JP7018685B2 - ハイドロゲル・マイクロカプセルの製造方法、カプセルを製造するためのキット、およびその利用 - Google Patents

ハイドロゲル・マイクロカプセルの製造方法、カプセルを製造するためのキット、およびその利用 Download PDF

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Description

本発明は、中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの製造方法、カプセルを製造するためのキット、およびその利用に関する。
マイクロカプセルは、その内部に封入された物質の形態、反応性、系外からの圧力等に対する影響を制御し得ることから、記録材料、医薬品、化粧品、農薬、および細胞移植研究等に広く用いられている。これらの多くは、内容物を不溶性のポリマーで被覆した外殻（シェル）を持ち、シェル内（コア）に内容物を安定に保持する（Ａｏ Ｚ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、ｅｔ．ａｌ．、２００９、２５、２５７２）。一方不溶性ポリマーの代わりに、低分子透過性のハイドロゲルのシェルをもち、コアが水溶液状の中空ハイドロゲル・マイクロカプセルは、従来のマイクロカプセルにはない、様々な利点をもつ。例えば中空ハイドロゲル・マイクロカプセルのコアに微生物や細胞を包埋し、酵素により遺伝子増幅を行うと、微細空間内での反応により、従来課題であった増幅時の不均一性（増幅バイアス）の改善が期待される（Ｌａｓｋｅｎ ＲＳ、２０１２、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０、６３１）。
また中空ハイドロゲル・マイクロカプセルに細胞を包埋して細胞移植を行うと、免疫系細胞の攻撃を防ぎつつ、酸素や栄養分を透過し、相互の細胞接着や細胞間ネットワークの構築によって、より生体内に近い環境を再現でき、移植細胞の定着率の向上が期待できる。そのため様々な中空ハイドロゲル・マイクロカプセルが研究されている（Ｒａｂａｎｅｌ ＪＭ、２００９、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２５、９４６）。
様々な中空ハイドロゲル・マイクロカプセルのうち、アガロースシェルをもつ中空ハイドロゲル・マイクロカプセル（Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅ：ＡＧＭ）は、他のハイドロゲル・マイクロカプセルにくらべ、機械的強度や安定性に優れ、低い抗原性を持ち、安全性が高いなどの、優れた特徴をもつ。これまで主に中空ハイドロゲル・マイクロカプセルは、アルギン酸ゲル・マイクロビーズをコアとし、表面にポリ―Ｌ―リジンやキトサンなどのカチオン性ポリマーとイオン結合させて、シェルを形成したものが報告されている（特表２０１２－５２５３３８号公報、特表２００９－５３７２６８号公報、特表２００８－５１５４３４号公報）。これらは比較的作製が容易だが、シェルの厚みが１μｍ以下と薄いため物理強度に乏しく、強アルカリや高濃度の塩などの、遺伝子増幅時に用いる試薬により、溶解する課題があった。そのため数１０μｍの厚みと、マイクロピペットで吸引しても容易に破損しない物理強度を持ち、酸、アルカリ、および高濃度の塩でも安定な、ＡＧＭが求められていた。
しかしこれまで、ＡＧＭの簡便な作製は困難だった。ＡＧＭ作製の一例として、次の方法が考えられる。最初にエマルジョン・内部ゲル化法（Ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ―Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｇｅｌａｔｉｏｎ、Ｒｅｉｓ ＣＰ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、２００６、２３、２４５）により、アルギン酸ゲル・マイクロビーズを作製する。次に加熱溶解したアガロースとアルギン酸ビーズを混合し、オイルとのエマルジョン中でアガロースを冷却し、ゲル化させる。最後にアルギン酸をＥＤＴＡにより可溶化して、ＡＧＭを作製する。しかし実際には、アガロースを静置してゲル化すると、アガロースとアルギン酸ビーズが沈降し、不定形のゲルを形成する。一方沈降を防ぐため、アガロースとアルギン酸ビーズをオイルと撹拌しながらゲル化させた場合、球状のＡＧＭが得られるが、多くは撹拌中に互いに付着し、不定形の凝集したゲルを形成する。また撹拌条件を激しくすると、アガロースとアルギン酸ビーズが分離する課題があった。
そこでアガロースとアルギン酸ビーズ懸濁液の微小液滴の、沈降や凝集を防ぐために、オイルにゲル化剤を添加する方法が開発された（非特許文献１）。アガロースとアルギン酸ビーズ懸濁液とオイルのエマルジョンにおいて、最初にオイルを、ゲル化剤により固めた後、冷却によりアガロースの液滴をゲル化させた。これにより、アガロース微小液滴の沈降や凝集を防ぎ、球状のＡＧＭを得た。しかしオイルゲルは融点が高く、アガロースとアルギン酸ビーズ懸濁液と混和する際、６０－７０℃に加熱する必要があった。そのためＡＧＭ内に微生物や細胞を包埋する場合、オイルゲルの熱により死滅する恐れがあった。また遺伝子解析において、微生物や細胞への熱によるダメージは、細胞外へのＤＮＡの漏出や、ＤＮＡの損傷を生じる可能性があった（非特許文献２）。そのため包埋する微生物や細胞に対し、ダメージを防ぐために、常温下で作製する方法が求められていた。
日本国公表特許公報：特表２０１２－５２５３３８号公報、マイクロファーマ・リミテッド 他、「変性疾患の予防および治療のための細菌組成物」 日本国公表特許公報：特表２００９－５３７２６８号公報、ユニヴァーシタ デグリ ステュディ デイ トリエステ、「組織工学用で活性化合物のキャリアとしての、多糖類混合物のハイドロゲル」 日本国公表特許公報：特表２００８－５１５４３４号公報、ジョージア テック リサーチ コーポレイション「静電ポテンシャルを用いたヒドロゲル中の細胞のマイクロカプセル化」
Hiroyoshi Aoki and Yutaka Yamagata, "Agarose Gel Microcapsule : Pico-liter scale DNA Amplification Microvessel for Single Cell Genomics". Multi-omics for Microbiomes-EMSL Integration Conference, August 1-3, 2017, PASCO, WA。 澤井 淳 他、日本食品微生物学会誌、１２、７９（１９９５）
ＡＧＭは、コアを形成するアルギン酸ビーズと加熱溶解したアガロースの混合液の微小液滴を、オイル中でゲル化させた後、ＥＤＴＡによるアルギン酸のゾル化により、作製し得る。しかしオイル中でアルギン酸とアガロースの微小液滴は、静置時は沈殿や凝集、または撹拌時はアルギン酸ビーズとアガロースの分離を生じ、簡便な効率のよい作製方法がなかった。
これについて、非特許文献１に記載の方法は、オイルのゲル化により、アルギン酸ビーズとアガロース微小液滴の、沈降や凝集を防いだ。さらに静置してゲル化することで、アルギン酸ビーズとアガロースの分離も防止した。
しかしオイルゲルは、アルギン酸ビーズとアガロースの混合液と懸濁する際、オイルのゲル化を防ぐため６０－７０℃に加熱する必要があった。そのためＡＧＭ内に微生物や細胞を包埋する場合、熱によるダメージを避けるため、常温下で相互の沈降や凝集を防ぐ、アガロースのゲル化法が求められていた。
本発明は、上記の問題に鑑みてなされたものであり、カプセルを製造する技術およびその関連技術を提供することを目的としている。
１) イオン結合性高分子を含むコアと熱依存性高分子を含むシェルとを備えたハイドロゲル・カプセルの製造方法であって、
少なくとも表面が上記イオン結合性高分子のゲルから形成されたコアを含む上記熱依存性高分子のゾル（水相）を油相に分散し、冷却することで上記熱依存性高分子をゲル化してシェルを形成する工程を包含し、
上記油相に含まれるオイルは、疎水性が、オクタノール／水分配係数（ＬｏｇＰｏｗ）が３以上で、かつ比重と粘度が次式を満たす、カプセルの製造方法。
Figure 0007018685000001
 上記式において、ρｐ：イオン結合性高分子ゲルと熱依存性高分子ゾルとの平均比重［ｋｇ／ｍ３］、ρｆ：オイル比重［ｋｇ／ｍ３］、ｘ：上記カプセルを製造する工程の歩留まり（収率）［％］、Ｌ：容器に収容された懸濁液の深さ［ｍ］、ｔ：熱依存性高分子のゲル化時間［ｓ］、Ｄｐ：カプセルの直径［ｍ］、ｇ：重力加速度［ｍ／ｓ２］、η：オイル粘度［Ｐａ・ｓ］、である。
ＡＧＭは機械的強度、安定性、および安全性に優れ、遺伝子工学用途や、細胞移植など医療用途など、様々な用途に期待される。本発明の一態様によれば、対象物に対するダメージや汚染を抑制しつつ、安定に保存し得る、中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの製造技術を提供できる。
