JP7063510B1 - Ｃｄ４７とｐｄ－ｌ１を標的とする組換え融合タンパク質、その調製および使用 - Google Patents

Ｃｄ４７とｐｄ－ｌ１を標的とする組換え融合タンパク質、その調製および使用 Download PDF

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Abstract

【課題】ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１および／またはＦｃＲを標的とする組換え融合タンパク質、およびその腫瘍治療における使用を提供する。【解決手段】抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片を含む組換え融合タンパク質であって、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片の各パラトープが、前記パラトープを構成する重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＮ末端にあるシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して結合しており、該組換え融合タンパク質がＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１およびＦｃＲに同時に結合することができるものを提供する。また、本願は、組換え融合タンパク質をエンコードする核酸分子、該核酸分子を含む発現ベクター、組換え融合タンパク質の製造方法、および該組換え融合タンパク質を用いてＣＤ４７および／またはＰＤ－Ｌ１の過剰発現に関連する疾患を治療する方法を提供する。【選択図】図１

Description

［関連出願と参照による取り込み］
本出願は、２０２１年９月１５日に出願された中国特許出願第２０２１１１０８３８１９．５号の優先権を主張するものである。
前述の出願、およびそこに引用された、またはその審査中のすべての文献（「ａｐｐｌｎ引用文献」）、および本明細書に引用または参照されたすべての文献（本明細書に引用されたすべての文献、特許、公開特許出願を含むがこれらに限定されない）（「本明細書引用文献」）、および本明細書に引用または参照されたすべての文献は、本明細書に記載された、または本明細書に参照により組み込まれたすべての文献に記載されたすべての製品の製造者の指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと共に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施に採用されることがある。より具体的には、参照されたすべての文献は、個々の文献が参照により組み込まれることが明確且つ個別に示された場合と同じ程度に参照により組み込まれている。本開示で言及されているすべてのＧｅｎｂａｎｋ配列は、本開示の最も早い有効出願日のＧｅｎｂａｎｋ配列を参照することによって組み込まれている。
本出願は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１および／またはＦｃＲを標的とする組換え融合タンパク質、その調製および使用、特に、腫瘍治療における使用に関する。
癌細胞は、宿主の免疫監視から逃れるために、１）膜のＰＤ－ＬｌおよびＰＤ－Ｌ２タンパク質を高発現させ、この２つのタンパク質がＴ細胞表面のＰＤ－１と結合し、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導し、２）癌細胞膜からのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢの剥離を促進し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面のＮＫＧ２Ｄタンパク質と結合して、ＮＫ細胞によるＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ＋癌細胞破壊を阻害し、３）マクロファージ表面のシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）と結合して、マクロファージによる癌細胞の貪食を阻害するシグナルを誘導するＣＤ４７を表面に高レベルで発現させるなどを含むようないくつかの機構を開発してきたが、これらに限定されていない。癌細胞は非常に「賢く」、獲得された回避機構に依存して急速に繁殖しているように見える。従って、すべての癌細胞を破壊するための効果的な抗癌薬剤の開発は、これらの機構を標的にすることが重要となる。
［ＳＩＲＰおよびＣＤ４７］
シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）は、３つのファミリーメンバ、すなわち、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）、およびＳＩＲＰγ（ＣＤ１７２ｇ）を含む膜貫通糖タンパク質である。３つのタンパク質はすべて、同様の細胞外領域を含むが、細胞内ドメインは異なる。細胞外領域は、３つの免疫グロブリン様ドメイン、１つのＩｇ Ｖセット、および２つのＩｇ Ｃセットドメインを含む。ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）の細胞内ドメインは、シグナル伝達および対応する細胞機能を阻害できる２つの阻害シグナリング領域を含む。ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）およびＳＩＲＰγ（ＣＤ１７２ｇ）は、いかなるシグナル伝達ドメインも有しない非常に短い細胞内領域を有する。しかしながら、ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）は、例えばＤＡＰ１２などのアダプタタンパク質を通じてシグナル伝達のために機能し得る。ＳＩＲＰは主に、マクロファージ（Ｍφ）、樹状細胞（ＤＣ）およびニューロンにおいて発現する。
ＣＤ４７は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通糖タンパク質であり、赤血球を含むすべての種類の細胞の表面上で発現する。ＣＤ４７のリガンドはインテグリン、トロンボスポンジン－１およびＳＩＲＰを含む。ＣＤ４７は、ＳＩＲＰαと相互作用して「私を食べないでください」というシグナルを発することにより、マクロファージによる貪食作用を阻害でき、これにより、血液細胞などの細胞をマクロファージによる攻撃から保護する。
多くの腫瘍や癌細胞がＣＤ４７を過剰に発現しており、マクロファージによる癌細胞の貪食を妨げているという研究結果が示されている。ＣＤ４７を過剰発現する癌細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、および腎癌の細胞を含む。ＳＩＲＰαに対するＣＤ４７の結合をブロックする、ＣＤ４７に特異的な抗体を注射することにより、担癌マウスにおける腫瘍増殖を大幅に阻害できることが報告されている。ヒト白血病細胞を保持するマウスに同一の抗体を注射したとき、腫瘍または癌細胞は完全に除去された（Ｔｈｅｏｃｈａｒｉｄｅｓ ＡＰＡ， ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。
［ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１］
ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １またはＣＤ２７４としても知られているＰＤ－Ｌ１は、組織同種移植、自己免疫性疾患および癌の発生など、一部の特定のイベントにおいて免疫系を抑制する上で主な役割を担う膜貫通タンパク質である。癌において、ＳＴＡＴ３およびＮＦ－κＢのような転写因子間のフィードバック抑制の喪失は、局所的なＰＤ－Ｌ１発現が増加を引き起こし得、ＰＤ－Ｌ１を標的にする薬剤を用いる全身治療の効果が制限され得る（Ｖｌａｈｏｐｏｕｌｏｓ ＳＡ， ２０１７）。腎細胞癌の患者からの１９６の腫瘍標本の解析から、ＰＤ－Ｌ１の高い腫瘍発現は、腫瘍の進行性の増加、および、死亡リスクの４．５倍の増加に関連することが分かった（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＨ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。
ＰＤ－１は約２６８アミノ酸の細胞表面受容体である。ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合したとき、免疫系を下方制御し、Ｔ細胞炎症活性を抑制することにより自己寛容を促進する。免疫系に対するＰＤ－１の阻害作用は、自己免疫性疾患を防止するが、免疫系が癌細胞を破壊することも防止する。抗ＰＤ－１抗体ＢＭＳ－９３６５５８は、非小細胞性肺癌、悪性黒色腫、または腎細胞癌の患者うち、約５人中１人から４人中１人において、客観的応答を生じさせた（Ｓｕｚａｎｎｅ Ｌ． Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。
［ＦｃおよびＦｃＲ］
断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）は抗体の尾部領域であり、抗体のエフェクター機能、すなわち、特定の細胞受容体または他の防御タンパク質とどのように係合するかを決定するドメインである。
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、Ｂリンパ球、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞を含む特定の細胞の表面上に見られるタンパク質である。これらの細胞は、免疫系の保護機能に寄与している。
Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体、および、免疫系を活性化する相補系の一部のタンパク質と相互作用し得る。
［治療用二重特異性または多特異性融合タンパク質／抗体］
単一の抗原を標的にする抗体は、治療効率が限定されることが分かっている。例えば、承認されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ）の全奏効率はわずか３３％である。近年、二重特異性または三重特異性な融合タンパク質が開発され、前臨床テストおよび臨床テストで有望な効果を示している。
従来の抗体に付加的な結合部位を付けることは、概念的には簡単なことのように思われますが、このような修飾は、抗体の構造を著しく変化させ、互いの親和性および／または有効性を損なう可能性がある（Ｗａｎｇ Ｓ ｅｔ ａｌ， ２０２１）。ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性と医薬品としての特性を最適化するためには、主結合部と付加結合部（配列）の選択、標的に対するバランスのとれた親和性、結合部位（Ｎ末端またはＣ末端、重鎖または軽鎖）、構造的安定性、リンカの長さと配列について、入念な設計とエンジニアリングを行う必要がある（Ｓｈｉｍ Ｈ．，２０２０）。
