JP7355976B2 - Ｃｄ７０と結合する抗体、その調製および使用 - Google Patents

Ｃｄ７０と結合する抗体、その調製および使用 Download PDF

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Description

関連出願および参照による援用
本出願は、２０２１年１０月１３日に出願された中国特許出願第２０２１１１１９１８６０．４号明細書に対する優先権を主張するものである。
前述の出願、およびその中でまたはその審査中に引用されたすべての文書（「ａｐｐｌｎ ｃｉｔｅｄ ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ」）、およびここで引用または参照されたすべての文書（ここで引用されたすべての文献文書、特許、公開特許出願を含むがこれに限定されない）（「ここで引用された文書」）、およびここで引用された文書中で引用または参照されたすべての文書は、ここに言及された、またはここに参照により援用されたいずれかの文書中のいずれかの製品に関するいずれかの製造元の指示、説明、製品仕様および製品シートとともに参照により本明細書に援用され、本発明の実施に使用され得る。より具体的には、参照されたすべての文書は、各個々の文書が参照により援用されるように具体的かつ個別に示された場合と同じ程度まで、参照により援用される。本開示で言及されるすべてのＧｅｎｂａｎｋ配列は、本開示の最も早い有効出願日のＧｅｎｂａｎｋ配列となるように、参照により援用される。
本出願は、ＣＤ７０と特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分、ならびにその調製および使用、特に腫瘍治療における使用に関するものである。
癌細胞は、宿主の免疫監視を回避するために、以下のものを含むいくつかのメカニズムを発達させてきた：１）免疫細胞のＣＤ２７に結合してＴ細胞のアポトーシス／枯渇を誘導し、Ｔｒｅｇ細胞集団を増加させる可能性のあるＣＤ７０タンパク質を高度に発現させること；２）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面のＮＫＧ２Ｄタンパク質に結合し、ＮＫ細胞によるＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ＋癌細胞の死滅を阻止する癌細胞膜からのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢの剥離を促進すること；および３）マクロファージ表面のシグナル制御タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）に結合し、マクロファージによる癌細胞の貪食を阻害する抑制シグナルを誘導する高レベルのＣＤ４７を発現させること。癌細胞は非常に「賢く」、発達した回避機構によって素早く繁殖することがわかる。したがって、癌細胞を死滅させるための有効な抗癌薬の開発は、これらの機構を標的にすることが重要であると考えられる。
ＣＤ７０およびＣＤ２７
ＣＤ７０は、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーである（Ｂ．Ｆ．Ｉｓｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５）。これは、主に高度に活性化されたリンパ球や樹状細胞で発現し、抗原提示細胞でもその発現が見られた。ＣＤ７０は、成熟Ｔ細胞、メモリーＢ細胞、胚中心Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に発現される受容体であるＣＤ２７と結合する可能性がある。ＣＤ７０－ＣＤ２７の相互作用は、リンパ球の活性化および免疫応答の維持に重要な役割を担っている。例えば、ＣＤ７０－ＣＤ２７のシグナル伝達は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、ならびにサイトカインの分泌を引き起こす可能性がある。ＣＤ７０－ＣＤ２７の相互作用はまた、Ｂ細胞の活性化、増殖および分化、胚中心形成、ならびに抗体放出も促進する可能性がある。
ＣＤ７０の発現は、腎細胞癌、鼻咽頭癌（Ａ．Ａｇａｔｈａｎｇｇｅｌｏｕ ｅｔ ａｌ，１９９５）、エプスタインバーウイルスによって誘導された癌（ＥＢＶ＋癌）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）（Ｈ．Ｊ．Ｇｒｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｂリンパ性白血病、バーキットリンパ腫（Ｓ．Ｍ．Ｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、多発性骨髄腫（Ｊ．Ａ．ＭｃＥａｒｃｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、胸腺癌（Ｔ．Ｈｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２０００）、腎細胞癌（Ｃ．Ｌ．Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，２００６）、膠芽腫（Ｊ．Ｗｉｓｃｈｈｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）、脳癌（Ｊ．Ｈｅｌｄ－Ｆｅｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００２）、骨肉腫（Ｊ．Ｈ．Ｐａｈｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、メラノーマ（Ｃ．Ｐｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、および卵巣癌（Ｓ．Ａｇｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２００８）の細胞を含む、多くの腫瘍細胞で見られる。腫瘍は、その表面に発現されるＣＤ７０を利用して、Ｔ細胞のアポトーシスおよび枯渇を誘導し、Ｔｒｅｇ細胞の量／レベルを増加させる可能性がある（Ｊｕｌｉｅ Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。さらに、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞におけるＣＤ７０－ＣＤ２７のシグナル伝達は、幹細胞遺伝子発現プログラムを開始し、対称的な細胞分裂および細胞増殖を促進することが報告された（Ｃ．Ｒｉｅｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
腫瘍細胞表面に加え、ＣＤ７０は、例えば、原発性または転移性の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の腫瘍微小環境でも発現される（Ｊ．Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。さらに、ＣＤ７０のレベルは、Ｂ細胞リンパ腫、腎細胞癌、および乳癌の患者の予後不良と関連している。これらのことから、ＣＤ７０は腫瘍治療の有望な標的とされる。抗ＣＤ７０抗体であるクサツズマブは、インビトロおよび異種移植実験でＣＤ７０＋白血病幹細胞（ＬＳＣ）を除去することに成功した（Ｃ．Ｒｉｅｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。抗体によるＣＤ７０－ＣＤ２７の遮断もＡＭＬ細胞の増殖を抑制した（Ｃ．Ｒｉｅｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，上記参照）。ＣＤ７０－ＣＤ２７のシグナル伝達を標的とする抗体は、例えば、頭頸部扁平上皮癌、卵巣癌、大腸癌、腎細胞癌、多形性膠芽腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、ＨＬ、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、任意のＴ細胞悪性腫瘍、メラノーマ、前立腺腺癌、大腸腺癌、非小細胞肺癌、バーキットリンパ腫、中枢神経系のリンパ腫、乳癌など（Ｌｕｔｆｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．，２０２１）の治療のために臨床試験下にある。
研究では、ＣＤ７０の過剰発現が関節炎、炎症性腸疾患および狼瘡に関与していることも示されている（Ｂｏｂｂｙ Ｋｗａｎｇｈｏｏｎ Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。抗ＣＤ７０抗体によるＣＤ２７－ＣＤ７０経路の遮断は、関節炎における関節疾患を改善し、大腸炎を抑制した。
優れた特性を有するより多くの抗ＣＤ７０抗体が必要である。
本出願における任意の文書の引用または特定は、かかる文書が本開示の先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
本出願は、ＣＤ７０＋細胞と結合し、ＣＤ７０－ＣＤ２７の結合／相互作用を遮断し、ＣＤ７０＋細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導し得る新規な抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合部分を開示し、クサツズマブなどの先行技術の抗ＣＤ７０抗体と比較して、より高くはないにしても同等の活性／能力を有する。本開示の抗体またはその抗原結合部分は、インビボで強力な抗腫瘍効果も示した。
具体的には、一態様において、本出願は、ＣＤ７０と結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を開示し、これは、ｉ）重鎖可変領域ＣＤＲ１（ＶＨ－ＣＤＲ１）、ＶＨ－ＣＤＲ２およびＶＨ－ＣＤＲ３を有し得る重鎖可変領域（ここで、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２およびＶＨ－ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１、２および３に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る）、および／またはｉｉ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ＶＬ－ＣＤＲ１）、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３を有し得る軽鎖可変領域（ここで、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、５および６に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る）を備え得る。
本開示の重鎖可変領域は、配列番号７または９に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備え得る。
本開示の軽鎖可変領域は、配列番号８または１０（Ｘ＝ＮまたはＸ＝Ｅ）に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備え得る。
本開示の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を備え得、これらは、（１）それぞれ配列番号７および８に対して、（２）それぞれ配列番号９および１０（Ｘ＝Ｎ）に対して、または（３）それぞれ配列番号９および１０（Ｘ＝Ｅ）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
本開示の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を備え得る。重鎖定常領域は、ＦｃＲおよび／または補体系タンパク質（Ｃ１ｑなど）結合親和性を有する、または有するように操作されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４重鎖定常領域、またはその機能的フラグメントであり得る。特定の実施形態では、重鎖定常領域は、例えば配列番号１１に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備えるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり得る。軽鎖定常領域は、例えば配列番号１２に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備えるヒトカッパ軽鎖定常領域などのカッパ軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域のＮ末端は重鎖可変領域のＣ末端に連結されており、軽鎖定常領域のＮ末端は軽鎖可変領域のＣ末端に連結されている。
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ジスルフィド結合によって接続された２本の重鎖および２本の軽鎖を備えるか、またはそれらからなるＩｇＧ抗体であり得、各重鎖は、上記の重鎖定常領域、重鎖可変領域および／またはＣＤＲ配列を有し得、各軽鎖は、上記の軽鎖定常領域、軽鎖可変領域および／またはＣＤＲ配列を有し得る。
本開示の抗体またはその抗原結合部分は、マウスであるか、キメラであるか、ヒトまたはヒト化されたものであり得る。
本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ７０と結合し、ＣＤ７０－ＣＤ２７結合／相互作用を遮断し、ＣＤ７０＋細胞に対してＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣを誘導し、強力なインビボ抗腫瘍効果を示し得る。