本発明の一態様に係る中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの作製工程の概略を説明する図である。（ａ）は、包埋対象物を含む、イオン結合性高分子ゾルへの懸濁液の作製工程を示す。（ｂ）は、オイルへの乳化による、イオン結合性高分子ゾルの微小液滴の作製工程を示す。（ｃ）は、イオン結合性高分子ゾルのゲル化の工程を示す。（ｄ）は、イオン結合性高分子ゲルビーズと、熱依存性高分子ゾルの懸濁液を示す。（ｅ）は、熱依存性高分子ゾルの微小液滴の作製工程を示す。（ｆ）は、熱依存性高分子のゲル化による、イオン結合性高分子ゲルコア上への、シェルの形成工程を示す。（ｇ）は、イオン結合性高分子ゲルのコアのゾル化による、熱依存性高分子ゲルビーズの中空化工程を示す。 本発明の一態様に係る中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの作製工程における、微小液滴の大きさＤＰ、微小液滴の終端速度ｖａ［ｍ／ｓ］、微小液滴とオイルとの懸濁液の深さＬ［ｍ］、及びカプセルにおけるシェルを形成する熱依存性高分子ゾルのゲル化時間ｔ［ｓ］との関係を説明する図である。 中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの一態様である、ＡＧＭの顕微鏡画像である。Ａは、位相差観察画像であり、ａはＡＧＭを、ｂはアガロースハイドロゲルシェルを、ｃはアルギン酸ゾルによる中空コアを、矢印はＡＧＭ内に単離された、大腸菌をそれぞれ示す。Ｂは、蛍光観察画像である。 本発明の一用途である、ＡＧＭ内での酵素による全ゲノム増幅を行った後、カプセル内内部に特異的に増幅されたＤＮＡを検出した、顕微鏡画像である。Ａは、ＡＧＭ内での、特異的な一菌体由来全ゲノム増幅を行った時の位相差ならびに蛍光顕微鏡画像を示す。Ｂは、比較実験として、菌体を含まないＡＧＭでの全ゲノム増幅後の位相差ならびに蛍光観察画像を示す。 一細胞解析の一例を示す模式図である。 本発明の一態様に係る中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの製造システムを示す図である。 本発明の一実施例における、ＡＧＭのライブラリの作成の結果を示す図である。 本発明の他の実施例における、ＡＧＭのライブラリを用いたＷＧＡの結果を示す図である。
＜１．マイクロカプセルの製造方法＞
以下、図１を用いて、本発明の一態様に係る中空ハイドロゲル・マイクロカプセル（カプセル）１５の製造方法について、より詳細に説明する。
図１の（ａ）～（ｇ）に示すように、一態様に係るカプセル１５の製造方法は、イオン結合性高分子ゾルのコア１６と熱依存性高分子のゲルのシェル１７とを備え、イオン結合性高分子のゾル６のゲル化工程（図１の（ｃ））、熱依存性高分子をゲル化してシェル１７を形成する工程（図１の（ｆ））、および内部のイオン結合性高分子ゲル８をゾル化する工程（図１の（ｇ））を、包含している。
〔１－１：イオン結合性高分子のゾルを、ゲル化する工程〕
イオン結合性高分子のゾルをゲル化する工程では、密閉性の容器１内に、イオン結合性高分子ゾル２に対し、包埋対象物３（本例では大腸菌）、およびイオン源４（本例では炭酸カルシウム粉末）を懸濁する（図１の（ａ））。次に、当該イオン結合性高分子ゾル２の懸濁物を、オイル（別の油相）５に乳化分散し、イオン結合性高分子ゾルの微小液滴６を形成する（図１の（ｂ））。微小液滴６内には、先の包埋対象物３およびイオン源４が含まれる。次いで、オイル５に有機酸７（本例では酢酸）を添加し、有機酸によりイオン源４（炭酸カルシウム）を溶解し、アルカリ土類金属イオン（本例ではカルシウムイオン）を遊離させる。遊離されたアルカリ土類金属イオンは、イオン結合性高分子ゾル２から形成された微小液滴６をゲル化させ、ビーズ８を形成する（図１の（ｃ））。ビーズ８は、オイル５から回収、洗浄した後、次工程に供する。
（イオン結合性高分子）
イオン結合性高分子は、水溶性の高分子であって、イオン結合を介して高分子の主鎖の一部を架橋できる。水系溶媒中にイオン結合性高分子を溶かして調製したゾル２は、イオンを供給すると、互いにイオン結合により架橋しゲル化する。このようなイオン結合性高分子は、当該イオン結合性高分子が含まれる系の温度によらず、系内に供給されるイオンによって可逆的にゾル－ゲル転移を生じる高分子である。よって、加温により、ゾル化する熱依存性高分子中に配合しても、ゲルの状態を好適に維持することができる点において好ましい。
イオン結合性高分子としては、例えば、アルギン酸等の、分子内に陽イオンあるいは陰イオン性の官能基をもつ多糖類、脱アシル型ジェランガム、ポリアクリル酸、およびカルボキシメチルセルロースから選択される少なくとも一種の可逆性ゲルを形成するイオン結合性高分子であり、カウンターイオンにより架橋し、ゲル化する。なお、イオン結合性高分子を溶解し、ゾルを調製するための水系溶媒は、緩衝液であり得る。
（イオン源）
これらイオン結合性高分子のゾルをゲル化するためのカウンターイオンを放出するイオン源４としては、カルシウム、およびマグネシウム、ストロンチウム、バリウム、亜鉛等のアルカリ土類金属の塩を挙げることができ、例えば、カルシウム塩であることが好ましく、カルシウム塩には、例えば、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、リン酸カルシウム等が挙げられる。特に中性で溶解せず、ｐＨ５程度の弱酸性下で均一に溶解する炭酸カルシウムが好ましい。そのため中性条件（６．５～７．５程度）に調整されたイオン結合性高分子ゾルへ炭酸カルシウムを分散し、オイルに乳化させると、ゲルを形成せずに均一に分散する。乳化後、有機酸を添加すると、オイル中の液滴内で炭酸カルシウムが溶解してカルシウムイオンを生成し、イオン結合性高分子をゲル化させ、均一なハイドロゲルのビーズを形成する。
なお、一態様に係るカプセルの製造方法では、イオン結合性高分子のゾルを調製する段階において、当該イオン結合性高分子のゾルに包埋すべき対象物を懸濁しておく。
（イオン結合性高分子を分散するオイル）
イオン結合性高分子の微小液滴は、イオン結合性高分子ゾル２をオイル５に分散することによって形成される。ここで、油相（連続相でもある）であるオイル５には界面活性剤が含まれていることが好ましい。
オイル５は、イオン結合性高分子のゾルを液滴状にして分散できればよく、飽和または不飽和の高級脂肪酸、これら高級脂肪酸のアルキルエステル、ポリグリセリンエステル、グリセライド、並びに、飽和または不飽和の高級脂肪族アルコール、および脂肪族炭化水素等などが挙げられる。より具体的には、オイルは、例えば、サラダ油、綿実油、大豆油、およびコーン油等の植物油（飽和または不飽和の高級脂肪酸のグリセライド）であってもよく、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸、これら脂肪酸のアルキルエステルとして、例えば、カプリル酸メチル、ラウリン酸メチル、パルミチン酸メチル、オレイン酸メチル、ステアリン酸メチル、ステアリン酸エチル等が挙げられ、また、これら脂肪酸とポリグリセリンとのエステルとして、オクタカプリル酸－６－ポリグリセリド（ＰＧＯ）等のエステルが挙げられ、高級脂肪族アルコールとして、例えば、カプリルアルコール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコールが挙げられ、脂肪族炭化水素には、例えば、イコサン等が挙げられる。また、オイルは、シリコーンオイルや、例えば、フェニル基、アミノ基、カルボキシル基等の官能基が導入された変性シリコーンオイル等であってもよい。これらの中でも、微生物の混入の恐れが少ない化学合成オイルで、安全性が高く、遠心や洗浄により除去しやすく、さらにゲル化に用いる酢酸が溶解しやすいという観点から、オイルは、飽和または不飽和の高級脂肪族アルコールが好ましく、イソステアリルアルコールがより好ましい。
（界面活性剤）
界面活性剤は、水系溶媒に含まれるイオン結合性高分子のゾルの液滴を、オイル中に乳化分散するという観点から、ｗ／ｏ型のエマルション形成性界面活性剤の使用が好ましい。界面活性剤は、ｗ／ｏ型のエマルションを形成できれば、カチオン系、アニオン系、両性、ノニオン系界面活性剤の何れであってもよい。界面活性剤には、例えば、天然由来の界面活性剤、合成界面活性剤を挙げることができ、天然由来の界面活性剤には、例えば、レシチンを挙げられる。また、合成界面活性剤には、例えば、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ（登録商標) ２０）、ソルビタンモノパルミテート（Ｓｐａｎ（登録商標） ４０）、ソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ（登録商標） ６０）、ソルビタントリステアレート（Ｓｐａｎ（登録商標） ６５）、ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標） ８０）、ソルビタンセスキオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標） ８３）、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標） ８５）、およびソルビタンイソステアレート（Ｓｐａｎ（登録商標） １２０）等が挙げられる。また、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ６１）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ６５）およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０）等が挙げられる。
このようにオイル５に界面活性剤を添加し、イオン結合性高分子ゾルの分散性を向上させ、かつゾル液滴６の融着を抑制できる。この観点から、オイル中に含まれる界面活性剤の濃度は、０．５～５％の範囲内であり得る。
また、オイル５へのイオン結合性高分子のゾルの分散時の撹拌は、イオン結合性高分子のゾル液滴６を調製するスケールによって適宜設計すればよく、限定されるものではないが、例えば、５０ｍＬコニカルチューブ中でオイル中にイオン結合性高分子のゾルを分散する場合、手やボルテックスミキサー等によって撹拌するとよい。
（有機酸）