ＵＳ１０,８００,８２１ Ｂ２は、ＨＬ細胞を保持するＢａｌｂ／ｃヌードマウスを治療するために使用される、ＣＤ４７およびＦｃＲの両方を標的にする約９０ｋＤａの組換え二機能性融合タンパク質を開示し、抗癌効果が強化されることが観察された。ＵＳ１０，９７３，８７８ Ｂ２には、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＦｃＲを同時に正確に標的とし、低分子量で半減期の長い融合タンパク質（すなわちＩＭＭ２５０５）が開示されている。
本出願中の文献の引用または識別は、当該文献が本開示の従来技術として利用可能であることを認めるものではありません。
本発明者らは、ＩＭＭ２５０５と類似の構造を持ちながら、新規の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を持つ組換え融合タンパク質を設計および調製し、この新規融合タンパク質がＩＭＭ２５０５よりも優れた抗腫瘍効果を示すことを明らかにした。
具体的には、本願は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片と、ＣＤ４７結合ペプチドとを含み、ＣＤ４７結合ペプチドが抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片に結合されている、組換え融合タンパク質を開示しており、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、ＦｃＲ結合能力を有し、重鎖可変領域のＣ末端に結合している重鎖定常領域とを含み、ＣＤ４７結合ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する変異したシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）細胞外ドメインを含み、組換え融合タンパク質は、ＣＤ４７とＰＤ－Ｌ１に同時に結合することができる。ＣＤ４７結合ペプチドは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＮ末端に結合してもよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列によってエンコードされていてもよい。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片の少なくとも１つのパラトープが、パラトープを構成する重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＮ末端でＣＤ４７結合ペプチドに連結されている。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片の各パラトープが、パラトープを構成する重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＮ末端でＣＤ４７結合ペプチドに連結されている。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片の各パラトープが、パラトープを構成する重鎖可変領域のＮ末端でＣＤ４７結合ペプチドに連結されている。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片の各パラトープが、パラトープを構成する軽鎖可変領域のＮ末端でＣＤ４７結合ペプチドに連結されている。
ＦｃＲ結合能力を有する重鎖定常領域は、天然由来または人工のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４重鎖定常領域、またはその機能的断片であってよい。特定の実施形態では、ＦｃＲ結合能力を有する重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、またはその機能的断片である。特定の実施形態では、ＦｃＲ結合能力を有する重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列を有する。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片は、軽鎖可変領域のＣ末端に連結された軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパ軽鎖定常領域、またはその機能的断片を含んでいてもよい。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含んでよい。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域－軽鎖定常領域断片とを含んでよい。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含んでよい。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域－軽鎖定常領域断片とを含んでよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および８のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および７の核酸配列によってエンコードされてよい。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片は、リンカを介してＣＤ４７結合ペプチドに連結されてよい。リンカは、５～３０、１０～３０、１０～２０または１５アミノ酸残基のペプチドであってよい。リンカは、－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）２－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、または－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）４－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）であってよい。特定の実施形態では、リンカは、－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の核酸配列によってエンコードされていてもよい。
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ４７結合ペプチド－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域－軽鎖定常領域断片とを含む。特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ４７結合ペプチド－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域とを含む。特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を有するＣＤ４７結合ペプチド－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域－軽鎖定常領域断片とを含む。特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を有するＣＤ４７結合ペプチド－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域とを含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８および１０のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７および９の核酸配列によってエンコードされてよい。
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ４７結合ペプチド－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域－軽鎖定常領域断片とを含む。特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有するＣＤ４７結合ペプチド－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域－軽鎖定常領域断片とを含んでいる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および１６のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および１５の核酸配列によってエンコードされてよい。
また、本願は、本開示の組換え融合タンパク質をエンコードする核酸分子、ならびに、そのような核酸分子を含む発現ベクター、および、そのような発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本開示の宿主細胞を用いて組換え融合タンパク質を調製する方法であって、（ｉ）宿主細胞で組換え融合タンパク質を発現させるステップと、（ｉｉ）宿主細胞またはその細胞培養物から組換え融合タンパク質を分離するステップとを含む方法が提供される。
本願はさらに、本開示の組換え融合タンパク質、核酸分子、発現ベクター、または宿主細胞と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含むことができる医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容されるアジュバントを含む。
本開示の組換え融合タンパク質または医薬組成物は、ＣＤ４７および／またはＰＤ－Ｌ１の過剰発現に関連する疾患の治療に、または治療用医薬品の調製に使用することができる。
一態様では、本願は、それを必要とする対象において、ＣＤ４７および／またはＰＤ－Ｌ１の過剰発現に関連する疾患を治療または緩和する方法であって、治療有効量の本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、腎細胞癌などが考えられる。
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例から明らかであるが、これは限定として解釈されるべきでない。本出願全体において引用されるすべての内容、ＧｅｎＢａｎｋエントリ、引用される特許および特許出願公開は、参照いよって本明細書に明示的に組み込まれる。
