JP7041913B2

JP7041913B2 - 皮脂産生促進剤

Info

Publication number: JP7041913B2
Application number: JP2017161114A
Authority: JP
Inventors: 隆佐藤; 晃治水野; 弘明坂上
Original assignee: TAKE-PLAS LLC
Current assignee: TAKE-PLAS LLC
Priority date: 2017-08-24
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2037-08-24
Also published as: JP2019038766A

Description

本発明は、竹の常圧過熱水蒸気による抽出物を主成分とする皮脂産生促進剤に関する。

外来植物である孟宗竹は、１９５０年代頃までは竹材や筍を得るために管理された竹林で栽培されていた。しかしながら、近年は竹林業が経済的に成立しなくなり、各地で竹林が放置されるようになった。孟宗竹は繁殖力が異常に強いため、放置された竹林では、竹の繁殖域が無秩序に周囲に広がり、既存の植生を破壊するいわゆる竹害が問題となっている。

一方、竹害の問題に対し、竹を有効利用するための研究が進められている。例えば、竹を常圧過熱水蒸気で処理して発生する蒸気を凝縮して得られる竹の過加熱水蒸気抽出物（以下、竹ＳＨＳ(Super-Heated Stream)抽出物という）が、食中毒原因菌選択制抗菌剤として提案されている（特許文献１）。

特開２０１６－１３５７４９号公報

特許文献１に記載の竹ＳＨＳ抽出物も含めて、竹抽出物に抗菌作用があることや低分子量の有機酸（ギ酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸など）が含まれることが知られているが、有機酸の物性から、竹抽出物を外用剤として皮膚疾患治療や美容の目的に利用する場合、皮膚刺激が懸念される。

これに対し、本発明は、竹抽出物から新たな有用成分とその薬剤としての用途を見出し、竹の有効利用を図ることを課題とする。

本発明者は、竹ＳＨＳ抽出物に含まれる成分を高速液体クロマトグラフィーにより分離し、個々の成分を細胞に作用させることで、比較的疎水性度の高い成分が皮脂産生促進作用を有することを見出し、本発明を想到した。

即ち、本発明は、皮脂産生促進剤の有効成分となる竹の抽出物の製造方法であって、
孟宗竹の稈部分の常圧過熱水蒸気抽出物を、高速液体クロマトグラフィーにて次の分析条件で展開し、
リテンションタイム１０分以下の分画成分を含有させず、リテンションタイムが３２分以上４２分以下の分画成分を含有させる製造方法を提供する。
高速液体クロマトグラフィーの分析条件
・カラムＷａｔｅｒｓ社製ＳｕｎＦｉｒｅ(商標) Ｃ１８（担体粒子径５μｍ、カラム内径４．６ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）
・カラム温度室温
・移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｗａｔｅｒ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ
・分離条件
０～５ｍｉｎ：移動相Ａ９８％、移動相Ｂ２％に保持、
５～４０ｍｉｎ：移動相Ａ９８％、移動相Ｂ２％から移動相Ａ６０％、移動相Ｂ４０％へ直線的に変化、
４０～５０ｍｉｎ：移動相Ａ２％、移動相Ｂ９８％に保持、
・移動相流速１ｍＬ／ｍｉｎ
・測定波長２１４ｎｍ

本発明の皮脂産生促進剤によれば、脂腺細胞における皮脂産生能力を促進させることができる。そのため、本発明の皮脂産生促進剤は皮脂の減少に伴う皮膚疾患の治療ないし予防に有用となる。また、本発明の皮脂産生促進剤を皮膚に適用すると、表皮に潤いや柔軟性を付与することができ、美容上の効果も得ることができる。

さらに、本発明の皮脂産生促進剤は、竹を原材料とし、常圧過熱水蒸気で竹を処理し、発生した蒸気を凝集するという簡便な方法により製造できるため、安価に製造することができる。

図１は、竹ＳＨＳ抽出物を逆相クロマトグラフィーで展開したクロマトグラムである。図２は、図１に対し、竹ＳＨＳ抽出物の注入量および分離条件を変更して逆相クロマトグラフィーで展開した場合のクロマトグラムである。図３Ａは、竹ＳＨＳ抽出物又はそのＨＰＬＣ画分の脂腺細胞に対する作用を示す写真である。図３Ｂは、竹ＳＨＳ抽出物のＨＰＬＣ画分の脂腺細胞に対する作用を示す写真である。図３Ｃは、竹ＳＨＳ抽出物のＨＰＬＣ画分の脂腺細胞に対する作用を示す写真である。図３Ｄは、竹ＳＨＳ抽出物のＨＰＬＣ画分の脂腺細胞に対する作用を示す写真である。図４は、脂腺細胞のＤＮＡ当たりの皮脂（ＴＧ）の産生量に及ぼす竹ＳＨＳ抽出物の影響を示す図である。