撹拌後、オイル５中にイオン結合性高分子ゾルの液滴６が乳化分散された状態において、有機酸７を供給する。これによって、イオン結合性高分子の微小液滴６中のイオン源４であるアルカリ土類金属塩からカルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属イオンを遊離し、これによりイオン結合性高分子をゲル化させ、ハイドロゲルのビーズ８を得る（図１の（ｃ）参照）。イオン結合性高分子ゾルをゲル化させるために使用する有機酸７には、オイル５に溶解する、有機溶媒可溶性の酸が用いられ、例えば、酢酸、クエン酸、乳酸等を挙げることができる（図１の（ｃ）では、酢酸を使用）。イオン結合性高分子のゲルのビーズ８を形成することによって、後の熱依存性高分子のシェル１７を形成する際に、中心部にシェルのアガロースゾルが浸透するのを防ぎ、中空のコア１６を形成する。
ゲル化後のイオン結合性高分子のビーズ８は、濾過や界面活性剤を含む緩衝液による洗浄除去により、好適にオイル５から回収できる（図１の（ｄ））。濾過には、１０μｍから１００μｍ口径の、メッシュフィルター等が使用できる。また緩衝液には、上述のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等の界面活性剤を添加しておくことが、オイル５を除去することができるという観点から好ましい。また遺伝子増幅など、包埋対象物の培養を目的としない場合には、エーテルやアルコール等の有機溶媒も洗浄に使用できる。ここで、エーテルには、例えば、ジエチルエーテル、およびジブチルエーテル等が挙げられ、アルコールには、炭素数が１～８程度の低級アルキルアルコールが挙げられる。
〔１－２：イオン結合性高分子のゾルをゲル化する、他の工程〕
なお、一態様に係るカプセルの製造方法では、イオン結合性高分子のゾルをゲル化する工程において、上述の、イオン結合性高分子ゾルとオイルとの、エマルジョン・内部ゲル化法が用いられる。しかし、イオン結合性高分子のゲルのハイドロゲルビーズを形成する方法は、この方法に限定されない。
イオン結合性高分子のゾルをビーズ状にゲル化する工程として、エマルジョン・内部ゲル化法以外にも、アルギン酸の液滴を塩化カルシウムなどの凝固剤にノズルから滴下する吐出法、マイクロ流路内で凝固させる方法（Ｒａｂａｎｅｌ ＪＭ、２００９）などがある。エマルジョン・内部ゲル化法にくらべ、吐出法やマイクロ流路法は、均一な粒径のハイドロゲルビーズを作製できる。しかしこれらは専用の機器が必要であり、その多くは市販されておらず、入手困難である。さらにハイドロゲル・ビーズ内に微生物や細胞を包埋する場合、他の微生物の混入を防ぐため、これらの機器を無菌滅菌する必要がある。一方エマルジョン・内部ゲル化法は、特に複雑な機器を必要とせず、市販の無菌滅菌した安価な使い捨て容器で作製できるため、利便性が高い。
〔２：熱依存性高分子ゲルのシェル１７を形成する工程〕
シェル１７を形成する工程では、まず、イオン結合性高分子ゲルのビーズ８を熱依存性高分子のゾル９に懸濁する（図１の（ｄ））。次いで、熱依存性高分子ゾル９の懸濁液とオイル１０をエマルジョン化して、イオン結合性高分子ゲル・ビーズ８を内包する、熱依存性高分子ゾル９の微小液滴１１を作製する（図１の（ｅ））。これを氷冷して、熱依存性高分子ゾルをゲル化させる（図１の（ｆ））。これをオイル１０から回収し、洗浄した後、緩衝液１３に懸濁する（図１の（ｇ））。
（熱依存性高分子）
熱依存性高分子は、当該熱依存性高分子が含まれている系内にイオンが存在するか否ではなく、所定の温度を境として可逆的にゾル－ゲル転移する材料である。また、熱依存性高分子のシェルを形成するための材料には、可視光下で透明で、親水性である材料が好ましく、このような材料には、例えば、アガロース、寒天、カラギナン（カッパ型が好ましい）、およびネイティブジェランガム等を挙げることができ、より好ましくは、アガロース、寒天、ゼラチン、およびカラギナン等を挙げることができ、アガロース、寒天、またはゼラチンがより好ましく用いられ、最も好ましくはアガロースを用いる。
（熱依存性高分子以外のゲル化材料）
またシェルには、イオン結合性高分子、熱依存性高分子以外のゲル化能をもつ高分子や、架橋剤を添加した高分子も使用できる。前者には、例えば、中性化に伴いゲル化する酸可溶化コラーゲンがある。また後者には、グルタルアルデヒドのような化学架橋試薬や、トランスグルタミナーゼなどの酵素架橋試薬を添加した、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンなど細胞外マトリクスタンパク質がある。特に化学架橋試薬にくらべ、酵素架橋試薬は毒性が少なく、より好適にシェルを形成できる。またトロンビンとフィブリンの混合液は、トロンビンの特異的な作用により、フィブリンをゲル化できる。これらのタンパク質系のマトリクスは細胞接着の足場となり、シェル内壁への細胞接着を促すことができる。
アガロースの特徴は、例えば、１）アルカリや塩に対しても安定なゲルを形成する、２）低温（例えば４０℃前後以下）においても、温度依存的にゲル化できる、３）ゲル強度が高く、中空の微細なマイクロカプセルにしても、ピペッティング等で簡単に破壊されず、取り扱いや単離が容易である、４）オリゴＤＮＡ、酸素、イオン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質のような低分子は透過するが、染色体ＤＮＡなどの巨大分子や、細胞や微生物のようなミクロスケールの物質は透過しない、５）生体毒性が低い、６）可視光下で透明で、無蛍光なゲルを形成する、７）親水性ゲルを形成する、８）２－ヒドロキシエチルエステル化などの化学修飾により、ゲル化温度を修飾前の４０℃前後から２６～３０℃に制御できる、等が挙げられる。特に、熱依存性高分子は、室温におけるマイクロカプセルの保存安定性、熱安定性の観点からゲル化温度を４～４０℃に制御することができる熱依存性高分子であることがより好ましい。
なお、アガロースに限らず、本発明にて用いる熱依存性高分子は、上記１）～８）から選択される少なくとも一つの特徴を備えることが好ましい。
（熱依存性高分子のシェルを分散するオイル）
イオン結合性高分子ゾルのビーズ８を含んだ熱依存性高分子のゾル９を、オイル１０に分散して、微小液滴１１を作製し、これを冷却によりゲル化するには界面活性剤が含まれていることが好ましい。
イオン結合性高分子は、イオンの添加により数秒でゲル化するが、熱依存性高分子のゲル化は温度変化に伴い、分子間のヘリックス形成などが徐々に進行し、数十分から１時間ほどかけて最終的にゲルを形成する（Ｊａｎａｋｙ Ｎａｒａｙａｎａｎ 他，２００６，Ｊ．Ｐｈｙｓ．：Ｃｏｎｆ．Ｓｅｒ ２８ ８３）。そのためイオン結合性高分子のゾル液滴６のゲル化にくらべ、熱依存性高分子の微小液滴１１のゲル化は、沈降や凝集により、不定形の塊状のゲルを形成しやすい。この沈降や凝集を防ぐため、熱依存性高分子のゲル化したビーズ１２を形成するためのオイル１０には、以下の１）～４）の構成を備えているオイルを使用する。なお、実施例１にも示したが、１）および３）の構成を備えるオイルを使用すれば、ゲル化中の沈降凝固を防ぎ、マイクロカプセルを簡便に作製できる。
１）微小液滴とオイルとの比重差、およびオイル粘度が、ストークスの式から導かれる関係式（３）式を満たすこと。
今、柱状の容器に、熱依存性高分子ゾルとイオン結合性高分子のゲルビーズとの混合液を、オイルと撹拌して、微小液滴を形成する。微小液滴は、一定時間冷却、静置して、ゲル化させる。静置後、微小液滴はオイルとの比重差により、徐々に沈降し始め、その沈降速度はオイルの粘性による抵抗により、一定の速度（終端速度）に達する。微小液滴の終端速度ｖｓ［ｍ／ｓ］はストークスの式（Ｓｔｏｋｅｓ’ｓ Ｌａｗ）（１）式から、求められる。
Figure 0007018685000002
 ここで、Ｄｐ：微小液滴の直径［ｍ］、ρｐ：微小液滴の比重［ｋｇ／ｍ３］、ρｆ：オイル比重［ｋｇ／ｍ３］、ｇ：重力加速度［ｍ／ｓ２］、η：オイル粘度［Ｐａ・ｓ］、である（図２）。
微小液滴の一部は底に沈降し、不定形のゲル（沈降凝集物）を形成して回収できなくなる（図２）。この工程の歩留まりをｘ［％］、その際の微小液滴の終端速度をｖａ［ｍ／ｓ］、容器（例えばコニカルチューブ）に収容されている微小液滴とオイルとの懸濁液の深さをＬ［ｍ］、カプセルにおけるシェルを形成する熱依存性高分子ゾルのゲル化時間をｔ［ｓ］、とすると、次の（２）式が求められる。
Figure 0007018685000003
 そして（１）と（２）式、およびｖｓ≦ｖａより、次の（３）式が求められる。
Figure 0007018685000004
 （３）式において、左辺のρｐ、右辺のηの係数は、作製条件により一意に決まり、オイル比重ρｆ、粘度ηとは、この式を満たす必要がある。
次に具体例を示す。５０ｍＬコニカルチューブを用い、約３０分かけて微小液滴をゲル化させ、ゲル化した微小液滴の歩留まりを９０％とする。その際、微小液滴とオイルとの懸濁液の深さＬを約４０ｍｍ、微小液滴の直径Ｄｐを約１００μｍ、微小液滴の比重ρＰを１０２０ｋｇ／ｍ３（約２％ゲル，ｗ／ｖ）、重力加速度９．８ｍ／ｓ２、とすると、（３）式は、次の（４）式のように示される。
Figure 0007018685000005
 オイル粘度を一般的なオイル粘度である０．２Ｐａ・ｓとする。すると、（４）式よりオイル比重ρｆは約８５７ｋｇ／ｍ３（０．８５７ｇ／ｍＬ）以上と求められる。この場合、ＰＧＯ（０．９９７ｇ／ｍＬ）などが本条件に該当する。
２）２０℃における粘度が１，０００ｍＰａ・ｓ以下であること。
（３）式より、粘度ηが大きい方が、より比重の軽いオイルも使用できる。しかし実際には、高粘性のオイルと熱依存性高分子ゾルの均一な撹拌は困難である。簡便に手あるいはボルテックスミキサーなど、容器を振盪して均一に撹拌するには、約１Ｐａ・ｓ（１，０００ｍＰａ・ｓ）（蜂蜜などの粘度）程度が上限である。
