記さらに含まれるヌクレオチドはそれぞれ独立してＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧの中から選択され得る。このとき、さらに含まれるヌクレオチドは、標的ＤＮＡ配列の該当の位置（延長された位置）のヌクレオチドと相補的な配列を有するものであり得る。
また、前記ｓｇＲＮＡは５’末端に１～３個のグアニン（Ｇ）をさらに含むことができる。このとき、さらに含まれるグアニンはそれぞれ独立して標的配列の該当の位置のヌクレオチドと相補的（マッチング）であるか、非相補的（ミスマッチング）であり得る。
このように、前述した一般式１のｓｇＲＮＡ、例えば、Ｘ２０、ＧＸ１９、又はｇＸ１９と比較して、５’末端に１～３個のグアニン（Ｇ）をさらに含んだり及び／又はｓｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡの５’末端に１～１０個のヌクレオチド（それぞれ独立してＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧの中から選択され得る。）をさらに含む延長されたｓｇＲＮＡ形態である場合に塩基校正頻度及び／又は効率が増加し、より広範囲な部位で塩基校正が起こり得る。
前記ガイドＲＮＡの標的配列は、標的ＤＮＡ上のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の場合、５’－ＮＧＧ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣ））が位置する鎖又はその反対鎖（相補的鎖）においてＰＡＭの５’に隣接して位置する２０個の連続する核酸配列であり得る。
前記ガイドＲＮＡの標的配列とハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡの標的化配列は、前記標的配列が位置するＤＮＡ鎖（すなわち、ＰＡＭ配列（５’－ＮＧＧ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣである。）が位置するＤＮＡ鎖又はその反対鎖）の相補的な鎖のヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、又は１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するものであり、前記相補的鎖のヌクレオチド配列と相補的結合が可能である。
本明細書において、標的部位の核酸配列は標的遺伝子の該当の遺伝子部位の２本のＤＮＡ鎖のうち、ＰＡＭ配列が位置する鎖の核酸配列で表示される。このとき、実際にガイドＲＮＡが結合するＤＮＡ鎖はＰＡＭ配列が位置する鎖の相補的鎖であるので、前記ガイドＲＮＡに含まれた標的化配列は、ＲＮＡ特性上、ＴをＵに変更する他は、標的部位の配列と同じ核酸配列を有する。したがって、本明細書において、ガイドＲＮＡの標的化配列と標的部位の配列（又は、切断部位の配列）はＴとＵが相互変更される他は、同じ核酸配列で表示される。
前記ガイドＲＮＡはＲＮＡ形態で使用される（又は、前記組成物に含まれる）か、或いはこれを暗号化するＤＮＡを含むプラスミドの形態で使用され得る（或いは、前記組成物に含まれ得る）。
実施例
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１：ｓｇＲＮＡ長による塩基校正範囲の変化試験
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株においてそれぞれの活性をディープシークエンシングを用いて測定した。その結果を図２ａ～図２ｆに示した。
図２ａは、ＨＥＫ２部位においてｓｇＲＮＡ長によるＡＢＥ７．１０置換活性を塩基位置別に示すものである。図２ｂは、ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時と比較して相対的な置換活性［ｇＸ２０～３０活性／ＧＸ１９活性］を示すものである。図２ｃは、最も頻繁に現れる突然変異対立遺伝子を表示したものであり、ＷＴ配列において変異が導入された部分を赤色で表した。図２ｄは、ＨＢＢ部位においてｓｇＲＮＡ長によるＢＥ３置換活性を塩基位置別に示したものである。図２ｅは、ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時と比較して相対的な置換活性［ｇＸ２０～３０活性／ＧＸ１９活性］を示したものである。図２ｆは、最も頻繁に現れる突然変異対立遺伝子を表示したものであり、ＷＴ配列において変異が導入された部分を赤色で表した。ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時に効率よく作動する位置として知られた塩基校正範囲を空色で表示した。
実施例２：追加的なミスマッチＧを１個又は２個を含むｓｇＲＮＡを使用した時に塩基校正範囲の変化試験
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株においてそれぞれの活性をディープシークエンシングを用いて測定して得られた結果を図３に示した。
ｓｇＲＮＡ長によるＢＥ３置換活性を塩基位置別にＦＡＮＣＦ部位（図３ａ）とＨＢＢ部位（図３ｃ）で確認した。ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時と比較して相対的な置換活性［ｇＸ２０～３０活性／ＧＸ１９活性］をＦＡＮＣＦ部位（図３ｂ）とＨＢＢ部位（図３ｄ）において示した。
実施例３：４個の個別の部位においてｓｇＲＮＡ長による塩基校正範囲の変化試験
４個の個別の部位でｓｇＲＮＡ長による塩基校正範囲の変化を試験し、その結果を図４ａ及び図４ｂに示した。