以下、本発明の皮脂産生促進剤について詳細に説明する。
本発明の皮脂産生促進剤は、竹を常圧過熱水蒸気で処理することにより発生する蒸気を凝縮して得られる竹ＳＨＳ抽出物であって、後述する逆相クロマトグラフィーで展開した場合に、リテンションタイムが特定の範囲となる成分を含有する。

ここで、竹はイネ目イネ科タケ亜科のうち、茎が木質化する種の総称であり、竹の代表的な種類としては、モウソウチク(孟宗竹)、マダケ、ハチク等が挙げられる。本発明が抽出対象とする竹には、孟宗竹をはじめとする上述の代表的な竹の他に、アズマザサ、ヤダケ、アズマネザサ、スズタケ、クマザサやチシマザサなどのイネ科タケ亜科に属するササ類を含めることができる。

抽出する竹の部位としては、稈、枝、葉又は根をあげることができる。

竹から竹ＳＨＳ抽出物を得る方法は、特許文献１に記載されている方法によればよい。即ち、竹を入れた容器に、好ましくは１８０～２５０℃、より好ましくは２００～２３０℃の常圧過加熱水蒸気を、好ましくは０．２～１．０ｋｇ／竹１ｋｇの流量で導入し、それにより発生する加水分解生成物の蒸気（即ち、竹の分解により生じた揮発竹酢成分）を冷却凝縮させる。こうして得られた竹ＳＨＳ抽出物は、タール分を含まず、発がん性を有するベンゾピレンの濃度が低く、好ましくは０．７ｐｐｂ以下である。

また、こうして得られた竹ＳＨＳ抽出物は種々の成分の混合物となっているが、本発明の皮膚産生促進剤には、室温（例えば２５℃）で実施例に記載の逆相クロマトグラフィーで展開した場合にリテンションタイムが３２分以上４２分以下の成分を含有させる。一方、この逆相クロマトグラフィーでリテンションタイム１０分以下の成分は、ギ酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸などの低分子量の有機酸であり、細胞毒性があるので、皮脂産生促進剤には含有させないことが好ましい。

本発明の皮脂産生促進剤の剤型は、固形状、半固形状、液状等のいずれであってもよく、製品の形態に応じて適宜決定される。

また、本発明の皮脂産生促進剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、ｐＨ調整剤、増粘剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、色素などの各種添加剤や賦形剤を含有することができる。

本発明の皮脂産生促進剤の投与形態は、経口、経腸、径粘膜、注射等とすることができる。また、医薬品、化粧品、飲食品、ペットフード等に配合して使用することができる。

（１）竹ＳＨＳ抽出物の調製
特許文献１の実施例の「選択性抗菌剤の製造実施例１」に記載されている方法で、孟宗竹の稈部分から竹ＳＨＳ抽出物を得た。

（２）ＨＰＬＣによる竹ＳＨＳ抽出物の解析
（１）で得た竹ＳＨＳ抽出物を試料とし、高速液体クロマトグラフ（Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（Ｏｒｇａｎｉｚｅｒ，ＩｎｔｅｒｆａｃｅＢｏｘ，５４１０ＵＶＤｅｔｅｃｔｏｒ，５１１０Ｐｕｍｐ）、株式会社日立ハイテクサイエンス)を用いて次の逆相クロマトグラフィーの分離条件で展開し、図１のクロマトグラムを得た。図１から疎水性度の異なる複数の化合物が竹ＳＨＳ抽出物に含まれることがわかる。

ＨＰＬＣ分析条件
・カラムＷａｔｅｒｓ社製ＳｕｎＦｉｒｅ(商標) Ｃ１８（担体粒子径５μｍ、カラム内径４．６ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）
・カラム温度室温
・移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｗａｔｅｒ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ
・分離条件
０～１７０ｍｉｎ：移動相Ａ１００％、移動相Ｂ０％から移動相Ａ６０％、移動相Ｂ４０％へ直線的に変化
・移動相流速１ｍＬ／ｍｉｎ
・測定波長２１４ｎｍ
・試料注入量１００μＬ

