JP6989645B2 - ＥｒｂＢ３に特異的に結合する抗体、及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、受容体チロシンキナーゼＥｒｂＢ−３（ＥｒｂＢ３：receptor tyrosine kinase ｅｒｂＢ−３）タンパク質に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、それを製造する方法、及びその用途に関する。
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ：epidermal growth factor receptor）ファミリは、受容体チロシンキナーゼとして、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ：epidermal growth factor receptor）とも知られているＥｒｂＢ１、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ：human epidermal growth factor receptor）２とも知られているＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３とも知られているＥｒｂＢ３、及びＨＥＲ４とも知られているＥｒｂＢ４を含む。ＥｒｂＢファミリは、リガンドとの結合により、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成し、マイトゲン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰ２Ｋ、ＭＥＫ、またはＭＡＰＫＫ：mitogen-activated protein kinase kinase）／マイトゲン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ：mitogen-activated protein kinase）信号伝逹経路、またはホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ：phosphoinositide ３−kinase）／タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢまたはＡｋｔ：protein kinase Ｂ）信号伝逹経路を活性化させることができる。ＥｒｂＢファミリのタンパク質は、癌の発生、進行または予後と係わると報告されている。
ＥｒｂＢ１を阻害する薬物として、エルビタックス（登録商標）（成分名：セツキシマブ（cetuximab））またはタルセバ（登録商標）（成分名：エルロチニブ（erlotiniｂ））、及びＥｒｂＢ２を阻害する薬物として、ハーセプチン（登録商標）（成分名：トラスツズマブ（trastuzumab））またはタイケルブ（登録商標）（成分名：ラパチニブ（lapatinib））が抗癌剤として開発されて市販中である。しかし、それら抗癌剤に対する無反応患者群が多く、耐性を伴う問題がある。ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４を特異的に阻害する抗体は、まだ市販されていない。
従って、癌の遺伝的多様性と、抗癌剤の耐性を克服することができる新たな抗癌剤を開発することが必要である。
ＥｒｂＢ３に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を提供する。
ＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病予防用または疾病治療用の薬学的組成物を提供する。
個体のＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病を予防または治療する方法を提供する。
一様相は、配列番号６１ないし８５、及び１０２からなる群から選択された１以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、配列番号８６ないし１０１、及び１０３からなる群から選択された１以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、または前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域を含むＥｒｂＢ３に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を提供する。
一様相によるＥｒｂＢ３に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片及びその用途によれば、ＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病を効果的に予防または治療するのに利用することができる。
リード抗体、及びそこから変形された抗体の可変領域のアミノ酸配列及びＣＤＲを示す図面である（重鎖）。 リード抗体、及びそこから変形された抗体の可変領域のアミノ酸配列及びＣＤＲを示す図面である（軽鎖）。 抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下、ＥｒｂＢ３タンパク質とＨＲＧとの結合率（％）を示すグラフである。 抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下、ＥｒｂＢ２タンパク質とＥｒｂＢ３タンパク質との結合率（％）を示すグラフである。 抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下、ＥｒｂＢ３リン酸化の比率（％）を示すグラフである。 抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下、Ａｋｔリン酸化の比率（％）を示すグラフである。 抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下、ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞の増殖率（％）を示すグラフである。 ＢＴ４７４乳房癌異種移植モデルにおいて、抗ＥｒｂＢ３抗体の投与による腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。 ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳房癌異種移植モデルにおいて、抗ＥｒｂＢ３抗体の投与による腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。 Ａ４３１皮膚癌異種移植モデルにおいて、抗ＥｒｂＢ３抗体の投与による腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。 ＦａＤｕ頭頚部癌異種移植モデルにおいて、抗ＥｒｂＢ３抗体の投与、または抗ＥｒｂＢ３抗体とセツキシマブとの併用投与による腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。 乳房癌細胞において、パクリタキセル、ＨＲＧ及び抗ＥｒｂＢ３抗体の組み合わせ投与時、カスパーゼ３／７活性（ＲＬＵ：相対的蛍光単位）を示すグラフである。 結腸直腸癌細胞において、セツキシマブ、ＨＲＧ及び抗ＥｒｂＢ３抗体の組み合わせ投与時、癌細胞増殖率（％）を示すグラフである。 セツキシマブ耐性−異種移植モデルにおいて、セツキシマブ及び抗ＥｒｂＢ３抗体の組み合わせ投与による腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。
本願は、韓国特許庁に、２０１５年１２月７日付けで出願された韓国特許出願番号第１０−２０１５−０１７３２８１に対して優先権を主張し、そこに記載された事項は、参照として、それ全体が本明細書に導入される。
添付された図面に例示された具体的な具体例に係わる参照は、詳細になされ、図面上で同一符号で表示された構成要素は、全体として、同一構成要素を意味する。この点において、具体的な本具体例は、異なる形態を有することができ、以下で開示される記載に限定されるものであると解釈されるものではない。従って、具体的な具体例は、ただ、本明細書の様相について説明するために、図面を参照することによって、以下に記載される。以下の実施例において、用語「及び／または」は、１以上の関連した列挙事項の任意の組み合わせ、及びすべての組み合わせを含む。「少なくとも一つ」のような表現が構成要素リストの前に記載される場合、構成要素全体リストに係わるものであり、リストの個別的な構成要素に係わるものではない。
一様相は、配列番号６１ないし８５、及び１０２からなる群から選択された１以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、配列番号８６ないし１０１、及び１０３からなる群から選択された１以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域を含むＥｒｂＢ３に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を提供する。
前記重鎖（heavy chain）は、５種（γ、δ、α、μ、ε）があり、重鎖が抗体の種類を決定する。αとγは、４５０個のアミノ酸、μとεは、５５０個のアミノ酸から構成されている。該重鎖は、２つの領域、すなわち、可変領域と不変領域とがある。
前記軽鎖（light chain）は、λ、κの２種があり、およそ２１１個ないし２１７個のアミノ酸から構成されている。ヒト抗体それぞれには、いずれも同一に、１種の鎖しか存在しない。該軽鎖は、不変領域と可変領域とが連続的になっている。
前記可変領域（variable region）は、抗体において抗原が結合する領域をいう。
前記重鎖可変領域は、配列番号６１ないし６８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）−Ｈ１、配列番号６９ないし７７、及び１０２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号７８ないし８５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含んでもよい。例えば、前記重鎖可変領域は、配列番号１ないし３０からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んでもよい。用語「相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity-determining region：ＣＤＲ）」は、抗体の可変部位において、抗原との結合特異性を付与する部位をいう。
前記軽鎖可変領域は、配列番号８６ないし８７、及び１０３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８８ないし９３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号９４ないし１０１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含んでもよい。例えば、前記軽鎖可変領域は、配列番号３１ないし６０からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んでもよい。
前記抗体またはその抗原結合断片は、下記表５に記載されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域からなる群から選択された重鎖可変領域を含んでもよい。
Figure 0006989645
Figure 0006989645
例えば、前記抗体またその抗原結合断片は、配列番号６１のＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号６９のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、及び配列番号７８のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含んでもよい。