すなわち、熱依存性高分子ゾルを分散するためのオイルは、２０℃における粘度が（３）式を満たし１，０００ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましい。この条件下では、熱依存性高分子ゾルの微小液滴の分散性を好適に維持できる。（４）式において、１，０００ｍＰａ・ｓ以下に該当するオイルには、上述のＰＧＯ以外に、ポリブテン（日油、０１５Ｎ、０．８７０ｇ／ｍＬ、５６６ｍＰａ・ｓ）などの液状合成樹脂；トリイソステアリン酸ポリグリセリン‐２（日光ケミカル、０．９３０ｇ／ｍＬ、５１０ｍＰａ・ｓ）、ひまし油（伊藤製油、０．９５９ｇ／ｍＬ、６８０ｍＰａ・ｓ）、テトライソステアリン酸ペンタエリスリチル（日清オイリオ、０．９６０ｇ／ｍＬ、４２０ｍＰａ・ｓ）、テトライソステアリン酸ポリグリセリン‐２（日清オイリオ、０．９２６ｇ／ｍＬ、３６９ｍＰａ・ｓ）、などのグリセリド、ポリグリセリドまたは多価アルコールのエステルが挙げられる。そのうちもっとも粘度が低いＰＧＯが最も撹拌しやすく、好ましい。
３）オクタノール／水分配係数（ＬｏｇＰｏｗ）が３以上であること。
オクタノール／水分配係数（ＬｏｇＰｏｗ）は、オクタノールと水との二相系において、オイルがオクタノール相に溶解している濃度と、水相に溶解している濃度との比として定義され、常用対数にて示される。オイルのＬｏｇＰｏｗが高い程、疎水性を示し、熱依存性高分子ゾルと分離し、熱依存性高分子ゾルはオイルによって沈殿せず、安定にゲルを形成するため、より好ましい。オイルのオクタノール／水分配係数（ＬｏｇＰｏｗ）は３以上であり、より好ましくは、６以上である。
４）オイルの融点は、２０℃以下であること。
微生物や細胞を包埋するため、オイルは、これらに熱によるダメージを与えないよう、室温または３７℃での熱依存性高分子ゾルとの混和時、液体である必要がある。そのためオイルの融点は室温、より好ましくは２０℃以下がよい。
このような、１）～４）の構成を備え、微小液滴を内部に安定して分散し得るオイルとしては、ポリオールエステル、グリセリンエステル、ポリグリセリンエステル、およびシリコーンオイル、脂肪族炭化水素、液状合成樹脂、ひまし油等を選択することが好ましく、ポリオールエステル、グリセリンエステル、ポリグリセリンエステルを用いることがより好ましい。ポリオールエステル、グリセリンエステル、ポリグリセリンエステルとしては、Ｃ８以上からＣ２０以下の脂肪酸と、多価アルコール、グリセロール、あるいはポリグリセリンなどから合成されるエステルを挙げることができる。ここでポリグリセリンの重合度は２から１５の範囲内である。また、例えば、シリコーンでは、例えば、ジメチルシリコーンオイル（信越シリコーン、ＫＦ－９６ ５０ｃｓ～６，０００ｃｓ）や、メチルフェニルシリコーンオイル（信越シリコーン、ＫＦ－５０）等が、１）～４）の構成を備え、使用できる。また液状合成樹脂としては、ポリブテン（日油、０１５Ｎ、３Ｎ）などが挙げられる。
また複数のオイルを組み合わせて、１）から４）の仕様を満たしてよい。例えば比較的低比重、低粘性のオイルに高粘性のオイルを混和して使用してよい。同様にして、互いに比重の異なるオイルを混和して、オイル比重を調整してもよい。なお、オイル比重と微小液滴の比重との差は、±５％の範囲内になるように調製することが好ましい。
上述の４）において、オイルの融点は、２０℃以下であることが好ましいことを説明したが、別の態様に係るマイクロカプセルの製造方法では、上述の式（３）の要件を満たしていれば、その他、オイルには、融点が、熱依存性高分子がゲル化する温度である２６～３０℃以上で、包埋する生物にダメージを与えない３７℃付近、もしくは３７℃以下の、オイルでもよい。このような、オイルとして、例えば、上述のオイルのうち、ノナデカン（融点３２℃）、エイコサン（融点３６．７℃）のような高分子のアルカンや、トリデシルアルコール（融点３０～３２℃）およびミリスチルアルコール（融点３８℃）のような高分子アルコール、およびステアリン酸メチル（融点３７℃）、ヘキサ（ヒドロキシステアリン酸／ステアリン酸／ロジン酸）ジペンタエリスリチル（融点３５℃）、（エチルヘキサン酸／ステアリン酸／アジピン酸）グリセリル（融点３１℃）のような高分子のエステル等が挙げられる。このようなオイル１０を溶融し、熱依存性高分子ゾル９を分散してエマルジョン化した後、速やかに冷却して、固化したオイル１０に熱依存性高分子ゾルの微小液滴１１を安定して保持できる。
その他、オイルには、例えば、パルミチン酸デキストリン、（パルミチン酸／エチルヘキサン酸）デキストリン等のデキストリン脂肪酸エステル、１２‐ヒドロキシステアリン酸のような脂肪酸、１，３；２，４‐ジベンジリデン‐Ｄ‐ソルビトールなどソルビトール化合物、およびＮ‐ラウロイル‐Ｌ‐グルタミン酸‐α，γ‐ビス‐ｎ‐ブチルアミドなどのアミノ酸誘導体をオイルゲル化剤として配合してもよい。これによって、オイルの粘度を、上記の範囲に調整してもよい。また、オイルゲル化剤のゲル化温度は、熱依存性高分子のゲル化温度よりも高いことが好ましく、具体的は、３０～４０℃程度の温度でゲル化することが好ましい。オイルゲル化剤を使用することによって、ゲル化したオイル１０中において、熱依存性高分子ゲルの微小液滴１１を安定して保持できる。またオイルゲル化剤以外に、２‐エチルヘキサン酸アルミニウムなどの、オイル増粘剤を、同様に用いてもよい。
（界面活性剤）
オイル１０に、熱依存性高分子ゾルを乳化分散するために添加する界面活性剤は、ｗ／ｏ型エマルション用の界面活性剤を使用する。このような界面活性剤には、上述のイオン結合性高分子ゾルを乳化分散するために使用されるものを用いることができる。中でも、合成界面活性剤としてすでに説明した、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンイソステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等を用いることが好ましい。
例えばＰＧＯでは０．２５～１％（ｖ／ｖ）ソルビタンモノオレエートを添加してもよい。５％以上のソルビタンモノオレエートを使用した場合、乳化能の向上により、熱依存性高分子ゾルの液滴が微小化や、オイル中で固化した球状の熱依存性高分子ゾルの破砕が見られる。また洗浄に１－ブタノールを使用する場合、５％以上のソルビタンモノオレエートはブタノールに溶解しにくく沈殿するため、洗浄方法が限定される。そのためソルビタンモノオレエートの濃度は５％未満が好ましい。
また、オイルの種類に応じて、適宜上記の界面活性剤を組み合わせて使用してもよい。
（熱依存性高分子ゾルのゲル化）
熱依存性高分子ゲルのシェル１７を速やかに形成するため、熱依存性高分子ゾルを室温でのオイル１０に分散させた後、冷却したオイル１０と混和し、ゲル化させてもよい。この場合容器を氷等で冷却するのに加え、直接オイルで冷却できるので、作製時間の短縮が図れる。よって油相は、熱依存性高分子がゲルする温度よりも低い温度に予め冷却しておくことが好ましく、４～１０℃の範囲内の温度であることが好ましい。
熱依存性高分子のシェルがゲル化することによって、イオン結合性高分子ゲルのコア、および熱依存性高分子ゲルのシェルからなる、マイクロカプセル１２が形成される（図１の（ｆ））。このような、マイクロカプセル１２は、ゲル化により、相互の融着や結合が抑制されている。このため、イオン結合性高分子ゲルのコア８の洗浄と同じく、エーテルやアルコール等の有機溶媒による洗浄や界面活性剤を含む緩衝液による洗浄によって好適にオイル１０からマイクロカプセル１２を回収できる。
ここで、エーテルやアルコール等の有機溶媒には、イオン結合性高分子ゲルのコア８の洗浄に使用されるものと同様の有機溶媒を使用できる。また、洗浄に使用する緩衝液には、上述のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等の界面活性剤を配合しておくことが、油相を好適に除去することができるという観点から好ましい。
〔３：イオン結合性高分子のコアをゾル化する工程〕
一態様に係るマイクロカプセルの製造方法では、緩衝液１３に懸濁したマイクロカプセル１２中の、イオン結合性高分子ゲルのコア８に含まれているイオンを除去する（図１の（ｇ））。より具体的には、コア８において、イオン結合による架橋に寄与している、カルシウムイオン等のアルカリ土類金属イオンを、キレート剤１４（図１の（ｇ）では、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ））によってキレートし、シェル１７の外部に溶出する。これによって、イオン結合性高分子ゾルのコア１６と、熱依存性高分子ゲルのシェル１７とを備えた中空ハイドロゲル・マイクロカプセル１５を形成する（図１の（ｇ））。またイオン結合性高分子がアルギン酸の場合、アルギン酸リアーゼ等の酵素を用いて、アルギン酸を分解し、ゾル化してもよい。
（他のキレート剤）
またキレート剤として、ＥＤＴＡ以外にも、ＥＧＴＡ、クエン酸、シュウ酸、トランス‐１，２‐シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）など，種々のキレート剤を使用してよい。
これによって、熱依存性高分子ゲルのシェル１７の内部に、イオン結合性高分子ゾルのコア１６を有するマイクロカプセル１５を得ることができる。このようなマイクロカプセル１５は、熱依存性高分子ゲルのシェル１７によって、外部から染色体ＤＮＡなどの高分子、ウイルス、細菌、細胞等の、コア１６への侵入を防止できる。よって、予めコア１６に包埋した対象物を、外部のＤＮＡや細菌等による汚染から、防止できる。また、コア１６に包埋した対象物が、ＤＮＡ等である場合、コア１６がゾル状であるために、ゲルの場合にくらべ、シェル１７内部の全体にＤＮＡを酵素を用いて増幅できる。さらにコア１６に包埋した対象物が細胞等である場合、免疫細胞からの攻撃を防ぎ、細胞相互の接着や、シェルの材質によってはシェル内壁に接着して、より生体内に近い環境を模倣できるため、生存率や移植効率向上が期待できる。
