JP7033788B2 - 組み合わせ医薬 - Google Patents
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Description
以下の実施例で使用されるLm-LLO、LLO-E6及びLm-LLO-E7については、Peng X, Hussain SF, Paterson Y.著の「ヒトパピローマウイルス-16のE7を標的とする2種のリステリア・モノサイトゲネスワクチンが抗腫瘍応答を誘導する能力は、骨髄性樹状細胞機能と相関する(The ability of two Listeria monocytogenes vaccines targeting human papillomavirus-16 E7 to induce an antitumor response correlates with myeloid dendritic cell function.)」 Journal of immunology 2004; 172:6030-8、及びGunn GR, Zubair A, Peters C, Pan ZK, Wu TC, Paterson Y.著の「異なる分子形のヒトパピローマウイルス-16(HPV-16)のE7を発現する2種のリステリア・モノサイトゲネスワクチン運搬体は、定性的に異なるT細胞免疫を誘導し、そのT細胞免疫は、それらがHPV-16によって不死化された定着腫瘍の退縮を誘導する能力と相関する(Two Listeria monocytogenes vaccine vectors that express different molecular forms of human papilloma virus-16 (HPV-16) E7 induce qualitatively different T cell immunity that correlates with their ability to induce regression of established tumors immortalized by HPV-16.)」 Journal of immunology 2001; 167:6471-9が参照される。以下の実施例で使用される抗PD-L1抗体は、BioLegend社のカタログ番号329716、RRID:AB_11149168の抗体である。
肺腫瘍検体は、台中栄民総医院(Taichung Veterans General Hospital)(台湾、台中市)の胸部外科で1998年から2004年の間に原発NSCLCの外科的切除を受けた122人の患者から収集した。患者には書面によるインフォームド・コンセントの提出を依頼し、その研究は、治験審査委員会によって承認された(TMUH番号201301051)。各々の収集された検体の腫瘍型及び病期を、世界保健機構の分類システムに従って組織学的に調べた。癌の再燃データを、チャートレビューから得て、胸部外科医が確認した。臨床パラメーター並びに全生存期間及び無再発生存期間のデータは、チャートレビュー及び台湾癌登録センター(Taiwan Cancer Registry)(中華民国行政院衛生署)から収集した。
TL-1細胞及びTL-4細胞は、Y.-W. Cheng博士(台湾台北市の台北医学大学の癌生物学及び創薬の大学院研究所(Graduate Institute of Cancer Biology and Drug Discovery))により寄贈された(10)。SiHa細胞及びC33A細胞は、食品工業発展研究所(台湾、新竹市)の生物資源保存及び研究センター(Bioresource Collection and Research Center)から取得した。TL-1癌細胞系統、TL-4癌細胞系統、及びC33A癌細胞系統は、RPMI-1640培地(HyClone社、ユタ州、ローガン)中で維持した。SiHa癌細胞系統は、DMEM培地(HyClone社、ユタ州、ローガン)中で維持した。その培地は、ペニシリン(100U/mL)及びストレプトマイシン(100mg/mL)が補われた10%仔ウシ血清(FBS)を含有していた。上記細胞は、供給業者の説明書に従って培養した。蘇生させたら(Once resuscitated)、該細胞系統を、細胞形態モニタリング、増殖曲線分析、イソ酵素学及び核型分類による種の鑑定、ショートタンデムリピートのプロファイリング分析による同一性鑑定、並びにコンタミネーション確認によって慣例的に認証した(6ヶ月に1回、該細胞は、2012年12月に最終試験が行われた)。