本開示はまた、細胞毒素または抗癌剤などの治療剤に連結された、抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体を提供する。本開示はまた、本開示の抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能部分（例えば、第２の抗体）に連結された、本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子を提供する。別の態様では、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部とすることができる。本開示はさらに、免疫細胞に、Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの本開示のＣＡＲまたはＴＣＲを提供する。
本開示はさらに、本開示の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子だけでなく、かかる核酸分子を含む発現ベクターおよびかかる発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本開示の宿主細胞を用いて抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合部分を調製する方法であって、（ｉ）宿主細胞において抗体またはその抗原結合部分を発現させるステップと、（ｉｉ）宿主細胞またはその細胞培養物から抗体またはその抗原結合部分を単離するステップとを含む方法が提供される。
本開示は、本開示の抗体またはその抗原結合部分、免疫複合体、二重特異性分子、免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、または宿主細胞と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物はさらに、ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ融合タンパク質などの抗腫瘍剤、または抗炎症剤をさらに含み得る。
別の態様では、本開示は、ＣＤ７０過剰発現またはＣＤ７０－ＣＤ２７シグナル伝達に関連する疾患を治療または緩和を必要とする対象における疾患を治療または緩和する方法であって、本開示の医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
疾患は、癌であり得る。癌は、固形癌または血液癌であり得、腎臓癌、骨髄異形成症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、鼻咽頭癌、エプスタインバーウイルス誘発性癌、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｂリンパ性白血病、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、胸腺癌、膠芽腫、脳癌、骨肉腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、大腸癌、マントル細胞リンパ腫、前立腺腺癌、大腸腺癌、中枢神経系のリンパ腫、または非小細胞肺癌を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、ＣＤ４７を標的とするタンパク質などの少なくとも１つの抗腫瘍剤とともに投与され得る。ＣＤ４７を標的とするタンパク質は、配列番号１７に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＳＩＲＰα－ＦＣ融合タンパク質であり得る。それはグリコシル化部位を除去するために、配列番号１７の８０位にＮ→Ａ変異を含む。
特定の実施形態では、疾患は、炎症性疾患であってよい。特定の実施形態では、炎症性疾患は、自己免疫疾患であってよい。特定の実施形態では、炎症性疾患は、関節炎、炎症性腸疾患、または狼瘡であってよい。
また、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ７０タンパク質のインビトロ検出、および同種細胞移植の改善にも使用することができる。
本開示の他の特徴および利点は、限定的に解釈されるべきではない以下の詳細な説明および実施例から明らかになるであろう。本出願を通じて参照されたすべての参考文献、ＧｅｎＢａｎｋエントリー、特許および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。
したがって、本出願の目的は、任意の従来公知の製品、製品の製造プロセス、または製品の使用方法を本出願内に包含せず、それにより出願人は、任意の従来公知の製品、プロセス、または方法の免責事項を開示する権利を留保し、ここに開示するものとする。さらに、本出願は、米国特許商標庁（米国特許法第１１２条第１段落）または欧州特許庁（欧州特許条約（ＥＰＣ）第８３条）の記載要件および実施可能要件を満たさないいかなる製品、プロセス、または製品の製造方法または製品の使用方法も、出願の範囲内に包含する意図はないことに留意され、それにより出願人は、任意の前述の製品、製品の製造プロセスまたは製品の使用方法の免責事項を開示する権利を留保し、ここに開示するものとする。ＥＰＣ第５３条（ｃ）、ＥＰＣ規則第２８条（ｂ）および（ｃ）に準拠していることは、出願の実施において有利であり得る。本出願の系統、または他の任意の系統、または任意の第三者の任意の先行出願における出願人の任意の許諾特許の対象である任意の実施形態を明示的に否認するすべての権利が、明示的に留保される。ここに記載されているいかなる内容も、取り決めとして解釈されるものではない。
本開示、特に特許請求の範囲および／または段落において、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、「ｃｏｍｐｏｓｅｄ（含まれる）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの用語は、米国特許法でそれに帰属する意味を有し得ること、例えば、それらは「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｄ（含まれる）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」などを意味する場合があり、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（本質的にからなる）」および「ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（本質的にからなる）」などの用語は、米国特許法でそれらに帰属する意味を有すること、例えば、それらは明示的に記載されていない要素を許容するが、先行技術に見られる要素、または本出願の基本的もしくは新規な特性に影響を及ぼす要素を除外することに留意されたい。
以下の詳細な説明は、例として与えられるが、記載されている特定の実施形態のみに適用を限定することを意図するものではなく、添付の図面と併せて最もよく理解され得る。
本開示の抗ＣＤ７０タンパク質であるＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｍの構造の概略図を示す。ＩＭＭ４０Ｈは、配列番号９、１１、１０（Ｘ＝Ｎ）および１２に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ヒト化重鎖可変領域、重鎖定常領域、ヒト化軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を備えるＩｇＧ抗体である。ＩＭＭ４０ＭはＩＭＭ４０Ｈに類似しているが、★で表されるグリコシル化部位を除去する軽鎖可変領域にＮ８５Ｅ変異を含む。
ヒトＣＤ７０発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのＩＭＭ４０Ｃ、ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｍの結合活性を示し、クサツズマブ（配列番号２０および２１に記載の重鎖および軽鎖配列を有する抗ＣＤ７０抗体）、ＩＭＭ０１（ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ融合タンパク質、配列番号１７）、および／またはｈＩｇＧ１－Ｆｃを対照として使用した図を示す。 ＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｕ２６６細胞へのＩＭＭ４０Ｃ、ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｍの結合活性を示し、クサツズマブ（配列番号２０および２１に記載の重鎖および軽鎖配列を有する抗ＣＤ７０抗体）、ＩＭＭ０１（ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ融合タンパク質、配列番号１７）、および／またはｈＩｇＧ１－Ｆｃを対照として使用した図を示す。 ＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｒａｊｉ細胞へのＩＭＭ４０Ｃ、ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｍの結合活性を示し、クサツズマブ（配列番号２０および２１に記載の重鎖および軽鎖配列を有する抗ＣＤ７０抗体）、ＩＭＭ０１（ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ融合タンパク質、配列番号１７）、および／またはｈＩｇＧ１－Ｆｃを対照として使用した図を示す。 ＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｕ２６６細胞へのＩＭＭ４０Ｃ、ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｍの結合活性を示し、クサツズマブ（配列番号２０および２１に記載の重鎖および軽鎖配列を有する抗ＣＤ７０抗体）、ＩＭＭ０１（ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ融合タンパク質、配列番号１７）、および／またはｈＩｇＧ１－Ｆｃを対照として使用した図を示す。 ヒトＣＤ７０発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ＩＭＭ４０Ｃ、ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｍの結合活性を示し、クサツズマブ（配列番号２０および２１に記載の重鎖および軽鎖配列を有する抗ＣＤ７０抗体）、ＩＭＭ０１（ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ融合タンパク質、配列番号１７）、および／またはｈＩｇＧ１－Ｆｃを対照として使用した図を示す。 ＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｕ２６６細胞へのＩＭＭ４０Ｃ、ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｍの結合活性を示し、クサツズマブ（配列番号２０および２１に記載の重鎖および軽鎖配列を有する抗ＣＤ７０抗体）、ＩＭＭ０１（ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ融合タンパク質、配列番号１７）、および／またはｈＩｇＧ１－Ｆｃを対照として使用した図を示す。
ＣＤ７０＋ＣＨＯ細胞へのＣＤ２７（ＥＣＤ）－Ｆｃ（配列番号２２）の結合を遮断するＩＭＭ４０Ｈの能力を示し、陽性対照としてクサツズマブを、陰性対照としてｈＩｇＧ１－Ｆｃを使用した図を示す。
ＣＤ７０－ＣＤ２７相互作用により誘導されたＣＤ６９発現レベルによって測定される、ＣＤ２７－ＣＡＲ（配列番号２３）を発現するＪｕｒｋａｔ細胞へのＣＤ７０＋Ｒａｊｉ細胞の結合をブロックするＩＭＭ４０Ｈの能力を示し、陽性対照としてクサツズマブを、陰性対照としてＩＭＭ０１およびｈＩｇＧ１－Ｆｃを使用した図を示す。
ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１がＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｒａｊｉ細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を示し、対照としてＩＭＭ０１およびｈＩｇＧ１－Ｆｃを使用した図を示す。 ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１がＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｕ２６６細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を示し、対照としてＩＭＭ０１およびｈＩｇＧ１－Ｆｃを使用した図を示す。 ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１がＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｄａｕｄｉ細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を示し、対照としてＩＭＭ０１およびｈＩｇＧ１－Ｆｃを使用した図を示す。 ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１がＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｊｅｋｏ－１細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を示し、対照としてＩＭＭ０１およびｈＩｇＧ１－Ｆｃを使用した図を示す。
ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１がＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｒａｊｉ細胞に対して抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導する能力を示し、対照としてＩＭＭ０１およびｈＩｇＧ１－Ｆｃを使用した図を示す。 ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１がＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｕ２６６細胞に対して抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導する能力を示し、対照としてＩＭＭ０１およびｈＩｇＧ１－Ｆｃを使用した図を示す。 ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１がＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｄａｕｄｉ細胞に対して抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導する能力を示し、対照としてＩＭＭ０１およびｈＩｇＧ１－Ｆｃを使用した図を示す。 ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１がＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｊｅｋｏ－１細胞に対して抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導する能力を示し、対照としてＩＭＭ０１およびｈＩｇＧ１－Ｆｃを使用した図を示す。
ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１がＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｒａｊｉ細胞に対して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する能力を示し、対照としてｈＩｇＧ１－ＦｃおよびＩＭＭ０１を使用した図を示す。
Ｕ２６６異種移植ＳＣＩＤマウスモデルにおけるＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１のインビボ抗腫瘍効果の図を示す。
本開示がより容易に理解され得るようにするために、特定の用語が最初に定義される。その他の定義については、詳細な説明全体を通して記載される。
「ＣＤ７０」という用語は、分化抗原群７０を指す。「ＣＤ７０」という用語は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オルソログおよびパラログを含む。
本明細書で言及される「抗体」という用語には、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭの全抗体、ならびに任意のその抗原結合フラグメント（すなわち「抗原結合部分」）または一本鎖が含まれる。全抗体は、ジスルフィド結合で連結された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）とを含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記）と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記）と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性のより高い領域が点在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分化され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。重鎖定常領域の「機能的フラグメント」とは、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介して、例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰなどを開始させる能力を保持する定常領域の部分を指す。
本明細書で使用される抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＣＤ７０タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって発揮され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の内に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含み得る二価のフラグメントであるＦ（ａｂ'）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、（ｉｖ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって結合され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３）を参照されたい）。かかる一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語の内に包含されることが意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の通常の技術を用いて取得され、このフラグメントは、インタクトな抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングが行われる。
本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している（例えば、ＣＤ７０タンパク質と特異的に結合する単離された抗体は、ＣＤ７０タンパク質以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＣＤ７０タンパク質と特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば他の種からのＣＤ７０タンパク質と交差反応性を有する場合がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まないことができる。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性と親和性とを示す。
本明細書で使用される「マウス抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がマウス生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もマウス生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本開示のマウス抗体は、マウス生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含むことができる。しかしながら、本明細書で使用される「マウス抗体」という用語は、別の哺乳類種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がマウスのフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。
キメラ抗体という用語、非ヒト起源の遺伝物質とヒト由来の遺伝物質とを組み合わせることによって作製された抗体を指す。またはより一般的には、キメラ抗体とは、特定の種由来の遺伝物質と別の種由来の遺伝物質とを有する抗体のことである。
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒトで自然に産生される抗体バリアントとの類似性を高めるためにタンパク質配列が修飾された非ヒト種由来の抗体を指す。
本開示の抗体またはその抗原結合部分における重鎖可変領域ＣＤＲおよび軽鎖可変領域ＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号付けシステムにより定義されている。しかしながら、当該技術分野で周知のように、ＣＤＲ領域は、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ、ＡｂＭ、またはＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステム／方法などの他のシステムによって決定することもできる。
「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」という用語は、免疫系のエフェクター細胞が、例えば、抗ＣＤ７０抗体によって結合された標的細胞を活発に溶解する、細胞媒介性免疫防御機構を指す。
抗体依存性細胞貪食または「ＡＤＣＰ」という用語は、抗体のＦｃドメインまたはその抗原結合部分と食細胞（すなわち、マクロファージ、顆粒球および樹状細胞）上の活性化ＦｃＲとの相互作用が、抗体またはその抗原結合部分によって結合されたオプソニン化細胞の飲み込みを引き起こし、最終的に標的細胞の分解をもたらすという免疫防御機構のことである。
「補体依存性細胞傷害」、「抗体依存性補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」という用語は、抗体またはその抗原結合部分が補体成分Ｃ１ｑに結合し、古典的な補体カスケードを活性化し、抗体またはその抗原結合部分によって結合された標的細胞の表面に膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成し、続いて標的細胞を溶解するという抗体媒介免疫機構を指す。
「ＥＣ５０」という用語は、半値有効濃度としても知られて、指定された曝露時間後にベースラインと最大値との中間で反応を引き起こす抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。
「ＩＣ５０」という用語は、半値最大阻害濃度としても知られ、抗体またはその抗原結合部分が存在しない場合と比較して、特定の生物学的または生化学的機能を５０％阻害する抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、定義された特異性を免疫エフェクター細胞、通常はＴ細胞に移植し、Ｔ細胞の機能を増強する操作された受容体を指す。新世代のＣＡＲは、ａ）細胞外結合ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、および任意に細胞外結合ドメインのＮ末端にあるシグナルペプチドを含む。本開示のＣＤ２７－ＣＡＲは、シグナルペプチド、ＣＤ２７の細胞外ドメイン、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
「対象」という用語には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、羊、犬、猫、牛、馬、鶏、両生類、および爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれるが、非ヒト霊長類、羊、犬、猫、牛および馬などの哺乳類が好ましい。
本明細書で使用される「配列同一性」とは、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、配列間の配列同一性の最大パーセントを達成するために、参照配列のヌクレオチド／アミノ酸残基と同一である対象配列のヌクレオチド／アミノ酸残基のパーセントを指す。２つ以上のアミノ酸または核酸配列間の配列同一性のパーセントを決定する目的でのペアワイズおよび多重整列は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ、Ｔ－ｃｏｆｆｅｅ、ＫａｌｉｇｎおよびＭＡＦＦＴなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者に知られている様々な方法で達成することができる。かかるソフトウェアを使用する場合、デフォルトパラメーター、例えば、ギャップペナルティおよびエクステンションペナルティが好ましくは使用される。
「治療有効量」という用語は、疾患または状態（炎症性疾患など）に関連する症状を予防または改善し、かつ／または疾患または状態の重症度を軽減するのに十分な、本開示の抗体またはその抗原結合部分の量を意味する。治療有効量は、治療される状態に関連して理解され、実際の有効量は、当業者によって容易に識別される。
一実施形態では、本開示の抗体は、１つまたは複数の保存的修飾によって本開示の抗ＣＤ７０抗体のものと異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の重鎖および／または軽鎖可変領域配列を含む。当該技術分野では、抗原結合を除去しない、特定の保存的配列修飾を施すことが可能であると理解される。
本明細書で使用される場合、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合部分の結合特性に有意な影響または変化を及ぼさないアミノ酸修飾を指すことを意図している。かかる保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発など、当該技術分野で知られる標準的な技術によって、本開示の抗体またはその抗原結合部分に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、本開示の抗体またはその抗原結合部分のＣＤＲ領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変更された抗体は、本明細書に記載の機能アッセイを使用して、保持機能（すなわち、上記に記載の機能）に関して試験することができる。
本開示の抗体は、本開示の抗ＣＤ７０抗体の１つまたは複数のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体を出発物質として使用して調製し、修飾された抗体を操作することができる。抗体は、１つもしくは両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つもしくは複数の残基を修飾することによって操作することができる。追加的または代替的に、抗体またはその抗原結合部分は、例えば、抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基を修飾することによって操作することができる。