従って、本出願の目的は、従来から知られている製品、製品の製造プロセス、製品の使用方法を本出願に包含しないことであり、本出願人は、従来から知られている製品、製造プロセス、方法の免責事項を表明する権利を留保し、ここに開示する。さらに、本出願は、ＵＳＰＴＯ（米国特許法§１１２第１段落）またはＥＰＯ（ＥＰＣ第８３条）の書面による記述および実施可能要件を満たさない製品、プロセス、または製品の製造、または製品の使用方法を本出願の範囲内に包含することを意図していないため、出願人は、以前に記述された製品、製品の製造プロセス、または製品の使用方法の免責事項を表明する権利を留保し、ここに開示するものとする。Ａｒｔ．５３（ｃ）ＥＰＣとＲｕｌｅ ２８（ｂ）および（ｃ）ＥＰＣに準拠していることは、出願の実務において有利に働く可能性がある。本出願の系統、他の系統、または第三者の先行出願において、出願人が付与した特許の対象となっている実施形態を明示的に否認する権利はすべて留保されている。本明細書に記載されている内容は、約束事として解釈されるものではない。
本開示、特に請求項および／または段落において、「備える」、「からなる」、「構成されている」などの用語は、米国特許法で帰される意味を持つことができることに留意されたい。例えば、「含む」、「含まれる」、「含んでいる」などの意味がある。また、「基本的に構成されている」および「基本的に備える」などの用語は、米国特許法においてそれに帰せられる意味を有し、例えば、明示的に記載されていない要素を許容するが、先行技術に見られる要素や、本願発明の基本的または新規な特性に影響を与える要素を除外することができる。
図１Ａおよび図１Ｂは、本願発明の組換え融合タンパク質「ＩＭＭ２５２０」および「ＩＭＭ２５２１」の構造を示す模式図である。 図２は、本願発明の組換え融合タンパク質の作用機構を示す模式図である。 図３は、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＰＤＬ１）におけるＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１のＰＤ－Ｌ１に対する結合活性を示す。 図４は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ４７に対するＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１の結合活性を示す。 図５Ａおよび図５Ｂは、ＣＤ４７－ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞（Ａ）またはＣＤ４７＋Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞（Ｂ）におけるＰＤ－１－ＦｃのＰＤ－Ｌ１への結合をブロックするＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１の能力を示す。 図６Ａおよび図６Ｂは、ＰＤ－Ｌ１－Ｒａｊｉ細胞（Ａ）またはＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞（Ｂ）におけるＳＩＲＰα－ＦｃとＣＤ４７との結合をブロックするＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１の能力を示す。 図７は、ＩＭＭ２５２０がＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する能力を示している。 図８は、ＩＭＭ２５２０がＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞に対して抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を誘導する能力を示したものである。 図９は、ＣＴ２６－ｈＰＤＬ１ｈＣＤ４７腫瘍を有するシンジニックＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ１／ｈＳＩＲＰαマウスにおけるＩＭＭ２５２０のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。 図１０は、ＩＭＭ２５２０を投与したマウスが、ＩＭＭ２５０５を投与したマウスよりも優れた生存率を示している。 図１１は、ＰＤ－Ｌ１結合で飽和した場合のＩＭＭ２５２０のＣＤ４７への結合能力を示している。 図１２は、ＣＤ４７結合で飽和した場合のＩＭＭ２５２０のＰＤ－Ｌ１への結合能力を示している。
以下の詳細な説明は、例として与えられたものであり、記載された特定の実施形態のみに適用を限定することを意図したものではないが、添付の図面と併せて最もよく理解されるであろう。
図１Ａおよび図１Ｂは、本願発明の組換え融合タンパク質「ＩＭＭ２５２０」および「ＩＭＭ２５２１」の構造を示す模式図である。一番上の円形のドメインは、ＳＩＲＰαタンパク質の変異した細胞外ドメイン１（ＳＩＲＰαＤ１）で、ペプチドリンカを介して抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖（Ａ）または軽鎖（Ｂ）のＮ末端に結合している。変異したＳＩＲＰαＤ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にそれぞれ記載された核酸およびアミノ酸配列を有している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有するリンカは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の核酸配列によってエンコードされてよい。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６にそれぞれ記載されている核酸配列およびアミノ酸配列を有している。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８にそれぞれ記載されている核酸およびアミノ酸配列を有している。
図２は、本願発明の組換え融合タンパク質の作用機構を示す模式図である。
図３は、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＰＤＬ１）におけるＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１のＰＤ－Ｌ１に対する結合活性を示す。ＩＭＭ２５０５は、ＵＳ１０，９７３，８７８Ｂ２に記載されている融合タンパク質で、ＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１と同様の全体的なデザインを共有しており、変異したＳＩＲＰαＤ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と異なる抗ＰＤ－Ｌ１抗体から構成されている。ＩＭＭ２５１５は、ＩＭＭ２５２０とＩＭＭ２５２１を構成する抗ＰＤ－Ｌ１抗体で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の重鎖とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の軽鎖で構成されている。アテゾリズマブは市販の抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、ｈＩｇＧ１－Ｆｃは陰性対照として使用した。
図４は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ４７に対するＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１の結合活性を示す。ＩＭＭ２５０５は、ＵＳ１０，９７３，８７８Ｂ２に記載されている融合タンパク質で、ＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１と同様の全体的なデザインを共有しており、変異したＳＩＲＰαＤ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と異なる抗ＰＤ－Ｌ１抗体から構成されている。ＩＭＭ０１は、ＵＳ２０２１／００２４５９８Ａ１に記載されており、２つの変異したＳＩＲＰαＤ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）がＦｃダイマー断片に連結されて構成されており、その単量体はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の核酸配列およびアミノ酸配列を有している。陰性対照としてｈＩｇＧ１－Ｆｃを用いた。
図５Ａおよび５Ｂは、ＣＤ４７－ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞（Ａ）またはＣＤ４７＋Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞（Ｂ）におけるＰＤ－１－ＦｃのＰＤ－Ｌ１への結合をブロックするＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１の能力を示す。ＩＭＭ２５１５は、ＩＭＭ２５２０とＩＭＭ２５２１を構成する抗ＰＤ－Ｌ１抗体で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の重鎖とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の軽鎖で構成されている。陰性対照としてｈＩｇＧ１－Ｆｃを用いた。
図６Ａおよび図６Ｂは、ＰＤ－Ｌ１－Ｒａｊｉ細胞（Ａ）またはＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞（Ｂ）におけるＳＩＲＰα－ＦｃとＣＤ４７との結合をブロックするＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１の能力を示す。ＩＭＭ０１は、ＵＳ ２０２１／００２４５９８Ａ１に記載されており、２つの変異したＳＩＲＰαＤ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）がＦｃダイマー断片に連結されて構成されており、その単量体はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の核酸配列およびアミノ酸配列を有している。陰性対照としてｈＩｇＧ１－Ｆｃを用いた。
図７は、ＩＭＭ２５２０がＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する能力を示している。ＩＭＭ２５１５は、ＩＭＭ２５２０とＩＭＭ２５２１を構成する抗ＰＤ－Ｌ１抗体で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の重鎖とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の軽鎖で構成されている。