免疫組織化学分析を行って、PD-L1タンパク質発現を評価した。ホルマリン固定されてパラフィンに包埋された検体を、3μmの切片に切断し、ガラス上にマウントして37℃で一晩乾燥させた。次いで、すべての切片を、キシレン中で脱パラフィンし、アルコールに通して再水和させ、リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄した。この緩衝液は、すべての後続の洗浄に使用した。慣用のストレプトアビジンペルオキシダーゼ法(LSAB Kit K675、DAKO社、カリフォルニア州、カーピンテリア)に従って、切片を、マイクロ波オーブン内にてクエン酸緩衝液(pH6.0)中で5分間にわたり2回加熱し、その後に室温で60分間にわたりインキュベートした。シグナルを、3,3’-ジアミノベンジジンで5分間にわたり顕色させ、それらの切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。ネガティブコントロールは、一次抗体を省くことによって得た。シグナルの強度を、独立して3人の観察者によって評価した。
HPV 16型のE6のcDNAプラスミド及びHPV 16型のE6の小ヘアピン(sh)RNAは、以前に記載されている。PD-L1のcDNAプラスミドは、Addgene社(Addgene Company社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ)から購入した。PD-L1のshRNAは、台湾中央研究院(台湾、台北市)の国立RNAiコア施設(National RNAi Core Facility)から入手した。shRNAのターゲット配列は、補足的な表2に示されている。スクランブル配列を有し、空ベクター発現を伴う非特異的shRNAを、それぞれノックダウン実験及び異所性発現実験におけるコントロールとして使用した。トランスフェクション手順及び安定なクローン選択手順は、以前に記載されている。
足場非依存性増殖を、細胞が軟寒天プレート上にコロニーを形成する能力としてアッセイした。6ウェルプレート中の底部の寒天は、10%仔ウシ血清及び0.5%アガロースを含有する増殖培地からなっていた。全体で300個の細胞を、10%仔ウシ血清及び0.4%アガロースを含有する増殖培地中で再懸濁し、底部の寒天の上に載せた。それらの細胞を、5%CO2中で加湿されたインキュベーター内にて37℃で増殖させた。培養14日後にコロニーを可視化して顕微鏡で定量し、100μmより大きい直径のコロニーを数えた。
6週齢~8週齢の雌のBALB/cヌードマウス及びC57Bl/6マウスを、国立実験動物センター(National Laboratory Animal Center)(台湾、台北市)から購入した。マウスは、NLACの動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下に管理した。Lm-LLO-E6(E6)ワクチン及びLm-LLO-E7(E7)ワクチンを、5×106CFU/マウスの用量で腹腔内注射した。BioLegend社(カリフォルニア州、サンディエゴ)から入手した抗PD-L1モノクローナル抗体を、25μg/マウスの用量で静脈内注射した。その実験は、コントロール群と比較した場合の、種々の処置によって誘導された腫瘍増殖の変化を調べることが目的であった。簡潔には、マウスに、0日目に1匹のマウス当たり500000個のTL-1細胞を右脇腹に皮下的に移植した。7日目(腫瘍サイズが、直径で約3mm~4mm)に、それらのマウスに、Lm-LLO-E6又はLm-LLO-E7を腹腔内注射し、及び/又は抗PD-L1モノクローナル抗体を静脈内注射した。マウスを、抗PD-L1モノクローナル抗体で、腫瘍移植後の14日目、21日目、及び28日目に更に3回処置した。コントロール群のマウスは、TL-1細胞又はSiHa細胞を注射しただけであった。腫瘍を、3日~4日毎にデジタルノギスを用いて計測し、腫瘍容積を、式V=(W2×L)/2(式中、Vは、容積であり、Lは、長さ(長径)であり、かつWは、幅(短径)である)を使用して計算した。フローチャートは、補足的な図1に示されている。
Lm-LLO-E6(E6)ワクチン及びLm-LLO-E7(E7)ワクチンを、5×106CFU/マウスの用量で腹腔内注射した。抗PD-L1モノクローナル抗体を、25μg/マウスの用量で静脈内注射した。その実験は、種々の処置によって誘導された腫瘍増殖及び生存における変化を調べることが目的であった。簡潔には、マウスに、0日目に1匹のマウス当たり100000個のTL-1細胞又はSiHa細胞を尾静脈注射によって注射した。14日目に、それらのマウスに、Lm-LLO-E6ワクチン若しくはLm-LLO-E7ワクチンを腹腔内注射し、及び/又は抗PD-L1モノクローナル抗体を静脈内注射した。マウスを、抗PD-L1モノクローナル抗体で、腫瘍細胞注射後の21日目、28日目、35日目に更に3回処置した。マウスには、死ぬまで通常の食餌を与え続けた。