特定の実施形態では、ＣＤＲ移植は、抗体の可変領域を設計するために使用することができる。抗体は、６本の重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と主に相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の酸配列と比べて、個々の抗体間でより多様なものである。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体－抗原相互作用を担っているため、特性の異なる別の抗体からのフレームワーク配列に移植された特定の天然型抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然型抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である。
したがって、本開示の別の実施形態は、上記のような本開示の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域、および／または上記のような本開示の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を備える単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関するものである。これらの抗体は、本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含むが、それらは異なるフレームワーク配列を含むことができる。かかるフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から取得することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（インターネット上のｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ利用可能）で確認することができる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで確認することができる。本開示の抗体で使用するための好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似しているものである。ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子に見られるものと同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植することができ、またはＣＤＲ配列は生殖細胞系配列と比較して１つまたは複数の変異を含むフレームワーク領域上に移植することができる。例えば、場合によっては、抗体の抗原結合能を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出された。
可変領域修飾の別のタイプは、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それによって目的の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することである。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発を行って変異を導入することができ、抗体結合または目的の他の機能特性に及ぼす効果は、当該技術分野で知られているようにインビトロまたはインビボアッセイで評価することができる。好ましくは、保存的修飾（当該技術分野で知られている）が導入される。変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、通常、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５つ以下の残基は変更されない。
本開示の操作された抗体には、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が施されたものが含まれる。通常、かかるフレームワークの修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために施される。例えば、１つのアプローチは、１つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「逆変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、その抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含むことができる。かかる残基は、抗体のフレームワーク配列を、その抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することによって同定することができる。
別のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内、または１つもしくは複数のＣＤＲ領域内でさえ１つまたは複数の残基を変異させてＴ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。
さらに、またはフレームワーク領域またはＣＤＲ領域内で施される修飾の代替として、本開示の抗体は、通常、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害などの、抗体の１つまたは複数の機能特性を変更するために、Ｆｃ領域内の修飾を含むように操作することができる。さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾することができ（例えば、１つまたは複数の化学部分を抗体に付着させることができる）、またはそのグリコシル化を変更するために修飾され、重ねて抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更するために修飾される。
一実施形態では、ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間のヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基の数が変更されるように、例えば、増加または減少するよう修飾される。ヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを促進するために、または抗体の安定性を増加または減少させるために変更される。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を増加または減少させるために変異される。より具体的には、１つまたは複数のアミノ酸変異が、ＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２－ＣＨ３ドメインインターフェース領域に導入され、その結果、抗体がネイティブなＦｃヒンジドメインＳｐＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌタンパク質）結合と比較して損なわれたＳｐＡ結合を有するようになる。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変更することができる。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１つまたは複数のアミノ酸置換を施し、それによってその部位でのグリコシル化を除去することができる。かかるグリコシル化は、抗体の抗原に対する親和性を増加させることができる。追加的または代替的に、フコシル残基の量が低下した低フコシル化抗体またはバイセクト型ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体など、グリコシル化のタイプが変更された抗体を作製することができる。かかる変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を高めることが実証されている。かかる炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構が変更された宿主細胞で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構が変更された細胞は、当該技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現させて、それによってグリコシル化が変更された抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。
本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を使用して産生することができる。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態には、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換およびファージディスプレイ技術が含まれる。キメラまたはヒト化抗体も当該技術分野において周知である。
本開示の抗体はまた、例えば、当該技術分野で周知のような組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを用いて、宿主細胞のトランスフェクトーマで産生することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。一実施形態では、標準的な分子生物学技術によって取得された部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳調節配列に動作可能に連結されるように、１つまたは複数の発現ベクターに挿入される。この文脈において、「動作可能に連結された」という用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというそれらの意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲートされることを意味することを意図している。
「調節配列」という用語は、抗体遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。かかる調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。代替的に、非ウイルス性調節配列、例えばユビキチンプロモーターまたはβ－グロビンプロモーターを使用することができる。さらに、異なる供給源からの配列から構成される調節要素、例えば、ＳＶ４０初期プロモーターからの配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型のロングターミナルリピートを含むＳＲαプロモーターシステム（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）を使用することができる。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。
抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、同じまたは別個の発現ベクターに挿入することができる。好ましい実施形態では、可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに動作可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに動作可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターにそれらを挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製するために使用される。追加的または代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子などの追加の配列を持つことができる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書；同第４，６３４，６６５号明細書および同第５，１７９，０１７号明細書を参照されたい）。
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、原核生物または真核生物の宿主細胞への外来性ＤＮＡの導入に一般的に用いられる多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図されている。本開示の抗体を原核生物または真核生物の宿主細胞のいずれかで発現させることは理論的には可能であるが、真核細胞、最も好ましくは哺乳類の宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。なぜなら、かかる真核細胞、特に哺乳類細胞が、原核細胞よりも、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体をアセンブルして分泌する可能性が高いためである。
本開示の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは宿主細胞が増殖している培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培地から回収することができる。