図８は、ＩＭＭ２５２０がＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞に対して抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を誘導する能力を示したものである。ＩＭＭ２５１５は、ＩＭＭ２５２０とＩＭＭ２５２１を構成する抗ＰＤ－Ｌ１抗体で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の重鎖とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の軽鎖で構成されている。ＩＭＭ０１は、ＵＳ２０２１／００２４５９８Ａ１に記載されており、２つの変異したＳＩＲＰαＤ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）がＦｃダイマー断片に連結されて構成されており、その単量体はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の核酸配列およびアミノ酸配列を有している。陰性対照としてｈＩｇＧ１－Ｆｃを用いた。
図９は、ＣＴ２６－ｈＰＤＬ１ｈＣＤ４７腫瘍を有するシンジニックＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ１／ｈＳＩＲＰαマウスにおけるＩＭＭ２５２０のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。ＩＭＭ０１は、ＵＳ ２０２１／００２４５９８ Ａ１に記載されており、２つの変異したＳＩＲＰαＤ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）がＦｃダイマー断片に連結されて構成されており、その単量体はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の核酸配列およびアミノ酸配列を有している。ＩＭＭ２５０５は、ＵＳ１０，９７３，８７８Ｂ２に記載されている融合タンパク質で、ＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１と同様の全体的なデザインを共有しており、変異したＳＩＲＰαＤ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と異なる抗ＰＤ－Ｌ１抗体から構成されている。
図１０は、ＩＭＭ２５２０を投与したマウスが、ＩＭＭ２５０５を投与したマウスよりも優れた生存率を示している。ＩＭＭ２５０５は、ＵＳ１０，９７３，８７８ Ｂ２に記載されている融合タンパク質で、ＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１と同様の全体的なデザインを共有しており、変異したＳＩＲＰαＤ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と異なる抗ＰＤ－Ｌ１抗体から構成されている。
図１１は、ＰＤ－Ｌ１結合で飽和した場合のＩＭＭ２５２０のＣＤ４７への結合能力を示している。
図１２は、ＣＤ４７結合で飽和した場合のＩＭＭ２５２０のＰＤ－Ｌ１への結合能力を示している。
腫瘍増殖に関わる２つ以上の薬理学的ターゲットを標的とするアプローチには、主に３つの異なる方法がある。最も一般的なのは、患者に２種類以上の異なる薬剤を組み合わせたカクテルを投与することができる。この選択肢では、可能な薬剤の組み合わせ、および異なる投与量に関して最大限の柔軟性を可能にするが、（ａ）錠剤の負担が増加すること、および、個々の薬剤ごとに投与スケジュールが異なることから、治療に対する患者のアドヒアランスが低下する可能性があり、（ｂ）薬剤間の相互作用による不適合の可能性があり、（ｃ）薬剤の副作用のリスクが増加する、という問題がある。これらの課題により、治療の効果が低減し、特に癌など慢性疾患の管理において、治療目標の達成の妨げになり得る。
第２のアプローチは、単回投与形態の薬剤の多剤混合薬を使用することに依存する。このアプローチは、錠剤の負担を低減させるので、患者コンプライアンスの改善をもたらす。多剤混合薬の短所は主に、活性成分間の可能な用量比の選択肢が限定されることである。これにより、最小の副作用で最大の効力を得るように個々の患者について適切に調整することがより難しくなる。付加して、組み合わせにおける成分の薬物動態特性が異なることにより、個々の標的における薬力学作用の複雑な時間的ミスマッチが生じ得、それにより、全体的な効力が損なわれる。
第３のアプローチは、単一の化合物において２つ以上の薬理を組み合わせる多機能性薬剤を使用することである。そのような多機能分子の設計および妥当性確認は、より複雑であり、分子における標的活性の最適比について、多くの調査を必要とするが、統一された薬物動態は、分子標的における整合された薬力学活性をもたらし得る。多機能分子はまた、他の薬剤との多剤混合薬にもなり得、これにより、単一の錠剤において、３つ、またはさらには４つの薬理を組み合わせて効力の更なる増加をもたらす。
本発明者は入念な実験を通じて、３つの作用機構（１つはＰＤ－１媒介阻害シグナルによるＴ細胞に対するブレーキまたは阻害を解除すること、１つはＳＩＲＰ媒介阻害シグナルによるマクロファージに対するブレーキを解除すること、１つはＮＫ細胞および／またはマクロファージによる癌細胞破壊を刺激すること）を介して腫瘍を攻撃できる新規の組換え多機能性融合タンパク質を発明した。
本願発明の組換え融合タンパク質は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗体断片からなり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗体断片の少なくとも１つのパラトープが、パラトープを構成する重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＮ末端にあるシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結されているものである。組換えタンパク質は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１およびＦｃＲに同時に結合でき、ｉ）癌細胞上のＰＤ－Ｌ１とＴ細胞上のＰＤ－１との相互作用をブロックし、これにより、ＰＤ－１媒介阻害シグナルによるＴ細胞に対するブレーキを解除し、ｉｉ）癌細胞上のＣＤ４７と、マクロファージ上のＳＩＲＰとの相互作用をブロックし、これにより、ＳＩＲＰ媒介阻害シグナルによるマクロファージに対するブレーキを解除し、（ｉｉｉ）ＮＫ細胞またはマクロファージ上のＦｃＲに対して抗体のＦｃ部を結合させて、ＮＫ細胞またはマクロファージによる癌細胞破壊を刺激する。一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の１つのパラトープが、リンカを介して、パラトープを構成する重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＮ末端にあるシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結されている。別の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の各パラトープは、リンカを介して、パラトープを構成する重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＮ末端にあるシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結されている。一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の各パラトープは、リンカを介して、パラトープを構成する重鎖可変領域のＮ末端にあるシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結されている。一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の各パラトープは、リンカを介して、パラトープを構成する軽鎖可変領域のＮ末端にあるシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結されている。本願の組換え融合タンパク質は、サイズが小さく（１５０～１８０ｋＤａ）、５～１０日の長い半減期を有する。
本願の融合タンパク質に含まれる３つの主成分は、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメイン、リンカ、および抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。当業者であれば、上の３成分を選択するための設計の選択肢が多くあることを認識するであろう。非ヒト動物のタンパク質またはペプチドの免疫原性はアレルギーおよびその他の副作用を引き起こし得るので、好ましくは、ヒト由来配列がヒトの癌療法において使用される。しかしながら、異なる応用の目的に基づき、他の動物タンパク質またはペプチドも、必要に応じてヒト化されて本願において使用され得る。
ＣＤ４７と結合可能な任意のＳＩＰＲ（ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβ、ＳＩＲＰγ）の任意の細胞外Ｉｇ様ドメインが融合タンパク質の構築のために選択され得る。一実施形態において、組換え融合タンパク質におけるシグナル調節タンパク質はＳＩＲＰαであり、シグナル調節タンパク質の細胞外Ｉｇ様ドメインはＳＩＲＰαの第１細胞外Ｉｇ様ドメインである（ＳＩＲＰαＤ１）。特定の実施形態において、ＳＩＲＰαＤ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の８０位にＮからＡへの変異を含み、グリコシル化部位を除去したＳＩＲＰαＤ１変異体である。
一実施形態において、組換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２においてそれぞれ記載される核酸配列およびアミノ酸配列を有するＳＩＲＰαＤ１を含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαＤ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＳＩＲＰαＤ１は、癌／腫瘍細胞の細胞表面上のＣＤ４７に結合して、ＣＤ４７とマクロファージの細胞表面上のＳＩＲＰとの相互作用をブロックできる。
リンカは主に、ＳＩＲＰの細胞外Ｉｇ様ドメインと、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端との間のスペーサとして機能する。リンカは、ペプチド結合で連結されたアミノ酸で構成されていてもよく、好ましくは、ペプチド結合で連結された５～３０個のアミノ酸、１０～３０個のアミノ酸、１０～２０個のアミノ酸、または１５個のアミノ酸であり、アミノ酸は、天然に存在する２０種類のアミノ酸から選択される。当業者であれば理解できるように、これらのアミノ酸のうち１または複数は、グリコシル化され得る。一実施形態において、５～３０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびリシンから選択され得る。一実施形態において、リンカの大部分は、グリシンおよびアラニンなど、立体障害のないアミノ酸から作られる。例示的なリンカは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙｓ、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ－Ａｌａ））およびポリアラニンである。下の例に示される好適なリンカの一例は、（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）、例えば－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）である。