すべての統計分析は、SPSS統計ソフトウェアプログラム(バージョン17.0、SPSS, Inc.社、イリノイ州、シカゴ)を使用して、以前に記載された通りに実施した(18、19)。統計的検定において分散の両側分析を行い、P値<0.050を統計学的に有意とみなした。
1. Lm-LLO-E6ワクチンの形成
E6腫瘍抗原研究で使用されるリステリア菌株は、Lm-LLO-E6(エピソーム性発現系におけるhly-E6融合遺伝子)、Lm-E6(リステリアのゲノム中に組み込まれた単コピーE6遺伝子カセット)、Lm-LLO-NP(エピソーム性発現系におけるhly-NP融合遺伝子)、及びLm-Gag(染色体中に組み込まれた単コピーHIV-1 Gag遺伝子カセット)である。DP-L2028としても知られるLm-LLO-NP(Chen CJ, Hsu LS, Lin LS, Lin SH, Chen MK, Wang HK, Hsu JD, Lee H, Yeh KT (2012)「クルッペル様因子4の核発現の喪失は、口腔癌患者における予後不良と関連している(Loss of nuclear expression of Kruppel-like factor 4 is associated with poor prognosis in patients with oral cancer.)」 Human Pathology, 43, 1119-1125)、及びZY-18としても知られるLm-Gag(Wang YC, Sung WW, Wu TC, Wang L, Chien WP, Cheng YW, Chen CY, Shieh SH and Lee H* (2012).「インターロイキン-10ハプロタイプは、切除された非小細胞肺癌における生存及び再燃を予測し得る(Interleukin-10 haplotype may predict survival and relapse in resected non-small cell lung cancer.)」 PLOS ONE, 7, 7, e39525)は、以前に記載されている。E6は、PCRによってプライマー5’-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3’(配列番号6)(XhoI部位に下線が引かれている)及び5’-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3’(配列番号7)(SpeI部位に下線が引かれている)を使用して増殖させ、pCR2.1(Invitrogen社、カリフォルニア州、サンディエゴ)中にライゲーションした。E6を、pCR2.1からXhoI及びSpeIによる二重消化によって切り出し、pGG-55中にライゲーションした。発現系pGG-55は、pDP-2028を手本にしている(Chen CJ, Hsu LS, Lin LS, Lin SH, Chen MK, Wang HK, Hsu JD, Lee H, Yeh KT (2012).「クルッペル様因子4の核発現の喪失は、口腔癌患者における予後不良と関連している(Loss of nuclear expression of Kruppel-like factor 4 is associated with poor prognosis in patients with oral cancer.)」 Human Pathology, 43, 1119-1125)。hly-E6融合遺伝子及びprfAを、pAM401という多コピーのシャトルプラスミド中にクローニングすることで、pGG-55が作製される。hlyプロモーターは、XhoI部位によってE6遺伝子に結合されているhly遺伝子産物のLLOの最初の441アミノ酸の発現を駆動する。そこで得られるのは、転写されてLLO-E6として分泌されるhly-E6融合遺伝子である。LLOの溶血性C末端を欠失させることによって、該融合タンパク質中の溶血活性は取り除かれた。多能性転写因子のprfAもpGG-55中に含まれている。リステリアのprfA陰性菌株XFL-7(ペンシルバニア大学のHao Shen博士からの寄贈)をpGG-55で形質転換させることによって、in vivoにおけるプラスミドの保有が選択される。