イオン結合性高分子ゲルのコア８に、キレート剤１４に不溶性の骨格材（例えば、線維等）を含ませておけば、上記のコア８をゾル化する工程を経ることで、イオン結合性高分子ゾルと骨格材とを含んだコア１６を有するマイクロカプセル１５が得られる。このマイクロカプセル１５は、イオン結合性高分子ゾルによってコア中の内部拡散は維持しつつ、骨格材によってカプセル強度が向上している。例えば、コア８が、アルギン酸と、ＥＤＴＡ不溶性のセルロース（骨格材）とを混ぜて作製されたアルギン酸ゲルのコアの場合、 ＥＤＴＡ可溶化後（すなわちアルギン酸ゲルのゾル化後）に、アルギン酸ゾルのコア１６の内部にセルロース支持構造が残存する。また、一般にゲルの孔径は、ゲルを形成する高分子の濃度や分子量に比例するため、低濃度または高分子量、あるいは低濃度かつ高分子量のアルギン酸を用いて多孔質のコアを作製し、アガロースと混和後、エマルジョン中でゲル化させる。このアルギン酸をＥＤＴＡでゾル化させると、内部にアガロースの多孔質構造をもつ、マイクロカプセルを作製できる。
マイクロカプセル１５の粒子径やシェル厚みは、包埋対象物の大きさや、用途に応じ、選択できる。遺伝子増幅や細胞培養の場合、粒子径が、１０～５００μｍの範囲内のものが好適に用いられる。
（包埋の対象物）
包埋の対象物は、特に限定されるものではなく、熱依存性ゲルのシェル１７の網目よりも大きい物質なら、安定に保持できる。例えば、高分子ＤＮＡ、ウイルス、微生物等、の生物性の材料でもよい。また、対象物は、細胞であってもよく、細胞は生細胞でも死細胞でもよい。細胞は、一つ一つの細胞が互いに分散した状態で含まれていてもよく、複数の細胞が集合した状態（例えば、組織の一部や細胞塊等）で含まれていてもよい。細胞の由来は特に限定されず、例えば、動物；植物；酵母等の菌類；等を挙げることができる。細胞は生体由来試料や臨床検体以外にも、培養細胞でもよい。また成体幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、あるいはそれぞれの分化した細胞等でもよい。
本発明の一態様に係るマイクロカプセルの製造方法によれば、対象物に対するダメージや汚染を抑制しつつ安定に保持できる、中空ハイドロゲル・マイクロカプセルを提供することができる。
＜２．キット＞
本発明の一態様に係るキットは、本発明の一態様に係る中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの製造方法に使用されるキットである。
このキットは、必須の構成要素として、イオン結合性高分子の原料粉末（例えば、アルギン酸）、イオン結合性高分子ゲル化用の、アルカリ土類金属炭酸塩（例えば、炭酸カルシウム）、アルカリ土類金属塩溶解用の酸（例えば、酢酸）、イオン結合性高分子を分散させる上記油相の材料、上記熱依存性高分子の原料粉末（例えば、低融点アガロース等）と、熱依存性高分子のシェルを形成するために使用される上記オイルの材料、およびイオン結合性高分子ゲルをゾル化させるキレート剤と、を備えている。当該油相の材料には、界面活性剤が予め含まれていてもよい。
このキットはさらに、上述の何れかの組成物を製造するためのマニュアルを備えていてもよい。マニュアルには、例えば、上述の＜１．マイクロカプセルの製造方法＞の欄に記載された手順が記録されている。マニュアルの形態は特に限定されず、例えば紙などの媒体に印刷されたものでもよいし、記録媒体に電子的に記録されたものでもよい。
なお、一態様に係るキットは、一般に入手可能な上記イオン性高分子のゾルの原料粉末（例えば、アルギン酸）と、上記熱依存性高分子のシェルの原料粉末（例えば、低融点アガロース等）との用法、用量等をマニュアルに記載しておくことによって、上記熱依存性高分子のシェルの原料粉末と、上記イオン性高分子のゾルの原料粉末とは、別途購入可能な形態としてもよい。
一態様に係るキットを用いれば、ＤＮＡ、微生物や、細胞等の対象物を内包した中空ハイドロゲル・マイクロカプセルを提供することができる。さらに、これら対象物を内包した中空ハイドロゲル・マイクロカプセルを、環境中の汚染から防ぎつつ、マイクロマニピュレータやセルソータ等で単離できる。
また中空ハイドロゲル・マイクロカプセル内で対象物を酵素反応、培養、あるいは任意の試薬と反応させた後、これらを同様に単離し、内容物を解析に供することができる。
＜３．増幅方法＞
次に、本発明の一態様に係る反応方法について、より詳細に説明する。本実施形態に係る反応方法は、上述の＜１．マイクロカプセルの製造方法＞に記載された方法によって製造されたマイクロカプセルの内部で生物性の材料を、酵素により増幅する。なお、一態様において、マイクロカプセルは、＜２．キット＞に記載のキットを用いて製造してもよい。ここで、生物性の材料は、好ましくは、例えば、高分子ＤＮＡである。
図３に示すように、中空ハイドロゲル・マイクロカプセルは、約１００μｍ径の熱依存性高分子ゲルによるシェルを有し、当該シェルによって、別の高分子ＤＮＡ、ウイルス、細胞、微生物等から、高分子ＤＮＡを包埋する、内部の中空ゾルへの混入を防ぐ。一方、シェルを透過できる、緩衝液、マグネシウム塩、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）、反応基質（ｄＮＴＰ）、およびＲＮＡプライマーやＤＮＡプライマー等の核酸増幅に必要な資材を供給して、当該マイクロカプセル内の微細中空ゾル空間において、高分子ＤＮＡを均一に増幅できる。よって、熱依存性高分子のシェル内において、好適に増幅バイアスを抑制できる。
より具体的には、一態様に係る増幅方法は、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用い、高分子ＤＮＡを鋳型ＤＮＡ（テンプレート）として増幅させる全ゲノム増幅（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、 ＷＧＡ）であり得る。なお、全ゲノム増幅には、例えば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼセット（関東化学）およびＲＥＰＬＩ‐ｇ ウルトラファストミニキット（キアゲン）等を使用できる。
一態様に係る増幅方法では、１回目の増幅において、蛍光染色により、一菌体を含み、ＤＮＡの増幅が認められたマイクロカプセルを、蛍光セルソータやマイクロマニピュレータ等によって単離する。採取されたマイクロカプセル内のＤＮＡ量は約１ｎｇと微量なため、さらにシェルを溶解後、マイクロチューブ内で２回目の増幅を行い、次世代ＤＮＡシーケンサの解析に必要な、数μｇの増幅ＤＮＡを得てもよい。ＤＮＡシーケンサは、例えば、ＭｉＳｅｑＴＭやＨｉＳｅｑＴＭ（イルミナ）、およびＩｏｎ ＰＧＭＴＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）等の次世代ＤＮＡシーケンサであり得る。
＜４．デリバリ剤＞
本発明は、一態様において、＜１．マイクロカプセルの製造方法＞に記載の製造方法を含む、デリバリ剤の製造方法であって、包埋の対象が微生物または細胞であるデリバリ剤を製造する。微生物の場合、例えば中空ハイドロゲル・マイクロカプセル内に、乳酸菌や健常者からの腸内細胞を包埋して患者に投与し、腸内環境への定着と腸内環境の改善を図る。直接経口投与するより、マイクロカプセル内への包埋により、腸内から拡散や流出しにくく、定着率の向上が期待できる。
また中空ハイドロゲル・マイクロカプセル内に成体幹細胞などの幹細胞を包埋して患部に移植した場合、シェルによって免疫系細胞の攻撃を防ぎつつ、シェル透過性の液性因子の拡散によって、周辺組織の活性化と治癒の促進が図れる。中空であるため、細胞が相互に接着し、足場形成による生存率向上も、利点である。またカプセル径が小さく、注射や点滴により移植でき、栄養分や酸素の透過による細胞死の防止などの、利便性をもつ。特にシェルにアガロースを用いた場合、低いアガロースの生体毒性も移植に適する。
さらに再生医療において、幹細胞から分化誘導した細胞を、アガロースシェルをもつ中空ハイドロゲル・マイクロカプセルに包埋して移植することは、上述の利便性に加え、シェルが数から数十μｍと薄く、増殖後の細胞による力学的な破砕により、内部の細胞をマイクロカプセル外に放出し、最終的な生体組織へと形成することも可能である。
＜５． ハイドロゲル・マイクロカプセルのライブラリ＞
本発明の一実施形態で製造されるハイドロゲル・マイクロカプセルは、対象物を包埋している複数個のハイドロゲル・マイクロカプセルから構成されるライブラリであってもよい。包埋される対象物は、ハイドロゲル・マイクロカプセル間で異なっていてもよい。ライブラリを構成するハイドロゲル・マイクロカプセルの数は特に限定されないが、例えば、１０個～１０１０個の範囲内、又は１００個～１０９個の範囲内である。
＜６. １細胞解析＞
本発明の一実施形態で製造されたハイドロゲル・マイクロカプセルは、１細胞解析に利用することもできる。ハイドロゲル・マイクロカプセルに包埋される細胞の数を高い確率で１個に揃えることは、マイクロカプセルのコアを調製する溶液に含まれる細胞の濃度を適切に制御すること等によって実現可能である（実施例も参照のこと）。１細胞解析の種類は、特に限定されない。解析手法も、細胞が有する遺伝子の解析、タンパク質の解析、その他代謝物質の解析等、解析の対象に応じて適宜選択すればよい。
例えば、ハイドロゲル・マイクロカプセルに包埋される細胞が微生物の場合は、本発明を、有用微生物の単離と、その解析とに用いることが出来る。より具体的な一例は、本発明を、腸内環境モニタリング等に用いることである。例えば、腸内細菌叢を対象として、１微生物を包埋したハイドロゲル・マイクロカプセルのライブラリを作製する。そして、このライブラリを用いて、腸内細菌叢を構成する腸内細菌の種類や、ある種の腸内細菌の存在割合（腸内細菌叢に占める割合）等を解析することによって、腸内環境のモニタリング等を行うことが出来る。
本発明を医療分野に利用することもできる。例えば、がん診断の分野では、被検者より採取した組織試料（血液、リンパ液等の液性の試料であってもよい）に含まれる細胞個々を包埋した、ハイドロゲル・マイクロカプセルのライブラリを作製する。そして、このライブラリを用いて、がん細胞の有無や、がん細胞の存在割合、並びに、がん細胞の特性等を解析する。がん細胞は、血中循環がん細胞（ＣＴＣ）でありうる。本発明は、がんであるか否かの診断のみならず、がんである場合の治療法の選択等にも利用することができる。