リンカは非ペプチドリンカでもよい。例えば、－ＮＨ－、－（ＣＨ２）ｓ－Ｃ（Ｏ）－などのアルキルリンカ（ｓ＝２～２０）を使用できる。これらのアルキルリンカはさらに、低級アルキル（例えばＣ１－４）、低級アシル、ハロゲン（例えばＣＩ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなど、任意の非立体障害基によって置換され得る。
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および７の核酸配列によってそれぞれエンコードされ得る、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を各々有する２つの重鎖と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を各々有する２つの軽鎖とを備える単離モノクローナル抗体である。抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＦａｂ部分（またはパラトープ）は、癌／腫瘍細胞の細胞表面上のＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－Ｌ１と、Ｔ細胞の細胞表面上のＰＤ－１との相互作用をブロックでき、これにより、ＰＤ－１媒介阻害シグナルによるＴ細胞に対するブレーキを解除する。抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＦｃ部はＮＫ細胞またはマクロファージの細胞表面上のＦｃＲに結合して、ＮＫ細胞またはマクロファージによる癌細胞破壊を促進できる。いくつかの実施形態において、重鎖はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－Ｌ１とＴ細胞の細胞表面上のＰＤ－１との相互作用をブロックでき、また、ＮＫ細胞またはマクロファージの細胞表面上のＦｃＲに結合でき、これにより、癌細胞を破壊するようにＮＫ細胞またはマクロファージを活性化する。いくつかの実施形態において、軽鎖はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－Ｌ１とＴ細胞の細胞表面上のＰＤ－１との相互作用をブロックできる。
本明細書でいう「抗体」との用語には、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭの全抗体、および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその単鎖が含まれる。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に細分化でき、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存的な領域が点在する。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）、および、古典的補体経路の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主の組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介できる。
本明細書において、「抗体断片」という用語は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する能力、および任意にＦｃ受容体に結合する能力を保持する、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の一部または断片を意味する。
本明細書では、「配列同一性」とは、配列間の最大パーセントの配列同一性を達成するために、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、参照配列中のヌクレオチド／アミノ酸残基と同一である対象配列中のヌクレオチド／アミノ酸残基のパーセントを意味する。２つ以上のアミノ酸配列または核酸配列間の配列同一性の割合を決定するためのペアワイズおよびマルチプルシーケンスアラインメントは、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ、Ｔ－ｃｏｆｆｅｅ、ＫａｌｉｇｎおよびＭＡＦＦＴなどの一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者に知られている様々な方法で達成することができる。このようなソフトウェアを使用する場合は、ギャップペナルティおよび拡張ペナルティなどのデフォルトパラメータを使用することが望ましい。
また、本願は、組換え融合タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド分子、および、組換え二機能性融合タンパク質を発現する発現ベクターを提供する。ベクターの例には、これらに限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、形質転換可能人工染色体（ＴＡＣ）、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）、およびヒト人工エピソーム染色体（ＨＡＥＣ）が含まれる。
本願は、上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされ得る。好適な宿主細胞として、大腸菌、酵母および他の真核生物が挙げられる。好ましくは、大腸菌、酵母または哺乳類の細胞株（ＣＯＳまたはＣＨＯなど）が使用される。
別の態様において、本開示は、薬学的に許容されるキャリアと共に製剤化された本願の融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。組成物は任意で、別の抗体または薬剤など、１または複数の追加の薬学的活性成分を含み得る。本願の医薬組成物はまた、例えば、別の免疫刺激剤、抗癌剤、抗ウイルス剤、またはワクチンとの併用療法において投与できる。
医薬組成物は任意の数の賦形剤を含むことができる。使用できる賦形剤として、担体、表面活性剤、増粘剤、乳化剤、固体結合剤、分散助剤、懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、着香剤、コーティング、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存料、等張剤、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適切な賦形剤の選択と使用については、Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ Ｅｄ． （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれている。
医薬組成物における主要なビヒクルまたは担体は、本質的に水性でも非水性でもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、場合によっては注射において一般的な他の物質が添加されている、注射、生理食塩水、または人工脳脊髄液のための水であり得る。例えば、ビヒクルまたは担体は、中性緩衝生理食塩水、または、血清アルブミンと混合された生理食塩水であり得る。他の例示的な医薬組成物は、ソルビトールまたはその好適な置換をさらに含み得るＴｒｉｓ緩衝液、または、酢酸塩緩衝液を含む。本願の一実施形態において、組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、所望の純度を有する選択された組成物を任意の製剤化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｓｕｐｒａ）と混合することによって、保管のために調製され得る。さらに、治療用組成物は、スクロースなど適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化され得る。
医薬組成物は、好ましくは（例えば注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に好適である。投与の経路に応じて、活性分子は、それを不活性化し得る酸および他の天然条件の作用から保護するための物質にコーティングされ得る。本明細書において使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。代替的に、本願の抗体は、局所、表皮、または粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、口腔内、経膣、直腸、舌下または局所などの経口経路を介して投与できる。
医薬組成物は、無菌水溶液または分散系の形態であり得る。また、それらはマイクロエマルション、リポソーム、または、高い薬剤濃度に好適な他の規則構造で製剤化され得る。
単回投与形態を生成するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される対象、および、特定の投与方法に応じて変動し、一般的に、治療効果を生じさせる組成物の量である。一般的に、１００％のうち、この量は、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて、活性成分の約０．０１％から約９９％の範囲になる。
最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように投与計画が調整される。例えば、いくつかの分割された用量を経時的に投与できる、または、治療状況の緊急事態による指示に応じて用量を比例的に減少または増加させることができる。投与を容易にするために、および、投与量を統一するために、単位用量形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において使用される単位用量形態とは、治療される対象のための単位用量として好適な物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じさせるために算出された活性化合物の予め定められた量を含む。融合タンパク質は代替的に、徐放性製剤として投与できる。この場合、必要な投与頻度が少ない。