hlyプロモーター及び遺伝子断片を、プライマー5’-GGG GGC TAG CCC TCC TTT GAT TAG TAT ATT C-3’(配列番号8)(NheI部位に下線が引かれている)及び5’-CTC CCT CGA GAT CAT AAT TTA CTT CAT C-3’(配列番号9)(XhoI部位に下線が引かれている)を使用して作製した。prfA遺伝子を、プライマー5’-GAC TAC AAG GAC GAT GAC CGA CAA GTG ATA ACC CGG GAT CTA AAT AAA TCC GTT T-3’(配列番号10)(XbaI部位に下線が引かれている)及び5’-CCC GTC GAC AG CTC TTC TTG GTG AAG-3’(配列番号11)(SalI部位に下線が引かれている)を使用してPCR増幅させた。Lm-E6は、E6の発現及び分泌を駆動するhlyプロモーター及びシグナル配列を有する発現カセットを、L.モノサイトゲネスのゲノムのorfZドメイン中に導入することによって作製した。E6を、PCRによってプライマー5’-GCG GAT CCC ATG GAG ATA CAC CTA C-3’(配列番号12)(BamHI部位に下線が引かれている)及び5’-GCT CTA GAT TAT GGT TTC TGA G-3’(配列番号13)(XbaI部位に下線が引かれている)を使用して増幅させた。次いでE6を、pZY-21シャトルベクター中にライゲーションした。得られたプラスミドpZY-21-E6は、L.モノサイトゲネスのゲノムのorfX、Y、Zドメインに相当する1.6kbの配列の中央に挿入された以前に記載された発現カセットを含む発現系である。L.モノサイトゲネス菌株10403Sを、pZY-21-E6で形質転換させた。ホモロジードメインは、E6遺伝子カセットをorfZドメイン中に相同組換えにより挿入することを可能にする。クローンを、E6遺伝子カセットのorfZドメイン中への組み込みについてスクリーニングした。細菌を、クロラムフェニコール(20μg/ml)を有する(Lm-LLO-E6及びLm-LLO-NP)又は有さない(Lm-E6及びZY-18)脳心臓浸出物培地中で増殖させた。細菌を、アリコートにおいて-80℃で凍結させた。
6週齢~8週齢の雌のBALB/cヌードマウス及びC57Bl/6マウスを、国立実験動物センター(台湾、台北市)から購入した。マウスは、NLACの動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下に管理した。TL1細胞は、Cheng YW博士により寄贈された。ヒトパピローマウイルス株16型(HPV16型)早期タンパク質6及び7(E6及びE7)並びに活性化ras癌遺伝子を原発C57BL/6マウスの肺上皮細胞に同時トランスフェクションさせることによって得られたTC-1細胞を、ATCC(バージニア州、マナサス)から入手し、細胞を、10%FBS、ペニシリン及びストレプトマイシン(それぞれ100U/ml)並びにL-グルタミン(2mM)を補ったRPMI 1640中で37℃、5%のCO2で増殖させた。ヒトパピローマウイルス-16型(HPV-16型)のE6及びE7を有する又は有さないリステリアワクチン運搬体(Lm-LLO、LLO-E6及びLm-LLO-E7)は、Advaxis Inc.社によって供給された。Lm-LLO、LLO-E6及びLm-LLO-E7を、5×106CFU/マウスの用量で腹腔内注射した。抗PD-L1モノクローナル抗体及び抗PD-1モノクローナル抗体を、CureTech社(イスラエル)から入手し、該抗体を、50μg/マウスの用量で静脈内注射した。フローサイトメトリーのために使用されるすべての蛍光標識された抗体及び適切なアイソタイプコントロールは、BD Biosciences社(カリフォルニア州、サンノゼ)から購入した。腫瘍増殖及び生存を分析することを目的とする治療的実験は、以前に記載されたように実施した。簡潔には、0日目に、右脇腹において皮下的に1匹のマウス当たり500000個の細胞で、C57Bl/6マウスにTC-1細胞を移植し、かつBALB/cヌードマウスにTL-1細胞を移植した。8日目(腫瘍サイズが、直径で約3mm~4mm)に、適切な群からの動物(1群当たり5匹のマウス)に、Lm-LLO又はLm-LLO-E6又はLm-LLO-E7を腹腔内注射すると共に、抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体を静脈内注射するか、又は該抗体を注射しなかった。腫瘍移植後の15日目に、ワクチンとモノクローナル抗体でマウスをもう一度処置した。別の群のマウスは、未処置のままにした。腫瘍を、3日~4日毎にデジタルノギスを用いて計測し、腫瘍容積を、式V=(W2×L)/2(式中、Vは、容積であり、Lは、長さ(長径)であり、かつWは、幅(短径)である)を使用して計算した。