本開示の抗体は、治療剤にコンジュゲートして、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの免疫複合体を形成することができる。適切な治療剤としては、細胞毒素、アルキル化剤、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核輸出阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、および抗有糸分裂剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、またはヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｖａｌ、Ａｌａ－ＡＳＮ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－ＡＳＮ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕとなどのペプチジルリンカーである。
別の態様では、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、少なくとも１つの他の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体または受容体のリガンド）に連結された本開示の１つまたは複数の抗体を含む二重特異性分子を特徴としている。したがって、本明細書で使用される場合、「二重特異性分子」は、３つ以上の特異性を有する分子を含む。一実施形態では、二重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗ＣＤ７０結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。第３の特異性はＣＤ４７に対するものとし、ＣＤ７０＋免疫細胞などの他のＣＤ７０＋細胞を放出しながら腫瘍細胞をより正確に標的化することができる。
二重特異性分子は、多くの異なるフォーマットおよびサイズであってよい。サイズスペクトルの一端では、二重特異性分子は、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、それぞれが異なる特異性を有する２つの結合アームを有することを除いて、従来の抗体フォーマットを保持する。他方の末端では、二重特異性分子は、ペプチド鎖によって連結された２つの単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦ'ｖ）、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２コンストラクトからなる。中間サイズの二重特異性分子には、ペプチジルリンカーによって連結された２つの異なるＦ（ａｂ）フラグメントが含まれる。これらや他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子工学、体細胞ハイブリダイゼーション、または化学的方法によって調製することができる。
また、本明細書では、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖは、本明細書に記載のＣＤＲおよび重鎖／軽鎖可変領域を含む。
抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、（ａ）抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
別の態様では、本開示は、本開示の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域、またはＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞中、細胞溶解物中、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在することができる。核酸は、標準的な技術によって、他の細胞成分または他の汚染物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から精製される場合、「単離される」または「実質的に純粋にされる」。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。
本開示の核酸は、標準的な分子生物学的技術を用いて取得することができる。ハイブリドーマ（例えば、以下でさらに説明するようにヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現された抗体の場合、ハイブリドーマによって作製された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって取得することができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから取得された抗体（例えば、ファージディスプレイディープ技術を使用して）の場合、かかる抗体をコードする核酸を遺伝子ライブラリーから回収することができる。
本開示の好ましい核酸分子には、抗ＣＤ７０モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列またはＣＤＲをコードするものが含まれる。ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが取得されたら、これらのＤＮＡフラグメントはさらに、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂフラグメント遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によって操作することができる。これらの操作において、ＶＬ－またはＶＨ－をコードするＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域または柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに動作可能に連結される。この文脈で用いられる「動作可能に連結」という用語は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡフラグメントが結合されることを意味することを意図している。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で知られており、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって取得することができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に連結することができる。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（だけでなくＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で知られており、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって取得することができる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域は、カッパ定常領域またはラムダ定常領域であり得る。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、ＶＨおよびＶＬ配列が連続した単鎖タンパク質として発現され得るように、柔軟なリンカーをコードする別のフラグメントに動作可能に連結され、ＶＬおよびＶＨ領域は柔軟なリンカーによって結合される。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容され得る担体とともに製剤化された、本開示の１つもしくは複数の抗体またはその抗原結合部分、免疫複合体、二重特異性体、ＣＡＲ発現免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、または宿主細胞を含み得る医薬組成物を提供する。組成物は、任意に、ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ融合タンパク質であるＩＭＭ０１などの抗腫瘍剤など、１つまたは複数の追加の薬学的に有効な成分を含み得る。
医薬組成物は、任意の数の医薬品添加剤を含み得る。使用され得る医薬品添加剤としては、担体、界面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤、分散助剤または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、保存剤、等張剤、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している場合がある。投与経路に応じて、有効成分を酸や他の自然条件の作用で不活性化されることがないように保護するための物質でコーティングすることができる。本明細書で使用される「非経口投与」という文言は、経腸投与および局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊椎内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入が挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、本開示の医薬組成物は、非経口経路、例えば、局所、表皮または粘膜の投与経路、例えば、経鼻、経口、経膣、直腸、舌下または局所的に投与することができる。
医薬組成物は、滅菌水溶液または分散液の形態とすることができる。また、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の秩序立った構造で製剤化することができる。
担体物質と組み合わせて単一の剤形をもたらすことができる有効成分の量は、治療される対象および特定の投与様式によって異なり、一般に、治療効果をもたらす組成物のその量となる。一般に、１００％のうち、この量は、薬学的に許容され得る担体と組み合わせた有効成分の約０．０１％～約９９％の範囲となる。
投与レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、単一のボーラスを投与することができ、数回に分けて経時的に投与することができ、または治療状況の緊急性によって示されるように、投与量を比例的に減少または増加させることができる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態とは、治療される対象への単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の有効成分を含有する。代替的に、抗体は徐放性製剤として投与することができ、この場合、より少ない頻度の投与が必要となる。
抗体の投与のために、投与量は約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤とすることができる。
生分解性、生体適合性ポリマーは、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用することができる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
治療用組成物は、（１）針無し皮下注射デバイス（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；および同第４，５９６，５５６号明細書）、（２）マイクロ注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号明細書）、（３）経皮デバイス（米国特許第４，４８６，１９４号明細書）、（４）注入装置（米国特許第４，４４７，２３３号明細書および同第４，４４７，２２４号明細書）、ならびに（５）浸透圧デバイス（米国特許第４，４３９，１９６号明細書および同第４，４７５，１９６号明細書）などを介して投与することができ、これらの開示は参照により本明細書に援用される。
特定の実施形態では、本開示のモノクローナル抗体は、インビボでの適切な分配を確実にするために製剤化することができる。例えば、本開示の治療用抗体が血液脳関門を通過することを確実にするために、それらは、特定の細胞または器官への選択的輸送を強化するための標的化部分を追加的に含み得るリポソーム中に製剤化することができる。
本開示の医薬組成物は、複数のインビトロおよびインビボでの用途を有し得る。例えば、医薬組成物は、腫瘍を治療するために、またはより一般的に言えば、腫瘍患者における免疫応答を強化するために使用することができる。医薬組成物は、例えば、腫瘍の増殖を阻害するために、ヒト対象に投与されてよい。
腫瘍細胞の増殖および生存を阻害する医薬組成物の能力を考慮すると、本出願は、腫瘍細胞の増殖の阻害を必要とする対象において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、対象において腫瘍の増殖が阻害されるように、本開示の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。本開示の医薬組成物によって治療され得る腫瘍は、固形腫瘍および血液腫瘍を含み、腎臓癌、骨髄異形成症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、鼻咽頭癌、エプスタインバーウイルス誘発性癌、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｂリンパ性白血病、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、胸腺癌、膠芽腫、脳癌、骨肉腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、大腸癌、マントル細胞リンパ腫、前立腺腺癌、大腸腺癌、中枢神経系のリンパ腫、および非小細胞肺癌（原発性または転移性）を含むが、これらに限定されない。
さらに、ＣＤ７０と炎症性疾患との相関関係を考慮すると、本出願は、炎症性疾患の治療または改善を必要とする対象において炎症性疾患を治療または改善する方法であって、本開示の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。炎症性疾患は、関節炎、炎症性腸疾患、および狼瘡を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患であり得る。