（３）ＨＰＬＣによる竹ＳＨＳ抽出物分画試料の調製
次に、竹ＳＨＳ抽出物に含まれる個々の成分を分離し、分離した成分ごとに細胞に対する作用を調べるため、逆相クロマトグラフィーの分離条件及び試料注入量を次のように変更し、細胞培養に用いるために十分な量の分画成分を得た。この場合のクロマトグラムを図２に示す。

ＨＰＬＣ分析条件
・カラムＷａｔｅｒｓ社製ＳｕｎＦｉｒｅ(商標) Ｃ１８（担体粒子径５μｍ、カラム内径４．６ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）
・カラム温度室温
・移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｗａｔｅｒ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ
・分離条件
０～５ｍｉｎ：移動相Ａ９８％、移動相Ｂ２％に保持、
５～４０ｍｉｎ：移動相Ａ９８％、移動相Ｂ２％から移動相Ａ６０％、移動相Ｂ４０％へ直線的に変化、
４０～５０ｍｉｎ：移動相Ａ２％、移動相Ｂ９８％に保持、
・移動相流速１ｍＬ／ｍｉｎ
・測定波長２１４ｎｍ
・試料注入量１０００μＬ

図２が示すように、竹ＳＨＳ抽出物は１１の成分に分画した。このようにして得られた１１の画分を凍結乾燥した。

このうち、画分１は、ＤＭＳＯに溶解した成分（Ｆ１Ｄ）と、ＤＭＳＯに不溶性のものを超純水にて溶解したもの（Ｆ１Ｗ）の２つに分けた。画分２から画分９は全てＤＭＳＯに溶解した（Ｆ２－Ｆ９）。なお、リテンションタイム１０分以下の成分には、特許文献１に記載されている、ギ酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸などの低分子量の有機酸が含まれていると考えられる。

（４）竹ＳＨＳ抽出物の皮脂産生促進作用
(4-1)ハムスター脂腺細胞の単離
ゴールデンハムスター（雄、５週齢）の左右耳介部を切除し、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）および硫酸ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭに浸し、１時間以上４℃にて放置した後にリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ(－)）で洗浄した。耳介部周囲の毛を刈り、５×５ｍｍ程度に細切し、２．４ｕｎｉｔｓ／ｍＬｄｉｓｐａｓｅ溶液中で４℃、１３．５時間静置した。酵素処理後、ピンセットにて耳介部より表皮を剥離し、皮脂腺を含む真皮を脂腺細胞培養液（ＳＧＭ）［ＤＭＥＭ/Ｆ１２／６％(v/v)ＦＢＳ／２％(v/v)ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ／０．６８ｍＭＬ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ／ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）／硫酸ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）］に浸し、実体顕微鏡下で皮脂腺を単離した。

(4-2)ハムスター脂腺細胞の皮脂産生に対する竹ＳＨＳ抽出物の作用
継代培養したハムスター脂腺細胞（ｐ＝５）を９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ製）に１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種した。この場合、ハムスター脂腺細胞を未分画の竹ＳＨＳ抽出物（０．０００３％、０．０１％、０．１％及び１％）、及び竹ＳＨＳ抽出物のＨＰＬＣ分画のＦ１Ｄ、Ｆ１Ｗ、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８及びＦ９（０．０００３％、０．０１％、及び１％）でそれぞれ処理し、９日間培養した。培養後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ(－)）にて細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、細胞標本を得た。

皮脂産生能に対する竹ＳＨＳ抽出液の影響を評価するため、得られた細胞標本をｏｉｌｒｅｄＯ染色法により脂肪滴を染色した。また、対照として、ＤＨＴや竹ＳＨＳ抽出物を添加せずに作製した細胞標本（Ｃｔｌ）、ＤＨＴの存在下(濃度１０μＭ)で竹ＳＨＳ抽出物を添加せずに作製した細胞標本（ＤＨＴ）、又は皮脂産生促進作用が知られているインスリン（Ｉｎｓ）の存在下（濃度１０μＭ）で作製した細胞標本についても同様に染色した。

ここで、ＯｉｌｒｅｄＯ染色液は、０．３％(w/v)ｏｉｌｒｅｄＯを含むｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ溶液と精製水を３：２(v:v)で混合し、密閉式超音波細胞破砕装置（コスモ・バイオ株式会社製）により１５分間超音波処理を行い、１０分間室温に放置し、ろ過した上清である。

この染色法では、固定した細胞標本にｏｉｌｒｅｄＯ染色液を加えて３７℃で１５分間染色した。

染色後、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ(－)）にて洗浄し、光学顕微鏡（オリンパス株式会社製）により脂肪滴形成を観察した。この観察写真を「竹ＳＨＳ抽出物（画分）」として図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄに示す。