1. TC-1に誘導された転移性肺腫瘍形成における、抗PD-L1モノクローナル抗体(BioLegend社のカタログ番号329716、RRID:AB_11149168)若しくは抗PD-1モノクローナル抗体の治療的実験、及び/又は該抗体とLm-LLO-E6ワクチン若しくはLm-LLO-E7ワクチンとを組み合わせた治療的実験
6週齢~8週齢の雌のBALB/cヌードマウス及びC57Bl/6マウスを、国立実験動物センター(台湾、台北市)から購入した。マウスは、NLACの動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下に管理した。ヒトパピローマウイルス-16型(HPV-16型)のE6及びE7を有する又は有さないリステリアワクチン運搬体(Lm-LLO、Lm-LLO-E6及びLm-LLO-E7)は、Advaxis Inc.社によって供給された。Lm-LLO、Lm-LLO-E6及びLm-LLO-E7を、5×106CFU/マウスの用量で腹腔内注射した。抗PD-L1モノクローナル抗体及び抗PD-1モノクローナル抗体を、BioLegend社から入手し(カタログ番号329716、329926)、それらの抗体を、それぞれ0.1mg/kg~30mg/kgの用量で静脈内注射した。フローサイトメトリーのために使用されるすべての蛍光標識された抗体及び適切なアイソタイプコントロールは、BD Biosciences社(カリフォルニア州、サンノゼ)から購入した。腫瘍増殖及び生存を分析することを目的とする治療的実験は、以前に記載されたように(参考文献)実施した。簡潔には、マウスに、0日目に1匹のマウス当たり500000個のTC-1細胞を右脇腹に皮下的に移植した。8日目(腫瘍サイズが、直径で約3mm~4mm)に、適切な群からの動物(1群当たり5匹のマウス)に、Lm-LLO又はLm-LLO-E6又はLm-LLO-E7を腹腔内注射すると共に、抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体を静脈内注射するか、又は該抗体を注射しなかった。腫瘍移植後の15日目に、Lm-LLOワクチン又はLm-LLO-E6ワクチン又はLm-LLO-E7ワクチンと、抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体とで、マウスをもう一度処置した。別の群のマウスは、未処置のままにした。腫瘍を、3日~4日毎にデジタルノギスを用いて計測し、腫瘍容積を、式V=(W2×L)/2(式中、Vは、容積であり、Lは、長さ(長径)であり、かつWは、幅(短径)である)を使用して計算した。Lm-LLO、LLO-E6又はLm-LLO-E7を、抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体と組み合わせた群においては、腫瘍容積はほとんどが100%減少する一方で、抗PD-L1単独の群においては、腫瘍容積は約10%減少した。
マウスの樹状細胞(DC)を、以前に本発明者らが記載したように骨髄から単離及び精製した。ヒト樹状細胞を得るために、単球を健康な成人血液ドナー(米国国立衛生研究所、血液バンク)から単離した。簡潔には、末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll-Paque Plus(Amersham Biosciences社)を使用して勾配遠心分離により単離し、該細胞を、洗浄後に37℃で2時間にわたり組織培養プレートに付着させた。非付着性細胞を洗浄により除去し、付着性単球を、プレートにおいて37℃、5%CO2でRPMI 1640、2mMのL-グルタミン、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、10mMのHEPES、10%の仔ウシ血清、10mMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、及び5×10-5Mの2-メルカプトエタノールからなる完全RPMI 1640中で培養した。