また、医療分野では、本発明を、治療用の細胞の品質管理に用いることが出来る。例えば、治療用の細胞個々を包埋した、ハイドロゲル・マイクロカプセルのライブラリを作製する。そして、このライブラリを用いて、当該細胞の特性等や、良品/不良品細胞の存在割合等を解析する。治療用の細胞の一例としては、再生医療の分野における治療用の幹細胞（多能性幹細胞を含む）や、当該幹細胞から分化した細胞等が挙げられる。治療用の細胞の他の例としては、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞（治療用の幹細胞でもある）、ＣＡＲ－Ｔ細胞、遺伝子治療用の細胞（例えば、患者にて欠損している遺伝子を発現可能に導入した細胞）等の、遺伝子改変を伴う治療用の細胞が挙げられる。
また、遺伝子診断の分野では、例えば、遺伝子診断を受ける対象者から採取した細胞を包埋した、ハイドロゲル・マイクロカプセルを作製する。そして、このハイドロゲル・マイクロカプセルを用いて、当該細胞の遺伝子解析（特定の標的遺伝子でも、全ゲノム解析でもよい）を行い、遺伝子診断に用いる解析データを取得する。遺伝子診断には、遺伝子が関連する疾病等への罹病可能性の診断や、薬剤に関する感受性の診断（薬剤が効きやすいか否か、がん等の疾患治療における薬剤の選択等）等が含まれる。
本発明で得られたハイドロゲル・マイクロカプセルを用いて１細胞遺伝子解析を行う利点として、セルソータ等で１細胞を単離して解析を行う場合と比較して、遺伝子増幅を行う場合の増幅バイアスがかかりにくい点がある（実施例も参照のこと）。なお、液滴中でゲノム増幅を行う既存技術（エマルジョンＷＧＡ）は、本発明のように特定の細胞単位での解析は行えず、かつ、遺伝子増幅量が少なく全ゲノムの解析は困難である。
図５に、１細胞解析の具体的な一例を示す。この例では、被検者（例えば、がんの診断を受ける者）より採取した組織試料に含まれる細胞個々を包埋した、ハイドロゲル・マイクロカプセル（ＡＧＭ）のライブラリを作製する。次に、ライブラリを構成するＡＧＭを１個ずつマイクロウェルに格納する。次いで、ＡＧＭに包埋された細胞を、ＡＧＭ内に格納された状態で浸透圧、界面活性剤、あるいはアルカリ等により溶解する（lysis)。次いで、溶解した細胞を含むＡＧＭを、各種の解析に用いる。タンパク質のみ、又は、核酸（ＤＮＡ）のみを分離して解析する方法は公知であるから、本発明によれば、１細胞に含まれるタンパク質のみ、核酸（ＤＮＡ）のみ、或いはこれら両方を同時に解析することが出来る。なお、タンパク質や核酸を含む組成物から所望の成分を分離する方法は、電気泳動等の公知の方法を適宜採用すればよい。核酸（ＤＮＡ）は巨大分子であるのでハイドロゲル・マイクロカプセルの半透膜性のシェルを透過できないが、核酸（ＤＮＡ）より低分子であるタンパク質はハイドロゲル・マイクロカプセルのシェルを透過できる。これにより１細胞のタンパク質と核酸（ＤＮＡ）を効果的に分離しえる。タンパク質や核酸（ＤＮＡ）を解析する方法も公知の方法を採用すればよく、例えばタンパク質の場合は、二次元電気泳動法、ペプチドマス法、フィンガープリンティング法等が挙げられる。
＜７. ハイドロゲル・マイクロカプセルの製造システム＞
以下、図６を用いて、本発明の一態様に係る中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの製造システムの一例について説明する。この製造システムは、＜１．マイクロカプセルの製造方法＞に記載の製造方法を実行するものであり、マイクロカプセル製造装置１１０Ａを備えて構成される。
マイクロカプセル製造装置１１０Ａは、異なる液体を混合するマイクロ流路を備えている。マイクロ流路は、例えば、主流路と、当該主流路に交差する（直交する）２つの副流路とが、アクリル樹脂等の樹脂基板に形成されてなる。２つの副流路のうち、主流路の上流側に位置するものを第一の副流路、下流側に位置するものを第二の副流路とする。細胞を包埋したハイドロゲル・マイクロカプセルを製造する場合は、主流路の上流側から、細胞－オイルエマルジョン（図１の（ａ）～（ｃ）の工程を経て得られた、細胞を包埋したイオン結合性高分子ゲルのビーズ８とオイル５とを含むエマルジョン）を注入する。第一の副流路からは、熱依存性高分子のゾル（アガロース溶液）を注入して、細胞－オイルエマルジョンの液滴が当該ゾル中に懸濁された懸濁液とする（図１の（ｄ）に相当）。第二の副流路からは、オイル（ＰＧＯ等）を注入して、熱依存性高分子ゾルの懸濁液とオイルをエマルジョン化して、ビーズ８を内包する、熱依存性高分子ゾルの微小液滴１１を作製する（図１の（ｅ）に相当）。マイクロ流路を用いることで、より均一な微小液滴１１を容易に作製することが出来る。
マイクロ流路よりも後段には、例えば冷却装置が設けられる。得られた熱依存性高分子ゾルの微小液滴１１を、マイクロ流路の主流路下流側から回収し、冷却装置においてこれを氷冷して、熱依存性高分子ゾルをゲル化させる（図１の（ｆ）に相当）。
冷却装置よりも後段には、中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの回収装置（例えば遠心分離装置等）が設けられる。回収装置では、遠心分離等の操作によって、オイルから中空ハイドロゲル・マイクロカプセル１５を回収し、洗浄した後、緩衝液１３に懸濁する（図１の（ｇ）に相当）。
なお、マイクロカプセル製造装置１１０Ａが行う一連の操作は、コンピュータ制御を通じて自動化されていることが好ましい。
中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの製造システムは、マイクロカプセル製造装置１１０Ａの後段に、マイクロカプセル１５のピッカー（選別装置）１１０Ｂをさらに備えていてもよい。ピッカー１１０Ｂは、所望の条件を満たすマイクロカプセル１５を選別する。ピッカー１１０Ｂは、例えば、１）マイクロカプセル製造装置１１０Ａが製造した良品のマイクロカプセル１５を選別する、又は、２）解析に利用されたマイクロカプセル１５のうち所望するもの（例えば、ＷＧＡが見られたもののみ）を選別する。
ピッカー１１０Ｂは、選別したマイクロカプセル１５を、例えば、マイクロウェル等の格納容器に分注する。なお、ピッカー１１０Ｂが行う一連の操作は、コンピュータ制御を通じて自動化されていることが好ましい。制御の自動化は、無菌環境下での操作を容易とする。
＜８. 付記事項＞
本明細書において例示をした本発明の様々な態様は何れも、同一の主体によって全工程が行われてもよいが、異なる主体によって一部の工程が行われてもよい。例えば、上記の＜１．マイクロカプセルの製造方法＞において、（包埋の対象物）の調製工程(工程Ａとする）は自身で行い、当該対象物を包埋した中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの製造工程（工程Ｂとする）は、受託製造者が行い得る。受託製造者は、上記の＜７.ハイドロゲル・マイクロカプセルの製造システム＞やその原料を保有する。
対象物を包埋した中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの利用や解析の工程（工程Ｃとする）も、工程ＡやＢの実施主体とは異なる主体によって行われてもよい。工程Ｃは、例えば、上記の＜３．増幅方法＞や上記の＜６．一細胞解析＞に相当し、受託検査機関等が実施主体となりうる。増幅や解析に必要な試薬は、委託者側で調製してもよく、受託検査機関が自ら調達してもよい。
＜まとめ＞
本発明には、例えば、以下の態様が含まれている。
１) イオン結合性高分子を含むコアと熱依存性高分子を含むシェルとを備えたハイドロゲル・カプセルの製造方法であって、
少なくとも表面が上記イオン結合性高分子のゲルから形成されたコアを含む上記熱依存性高分子のゾル（水相）を油相に懸濁した懸濁液を、冷却することで上記熱依存性高分子をゲル化してシェルを形成する工程を包含し、
上記油相に含まれるオイルは、疎水性が、オクタノール／水分配係数（ＬｏｇＰｏｗ）が３以上で、かつ比重と粘度が次式を満たす、カプセルの製造方法。
Figure 0007018685000006
 上記式において、ρｐ：イオン結合性高分子ゲルと熱依存性高分子ゾルとの平均比重［ｋｇ／ｍ３］、ρｆ：オイル比重［ｋｇ／ｍ３］、ｘ：上記カプセルを製造する工程の歩留まり（収率）［％］、Ｌ：容器に収容された懸濁液の深さ［ｍ］、ｔ：熱依存性高分子のゲル化時間［ｓ］、Ｄｐ：カプセルの直径［ｍ］、ｇ：重力加速度［ｍ／ｓ２］、η：オイル粘度［Ｐａ・ｓ］、である。
２) 上記カプセルは、内部が溶液状の中空ハイドロゲル・カプセルである、１)に記載のカプセルの製造方法。または、上記カプセルは、溶液状でかつ骨格材を含んでいる多孔質構造の内部を持つ、ハイドロゲル・カプセルであってもよい。
３) 上記シェルを形成する工程の後に、上記イオン結合性高分子のゲルに含まれている、イオンを除去し、当該イオン結合性高分子のゲルをゾル化する、２）に記載のカプセルの製造方法。
４） 上記シェルを形成する工程の前に、上記イオン結合性高分子のゾルを上記油相とは別の油相に分散し、イオンを供給することによって、分散した当該イオン結合性高分子のゾルにおける少なくとも表面をゲル化する工程と、
少なくとも表面がゲル化した当該イオン結合性高分子を上記熱依存性高分子のゾルに分散する工程と、をさらに含み、
当該別の油相は、界面活性剤を含んでいる、１）～３）の何れかに記載のカプセルの製造方法。
５） 上記油相からカプセルを回収するために、上記油相の比重を水相の比重より低下させ、遠心分離する工程を含む、１）～４）の何れかに記載のカプセルの製造方法。
６） 上記熱依存性高分子は、アガロース、カラギナン、寒天、およびゼラチンからなる群より選択される少なくとも一種の可逆性ゲルを形成する熱依存性高分子である、またはコラーゲン、である、１）～５）の何れかに記載のカプセルの製造方法。