本開示の医薬組成物は、対象において腫瘍の増殖を効果的に阻害し、または炎症を軽減／除去し得る１つまたは複数の追加の薬剤とともに投与され得る。特定の実施形態では、本出願は、腫瘍増殖の阻害を必要とする対象において腫瘍成長を阻害する方法であって、対象に、本開示の医薬組成物およびＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ融合タンパク質であるＩＭＭ０１を投与するステップを含む方法を提供する。
本明細書で論じられる治療剤の組み合わせは、薬学的に許容され得る担体中での単一の組成物として同時投与することができ、または薬学的に許容され得る担体中の各薬剤を有する別々の組成物として同時投与することができる。別の実施形態では、治療剤の組み合わせは、連続投与することができる。
さらに、組み合わせ療法の１回分より多い用量を連続投与する場合、連続投与の順序は、投与の各時点で逆にするかまたは同じ順序に保つことができ、連続投与は同時投与と組み合わせることができ、またはそれらの任意の組み合わせが可能である。
次に、本出願を以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。
本開示の例示的な抗ＣＤ７０抗体であるＩＭＭ４０Ｃ、ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｍの構造を図１に示し、以下にさらに詳細に記載する。
ＩＭＭ４０Ｃは、配列番号７、１１、８および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する、マウス重鎖可変領域、ヒトＩｇＧ１定常領域、マウス軽鎖可変領域およびヒトカッパ定常領域を備えるＩｇＧ抗体である。
ＩＭＭ４０Ｈは、配列番号９、１１、１０（Ｘ＝Ｎ）および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ヒト化重鎖可変領域、ヒトＩｇＧ１定常領域、ヒト化軽鎖可変領域およびヒトカッパ定常領域を備えるＩｇＧ抗体である。
ＩＭＭ４０Ｍは、配列番号９、１１、１０（Ｘ＝Ｅ）および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ヒト化重鎖可変領域、ヒトＩｇＧ１定常領域、ヒト化軽鎖可変領域およびヒトカッパ定常領域を備えるＩｇＧ抗体である。ＩＭＭ４０Ｈと比較して、ＩＭＭ４０Ｍは、★で表されるグリコシル化部位を除去する軽鎖可変領域にＮ８５Ｅ変異を含む。
ＩＭＭ０１は、米国特許出願第２０２１／００２４５９８号明細書に開示されているように、ＣＤ４７に結合するＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ融合タンパク質であって、２つのＦｃフラグメントに連結された２つのＳＩＲＰαＤ１変異体を備え、ここで、形成された二量体の各単量体は配列番号１７のアミノ酸配列を有する。ＩＭＭ０１中のＳＩＲＰαＤ１変異体はグリコシル化部位を除去するＮ８０Ａ変異を配列番号１７に含む。
クサツズマブは、配列番号２０および２１のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖および軽鎖を備える、抗ＣＤ７０ ＩｇＧ抗体である。
実施例１．抗ＣＤ７０抗体の生成およびヒト化、ならびに抗体発現用ベクターの構築
マウスをヒトＣＤ７０タンパク質で免疫し、抗体調製のために良好な力価を有するものを選択した。簡単に説明すると、選択されたマウスからの脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合し、高いＣＤ７０結合能を有する抗ＣＤ７０抗体を分泌するハイブリドーマコロニーを摘出し、制限希釈によってサブクローニングした。モノクローナル抗体を生成し、配列決定した。ＩＭＭ４０Ｃと呼ばれる１つの抗体は、配列番号７および８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有していた。
その後、ＩＭＭ４０Ｃを、十分に確立されたＣＤＲ移植法を用いてヒト化した。１つの例示的なヒト化抗体ＩＭＭ４０Ｈは、配列番号９および１０（Ｘ＝Ｎ）に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を伴って取得された。ＩＭＭ４０ＨをＮ８５Ｅ変異により軽鎖可変領域でさらに修飾してＩＭＭ４０Ｍを提供し、ここで、Ｎ８５Ｅ変異はグリコシル化部位を除去し得る。ＩＭＭ４０Ｍの重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号９および１０（Ｘ＝Ｅ）に記載されるアミノ酸配列をそれぞれ含んでいた。
例示的な抗体の全長コード配列は、人為的に設計した。
具体的には、ＩＭＭ４０Ｃの重鎖について、ＩＭＭ４０Ｃの重鎖可変領域＋定常領域（配列番号１３）のコード配列の５'末端にマウスＩｇＧ１重鎖のシグナルペプチド（配列番号１８）をコードする５７ヌクレオチドを付加し、そのシグナルペプチド配列の５'末端にＫｏｚａｋ配列（配列番号１９）を付加した。最後に、得られた配列の５'および３'末端のそれぞれにＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位を付加した。ＩＭＭ４０Ｃの軽鎖について、ＩＭＭ４０Ｃの軽鎖可変領域＋定常領域（配列番号１４）のコード配列の５'末端にＫｏｚａｋ配列と同様のシグナル配列を付加し、得られた配列の５'末端および３'末端のそれぞれにＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を付加した。この配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、それぞれｐＭａｃ－ＨおよびｐＭａｃ－Ｌベクターにクローニングした。
ＩＭＭ４０Ｈの重鎖について、ＩＭＭ４０Ｈの重鎖可変領域＋定常領域（配列番号１５）のコード配列の５'末端にマウスＩｇＧ１重鎖のシグナルペプチド（配列番号１８）をコードする５７ヌクレオチドを付加し、そのシグナルペプチド配列の５'末端にＫｏｚａｋ配列（配列番号１９）を付加した。最後に、得られた配列の５'末端および３'末端のそれぞれにＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位を付加した。ＩＭＭ４０Ｈの軽鎖について、ＩＭＭ４０Ｈの軽鎖可変領域＋定常領域（配列番号１６、Ｎ１＝Ａ、Ｎ２＝Ｃ）のコード配列の５'末端にＫｏｚａｋ配列と同様のシグナル配列を付加し、得られた配列の５'末端および３'末端のそれぞれにＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を付加した。この配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、それぞれｐＭａｃ－ＨおよびｐＭａｃ－Ｌベクターにクローニングした。
ＩＭＭ４０Ｍの重鎖について、ＩＭＭ４０Ｍの重鎖可変領域＋定常領域（配列番号１５）のコード配列の５'末端にマウスＩｇＧ１重鎖のシグナルペプチド（配列番号１８）をコードする５７ヌクレオチドが付加し、そのシグナルペプチド配列の５'末端にＫｏｚａｋ配列（配列番号１９）を付加した。最後に、得られた配列の５'末端および３'末端のそれぞれにＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位を付加した。ＩＭＭ４０Ｍの軽鎖について、ＩＭＭ４０Ｍの軽鎖可変領域＋定常領域（配列番号１６、Ｎ１＝Ｇ、Ｎ２＝Ａ）のコード配列の５'末端にＫｏｚａｋ配列と同様のシグナル配列を付加し、得られた配列の５'末端および３'末端にそれぞれにＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を付加した。この配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって合成し、それぞれｐＭａｃ－ＨおよびｐＭａｃ－Ｌベクターにクローニングした。
本開示のこれらの抗体は、上記で構築したベクターでＣＨＯ－Ｓ細胞を用いて発現させた。簡単に言うと、ＣＨＯ－Ｓ細胞を、一過性トランスフェクションの１日前に、６ｍＭのグルタミンを含むＴｒａｎｓＦｘ－ＣＴＭＣＨＯ一過性トランスフェクション培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中に１×１０６細胞／ｍｌの密度で播種した。重鎖および軽鎖発現ベクターを、質量比１：１、総ＤＮＡ量１μｇ／ｍｌで、使用したＴｒａｎｓＦｘ－ＣＴＭＣＨＯ一過性トランスフェクション培地の１／２０量であるＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に添加した。１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＭＷ４０，０００，カタログ番号２４７６５－１、ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、使用したＴｒａｎｓＦｘ－ＣＴＭＣＨＯ一過性トランスフェクション培地の１／２０量であるＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に添加した。ＰＥＩ希釈液をゆっくりと添加し、混合し、希釈したＤＮＡとともに室温で２０分間、ＰＥＩ：ＤＮＡの質量比４：１でインキュベートした。次に、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を細胞培養物に添加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ２の細胞培養インキュベーターで１１０ｒｐｍにて振盪しながらインキュベートした。２日後にトランスフェクションエンハンサー（１ｍＭの酪酸ナトリウム、０．２５％Ｖ／Ｖ ＤＭＳＯ）を添加し、温度を３３℃に下げた。細胞生存率が約５０％に低下したら、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、細胞培養上清を回収し、プロテインＡクロマトグラフィーを用いたタンパク質精製に供した。
実施例２．細胞表面ＣＤ７０に結合した例示的な抗体
細胞、すなわち、ヒトＣＤ７０を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｕ２６６細胞、およびＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｒａｊｉ細胞を、１×１０６／ｍｌの細胞密度で１００μｌの培地（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ、１％ＢＳＡ－ＰＢＳとも呼ばれる）中で、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中で１００μｌの連続希釈したＩＭＭ４０Ｃ、ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｍのそれぞれと４℃で４５分間インキュベートした。細胞を１％ＢＳＡ－ＰＢＳで１回洗浄し、次に１００μｌの１：５００に希釈したヒトＩｇＧ－Ｆｃに対するＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体（カタログ番号Ｆ９５１２、Ｓｉｇｍａ社）と４℃で４５分間インキュベートした。細胞を１％ＢＳＡ－ＰＢＳで１回洗浄し、２００μｌの１％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁し、次にフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ）を用いてＦＡＣＳ解析に供した。
図２Ａに示すように、ＩＭＭ４０ＣおよびＩＭＭ４０ＨはＣＤ７０＋ＣＨＯ細胞と特異的に結合し、両者の結合能に差はなく、ｈＩｇＧ１－Ｆｃを陰性対照として使用した。
図２Ｂによれば、ＩＭＭ４０ＣおよびＩＭＭ４０Ｈは、ＣＤ７０＋ＣＤ４７＋Ｕ２６６細胞と特異的に結合し、両者の間に結合能の差はなく、ｈＩｇＧ１－Ｆｃを陰性対照として使用した。
図２Ｃに示すように、ＩＭＭ４０ＨはＣＤ７０＋ＣＤ４７＋Ｒａｊｉ細胞と特異的に結合し、クサツズマブおよびＩＭＭ０１のものよりもはるかに高い結合能を有し、ｈＩｇＧ１－Ｆｃを陰性対照として使用した。
同様に、図２Ｄに示すように、ＩＭＭ４０Ｈは、ＣＤ７０＋ＣＤ４７＋Ｕ２６６細胞と特異的に結合し、クサツズマブおよびＩＭＭ０１のものよりもはるかに高い結合能を有し、ｈＩｇＧ１－Ｆｃを陰性対照として使用した。
図２Ｅは、ＣＤ７０＋ＣＨＯ細胞に対するＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０Ｍの結合活性を示し、ｈＩｇＧ１－Ｆｃを陰性対照として使用した。これら２つの抗体は、類似の結合活性で細胞に結合し、ＩＭＭ４０Ｈの結合活性はＩＭＭ４０Ｍの結合活性より少し高いことが分かる。
図２Ｆは、ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ４０ＭのＣＤ７０＋ＣＤ４７＋Ｕ２６６細胞への結合活性を示し、ｈＩｇＧ１－Ｆｃを陰性対照として使用した。これら２つの抗体は、類似の結合活性で細胞に結合し、ＩＭＭ４０Ｈの結合活性はＩＭＭ４０Ｍの結合活性より少し高いことが分かる。
実施例３．例示的な抗体によるＣＤ２７（ＥＣＤ）－ＣＤ７０結合／相互作用の阻害
５×１０５／ｍｌの密度でヒトＣＤ７０を発現する５０μｌのＣＨＯ細胞を、５０μｌの連続希釈したＩＭＭ４０Ｈ、クサツズマブおよびｈＩｇＧ－Ｆｃ（３倍希釈、９００ｎＭから開始）のそれぞれとインキュベートした。得られた混合物を、各ウェルに５０μｌ ２．５μｇ／ｍｌのビオチン－ＣＤ２７（ＥＣＤ）－Ｆｃ（配列番号２２、ＣＤ２７細胞外ドメインをコードするアミノ酸残基１～１７２）を含む９６ウェルプレートに添加し、このプレートを４℃で４５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μｌのＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（カタログ番号５５４０６１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）と４５分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ解析に供した。