細胞を、GM-CSF(1000U/ml)及びIL-4(500U/ml)の存在下で4日間にわたり培養することで、未成熟樹状細胞となった。GM-CSF及びIL-4を、3日目に新たな培地と一緒に再び加えた。培養物における樹状細胞の生存率を、トリパンブルー排除プロトコルを使用して評価した。トリパンブルー陰性細胞を、生きているとみなした。単球からの樹状細胞を4日間~5日間にわたり培養した後に、樹状細胞を回収し、6ウェルプレートに移した(1×106個の細胞/ml)。種々の濃度のLm-LLO又はLm-LLO-E6又はLm-LLO-E7を、樹状細胞培養物(0CFU/ml、107CFU/ml、108CFU/ml、及び109CFU/ml)に1時間にわたり加え、それに引き続き、ゲンタマイシン(50μg/ml)を加えることで、リステリアを死滅させ、48時間にわたり培養した。樹状細胞を、適切な蛍光標識された抗PD-L1抗体(PE抗マウスPD-L1及びFITC抗ヒトPD-L1)で染色した。アイソタイプ適合されたモノクローナル抗体を、ネガティブコントロールとして使用した。染色された細胞を、FACSCaliburサイトメーター及びCellQuestソフトウェア(BD Biosciences社)を使用して分析した。
ELISPOTを使用して、製造業者(BD Biosciences社、カリフォルニア州、サンノゼ)によって提案される通りに、処置されたマウス及びコントロールマウスからのE6又はE7で再刺激された(10μg/ml)脾細胞培養物におけるIFNγ産生を検出した。CTL Immunospotアナライザー(Cellular Technology Ltd.社、オハイオ州、シェーカーハイツ)を使用して、スポットを分析した。無関係のペプチド(hgp 10025-33-KVPRNQDWL-Celtek Bioscience社、テネシー州、ナッシュビル)で再刺激された脾細胞からのスポットの数を、E7で再刺激された培養物のものから差し引いた。腫瘍試料を、GentleMACSディソシエーター及び固形腫瘍の均質化プロトコルを使用して、製造業者(Miltenyi Biotec社、カリフォルニア州、オーバーン)によって提案される通りに処理した。腫瘍浸潤性CD8陽性CD4陽性Foxp3陽性細胞(制御性T細胞)及びCD11b陽性Gr-1陽性細胞(MDSC)の数を、CD45陽性造血細胞集団内でフローサイトメトリーアッセイを使用して以前に本発明者らが記載したように分析した。制御性T細胞及びMDSCのレベルも、腫瘍を保有する処置されたマウス及びコントロールマウスの脾臓において同じフローサイトメトリーアッセイを使用して評価した。
本発明者らは、NSCLC患者から122人の手術で切除された肺腫瘍を収集して、E6発現が、PD-L1発現と関連し得るかどうかを調べた。E6発現に関するデータは、以前の研究から得られた。免疫組織化学分析により、E6陽性肺腫瘍は、より高い頻度の陽性PD-L1発現を示すことが指摘された(66.7%対47.9%、P=0.039、図1)。PD-L1発現は、年齢、性別、喫煙状況、及び病期等の臨床的パラメーターとは関連していなかったが、その発現は、腫瘍組織学と関連しており、陽性PD-L1が、扁平上皮細胞癌におけるよりも腺癌でより頻繁に発現されることが指摘された(63.8%対45.3%、P=0.042)。
本発明者らは、E6癌タンパク質発現が、PD-L1発現を増大させ、HPV感染による肺癌細胞におけるコロニー形成及び軟寒天増殖を促進し得る可能性を調査した。HPV16型陽性TL-1細胞を、E6又はE7の小ヘアピン(sh)RNAでのトランスフェクションのために、そしてE6又はE7の発現ベクターでトランスフェクションされたHPV16型陰性TL-4細胞との比較のために収集した。この比較は、E6癌タンパク質が、肺癌細胞におけるPD-L1発現の要因となるが、E7癌タンパク質は、その要因とならないかどうかを検証するものである(図3A)。ウェスタンブロッティングにより、E6及びE7のタンパク質発現が、E6又はE7の操作によって予想通りに減少及び増大したことが指摘された(図3A)。興味深いことに、PD-L1発現は、TL-1細胞におけるE6ノックダウンによって顕著に減少したが、それは、TL-4細胞におけるE6過剰発現によって増大した(図3A)。PD-L1発現は、E7の操作では両方の細胞型において不変であった(図3A)。HPV16型陽性及びHPV16型陰性の子宮頚部SiHa細胞及びC33A細胞を同じ処置に供したものには同様の応答が見られた(図3A)。これらの結果は、E6癌タンパク質が、HPV感染による肺癌細胞におけるPD-L1発現の要因となり得るが、E7癌タンパク質は、その要因となり得ないことを示唆している。