また、皮脂の主成分であるトリアシルグリセロール（ＴＧ）を定量するため、ＤＨＴや竹ＳＨＳ抽出物を添加しない細胞（Ｃｔｌ）、ＤＨＴの存在下(濃度１０μＭ)で竹ＳＨＳ抽出物を添加せずに処理した細胞（ＤＨＴ）、皮脂産生抑制作用が知られているレチノイン酸を処理した細胞（ＲＡ）（濃度１ｎＭ）、皮脂産生促進作用が知られているインスリンを処理した細胞（Ｉｎｓ）（濃度１０μＭ）、ＤＨＴ存在下でＲＡを処理した細胞（ＤＨＴ＋ＲＡ）、ＤＨＴ存在下で竹ＳＨＳ抽出物を処理した細胞（ＤＨＴ＋竹ＳＨＳ抽出物０．１％又は１％）をそれぞれＰＢＳ(－)で２回洗浄し、０．２５％ (w/v) ｔｒｙｐｓｉｎ/０．０２％ (w/v) ＥＤＴＡ／ＰＢＳ(－)溶液を用いて回収した。得られた細胞懸濁液を氷冷下、密閉式超音波細胞破砕装置(コスモ・バイオ株式会社製)により超音波処理を行い、細胞を破砕した。この細胞内のＴＧ量をアクアオートカイノスＴＧ－II試薬（株式会社カイノス製）を用いて次の方法で測定した。すなわち、上記で調製した細胞懸濁液試料(５０μＬ)に反応試液Ｒ－１(９０μＬ)を添加し、３７℃で１０分間反応させた後、直ちに反応試液Ｒ－２(３０μＬ)を添加し、さらに３７℃で１０分間反応させた。反応終了後、５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。この吸光度からＴＧ量を、同様に実施したトリオレイン標準液(２００ｍｇ／ｄＬ）の吸光度に基づいて算出した。一方、細胞中のＤＮＡ量を３，５－ジアミノ安息香酸二塩酸塩（ＤＡＢＡ）法を用いて測定し、ＤＮＡ１μｇあたりの皮脂量（ＴＧ／ＤＮＡ）を求め、このＴＧ／ＤＮＡのコントロールに対する比を求めた。結果を図４に示す。

図３Ａ～図３Ｄ及び図４から、未分画の竹ＳＨＳ抽出物には、その濃度依存的にＤＨＴにより誘導した皮脂産生を抑制する作用が認められ、竹ＳＨＳ抽出物の濃度が１％であると外観観察から細胞死が疑われた。また、竹ＳＨＳ抽出物のＦ１Ｄには皮脂産生に対して強い抑制作用が認められた。しかしながら、竹ＳＨＳ抽出物のＦ２～Ｆ５には細胞毒性が認められず、Ｆ６～Ｆ８には皮脂産生の促進作用が認められた。したがって、Ｆ６～Ｆ８を含む画分、即ち、リテンションタイムが３２分以上４２分以下の画分は、皮脂産生促進剤の有効成分となることがわかる。また、観察された脂肪滴を蓄積する細胞数と各画分の濃度との関係から、この有効成分の適正濃度は、画分濃度として１％未満であることがわかる。

Claims

皮脂産生促進剤の有効成分となる竹の抽出物の製造方法であって、
孟宗竹の稈部分の常圧過熱水蒸気抽出物を、高速液体クロマトグラフィーにて次の分析条件で展開し、
リテンションタイム１０分以下の分画成分を含有させず、リテンションタイムが３２分以上４２分以下の分画成分を含有させる製造方法。
高速液体クロマトグラフィーの分析条件
・カラムＷａｔｅｒｓ社製ＳｕｎＦｉｒｅ(商標) Ｃ１８（担体粒子径５μｍ、カラム内径４．６ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）
・カラム温度室温
・移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｗａｔｅｒ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ
・分離条件
０～５ｍｉｎ：移動相Ａ９８％、移動相Ｂ２％に保持、
５～４０ｍｉｎ：移動相Ａ９８％、移動相Ｂ２％から移動相Ａ６０％、移動相Ｂ４０％へ直線的に変化、
４０～５０ｍｉｎ：移動相Ａ２％、移動相Ｂ９８％に保持、
・移動相流速１ｍＬ／ｍｉｎ
・測定波長２１４ｎｍ