図３から分かるように、ＩＭＭ４０Ｈは、ＣＤ７０＋ＣＤ４７－ＣＨＯ細胞へのＣＤ２７（ＥＣＤ）－Ｆｃの結合を、クサツズマブと類似の活性でブロックした。
実施例４．例示的な抗体によるＣＤ２７－ＣＤ７０結合／相互作用の阻害
２×１０５／ｍｌの密度で５０μｌのＣＤ７０＋Ｒａｊｉ細胞を、５０μｌの連続希釈したＩＭＭ４０Ｈ、クサツズマブ、ＩＭＭ０１およびｈＩｇＧ－Ｆｃ（４倍希釈、１６ｎｇ／ｍｌから開始）のそれぞれと３７℃で４５分間インキュベートした。得られた混合物に、ＣＤ２７－ＣＡＲを発現する５０μｌ １×１０６／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞（自社で調製、ＣＤ２７－ＣＡＲのアミノ酸配列は配列番号２３に記載され、アミノ酸残基１～１７２はＣＤ２７細胞外ドメインをコードする）を添加し、３７℃で一晩インキュベートした。この混合物に０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳを添加し、遠心分離に供した。細胞を、ヒトＣＤ６９に対する５０μｌのＰＥコンジュゲート抗体（１：１００希釈、カタログ番号ｓｃ－３７３７９９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）に再懸濁し、４℃で４５分間インキュベートし、０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＦＡＣＳ解析に供した。ＣＤ６９の発現レベルは、Ｊｕｒｋａｔ細胞によって発現されたＣＤ２７－ＣＡＲへのＲａｊｉ細胞上のＣＤ７０の結合を間接的に反映している可能性がある。
図４に示すように、ＩＭＭ４０Ｈは、細胞表面ＣＤ７０へのＣＤ２７－ＣＡＲの結合をブロックし、クサツズマブよりも高い活性を示した。
実施例５．例示的な抗体によるＣＤ７０＋細胞に対して高い抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘導
１ｍＭのＣＦＳＥ（カタログ番号２１８８８－２５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ社）を１：５００に希釈し、ＣＤ７０＋腫瘍細胞の標識に使用した。
標的細胞としてＣＦＳＥ標識した腫瘍細胞を、６×１０５／ｍｌの密度で５０μｌの培地に入れ、エフェクター細胞としてＦｃγＲＩＩＩａを安定発現する１００μｌ ６×１０５／ｍｌのＮＫ９２ＭＩ細胞と２：１の比率で混合した。この混合細胞を、連続希釈した５０μｌのＩＭＭ４０Ｈ、ＩＭＭ０１、ＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１混合物、およびｈＩｇＧ－Ｆｃ（４倍希釈、１ｎＭから開始、ＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１混合物について、ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ０１ともに開始濃度は１ｎＭであった）のそれぞれと５％ＣＯ２下に３７℃で４時間培養した。次に、細胞培養物にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（カタログ番号Ｐ４１７０、Ｓｉｇｍａ社）を５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、次に、ＰＩシグナルについてＦＡＣＳ解析に供した。ＡＤＣＣ率を、以下の式に基づいて計算した。
溶解率＝（ＩＭＭ４０Ｈ、ＩＭＭ０１またはＩＭＭ４０＋ＩＭＭ０１で処理した％ＰＩ陽性標的細胞－陰性対照で処理した％ＰＩ陽性標的細胞）／（１００－陰性対照で処理した％ＰＩ陽性標的細胞）＊１００。
図５Ａによれば、ＩＭＭ４０Ｈによって誘導されたＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｒａｊｉ細胞に対するＡＤＣＣは、ＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１混合物によって誘導されたものと類似していたが、ＩＭＭ０１によって誘導されたものよりもはるかに高いものであった。
同様に、図５Ｂ～図５Ｄに示すように、ＩＭＭ４０Ｈによって誘導されたＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｕ２６６細胞、ＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｄａｕｄｉ細胞、およびＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｊｅｋｏ－１細胞に対するＡＤＣＣは、ＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１混合物によって誘導されたものと類似していたが、ＩＭＭ０１によって誘導されたものよりはるかに高いものであった。
実施例６．例示的な抗体によるＣＤ７０＋細胞に対して高い抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の誘導
マクロファージ（ＴＨＰ－１）を０．２５％トリプシンで３７℃にて２分間消化し、完全培地（１６４０＋１０％ＦＢＳ）に再懸濁し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して回収し、９６ウェルプレートに添加した。このプレートは、各ウェルに２００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡを含む１００μｌの完全培地中に３×１０５個のＴＨＰ－１細胞を含み、一晩インキュベートした。
１ｍＭのＣＦＳＥ（カタログ番号２１８８８－２５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ社）を１：５００に希釈し、ＣＤ７０＋ＣＤ４７＋Ｒａｊｉ細胞、Ｕ２６６細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｊｅｋｏ－１細胞を含む、腫瘍細胞を標識するために使用した。
ＣＦＳＥ標識した腫瘍細胞を１×１０６／ｍｌの完全培地１００μｌに入れ、１００μｌの連続希釈したＩＭＭ４０Ｈ、ＩＭＭ０１、ＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１混合物、ｈＩｇＧ－Ｆｃ（ＩＭＭ４０Ｈ＋ＩＭＭ０１混合物について、ＩＭＭ４０ＨおよびＩＭＭ０１の初期濃度は単一タンパク質群と同じであった）のそれぞれと混合し、４５分間インキュベーター内で培養した。
ＴＨＰ－１細胞を培養したプレートから上清を除去し、プレートに各ウェルにおける２００μｌの腫瘍細胞／タンパク質混合物を添加し、インキュベーターで２時間インキュベートした。試験は二重に行い、ＴＨＰ－１細胞のみの対照群と、ＣＤ７０またはＣＤ４７標的タンパク質を含まないＴＨＰ－１＋腫瘍細胞を含む対照群とを含んでいた。
プレートをＰＢＳで５回洗浄し、浮遊性のＣＦＳＥ標識した腫瘍細胞を除去した。次に、プレートに２００μｌのＰＢＳを添加してＴＨＰ－１細胞を再懸濁し、ＴＨＰ－１細胞の蛍光強度をフローサイトメーターで測定し、ＴＨＰ－１細胞の貪食活性を示した。
図６Ａによれば、ＩＭＭ４０Ｈによって誘導されたＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｒａｊｉ細胞に対するＡＤＣＰは、ＩＭＭ０１だけでなくＩＭＭ０１＋ＩＭＭ４０Ｈ混合物（高濃度）によって誘導されたものよりもはるかに高いものであった。
図６Ｂに示すように、ＩＭＭ４０Ｈによって誘導されたＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｕ２６６細胞に対するＡＤＣＰは、ＩＭＭ０１およびＩＭＭ０１＋ＩＭＭ４０Ｈ混合物によって誘導されたものよりもはるかに高かった。
図６Ｃによれば、ＩＭＭ４０Ｈによって誘導されたＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｄａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＰは、ＩＭＭ０１およびＩＭＭ０１＋ＩＭＭ０４Ｈ混合物によって誘導されたものと同等であった。
さらに、図６Ｄからは、ＩＭＭ４０Ｈは、ＣＤ４７＋ＣＤ７０＋Ｊｅｋｏ－１細胞に対してＡＤＣＰを誘導し、そのＡＤＣＰレベルは、ＩＭＭ０１＋ＩＭＭ４０Ｈ混合物によって誘導されたものと同等であり、ＩＭＭ０１によって誘導されたものよりはるかに高いことが分かる。
実施例７．例示的な抗体によるＣＤ７０＋細胞に対する高い補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導
５０μｌの無血清培地中のＣＤ７０＋ＣＤ４７＋Ｒａｊｉ細胞を３×１０５／ｍｌの密度で、９６ウェルのＵ字型細胞培養プレート上に播種し、３０μｌの連続希釈したＩＭＭ０１、ＩＭＭ４０Ｈ、ＩＭＭ０１＋ＩＭＭ４０Ｈ混合物およびｈＩｇＧ１－Ｆｃ（開始濃度２５ｎＭで４倍希釈、ＩＭＭ０１＋ＩＭＭ４０Ｈ混合物について、ＩＭＭ０１およびＩＭＭ４０Ｈともに開始濃度は２５ｎＭであった）のそれぞれと３０分間インキュベートした。このプレートに２０μｌの１：１３希釈ウサギ補体（カタログ番号ＣＬ３１１１、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を添加し、４時間インキュベートした。次に、プレートにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（カタログ番号Ｐ４１７０、Ｓｉｇｍａ社）を５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、次に、ＰＩシグナルについてＦＡＣＳ解析に供し、これに基づいて細胞溶解率を決定した。
図７に示すように、ＩＭＭ４０Ｈは、ＣＤ７０＋ＣＤ４７＋Ｒａｊｉ細胞に対して高いＣＤＣを誘導し、これはＩＭＭ０１＋ＩＭＭ４０Ｈ混合物によって誘導されたものと同等であり、ＩＭＭ０１によって誘導されたものよりずっと高いものであった。
実施例８．例示的な抗体が示した強力なインビボ抗腫瘍活性
３０匹の５～６週齢のＳＣＩＤマウスに、１００μｌの培地および１００μｌのマトリゲルマトリックス中の５×１０６個のＵ２６６細胞の混合物を右腋窩に近い背中にそれぞれ注射した。腫瘍サイズが約２００ｍｍ３に達したら、マウスを１群６匹のマウスとして５群に無作為に割り当て、この日を０日目とした。その日から、マウスにそれぞれ、ＰＢＳ、ＩＭＭ４０Ｈ（０．３ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ４０Ｈ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ０１（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ０１（０．５ｍｇ／ｋｇ）＋ＩＭＭ４０Ｈ（１．０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、４週間にわたり週１回投与した。４週目の終了時に投与を中止し、さらにマウスを３．５週目まで観察した。マウスの腫瘍サイズと体重を３～４日ごとに測定した。
腫瘍体積（Ｖ）は、（長さ×幅２）／２として計算した。相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝Ｖｔ／Ｖ０、ここで、Ｖｔはｔ日目（Ｄｔ）における腫瘍サイズを指し、Ｖ０は０日目（Ｄ０）における腫瘍サイズを指した。
腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）は、式：ＴＧＩ（％）＝（１－投与群における腫瘍体積変化量／ビヒクル対照群における腫瘍体積変化量）×１００％によって計算した。
試験レジームと結果を表１にまとめた。
表１．Ｄ５２におけるＩＭＭ４０Ｈおよび他の薬剤の抗腫瘍効果
結果を図８および表１に示した。５２日目（Ｄ５２）、群１（ＰＢＳ）の平均腫瘍体積は２７１５．１３±１０７．２７ｍｍ３であり、平均ＲＴＶは１４．０１±０．６７であった。
ＩＭＭ４０Ｈを０．３ｍｇ／ｋｇで４週間治療した後、２８日目（Ｄ２８）における腫瘍サイズは６１．４２±２７．６４ｍｍ３であり、ＲＴＶは０．３０±０．１３であった。腫瘍サイズおよびＲＴＶは、Ｄ３～Ｄ２８の間に、ビヒクル対照群と比較して有意に減少した（ｐ＜０．０５）。５２日目、それぞれ平均腫瘍サイズは４８７．７８±２３３．３７ｍｍ３であり、ＲＴＶは２．４３±１．１６であった。投与中止後、ビヒクル対照群と比較して、腫瘍サイズおよびＲＴＶは減少し続けた（ｐ＜０．０１）。
ＩＭＭ４０Ｈ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ０１（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ０１＋ＩＭＭ４０Ｈ（０．５ｍｇ／ｋｇ＋１．０ｍｇ／ｋｇ）群では、２８日目の腫瘍サイズはいずれも０．００±０．００ｍｍ３、ＲＴＶはいずれも０．００±０．００であった。腫瘍サイズおよびＲＴＶは、Ｄ３～Ｄ２８の間に、ビヒクル対照群と比較して有意に減少した（ｐ＜０．０１）。５２日目のこれらの各群の平均腫瘍サイズおよびＲＴＶは、それぞれ０．００±０．００ｍｍ３および０．００±０．００であった。投与中止後、ビヒクル対照群と比較して、腫瘍サイズおよびＲＴＶは減少し続けた（ｐ＜０．０１）。
このデータはＩＭＭ４０Ｈが強力な抗腫瘍効果を有することを示唆し、１．０ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍は完全に除去された。
本出願の配列を以下に記載する。
以上、本出願を１つ以上の実施形態に関連して説明してきたが、本出願はそれらの実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれ得るすべての代替物、修正物および等価物を網羅することを意図して説明されていることが理解されよう。本明細書で引用されたすべての参照は、さらにその全体が参照により援用される。