７） 上記イオン結合性高分子は、アルギン酸、多糖類、ポリアクリル酸、およびカルボキシメチルセルロースから選択される少なくとも一種の可逆性ゲルを形成するイオン結合性高分子である、１）～６）の何れかに記載のカプセルの製造方法。
８） 上記油相が、ポリグリセリン脂肪酸エステル、を含む油相である、１）～７）の何れかに記載のカプセルの製造方法。
９） 上記イオン結合性高分子のコアに対象物を包埋させる、１）～８）の何れかに記載のカプセルの製造方法。
１０） 上記対象物は、微生物、細胞、ウイルス、および高分子ＤＮＡからなる群より選択される生物性の材料である、９）に記載のカプセルの製造方法。
１１） 上記油相は、界面活性剤を含んでいる、１）～１０）の何れかに記載のカプセルの製造方法。
１２）１）～１１）の何れかに記載のカプセルを製造するためのキットであって、
上記イオン結合性高分子の材料と、
上記熱依存性高分子の材料と、
上記油相の材料と、を備えている、キット。
１３） １０）に記載のカプセルの製造方法を行なう工程の後、
上記生物性の材料を増幅させる方法であって、
当該生物性の材料は高分子ＤＮＡである、方法。
１４） １０）に記載のカプセルの製造方法を含み、
上記包埋の対象物が、細胞または微生物である、デリバリ剤の製造方法。
１５）１）～１１）の何れかに記載のカプセルを製造する製造装置。
１６）少なくとも表面が上記イオン結合性高分子のゲルから形成されたコアを含む上記熱依存性高分子のゾル（水相）を油相に懸濁した懸濁液は、マイクロ流路を用いて製造される、１）～１１）の何れかに記載のカプセルの製造方法。一形態において、マイクロ流路は、少なくとも表面が上記イオン結合性高分子のゲルから形成されたコアと、熱依存性高分子のゾルとを混合して上記水相を製造した後に、得られた水相と油相とを混合して上記懸濁液が得られるように、その流路が形成されている。
１７）１６）に記載のカプセルの製造方法に用いる製造装置又は製造システムであって、上記マイクロ流路を備えている。この製造装置又は製造システムは、上記懸濁液を冷却する冷却装置や、製造されたハイドロゲル・カプセルを回収する回収装置をさらに備えていてもよい。
＜実施例１．内部に大腸菌を包埋し、中空ハイドロゲル・マイクロカプセルの一例である、ＡＧＭの製造＞
以下の実施例において、特に明記しない場合、濃度を終濃度で示す。
最初に、大腸菌を含むアルギン酸ゲルのコアを、エマルジョン・内部ゲル化法により作製した。大腸菌ＤＨ５α株（３．０５×１０３／ｍＬ、タカラバイオ）、１％（ｗ／ｖ）の濃度でＣａＣＯ３粉末（白石工業）を含み、２％（ｗ／ｖ）の濃度でアルギン酸ナトリウム（和光純薬）を含む、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）を調製した（アルギン酸溶液）。
このアルギン酸溶液（１ｍＬ）を、３％（ｖ／ｖ）の濃度でレシチンを添加したイソステアリルアルコール（ＩＳＡ、高級アルコール工業）（９ｍＬ）と懸濁して、エマルジョン化した。これに２％（ｖ／ｖ）の濃度で酢酸を添加したＩＳＡ（１ｍＬ）を、撹拌しながら徐々に添加し、アルギン酸液滴をゲル化した。この懸濁液にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えて懸濁した後、２，０００×ｇ、３分間の遠心により上清を除いた。これを０．２％（ｗ／ｖ）の濃度でＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０を添加した５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）（５ｍＬ）に懸濁した後、１‐ブタノール（５ｍＬ）を加えて懸濁し、遠心してオイルを含む上清を除いた（ブタノール洗浄）。再度ブタノール洗浄した後、ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（５ｍＬ）に懸濁し、１００μｍメッシュのセルストレイナー（ファルコン）で濾過して、塊状のアルギン酸ゲルを除いた。さらにＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液で洗浄し、アルギン酸ゲルのコアとした。
次にアルギン酸ゲルのコアの表面上に、アガロースゲルのシェルを形成した。アルギン酸ゲルのコア（０．３ｍＬ）を、加熱溶解した２％（ｗ／ｖ）低融点アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅＴＭ アガロース、ロンザ）（１ｍＬ）に懸濁し、３５℃に保温した。これを０．２５％（ｗ／ｖ）の濃度でＳｐａｎ（登録商標） ８０を添加したＰＧＯ（日清オイリオ）（１０ｍＬ）と均一になるまで懸濁し、エマルジョン化した。これと等量のＳｐａｎ（登録商標） ８０を添加したＰＧＯを混和し、氷上で３０分間ゲル化させた。これによりＰＧＯ中に中心部にアルギン酸ゲルのコアをもち、シェルにアガロースゲルのシェルをもつ、マイクロカプセルを形成した。ＰＧＯとマイクロカプセルは、比重がほぼ同じ為、遠心分離は困難である。そこでマイクロカプセルを含んだＰＧＯにジエチルエーテル（１０ｍＬ）を混合し、油相の比重を下げた後、遠心し、油相とマイクロカプセルを分離した。油相を除いた後マイクロカプセルは、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０添加ＴＥ（１０ｍＬ）に懸濁し、２回ブタノール洗浄して、ＰＧＯを除いた。
上述の実施例における操作が、式（３）の条件を満たしていることを以下に示す。
Figure 0007018685000007
 実施例１の条件に基づく、式（３）に規定されている各パラメータの値は、以下の通りである。
［イオン結合性高分子ゲルと熱依存性高分子ゾルとの平均比重：ρＰ］
２％（ｗ／ｖ）アルギン酸ゲルと、２％（ｗ／ｖ）低融点アガロース懸濁液との平均比重は以下の通りである。
ρｐ：１，０２０ｋｇ／ｍ３（２０℃）
以下、アルギン酸ゲルと、２％（ｗ／ｖ）低融点アガロース懸濁液との懸濁液をアガロース懸濁液とも称する。
［オイル比重：ρｆ］
オイルとして使用したＰＧＯの比重は以下の通りである。
ρｆ：９９７ｋｇ／ｍ３（２０℃）
［オイル粘度：η］
上述のＰＧＯの粘度は以下の通りである。
η：０．１９６Ｐａ・ｓ（２０℃）
［懸濁液の深さ：Ｌ］
アガロース懸濁液と、Ｓｐａｎ（登録商標）８０を添加したＰＧＯとの懸濁液（以下、オイル懸濁液とも称する）の懸濁に用いた５０ｍＬコニカルチューブを垂直に立て、収容されたオイル懸濁液の液面から底部までの深さを懸濁液の深さとして求めた。
Ｌ：０．０４０ｍ
［熱依存性高分子のゲル化時間：ｔ］
ゲル化に伴う濁度変化から求められたゲル化時間（文献値）
ｔ：３，６００秒(６０分）
［マイクロカプセルの歩留：ｘ］
マイクロカプセルの歩留は、添加量に対して、得られたマイクロカプセル量（重量比）から求めた。
ｘ：８８％
なお、ＰＧＯ２０ｍＬに、ジエチルエーテルを１０ｍＬ配合して得た混合液の比重は、９０２ｋｇ／ｍ３（２０℃）であった。すなわち、オイルの比重ρｆ：９９７ｋｇ／ｍ３を、９０２ｋｇ／ｍ３まで低下させ、当該オイルの粘度ηを０．１９７Ｐａ・ｓから０．１３１Ｐａ・ｓまで低下させて、オイル懸濁液からマイクロカプセルを回収した。
［カプセルの直径：ＤＰ］
カプセルの直径は、顕微鏡観察により求めた。
ＤＰ：３９．２±９．８×１０-６ｍ
式(３）より次の式（５）が導かれ、各数値を代入するとオイル比重ρｆは以下のように求められる。
Figure 0007018685000008
 ＰＧＯの比重は９９７ｋｇ／ｍ３のため、上の式を満たすことがわかる。
［オクタノール／水分配係数］
ＣｈｅｍＤｒａｗ（ケンブリッジソフトウェア）を用いて求められたＰＧＯのオクタノール／水分配係数（ＬｏｇＰｏｗ）は、２６．３であった。
以上の通り、実施例１のマイクロカプセルの製造方法は、式（３）の要件を満たしており、オクタノール／水分配係数が、３以上という条件を満たしていることで、マイクロカプセルにおける熱依存性高分子のゲル化中における、当該マイクロカプセルの沈降凝固を防ぐことができ、マイクロカプセルを簡便に作製できることを確認できた。
最後にアルギン酸ゲルコアをゾル化し、中空ハイドロゲル・マイクロカプセルであるＡＧＭを作製した。マイクロカプセルに１／１０（ｖ／ｖ）量の０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、アルギン酸コアをゾル化した。これを３００μｍ孔径のフィルターでろ過し、大きなゲルを除いた後、１０μｍ孔径のフィルターでろ過し、小さいマイクロカプセルを除いた。さらにＴＥで洗浄し、ＡＧＭとした。
ＡＧＭを、ＤＮＡ結合性蛍光試薬であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で染色し、顕微鏡を用いて，位相差観察でＡＧＭの形状を，蛍光観察でＡＧＭ内の大腸菌を確認し、結果を図３に示した。図３において、Ａ：位相差画像および、Ｂ：蛍光画像であり、バーは１００μｍを表す。また図３に示すＡにおいて、（ａ）中空ハイドロゲル・マイクロカプセル、（ｂ）アガロースゲルのシェル、（ｃ）アルギン酸ゾルのコアであり、矢印は包埋された大腸菌を示す。このように内部に単一の大腸菌を含む、ＡＧＭを作製できた．またＡＧＭは、直径６４μｍ、コアの直径３８μｍ、容量２９ｐＬ、シェルの平均厚み１３μｍであった。
＜実施例２．ＡＧＭ内でのＷＧＡ＞
一菌体を含む中空ハイドロゲルマイクロカプセル内で、ＷＧＡを行い、菌体を包埋していないＡＧＭとの比較を行った。
最初に実施例１の大腸菌を添加したＡＧＭ（２５０μＬ）を、等量のＤ１緩衝液（キアゲン、ＲＥＰＬＩ‐ｇ ウルトラファストミニキット）と混和し、氷上で３０分間アルカリで大腸菌の溶菌とゲノムＤＮＡの変性を行った後、等量のＮ１緩衝液（同上）を添加し、氷上で３０分間、中和を行った。これを２，０００×ｇ、３分間遠心して上清を除いた後、ＴＥ緩衝液（１ｍＬ）と懸濁して、同様に遠心し、上清を除いて洗浄した。これを２回繰り返して洗浄し、アルカリ変性ＡＧＭを得た。