前記抗体またはその抗原結合断片は、下記表６に記載されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなる群から選択された軽鎖可変領域を含んでもよい。
Figure 0006989645
Figure 0006989645
例えば、前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８６のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号８８のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、及び配列番号９４のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
前記ＥｒｂＢ３は、ＥｒｂＢ３ポリペプチドまたはその断片でもある。前記ＥｒｂＢ３ポリペプチドは、GenBank Accession Ｎｏ．ＮＰ＿００１００５９１５のヒトアミノ酸配列、またはGenBank Accession Ｎｏ．ＮＰ＿０３４２８３のマウスアミノ酸配列を含んでもよい。前記断片は、ＥｒｂＢ３ポリペプチドの一部アミノ酸配列を含むポリペプチドでもある。前記ＥｒｂＢ３は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥＲｂＢ：epidermal growth factor receptor）ファミリに属する受容体チロシンキナーゼであり、ＨＥＲ３とも知られている。
前記ＥｒｂＢ３に特異的に結合するものは、ＥｒｂＢ３ポリペプチドまたはその断片に親和度を有するものでもある。
前記抗体またはその抗原結合断片は、ＥｒｂＢ３タンパク質と、ＥｒｂＢ３タンパク質に特異的に結合する物質との結合、ＥｒｂＢ１タンパク質とＥｒｂＢ３タンパク質との二量体形成、ＥｒｂＢ２タンパク質とＥｒｂＢ３タンパク質との二量体形成、ＥｒｂＢ３またはＡｋｔのリン酸化、またはそれらの組み合わせを阻害することができる。前記ＥｒｂＢ３タンパク質に特異的に結合する物質は、リガンドとも称され、例えば、ヘレグリン（ＨＲＧ：heregulin）である。
前記用語「抗体（antibody）」は、用語「免疫グロブリン（Ｉｇ：immunoglobulin）」と相互交換的に使用される。完全な抗体は、２個の全長（full length）軽鎖、及び２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖と、二硫化結合（ＳＳ−bond：disulfide bond）で結合する。該抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭでもある。前記抗体は、モノクローン抗体またはポリクローン抗体でもある。前記抗体は、動物由来抗体、マウス−ヒトキメリック抗体（chimeric antibody）、ヒト化抗体（humanized antibody）またはヒト抗体でもある。
前記用語「抗原結合断片（antigen-binding fragment）」は、免疫グロブリン全体構造に対するその断片であり、抗原が結合することができる部分を含むポリペプチドの一部をいう。例えば、抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ＦｖＦ（ａｂ’）２、またはそれらの組み合わせでもある。
前記抗体またはその抗原結合断片は、変形されたものでもある。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片は、接合（conjugation）または結合、糖化（glycosylation）、タグ付着、またはそれらの組み合わせによって変形されたものでもある。前記抗体は、抗癌剤のような他の薬物とも接合される。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：horseradish peroxidase）、アルカルリホスファターゼ、ヘプテン（hapten）、ビオチン、ストレプタビジン、蛍光物質、放射性物質、量子点、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethylene glycol）、ヒスチジンタグ、またはそれらの組み合わせと結合されたものでもある。前記蛍光物質は、Alexa Fluor（登録商標）５３２、Alexa Fluor（登録商標）５４６、Alexa Fluor（登録商標）５６８、Alexa Fluor（登録商標）６８０、Alexa Fluor（登録商標）７５０、Alexa Fluor（登録商標）７９０またはAlexa FluorＴＭ３５０でもある。
他の様相は前記抗体またはその抗原結合断片を含むＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病予防用または疾病治療用の薬学的組成物を提供する。
前記抗体、抗原結合断片及びＥｒｂＢ３タンパク質は、前述の通りである。
前記ＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病は、癌でもある。前記癌は、固形癌または非固形癌でもある。該固形癌は、例えば、肝臓、肺、乳房、皮膚など臓器に癌腫瘍が発生したものをいう。非固形癌は、血液内で発生した癌であり、血液癌とも呼ばれる。前記癌は、癌腫（carcinoma）、肉腫（sarcoma）、造血細胞由来の癌、胚細胞腫瘍（germ cell tumor）または母細胞種（blastoma）でもある。前記癌は、例えば、乳房癌、皮膚癌、頭頚部癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、肝臓癌、腎臓癌、透明細胞肉腫、黒色腫、脳脊髄腫瘍、脳癌、胸腺種、中皮腫、食道癌、胆道癌、睾丸癌、生殖細胞種、甲状腺癌、副甲状線癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、リンパ種、骨髄形成異常症侯群（ＭＤＳ：myelodysplastic syndromes：ＭＤＳ）、骨髄線維症（myelofibrosis）、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄種、ホジキン病（Hodgkin’s disease)、内分泌系癌及び肉腫からなる群から選択される。