融合タンパク質の投与については、投与量は、宿主の体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。一例としては、週に２回投与する投与計画が挙げられる。
本願の融合タンパク質の「治療有効投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、無疾患症状期間の頻度および期間の増加、または、疾患の苦痛に起因する機能障害または能力障害の予防を引き起こす。例えば、担癌の対象を治療する場合、「治療有効投与量」は好ましくは、未治療の対象と比較して、少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、なおさらに好ましくは少なくとも約９９％だけ腫瘍増殖を阻害する。本願の融合タンパク質の治療有効量は、腫瘍サイズを低減でき、または、そうでなければ、典型的にはヒトである、または別の哺乳類であり得る対象における症状を改善する。
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤であり得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など、生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８を参照されたい。
治療用組成物は、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３； ５，３８３，８５１； ５，３１２，３３５； ５，０６４，４１３； ４，９４１，８８０； ４，７９０，８２４；および４，５９６，５５６号）、（２）マイクロ注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮装置（米国特許第４，４８６，１９４号）、（４）注入機器（米国特許第４，４４７，２３３および４，４４７，２２４号）、（５）浸透圧装置（米国特許第４，４３９，１９６および４，４７５，１９６号）などの医療装置を介して投与され得る。これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、本願の融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで適切に分布することを確実にするために製剤化され得る。例えば、本願の治療用融合タンパク質が血液脳関門を超えることを確実にするために、それらは、特定の細胞または臓器への選択的輸送を強化する標的化部分を追加的に含み得るリポソームにおいて製剤化され得る。例えば、米国特許第４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；５，４１６，０１６；および５，３９９，３３１を参照されたい。
本願の組換え融合タンパク質またはその誘導体をエンコードする核酸分子が対象に直接導入されるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法も考えられる。例えば、本願の組換え融合タンパク質をエンコードする核酸配列が、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適切な送達ベクターを用いて、または用いず、核酸コンストラクトの局所注射を介して標的細胞に導入される。代替的なウイルスベクターとして、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよび乳頭腫ウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターの物理的移入は、所望の核酸コンストラクト、または、所望の核酸配列を含む他の適切な送達ベクターの局所注射、リポソーム媒介移入、直接注射（ネイキッドＤＮＡ）、または微粒子ボンバードメント（遺伝子ガン）によってｉｎ ｖｉｖｏで達成され得る。
本開示の組成物は、単独で、または、治療効果を強化するために、もしくは、潜在的な副作用を低減するために、他の治療剤と組み合わせて使用され得る。
本願の別の目的は、上の組換え融合タンパク質、および、それを含む医薬組成物を調製するための方法を提供することである。一実施形態において、方法は、（１）ポリヌクレオチド分子をエンコードするタンパク質を提供すること、（２）（１）のポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを構築すること、（３）（２）の発現ベクターで好適な宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換して、タンパク質を発現させるために宿主細胞を培養すること、（４）タンパク質を精製することを含む。調製は、当業者によって、既知の技術を用いて実行され得る。
本願の別の目的は、上記医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者または対象に投与することを含む、本願の医薬組成物を使用して癌を治療する方法を提供することである。一実施形態において、医薬組成物は、これらに限定されないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌および腎癌を含む、ＣＤ４７および／またはＰＤ－Ｌ１過剰発現腫瘍または癌を治療するために使用される。
一実施形態において、ＣＤ４７および／またはＰＤ－Ｌ１の過剰発現に関連する疾患は、これらに限定されないが、クローン病、アレルギー性喘息おｙび関節リウマチを含む。
以下では非限定的な例を用いて、本願をさらに説明する。
［実施例］
まず、本明細書以下に記載されている組換えタンパク質を説明する。
ＩＭＭ２５１５は、モノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。このモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を各々有する２つの重鎖と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を各々有する２つの軽鎖とを有し、これら２つはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および７の核酸配列によってエンコードされ得る。
ＩＭＭ０１は、米国特許出願公開第２０２１／００２４５９８Ａ１号に記載されたように、２つの変異したＳＩＲＰαＤ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）がＦｃダイマー断片に連結されて構成されており、その単量体はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の核酸配列およびアミノ酸配列を有している。
ＩＭＭ２５２０は、各重鎖のＮ末端においてＧＳ－リンカを介してＩＭＭ２５１５に各々連結される２つの変異したＳＩＲＰαＤ１を含む組換え融合タンパク質である。ここで、変異したＳＩＲＰαＤ１は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である核酸配列およびアミノ酸配列を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有するリンカは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の核酸配列によってエンコードされ得る。
ＩＭＭ２５２１は、各軽鎖のＮ末端においてＧＳ－リンカを介してＩＭＭ２５１５に各々連結される２つの変異したＳＩＲＰαＤ１を含む組換え融合タンパク質である。ここで、変異したＳＩＲＰαＤ１は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である核酸配列およびアミノ酸配列を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有するリンカは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の核酸配列によってエンコードされ得る。
ＩＭＭ２５０５は、米国特許出願公開第１０，９７３，８７８Ｂ２号に開示されている融合タンパク質で、ＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１と同様の全体的なデザインを共有しており、変異したＳＩＲＰαＤ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と異なる抗ＰＤ－Ｌ１抗体とを含んでいるる。
［実施例１．ＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１を発現するベクターの構築］
ＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１の構造を図１Ａおよび図１Ｂに示した。組換え融合タンパク質ＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１のコード配列の全長は人工的に設計された。
具体的には、ＩＭＭ２５２０のＳＩＲＰαＤ１－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖については、変異したＳＩＲＰαＤ１のコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）をＧＳ－リンカのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を介してＩＭＭ２５１５の抗ＰＤ－Ｌ１重鎖コード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の５'末端に連結し、変異したＳＩＲＰαＤ１－コード配列の５'末端にマウスＩｇＧ１重鎖のシグナルペプチドをエンコードする５７ヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）を付加し、コザック配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）をシグナルペプチド配列の５'末端に付加した。最後に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限酵素認識部位がそれぞれ、結果として生じる配列の５'および３'末端に付加された。ＩＭＭ２５２０の抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖については、抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖コード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）の５'末端にコザック配列と同様のシグナルペプチド配列を付加し、得られた配列の５'および３'末端にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を付加した。