抗PD-L1モノクローナル抗体は、持続的な腫瘍抑制及び進行したNSCLCにおける臨床的利益をもたらし得る(15)。したがって、PD-L1がHPV感染による肺癌におけるE6に媒介されるコロニー形成及び軟寒天増殖の要因となり得るという所見(図2)は、抗PD-L1モノクローナル抗体+Lm-LLO-E6ワクチンの組合せ物が、ヌードマウスにおけるTL-1細胞により誘導された腫瘍増殖に対する優れた抑制効果を有し得ることを示唆した。ヌードマウスを、それぞれ5匹のヌードマウスの7つの群に無作為に分け、それらのマウスにTL-1細胞を注射し、次いで、それらのマウスを、抗PD-L1モノクローナル抗体、Lm-LLO-E6ワクチン、Lm-LLO-E7ワクチン、抗PD-L1モノクローナル抗体+Lm-LLO-E6ワクチン、抗PD-L1モノクローナル抗体+Lm-LLO-E7ワクチン、又は抗PD-L1モノクローナル抗体+Lm-LLO-E6/E7ワクチンのいずれかで処置した。コントロール群のマウスは、TL-1細胞で処置しただけであった。各群における代表的な腫瘍量が図4に示されている。TL-1細胞によって誘導された皮下腫瘍量は、コントロール群と比較して、抗PD-L1モノクローナル抗体+Lm-LLO-E6ワクチン又は抗PD-L1モノクローナル抗体+Lm-LLO-E6/E7ワクチンではほぼ完全に抑制された。しかしながら、Lm-LLO-E6ワクチン群においては、抗PD-L1モノクローナル抗体群又は抗PD-L1+Lm-LLO-E7ワクチン群におけるよりも高い抗腫瘍活性が観察された。TL-1細胞によって誘導された腫瘍は、Lm-LLO-E7ワクチン処置によってほぼ不変であった(図4)。これらの結果は、その細胞モデルの所見を裏付けており、PD-L1が、HPV感染による癌におけるE6に媒介される腫瘍増殖及び転移の要因となり得ることが指摘された。
さらに本発明者らは、経尾静脈動物モデルを用いて、抗PD-L1モノクローナル抗体+Lm-LLO-E6の組合せ物が、ヌードマウスにおけるTL-1細胞により誘導された転移性肺腫瘍結節形成を抑制し得るかどうかを検証した。実験は、77日間で中止した。各群におけるTL-1細胞によって誘導された代表的な転移性肺腫瘍結節を、SiHa細胞によって誘導されたものと比較した。腫瘍は、H&E染色によって確認した(図5A)。各群の肺腫瘍結節についての代表的な免疫染色結果により、これらの肺腫瘍結節におけるPD-L1及びE6の発現が、抗PD-L1モノクローナル抗体とLm-LLO-E6ワクチンによって、コントロール群と比較して有意に抑制されることが示された。TL-1細胞によって誘導された転移性肺腫瘍結節の数は、コントロール群と比較して、抗PD-L1モノクローナル抗体+Lm-LLO-E6ワクチンによって最も抑制され、続いて、E6ワクチン、抗PD-L1モノクローナル抗体、抗PD-L1+Lm-LLO-E7ワクチン、及びLm-LLO-E7ワクチンによって抑制された(図5A)。同じ処置に供したヌードマウスにおけるSiHa細胞によって誘導された転移性肺腫瘍結節においては、同様の所見が観察された(図5B)。
Claims (20)
- 抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体をヒトパピローマウイルス(HPV)抗原関連ワクチンと組み合わせた、PD-L1陽性/HPV E6陽性の組み合わせ、PD-L1陽性/HPV E7陽性の組み合わせ、又は、PD-L1陽性/HPV E6陽性/HPV E7陽性の組み合わせの腫瘍に罹患している被験体の治療に用いられる組み合わせ医薬。
- 前記抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体の量は、約5mg/mLから約50mg/mLまでの範囲であり、前記HPV抗原関連ワクチンの量は、約1×104CFU/用量から約1×1012CFU/用量までの範囲である、請求項1の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記抗PD-L1抗体は、アテゾリズマブ又はMEDI4736であり、前記抗PD-1抗体は、ニボルマブ又はペムブロリズマブである、請求項1の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記HPV抗原関連ワクチンは、LLO-E6融合タンパク質又はLLO-E6-E7融合タンパク質を有する運搬体である、請求項1の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記LLO-E6融合タンパク質又はLLO-E6-E7融合タンパク質を有する運搬体は、LLO-E6融合タンパク質又はLLO-E6-E7融合タンパク質を発現するプラスミドを有するリステリアである、請求項4の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記リステリアは、リステリア・モノサイトゲネスである、請求項5の使用のための組み合わせ医薬。