前記用語「予防」は、前記薬学的組成物の投与により、ＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病を抑制したり、その発病を遅延させたりする全ての行為をいう。前記用語「治療」は、前記薬学的組成物の投与により、ＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病の症状が好転したり、好ましく変更されたりする全ての行為をいう。
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。前記担体は、賦形剤、希釈剤または補助剤を含む意味で使用される。前記担体は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルからなる群から選択されたものでもある。前記組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、風味剤、乳化剤、保存剤、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
前記薬学的組成物は、通常の方法により、任意の剤形で用意することができる。前記組成物は、例えば、経口投与剤形（例えば、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、丸薬、または顆粒）、または非経口剤形（例えば、注射剤）にも剤形化される。また、前記組成物は、全身剤形または局所剤形にも製造される。
前記薬学的組成物は、他の抗癌剤をさらに含んでもよい。前記抗癌剤は、セツキシマブ（cetuximab ）、パニツムマブ（panitumumab）、エルロチニブ（erlotinib）、ゲフィチニブ（gefitinib）、トラスツズマブ（trastuzumab）、Ｔ−ＤＭ１、 ペルツズマブ (pertuzumab)、ラパチニブ（lapatinib）、パクリタキセル(paclitaxel) 、タモキシフェン(tamoxifen)、シスプラチン(cisplatin)、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ゲムシタビン(gemcitabine)、またはそれらの組み合わせでもある。前記薬学的組成物は、単一組成物、または個別的な組成物でもある。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片の組成物は、非経口投与剤形の組成物であり、抗癌剤は、経口投与剤形の組成物でもある。
前記薬学的組成物は、前記抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせを有効量で含む。用語「有効量」は、予防または治療を必要とする個体に投与される場合、予防または治療の効果を示すのに十分な量をいう。前記有効量は、当業者が、選択される細胞または個体により、適切に選択することができる。疾患の重症度、患者の年齢・体重・健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、使用された組成物との配合、または同時使用される薬物を含んだ要素、及びその他医学分野に周知されている要素によっても決定される。前記有効量は、前記薬学的組成物当たり、約０．５μｇないし約２ｇ、約１μｇないし約１ｇ、約１０μｇないし約５００ｍｇ、約１００μｇないし約１００ｍｇ、または約１ｍｇないし約５０ｍｇでもある。
前記薬学的組成物の投与量は、例えば、大人基準で、約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１ｍｇ／ｋｇの範囲内でもある。前記投与は、１日１回、１日多回、または１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回から１年に１回投与される。
他の様相は、前記抗体またはその抗原結合断片を個体に投与する段階を含む個体のＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病を予防または治療する方法を提供する。
前記抗体、抗原結合断片、ＥｒｂＢ３タンパク質、ＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病、予防及び治療は、前述の通りである。
前記個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、牛、馬、豚、犬、羊、山羊または猫でもある。前記個体は、ＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病、例えば、癌を病んでいるか、あるいは病む可能性が大きい個体でもある。
前記方法は、前記個体に抗癌剤を投与する段階をさらに含んでもよい。前記抗癌剤は、前記抗体またはその抗原結合断片と同時、個別または順にも投与される。
前記抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせは、例えば、経口、静脈内、筋肉内、経皮（transdermal）、粘膜、鼻内（intranasal）、器官内（intratracheal）、または皮下投与のような任意の手段により、個体に直接的に投与される。前記抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせは、全身的にまたは局所的にも投与され、単独でまたは他の薬学的活性化合物と共にも投与される。