ＩＭＭ２５２１のＳＩＲＰαＤ１－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖については、変異したＳＩＲＰαＤ１のコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を、ＧＳ－リンカのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を介して、ＩＭＭ２５１５の抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖コード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）の５'末端に連結した。ＩＭＭ２５２１の抗ＰＤ－Ｌ１重鎖については、抗ＰＤ－Ｌ１重鎖コード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の５'末端に、コザック配列と同様に、同じシグナルペプチド配列を付加した。
結果として生じる配列は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成され、それぞれｐＭａｃ－ＨおよびｐＭａｃ－Ｌベクターにサブクローニングされた。
［実施例２．タンパク質発現および精製］
組換えタンパク質ＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１を製造するために、ネオマイシンの圧力選択を複数回受けたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ＃ ＣＣＬ－６１）へ発現ベクターが電気穿孔で導入された。選択された安定した細胞は、血清を含まないＢａｌａｎ ＣＤ ＣＨＯ Ｇｒｏｗｔｈ Ａ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃９４１２０）に適合された。タンパク質発現については、細胞は３リットルバイオリアクタに播種され、フェドバッチプロセスにおいて培養された。細胞の生存率が約８０％に低下した時点で、バイオリアクターから細胞培養上清を採取し、親和性クロマトグラフィーによるタンパク質精製を行った。組換えタンパク質の純度は９５％より高く、エンドチキシンの含有量は０．５Ｕ／ｇより低かった。
［実施例３．ＰＤ－Ｌ１およびＣＤ４７に結合したＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１］
ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞（ＰＤ－Ｌ１を過剰発現している、自社製）またはＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ４７を自然に発現している）を、それぞれ希釈したＩＭＭ２５２０、ＩＭＭ２５２１、対照剤とともに４℃で１時間連続的に希釈した。細胞は冷たいＰＢＳで２回洗浄され、次に、ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（Ｃａｔ＃Ｆ９５１２、Ｓｉｇｍａ）に対するＦＩＴＣ結合二次抗体と共に４５分間希釈された。細胞は２回洗浄され、２００ｍｌのＰＢＳにおいて再懸濁された。次に、フローサイトメータ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｇｕａｖａ（登録商標） ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ）を使用して、細胞がＦＡＣＳ解析にかけられた。
ＩＭＭ２５２０は、ＣＨＯ細胞上のＰＤ－Ｌ１に結合し（図３）（ＥＣ５０値は０．０９ｎＭの）、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ４７に結合し（図４）（ＥＣ５０値は０．８０ｎＭの）、従来の単一抗原標的化タンパク質に比べて少し劣っている。ＩＭＭ２５２１は、ＣＨＯ細胞上のＰＤ－Ｌ１に結合し（図３）（ＥＣ５０値は０．１１ｎＭの）、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ４７に結合し（図４）（ＥＣ５０値は０．７０ｎＭの）、従来の単一抗原標的化タンパク質に比べて少し劣っている。
［例４．ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１の相互作用を阻害したＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１］
１μｇ／ｍｌのビオチン－ｈＰＤ１－ｍＦｃタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を、連続的に希釈したＩＭＭ２５２０、ＩＭＭ２５２１、ＩＭＭ２５１５およびｈＩｇＧ１－Ｆｃとそれぞれ混合し、その混合物を、ＣＤ４７＋またはＣＤ４７－のＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞を含む９６ウェルプレートに添加した。細胞が４℃で４５分間希釈され、ＰＢＳで洗浄され、次に、４℃でさらに４５分間、ＰＥ結合マウス抗ヒトＣＤ２７９（Ｃａｔ＃５５７９４６、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）と共に希釈した。細胞を洗浄し、２００ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、ｈＰＤ１－ｍＦｃ－ＰＤ－Ｌ１の結合／相互作用についてＦＡＣＳ解析を行った。
図５Ａに示すように、ＩＭＭ２５２０、ＩＭＭ２５２１およびＩＭＭ２５１５のいずれも、ＰＤ１－ｍＦｃとＣＤ４７－ＰＤ－Ｌ１＋細胞との相互作用を１ｎＭ未満のＩＣ５０値で阻害した。
ＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７の二重陽性細胞（図５Ｂ）では、ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ４７のビスペシフィックであるＩＭＭ２５２０とＩＭＭ２５２１が、モノスペシフィックの抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＩＭＭ２５１５よりも高い阻害活性を示した。
［例５．ＣＤ４７－ＳＩＲＰαの相互作用が阻害されたＩＭＭ２５２０およびＩＭＭ２５２１］
ＦＩＴＣ結合ＳＩＲＰα－Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃと結合した野生型ヒトＳＩＲＰα、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）８０ｎＭを、連続的に希釈したＩＭＭ２５２０、ＩＭＭ２５２１、ＩＭＭ０１およびｈＩｇＧ１－Ｆｃとそれぞれ混合した。この混合物を、ＰＤ－Ｌ１－またはＰＤ－Ｌ１＋ ＣＤ４７－発現Ｒａｊｉ細胞を含む９６ウェルプレートに添加し、プレートを４℃で４５分間希釈した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＳＩＲＰα－Ｆｃ－ＣＤ４７の相互作用を調べるためにＦＡＣＳ解析を行った。
図６Ａに示すように、ＩＭＭ２５２０は、ＳＩＲＰα－ＦｃとＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７＋細胞との相互作用をＩＣ５０値１２７．７ｎＭで阻害し、ＩＭＭ２５２１は、ＳＩＲＰα－ＦｃとＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７＋細胞との相互作用をＩＣ５０値１３９．８ｎＭで阻害した。
ＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７の二重陽性細胞（図６Ｂ）では、ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ４７のビスペシフィックであるＩＭＭ２５２０とＩＭＭ２５２１が、モノスペシフィックのＩＭＭ０１よりもはるかに高い阻害活性を示した。
［実施例６．ＰＤ－Ｌ１陽性細胞に対して高レベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発したＩＭＭ２５２０］
ＣＦＳＥ標識Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞（標的細胞として使用される）が、ＦｃγＲＩＩＩａを安定的に発現するＮＫ９２ＭＩ細胞（エフェクター細胞）と、１：２の比で混合され、混合細胞は、連続的に希釈したＩＭＭ２５１５またはＩＭＭ２５２０の存在下で、５％のＣＯ２と共に３７℃で４時間培養された。次に、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｃａｔ＃Ｐ４１７０、Ｓｉｇｍａ）が、５μｇ／ｍｌの濃度で細胞培養液に添加され、細胞培養液が、ＰＩシグナルについてＦＡＣＳ解析にかけられた。ＡＤＣＣによる細胞溶解の割合を以下の式に基づいて算出した：
溶解率＝（ＩＭＭ２５１５またはＩＭＭ２５２０で処理した％ＰＩ陽性細胞－陰性対照タンパク質で処理した％ＰＩ陽性細胞）／（１００－陰性対照タンパク質で処理した％ＰＩ陽性細胞）×１００
図７に示すように、ＩＭＭ２５２０は、モノスペシフィックの抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＩＭＭ２５１５に比べて高いＡＤＣＣ活性を誘導した。
［実施例７．ＰＤ－Ｌ１陽性細胞に対して高レベルの抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を誘導したＩＭＭ２５２０］
９６ウェル細胞培養プレートにＡｎａ－１細胞（マウスマクロファージ細胞株、エフェクター細胞として）を１ウェルあたり１×１０５細胞ずつ播種し、３７℃および５％ＣＯ２で１６～１８時間培養した。Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞（標的細胞として）をＣＦＳＥで標識した後、それぞれ希釈したＩＭＭ２５２０、ＩＭＭ２５１５、ＩＭＭ０１、ＩＭＭ０１とＩＭＭ２５１５との組み合わせ、およびｈＩｇＧ１－Ｆｃと４５分間で連続的に希釈した。標的細胞溶液は、Ａｎａ－１細胞を含むプレートに移された（Ａｎａ－１細胞とＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞細胞との比は１：１）。混合物は細胞培養インキュベータで２時間培養され、次に、Ａｎａ－１細胞におけるＣＦＳＥの密度について、ＦＡＣＳによる解析にかけられた。
図８は、ＩＭＭ２５２０がＰＤ－Ｌ１＋腫瘍細胞に対して高いレベルの抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を誘導したことを示している。
［実施例８．強力な抗腫瘍活性を示したＩＭＭ２５２０］