４個の部位でＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時と比較して相対的なＡＢＥ７．１０の置換活性［ｇＸ２０～３０活性／ＧＸ１９活性］を確認し、その結果を図４ａに示した。ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時と比較して相対的なＢＥ３の置換活性［ｇＸ２０～３０活性／ＧＸ１９活性］を確認し、その結果を図４ｂに示した。ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡを使用した時に効率よく作動する位置として知られた塩基校正範囲を空色で表示した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株においてそれぞれの活性をディープシークエンシング方法で測定した。
実施例４：油彩と豆においてｓｇＲＮＡ形態による塩基校正範囲の変化試験
真核植物の代表として油彩と豆においてｓｇＲＮＡ形態による塩基校正範囲の変化を試験し、その結果を図５ａ～図５ｄに示した。
それぞれの活性はディープシークエンシングを用いて分析した。
油彩のプロトプラストにおいてｇＸ１９ ｓｇＲＮＡ及びｇＸ２０ ｓｇＲＮＡをＡＩＤ２シトシン塩基校正遺伝子ハサミと共に使用した時、シトシン位置による置換効率を測定してその結果を図５ａに示した。
ｓｇＲＮＡ形態によって最も頻繁に現れる突然変異が導入された対立遺伝子の変化を図５ｂに示した。ｇＸ２０ ｓｇＲＮＡを使用した時にのみＴＡＧ終止コドンが作られることが確認できた。
豆のプロトプラストにおいてｇＸ１９ ｓｇＲＮＡ及びｇＸ２０ ｓｇＲＮＡをＡＩＤ２シトシン塩基校正遺伝子ハサミと共に使用した時、シトシン位置による置換効率を測定して図５ｃに示した。ｓｇＲＮＡ形態によって最も頻繁に現れる突然変異が導入された対立遺伝子の変化を図５ｄに示した。同様に、ｇＸ２０ ｓｇＲＮＡを使用した時にのみＴＡＧ終止コドンが作られることが確認できた。
実施例５：マウスにおいてｓｇＲＮＡ形態による塩基校正範囲の変化試験
真核動物の代表としてマウスにおいてｓｇＲＮＡ形態による塩基校正範囲の変化を試験し、その結果を図６ａ及び図６ｂに示した。
マウスの胚に種々のｓｇＲＮＡと共にＡＢＥ ７．１０ ｍＲＮＡを微細注入した後、胚盤胞段階からディープシークエンシングによって置換活性を分析し、その結果を図６ａに示した。
ＧＸ２１ ｓｇＲＮＡを使用してＡＢＥ ７．１０ ｍＲＮＡと共に胚に微細注入を行って得た仔マウスを分析した結果、図６ｂに示した通り、所望のＨ４２０Ｒ突然変異を持つ３匹の仔マウスを得ることができた。
本発明によれば、デアミナーゼを使用した遺伝子塩基校正において、通常のガイドＲＮＡに比べて延長された形態の延長されたガイドＲＮＡを使用することによって、塩基校正頻度及び／又は効率を増進させることができ、このような技術を適用して所望の点突然変異を効果的に誘導することができる。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に述べたところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施態様であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。

Claims (7)

  1. （ｉ）デアミナーゼ又はこれをコードする遺伝子、
    （ｉｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）又は触媒活性欠乏Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）又はこれをコードする遺伝子及び
    （ｉｉｉ）標的配列とハイブリダイズ可能な延長されたガイドＲＮＡ又はこれをコードする遺伝子を含む塩基校正用組成物であって、
    前記延長されたガイドＲＮＡは、標的配列のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）から５’方向への２０個のヌクレオチドの配列を有し、そして５’末端に標的配列と非相補的な２個のグアニン（Ｇ）をさらに含むことを特徴とする塩基校正用組成物。
  2. 前記デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｅｄｉｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ １）、ＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）及びｔａｄＡ（ｔＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  3. ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）又はこれをコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  4. 核局在化配列（ＮＬＳ）又はこれをコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  5. 請求項１の塩基校正用組成物を非ヒト細胞に導入させる段階を含む塩基校正方法。
  6. 前記細胞はヒト細胞以外の動物細胞又は真核植物細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  7. 次の段階を含む突然変異が誘発されたヒト以外の哺乳動物又は真核植物の成体の作製方法；
    （ａ）請求項１に記載の塩基校正用組成物を哺乳動物の胚又は真核植物の胚に導入させる段階；及び
    （ｂ）前記胚を成長させて成体を得る段階。
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