前記抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせの望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択される。前記投与量は、例えば、大人基準で、約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１ｍｇ／ｋｇの範囲内でもある。前記投与は、１日１回、１日多回、または１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回から１年に１回投与される。
以下、実施例を介して、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
実施例１．抗ＥｒｂＢ３抗体の準備
１．リード（lead）抗体の選別
ヒト抗ＥｒｂＢ３抗体を得るために、ヒト合成ｓｃＦｖ−ファージライブラリー（梨花女子大学の沈ヒョンボ教授提供）をＥｒｂＢ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ systems）に対してスクリーニングし、ＥｒｂＢ３に結合するｓｃＦｖ断片を露出させるパージを得た。
得られたパージのｓｃＦｖ断片をコーディングする核酸配列を分析し、そこからアミノ酸配列を分析し、ＥｒｂＢ３に結合するｓｃＦｖ断片において、ＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列を確認した。ＥｒｂＢ３に結合するｓｃＦｖ配列を確保した後、ＩｇＧ１で発現させるSelexis０８５ベクター（Selexis）を使用し、ＶＨ部位及びＶＬ部位を再構成し、全体抗体遺伝子を作製した。再構成されたＩｇＧ１をコーディングする発現ベクターを、ＣＨＯ細胞株に形質転換させ、小規模で発現させた。発現された抗ＥｒｂＢ３抗体に対して、ＥｒｂＢ３に対する結合力及び細胞基盤の分析を行い、ヘレグリン（ＨＲＧ：heregulin）依存的ＥｒｂＢ３信号の伝達を抑制する抗ＥｒｂＢ３リード抗体４４２Ｐ，４７２Ｐ及び４５１Ｐを選別した。
２．リード抗体から変形された抗体の選別
無作為突然変異生成法を利用し、１．で選別された抗ＥｒｂＢ３リード抗体４４２Ｐ，４７２Ｐ及び４５１Ｐの６個のＣＤＲ部位に、突然変異を導入したＦａｂ−ファージライブラリーを作製した。Ｆａｂ−ファージライブロは、プライマーをIntegrated ＤＮＡ Technologies，Ｉｎｃ．に依頼して作製し、Phusion Polymerase（New England Biolabs）を使用してＰＣＲ方法で増幅した。
作製されたＦａｂ−ファージライブラリーを、組み換えヒトＥｒｂＢ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ systems）に対してスクリーニングし、組み換えヒトＥｒｂＢ３に係わる結合親和力が、リード抗体に比べて上昇した抗体を選別した。選別された抗体を、１．に記載されたように、ＩｇＧに転換させ、ＣＨＯ細胞株に形質転換させ、小規模に発現させた。
Octet（登録商標）ＱＫ３８４システム（Pall Life Sciences）を使用し、抗ＥｒｂＢ３抗体に対する結合力を測定した。測定された結果から、ＥｒｂＢ３結合力がリード抗体に比べて向上した抗体を選別し、細胞基盤分析を介して、効能を検証した。抗ＥｒｂＢ３リード抗体と、そこから変形された抗体との可変領域アミノ酸配列を分析し、Kabat定義により、相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）を決定した。選別された抗体において、重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号１ないし６０）を、図１Ａ及び図１Ｂに示し、重鎖及び軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列を、それぞれ表１及び表２に示した。
Figure 0006989645
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実施例２．抗ＥｒｂＢ３抗体の試験管内効果
１．抗ＥｒｂＢ３抗体のヒトＥｒｂＢ３タンパク質に対する結合力
実施例１．２．で選別された抗体の抗原であるＥｒｂＢ３タンパク質に対する結合力を測定した。
具体的には、組み換えヒトＥｒｂＢ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ systems）に対して、抗ＥｒｂＢ３抗体の結合親和性及び相互作用動力学を、Octet（登録商標）ＱＫ３８４システム（Pall Life Sciences）を使用して測定した。ＡＲ２Ｇセンサ（ForteBio）を、２０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、及び４０ｍＭのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）溶液で、カルボン酸基を活性化させた後、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）（ForteBio）で希釈した１０μｇ／ｍｌのヒトＥｒｂＢ３タンパク質溶液を加え、ＡＲ２Ｇセンサに、ヒトＥｒｂＢ３タンパク質を固定させた。ヒトＥｒｂＢ３タンパク質が固定されたＡＲ２Ｇセンサに、１Ｍのエタノールアミン（ForteBio）を処理し、未反応残余カルボン酸基を不活性化させた。前記ＡＲ２Ｇセンサに、それぞれ１２．５，２５，５０ｎＭの抗体溶液を加え、約９００秒まで反応物の結合相を観察した。その後、１ｘ kinetics buffer（ForteBio）を反応物に加えた後、約１，２００秒間反応物の分離相を観察した。Octet（登録商標）分析ソフトウェア（Pall Life Sciences）を使用し、各抗体に係わる吸着率定数（ｋａ：association constant）、分離率定数（ｋｄ：dissociation constant）及び平衡分離定数（ＫＤ：equilibrium dissociation constant）を決定した。