５～７週齢のＳＣＩＤマウス２４匹に、ＣＴ２６－ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ４７大腸癌細胞（１匹あたり２×１０６細胞）を右脇腹に皮下注射した。腫瘍体積が１００～１５０ｍｍ３に達した時点で、マウスを無作為に４群に振り分け、各群６匹ずつとし、この日を０日目とした。０日目から、これらのマウスにそれぞれＰＢＳ、ＩＭＭ２５０５（６．０ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ２５２０（６．０ｍｇ／ｋｇ）、およびＩＭＭ０１（３．０ｍｇ／ｋｇ）を週２回、４週間腹腔内注射した。４週目の終わりに投与を中止し、実験終了までマウスを観察した。ＰＢＳを投与した群では、平均腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達した時点でテストを終了したが、他の群では６０日目にテストを終了した。腫瘍体積および体重は３～４日ごとに測定された。
腫瘍体積（Ｖ）が（長さ×幅２）／２として算出された。腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）は、腫瘍増殖阻害率＝（投与群における１つの腫瘍体積の変化／対照群における腫瘍体積の変化）×１００％の式によって算出された。
テストレジームと結果を表１にまとめた。
上記表１および図９、１０に示すように、群４の腫瘍増殖阻害率は９７．８９％であり、ＩＭＭ２５０５を投与した群を含む他の群の腫瘍増殖阻害率よりもはるかに高い値を示した。ＩＭＭ２５０５は、ＩＭＭ２５２０と全体的なデザインが似ており、変異したＳＩＲＰαＤ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と異なる抗ＰＤ－Ｌ１抗体とを含む融合タンパク質である。米国特許第１０，９７３，８７８ Ｂ２号では、マウスモデルにおいて、ＩＭＭ２５０５が単剤の併用（すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＩＭＭ０１の併用）よりも優れた抗腫瘍効果を示した。
Figure 0007063510000002
 ＩＭＭ２５２０と他の薬剤の抗腫瘍効果
図９に示すように、群１のマウスの腫瘍サイズはテスト中に増加し続けたが、群２および群３では、それぞれＩＭＭ０１（変異型ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ）およびＩＭＭ２５０５の投与により、４０日目付近で腫瘍サイズが減少し始め、群４では、ＩＭＭ２５２０の投与後すぐに腫瘍体積が減少した。このデータは、ＩＭＭ２５２０が腫瘍に素早く作用し、ＩＭＭ０１およびＩＭＭ２５０５と比較して優れた抗腫瘍効果を示すことを示唆した。
図１０に示すように、群２と群３は同様の生存曲線を示し、生存率は４０日目４０付近で約８０％に減少し、その後は約７０％に減少したが、群４の生存率は６０日目まで１００％であった。
［例９．ＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７に同時に結合したＩＭＭ２５２０］
ＣＤ４７とＰＤ－Ｌ１へのＩＭＭ２５２０の同時結合を検出するために、分子間相互作用装置（Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｆｅ，Ｇａｔｏｒ）を使用した。抗ヒトＩｇＧプローブを用いて、１０μｇ／ｍｌのＩＭＭ２５２０タンパク質を、シフトが約１．０ｎｍになるまで捕捉した。続いて、プローブをバッファで３０秒間リンスした後、結合強度が飽和レベルに達するまで、１０μｇ／ｍｌのＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ（図１１）または１０μｇ／ｍｌのＣＤ４７－Ｈｉｓ溶液（図１２）に移した。最後に、プローブを１０μｇ／ｍｌ ＣＤ４７－Ｈｉｓ（図１１）または１０μｇ／ｍｌ ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ溶液（図１２）に１２０秒間移した。
図１１に示すように、ＩＭＭ２５２０は、ＰＤ－Ｌ１結合が飽和してもＣＤ４７と結合することができ、一方、図１２に示すように、ＩＭＭ２５２０は、ＣＤ４７結合が飽和した後にＰＤ－Ｌ１と結合することができた。
以上のことから、データは、ＩＭＭ２５２０は、一方の抗原との結合が飽和した後、もう一方の抗原と結合することができ、ＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７に同時に結合できることが示唆された。
Figure 0007063510000003
Figure 0007063510000004
Figure 0007063510000005
Figure 0007063510000006
Figure 0007063510000007
Figure 0007063510000008
本願は、１または複数の実施形態と関連して上で説明されたが、本願はこれらの実施形態に限定されず、本説明は、すべての代替形態、変更形態、および等価形態を包含することが意図され、添付の請求項の思想および範囲内に含まれ得ることが理解されるべきである。本明細書において参照される引用はすべて、参照によって全体的にさらに組み込まれる。
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Claims (16)

  1. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片と、ＣＤ４７結合ペプチドとを含む、組換え融合タンパク質であって、
    前記ＣＤ４７結合ペプチドが前記抗体またはその抗原結合断片に結合し、
    前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、前記重鎖可変領域に連結され、ＦｃＲ結合能力を有する重鎖定常領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含み、
    前記ＣＤ４７結合ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）細胞外ドメインを含み、
    前記組換え融合タンパク質は、ＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に同時に結合することができる
    組換え融合タンパク質。
  2. 前記ＣＤ４７結合ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する、
    請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
  3. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片の少なくとも１つのパラトープが、前記パラトープを構成する前記重鎖可変領域または前記軽鎖可変領域のＮ末端で前記ＣＤ４７結合ペプチドに連結されている、請求項１または２に記載の組換え融合タンパク質。
  4. 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片の各パラトープが、前記パラトープを構成する前記重鎖可変領域または前記軽鎖可変領域のＮ末端で前記ＣＤ４７結合ペプチドに連結されている、請求項３に記載の組換え融合タンパク質。
  5. 前記重鎖定常領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
  6. 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片が、リンカを介して前記ＣＤ４７結合ペプチドに連結されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
  7. 前記リンカが、－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）２－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、または－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）４－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）である、請求項６に記載の組換え融合タンパク質。
  8. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ４７結合ペプチド－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域とを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
  9. 前記軽鎖可変領域に連結された軽鎖定常領域をさらに含み、前記組換え融合タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ４７結合ペプチド－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域－軽鎖定常領域断片とを含む、請求項８に記載の組換え融合タンパク質。
  10. 前記軽鎖可変領域に連結された軽鎖定常領域をさらに含み、前記組換え融合タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域－重鎖定常領域断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ４７結合ペプチド－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域－軽鎖定常領域断片とを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
  11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質をエンコードする核酸分子。
  12. 請求項１１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  13. 請求項１２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  14. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載の発現ベクター、または請求項１３に記載の宿主細胞と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  15. ＣＤ４７および／またはＰＤ－Ｌ１の過剰発現に関連する疾患の治療を必要とする対象の治療に使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、および腎細胞癌から成る群から選択される、請求項１５に記載の使用するための医薬組成物。
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