- 第二の抗癌剤を更に含む、請求項1の使用のための組み合わせ医薬。
- PD-L1陽性/HPV E6陽性の組み合わせ、PD-L1陽性/HPV E7陽性の組み合わせ、又は、PD-L1陽性/HPV E6陽性/HPV E7陽性の組み合わせの腫瘍に罹患している被験体における腫瘍増殖、浸潤、及び/又は転移を治療及び/又は予防するために用いられる、抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体と、HPV抗原関連ワクチンとを含む組み合わせ医薬。
- 前記PD-L1陽性/HPV E6陽性の組み合わせ、PD-L1陽性/HPV E7陽性の組み合わせ、又は、PD-L1陽性/HPV E6陽性/HPV E7陽性の組み合わせの腫瘍は、肺腫瘍、子宮頚部腫瘍、膣腫瘍、外陰腫瘍、陰茎腫瘍、肛門腫瘍、直腸腫瘍、黒色腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸部扁平上皮癌腫(HNSCC)、及び中咽頭腫瘍である、請求項8の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記肺腫瘍は、非小細胞肺癌である、請求項9の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記PD-L1陽性/HPV E6陽性の組み合わせ、PD-L1陽性/HPV E7陽性の組み合わせ、又は、PD-L1陽性/HPV E6陽性/HPV E7陽性の組み合わせの腫瘍は、HPV感染による肺腫瘍又は子宮頚部腫瘍である、請求項8の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記抗PD-L1抗体は、アテゾリズマブ又はMEDI4736であり、前記抗PD-1抗体は、ニボルマブ又はペムブロリズマブである、請求項8の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記HPV抗原関連ワクチンは、LLO-E6融合タンパク質、LLO-E6-E7融合タンパク質を発現する運搬体、ADXS-HPV、又はその組み合わせである、請求項8の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体の投与量は、約0.01mg/kgから約20mg/kgまでの範囲である、請求項8の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記HPV抗原関連ワクチンの投与量は、約1×104CFU/用量から約1×1012CFU/用量までの範囲である、請求項8の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体と前記HPV抗原関連ワクチンとは、同時に、並行して、別々に、又は連続的に投与する、請求項8の使用のための組み合わせ医薬。
- PD-L1陽性/HPV E6陽性の組み合わせ、PD-L1陽性/HPV E7陽性の組み合わせ、又は、PD-L1陽性/HPV E6陽性/HPV E7陽性の組み合わせの腫瘍に罹患している被験体におけるPD-1/PD-L1癌免疫療法の改善に用いられる、抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体とHPV抗原関連ワクチンとを含む組み合わせ医薬。
- 前記癌の予後は改善される、請求項17の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体と前記HPV抗原関連ワクチンとは、同時に、並行して、別々に、又は連続的に投与する、請求項17の使用のための組み合わせ医薬。
- 前記HPV抗原関連ワクチンは、LLO-E6融合タンパク質、LLO-E6-E7融合タンパク質を発現する運搬体、ADXS-HPV、又はその組み合わせである、請求項17の使用のための組み合わせ医薬。
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