参考文献
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Ｇａｒｄａｉ ＳＪ，ＭｃＰｈｉｌｌｉｐｓ ＫＡ，Ｆｒａｓｃｈ ＳＣ，Ｊａｎｓｓｅｎ ＷＪ，Ｓｔａｒｅｆｅｌｄｔ Ａ，Ｍｕｒｐｈｙ－Ｕｌｌｒｉｃｈ ＪＥ，Ｂｒａｔｔｏｎ ＤＬ，Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ＰＡ，Ｍｉｃｈａｌａｋ Ｍ，Ｈｅｎｓｏｎ ＰＭ．Ｃｅｌｌ－ｓｕｒｆａｃｅ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｏｒ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＲＰ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ．Ｃｅｌｌ．２００５； １２３：３２１－３３４
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Ｌｅｅ ＷＹ，Ｗｅｂｅｒ ＤＡ，Ｌａｕｒ Ｏ，Ｓｅｖｅｒｓｏｎ ＥＡ，ＭｃＣａｌｌ Ｉ，Ｊｅｎ ＲＰ，Ｃｈｉｎ ＡＣ，Ｗｕ Ｔ，Ｇｅｒｎｅｒｔ ＫＭ，Ｐａｒｋｏｓ ＣＡ．．Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｎ ＳＩＲＰａ ｔｈａｔ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＣＤ４７．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７，１７９：７７４１－７７５０
Ｌｕｔｆｉ Ｆ，Ｗｕ Ｌ，Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｓ，Ｃａｏ Ｘ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＣＤ２７－ＣＤ７０ Ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ Ｂｏｔｈ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２１ Ｓｅｐ ２２；１２：７１５９０９．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２１．７１５９０９．ＰＭＩＤ：３４６３０３９０； ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ８４９３８７６．
Ｏｂｅｉｄ Ｍ，Ｐａｎａｒｅｔａｋｉｓ Ｔ，Ｊｏｚａ Ｎ，Ｔｕｆｉ Ｒ，Ｔｅｓｎｉｅｒｅ Ａ，ｖａｎ Ｅｎｄｅｒｔ Ｐ，Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌ，Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ．Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇａｍｍａ－ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ＵＶＣ ｌｉｇｈｔｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２００７，１４：１８４８－１８５０
Ｏｒｒ ＡＷ，Ｐｅｄｒａｚａ ＣＥ，Ｐａｌｌｅｒｏ ＭＡ，Ｅｌｚｉｅ ＣＡ，Ｇｏｉｃｏｅｃｈｅａ Ｓ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＤＫ，Ｍｕｒｐｈｙ－Ｕｌｌｒｉｃｈ ＪＥ．Ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｈａｔ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００３，１６１：１１７９－１１８９
Ｓ．Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｔ．Ｈｅ，Ｗ．Ｆｉｔｚｈｕｇｈ，Ｋ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｂ．Ｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｍｅｓｍｅｒ，Ｅ．Ｊｏｓｅｌｏｆｆ，Ｓ．Ｒｕｂｅｎ，Ｐ．Ｍｏｏｒｅ，Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ＣＤ７０ ａｎｄ Ｂ７－Ｈ２ ａｓ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｉｎ，ＡＡＣＲ，２００８．
Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ，Ｎａｍｅｎｕｋ ＡＫ，Ｈｏｎｇ Ｋ，Ｍｅｎｇ ＹＧ，Ｒａｅ Ｊ，Ｂｒｉｇｇｓ Ｊ，Ｘｉｅ Ｄ，Ｌａｉ Ｊ，Ｓｔａｄｌｅｎ Ａ，Ｌｉ Ｂ，Ｆｏｘ ＪＡ，Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ．Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ ＦｃγＲＩ，ＦｃγＲＩＩ，ＦｃγＲＩＩＩ，ａｎｄ ＦｃＲｎ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＩｇＧ１ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＦｃｇＲ．ＪＢＣ．２００１，２７６：６５９１－６６０４
Ｓ．Ｍ．Ｌｅｎｓ，Ｐ．Ｄｒｉｌｌｅｎｂｕｒｇ，Ｂ．Ｆ．Ｄｅｎ Ｄｒｉｊｖｅｒ，Ｇ．Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌ，Ｓ．Ｔ．Ｐａｌｓ，Ｒ．Ａ．Ｖａｎ Ｌｉｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｖａｎ Ｏｅｒｓ，Ａｂｅｒｒａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｏｆ ＣＤ７０ ｏｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｂ ｃｅｌｌｓ，Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１０６（１９９９）４９１－５０３．
Ｔ．Ｈｉｓｈｉｍａ，Ｍ．Ｆｕｋａｙａｍａ，Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．Ｆｕｊｉｉ，Ｔ．Ｏｏｂａ，Ｎ．Ｆｕｎａｔａ，Ｍ．Ｋｏｉｋｅ，ＣＤ７０ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｙｍｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２４（２０００）７４２－７４６．
Ｖｌａｈｏｐｏｕｌｏｓ，ＳＡ．Ａｂｅｒｒａｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＮＦ－κＢ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐｅｒｍｉｔｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ，ｔｏ ｃｕｒｔａｉｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ ｈｏｓｔ ｔｉｓｓｕｅ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅ．Ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７，１４：２５４－２７０
Ｓｈｉｍ Ｈ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０２０ Ｆｅｂ ２６；１０（３）：３６０
Ｗａｎｇ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｋ，Ｌｅｉ Ｑ，Ｍａ Ｐ，Ｙｕａｎ ＡＱ，Ｚｈａｏ Ｙ，Ｊｉａｎｇ Ｙ，Ｆａｎｇ Ｈ，Ｘｉｎｇ Ｓ，Ｆａｎｇ Ｙ，Ｊｉａｎｇ Ｎ，Ｍｉａｏ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｓｕｎ Ｓ，Ｙｕ Ｚ，Ｔａｏ Ｗ，Ｚｈｕ Ｑ，Ｎｉｅ Ｙ，Ｌｉ Ｎ．Ｔｈｅ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０２１ Ａｕｇ ２４：ｅ１４２９１．ｄｏｉ：１０．１５２５２／ｅｍｍｍ．２０２１１４２９１

Claims (13)

  1. ＣＤ７０と結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
    ｉ）重鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域が、配列番号１、２および３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変領域ＣＤＲ－１（ＨＶ－ＣＤＲ１）、ＨＶ－ＣＤＲ２およびＨＶ－ＣＤＲ３を有する、重鎖可変領域と、
    ｉｉ）軽鎖可変領域であって、前記軽鎖可変領域が、配列番号４、５および６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖可変領域ＣＤＲ－１（ＬＶ－ＣＤＲ１）、ＬＶ－ＣＤＲ２およびＬＶ－ＣＤＲ３を有する、軽鎖可変領域と
    を備える、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  2. 前記重鎖可変領域が、配列番号７または９に対して少なくとも９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を備える、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  3. 前記軽鎖可変領域が、配列番号８または１０（Ｘ＝ＮまたはＸ＝Ｅ）に対して少なくとも９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を備える、請求項１または２に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  4. 前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、ｉ）配列番号７および８に対して少なくとも９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ備えるか、ｉｉ）配列番号９および１０（Ｘ＝Ｎ）に対して少なくとも９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ備えるか、またはｉｉｉ）配列番号９および１０（Ｘ＝Ｅ）に対して少なくとも９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ備える、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  5. ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  6. 配列番号１１および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖定常領域および軽鎖定常領域を備える、請求項１から５までのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  7. マウスであるか、キメラであるか、またはヒト化されている、請求項１から６までのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  8. 請求項１から７までのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子。
  9. 請求項８に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  10. 請求項８に記載の核酸分子または請求項９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  11. 治療有効量の請求項１から７までのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分、請求項８に記載の核酸分子、請求項９に記載の発現ベクター、または請求項１０に記載の宿主細胞と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
  12. 癌の治療を必要とする対象における癌の治療に使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 前記癌が、腎臓癌、骨髄異形成症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、鼻咽頭癌、エプスタインバーウイルス誘発性癌、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｂリンパ性白血病、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、胸腺癌、膠芽腫、脳癌、骨肉腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、大腸癌、マントル細胞リンパ腫、前立腺腺癌、大腸腺癌、中枢神経系のリンパ腫、および非小細胞肺癌からなる群から選択される固形癌または血液癌である、請求項１２に記載の使用するための医薬組成物。
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