次にアルカリ変性ＡＧＭ（２４．４μＬ）を、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼキット（関東化学）を用い、全量５０μＬにて、３０℃、１６時間反応し、ＷＧＡを行った。１／１０（ｖ／ｖ）量の０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、反応停止した後、ＴＥ（２５０μＬ）にて、３回洗浄した。そしてＴＥ（２５μＬ）を添加して、ＷＧＡ処理ＡＧＭとした。
ＷＧＡ後ＡＧＭの形状と、内部に蓄積された増幅ＤＮＡを、実施例１と同様にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉで染色後、位相差および蛍光観察した。結果を図４に示す。図４において、Ａ：ＷＧＡ後の、大腸菌を含むＡＧＭ、Ｂ：同様にＷＧＡ後の、大腸菌を添加していないＡＧＭ、である。左側が位相差画像、右側が蛍光画像、およびバーは１００μｍを表す。大腸菌を含むＡＧＭのみ、コア全体のＤＮＡ増幅が見られた。
＜実施例３：ＡＧＭのライブラリの作製＞
内部に大腸菌を１個のみ包埋したＡＧＭを高い効率で得るため、大腸菌ＤＨ５α株の濃度が３万個／ｍＬとなるようにアルギン酸溶液を調製した点以外は、実施例１に記載の方法に従って、内部に大腸菌を包埋したＡＧＭを製造した。結果を図７に示す。図７中の（ａ）は、製造されたＡＧＭの直径（μｍ）の分布を示し、図７中の（ｂ）は、製造されたＡＧＭのコアの容量（ｐＬ）の分布を示す。図７中の（ｃ）は、バッチ当たりの、得られたＡＧＭの総数（Total)、大腸菌を包埋したＡＧＭの数（E.coli＋)、ＡＧＭの平均直径（Diameter)、ＡＧＭのコアの容量（Core）、ＡＧＭのシェルの膜厚（Shell）を示す。Single cell/E.coli＋は、大腸菌を包埋したＡＧＭのうち大腸菌を１個のみ含むＡＧＭの割合（％）である。
＜実施例４：ＡＧＭのライブラリを用いたＷＧＡ＞
実施例３に記載の方法で得られたＡＧＭのライブラリを用いて、実施例２の方法に準じてＡＧＭ内でのＷＧＡを行った。結果を図８に示す。図８の右側に、バッチ当たりの、遺伝子増幅が見られたＡＧＭの数（ＷＧＡ＋)とＡＧＭライブラリ中の割合（％）、大腸菌を包埋したＡＧＭのうち遺伝子増幅が見られた割合（％）(ＷＧＡ＋/E.coli＋)を示す。
＜実施例５：ＤＮＡ増幅バイアスの評価＞
＝プロトコール＝
（１）実施例３に記載の方法に従って、１ＡＧＭあたり１菌体となるように大腸菌を希釈して、ＡＧＭのライブラリを作製した。
（２）このＡＧＭのライブラリ(５０μｌ)を、REPLI-g UltraFastミニキット(Qiagen)を用いてＷＧＡした。具体的には、上記ライブラリと、略等量のＤ１緩衝液とを混和し、大腸菌の溶菌とゲノムＤＮＡのアルカリ変性とを行った。その後、Ｎ１緩衝液を添加して中和を行った後、反応液（REPLI-g UltraFast Reaction buffer）８２．５μｌ、酵素(REPLI-g UltraFast DNA Polymerase）１１μｌを加え、３０℃、３０分間、ＷＧＡを行った。
（３）その後、１／１０容の０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えて反応を停止し、ＴＥにて３回洗浄した。
（４）このＡＧＭのライブラリはSYBR Green Iで染色し、蛍光観察によりゲノムＤＮＡの増幅の有無を確認した。ゲノムＤＮＡが増幅されたＡＧＭを、マイクロマニピュレータを用いて回収した。
（５）ゲノムＤＮＡが増幅されたＡＧＭは，滅菌水（２９μｌ）に混和後、６０℃、５分加熱してアガロースゲルのシェルを溶解し、QIAseq FX (キアゲン)を用いて、キットのプロトコールに従って、（６）の工程で解析するシーケンスライブラリを調製した。ただし、プライマー濃度は、キットのプロトコールに記載の１／１０量にした。
（６）ＤＮＡ解析はMiSeq(イルミナ)で行い、得られたデータは、染色体全体に対するカバー率（Completeness, ％）で比較した。
なお、比較実験として、大腸菌を蛍光セルソータMoFLO(Beckman）で単離した後、REPLI-g UltraFastミニキット(Qiagen)を用いて、キットのプロトコルに従って（上記の（２）及び（３）の工程も参照）、マイクロチューブ内で大腸菌のゲノム増幅を行った。次いで、QIAseq FX (キアゲン)を用いて、キットのプロトコールに従って、解析対象とするシーケンスライブラリを調製した。ただし、プライマー濃度は、キットのプロトコールに記載の１／１０量にした。ＤＮＡ解析はMiSeq (イルミナ)で行い、得られたデータは、染色体全体に対するカバー率（Completeness, ％）で比較した。
＝結果＝
１３回（n＝１３）の試行の結果、比較実験の場合は、カバー率（Completeness）は３６．５±１７．９％であったが、本実施例の場合は、カバー率（Completeness）は９４．９±３．２％であった。本実施例の方が顕著に、大腸菌ゲノム上の領域を均一に増幅可能であることが分かる。
本発明は、例えば、全ゲノム増幅、デリバリ剤に使用するマイクロカプセルとして利用することができる。
１ 密閉性容器
２ イオン結合性高分子ゾル
３ 包埋対象物
４ イオン源
５ イオン結合性高分子ゾルの乳化用オイル
６ イオン結合性高分子ゾルの微小液滴
７ 有機酸
８ イオン結合性高分子ゲルビーズ
９ 熱依存性高分子ゾル
１０ 熱依存性高分子ゾルの乳化用オイル
１１ イオン結合性高分子ゲルビーズを内包する、熱依存性高分子ゾルの微小液滴
１２ イオン結合性高分子ゲルビーズを内包する、熱依存性高分子ゲルビーズ
１３ 緩衝液
１４ キレート剤
１５ 中空ハイドロゲル・マイクロカプセル
１６ イオン結合性高分子ゾルによる、中空コア
１７ 熱依存性高分子ゲルによる、ハイドロゲルシェル

Claims (15)

  1. イオン結合性高分子を含むコアと熱依存性高分子を含むシェルとを備えたハイドロゲル・カプセルの製造方法であって、
    少なくとも表面が上記イオン結合性高分子のゲルから形成されたコアを含む上記熱依存性高分子のゾル（水相）を油相に懸濁した懸濁液を、冷却することで上記熱依存性高分子をゲル化してシェルを形成する工程を包含し、
    上記油相に含まれるオイルは、疎水性が、オクタノール／水分配係数（ＬｏｇＰｏｗ）が３以上で、かつ比重と粘度が次式を満たす、カプセルの製造方法。
    Figure 0007018685000009
     上記式において、ρｐ：イオン結合性高分子ゲルと熱依存性高分子ゾルとの平均比重［ｋｇ／ｍ３］、ρｆ：オイル比重［ｋｇ／ｍ３］、ｘ：上記カプセルを製造する工程の歩留まり（収率）［％］、Ｌ：容器に収容された懸濁液の深さ［ｍ］、ｔ：熱依存性高分子のゲル化時間［ｓ］、Ｄｐ：カプセルの直径［ｍ］、ｇ：重力加速度［ｍ／ｓ２］、η：オイル粘度［Ｐａ・ｓ］、である。
  2. 上記カプセルは、内部が溶液状の中空ハイドロゲル・カプセルであるか、内部が溶液状でかつ骨格材を含んでいる、請求項１に記載のカプセルの製造方法。
  3. 上記シェルを形成する工程の後に、上記イオン結合性高分子のゲルに含まれている、イオンを除去し、当該イオン結合性高分子のゲルをゾル化する、請求項２に記載のカプセルの製造方法。
  4. 上記シェルを形成する工程の前に、上記イオン結合性高分子のゾルを上記油相とは別の油相に分散し、イオンを供給することによって、分散した当該イオン結合性高分子のゾルにおける少なくとも表面をゲル化する工程と、
    少なくとも表面がゲル化した当該イオン結合性高分子を上記熱依存性高分子のゾルに分散する工程と、をさらに含み、
    当該別の油相は、界面活性剤を含んでいる、請求項１～３の何れか１項に記載のカプセルの製造方法。
  5. 上記油相から熱依存性高分子がゲル化したシェルを回収するために、上記油相の比重を水相の比重より低下させ、遠心分離する工程を含む、請求項１～４の何れか１項に記載のカプセルの製造方法。
  6. 上記熱依存性高分子は、アガロース、カラギナン、寒天、およびゼラチンからなる群より選択される少なくとも一種の可逆性ゲルを形成する熱依存性高分子である、またはコラーゲン、である、請求項１～５の何れか１項に記載のカプセルの製造方法。
  7. 上記イオン結合性高分子は、アルギン酸、多糖類、ポリアクリル酸、およびカルボキシメチルセルロースから選択される少なくとも一種の可逆性ゲルを形成するイオン結合性高分子である、請求項１～６の何れか１項に記載のカプセルの製造方法。
  8. 上記油相が、ポリグリセリン脂肪酸エステル、を含む油相である、請求項１～７の何れか１項に記載のカプセルの製造方法。
  9. 上記イオン結合性高分子のコアに対象物を包埋させる、請求項１～８の何れか１項に記載のカプセルの製造方法。
  10. 上記対象物は、微生物、細胞、ウイルス、および高分子ＤＮＡからなる群より選択される生物性の材料である、請求項９に記載のカプセルの製造方法。
  11. 上記油相は、界面活性剤を含んでいる、請求項１～１０の何れか１項に記載のカプセルの製造方法。
  12. 請求項１～１１の何れか１項に記載のカプセルを製造するためのキットであって、
    上記イオン結合性高分子の材料と、
    上記熱依存性高分子の材料と、
    上記油相の材料と、を備えている、キット。
  13. 請求項１０に記載のカプセルの製造方法を行なう工程の後、
    上記生物性の材料を増幅させる方法であって、
    当該生物性の材料は高分子ＤＮＡである、方法。
  14. 請求項１０に記載のカプセルの製造方法を含み、
    上記包埋の対象物が、細胞または微生物である、デリバリ剤の製造方法。
  15. 請求項１～１１の何れか１項に記載のカプセルを製造する製造装置。
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