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 表３に示されているように、選別された抗体は、約０．１ｎＭないし約０．１ｐＭのＫＤ値を有するので、選別された抗体が、ヒトＥｒｂＢ３タンパク質に対して高い結合力を有するということを確認した。
２．抗ＥｒｂＢ３抗体によるＥｒｂＢ３タンパク質とＨＲＧとの結合阻害能
実施例１．２．で選別された抗体が、ＥｒｂＢ３タンパク質と、そのリガンドであるＨＲＧとの結合を阻害することができるか否かということを確認した。
具体的には、ヒトＥｒｂＢ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ systems）に対するＨＲＧの結合率を、Octet（登録商標）ＱＫ３８４システム（Pall Life Sciences）を使用して測定した。実施例２．１．に記載されたような方法で、ＡＲ２Ｇセンサに、１０μｇ／ｍｌのＨＲＧタンパク質を固定させ、１Ｍのエタノールアミン（ForteBio）を使用し、未反応残余カルボン酸基を不活性化させた。その後、５μｇ／ｍｌのヒトＥｒｂＢ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ systems）と、１０ｎＭまたは１００ｎＭの抗ＥｒｂＢ３抗体混合液を、前記ＨＲＧタンパク質が固定されたＡＲ２Ｇセンサに加え、９００秒まで結合相を観察した。陰性対照群として、抗ＥｒｂＢ３抗体を加えていない反応物を利用した。前記ＨＲＧタンパク質が固定されたＡＲ２Ｇセンサに結合して残っているヒトＥｒｂＢ３タンパク質を測定した。陰性対照群に対比し、抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下、ＥｒｂＢ３タンパク質とＨＲＧとの結合率（％）を算出し、その結果を図２に示した（ｙ軸：陰性対照群対比の結合率（％）、ｘ軸：０ｎＭの抗体、１０ｎＭの抗体、１００ｎＭの抗体）。
図２に示されているように、選別された抗体は、濃度依存的に、ヒトＥｒｂＢ３タンパク質とＨＲＧタンパク質との結合を阻害する一方、ｈＩｇＧ対照群は、ＥｒｂＢ３とＨＲＧとの結合に影響を及ぼさないということを確認した。
３．抗ＥｒｂＢ３抗体によるＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３二量体形成阻害能
実施例１．２．で選別された抗体が、ＥｒｂＢ２タンパク質とＥｒｂＢ３タンパク質との二量体形成を阻害することができるか否かということを確認した。
具体的には、マルチアレイ９６ウェルプレート（Thermo scientific）に、１００μｌの１μｇ／ｍｌ組み換えヒトＥｒｂＢ２タンパク質を加え、約４℃で約１６時間インキュベーションし、ＥｒｂＢ２タンパク質をコーティングした。コーティングされたプレートに、２００μｌの５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を加え、約１時間約３７℃でインキュベーションした。５０μｌの０．６μｇ／ｍｌ組み換えヒトＥｒｂＢ３タンパク質と、５０μｌの０．２μｇ／ｍｌ選別された抗ＥｒｂＢ３抗体と、を混合した反応物を、前記プレートに加え、約２時間３７℃でインキュベーションした。前記プレートを、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイン／ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。洗浄されたプレートに、１００μｌの１μｇ／ｍｌ塩素−抗ＥｒｂＢ３ポリクローン抗体（Ｒ＆Ｄ systems）を加え、約１時間３７℃でインキュベーションした。前記プレートを、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイン／ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に、１：５，０００で希釈させた抗塩素Ｆｃ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：horseradish peroxidase）（Jackson Immunoresearch）１００μｌを、前記プレートで約１時間３７℃でインキュベーションした。前記プレートを０．０５％（ｖ／ｖ）ツイン／ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。１００μｌの３，３’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＧ：tetramethylbenzidine）基質を各ウェルに加え、約５分間常温でインキュベーションし、１００μｌの２Ｎ硫酸溶液で反応を中断させた。陰性対照群として、抗ＥｒｂＢ３抗体を加えていない反応物を利用した。前記プレートに対して、波長４５０ｎｍで、蛍光強度を測定した。測定された蛍光強度から、抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下、ＥｒｂＢ２タンパク質とＥｒｂＢ３タンパク質との結合の比率を算出した。ヒトＩｇＧは、ＥｒｂＢ３に結合しない陰性対照群として使用された。
陰性対照群対比で、抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下、ＥｒｂＢ２タンパク質とＥｒｂＢ３タンパク質との結合率（％）を算出し、その結果を図３に示した（ｙ軸：陰性対照群対比の結合率（％）、ｈＩｇＧ：ヒトＩｇＧ）。
図３に示されているように、選別された抗体は、ＥｒｂＢ２タンパク質とＥｒｂＢ３タンパク質との二量体形成を阻害する一方、ｈＩｇＧ対照群は、二量体形成阻害能がないということを確認した。
４．抗ＥｒｂＢ３抗体によるＥｒｂＢ３リン酸化及びＡｋｔリン酸化の阻害能
実施例１．２．で選別された抗体が、ＥｒｂＢ３タンパク質とＡｋｔとのリン酸化を阻害することができるか否かということを確認した。
具体的には、約５ｘ１０５個のＭＣＦ７乳房癌細胞（National Institutes of Health）を２４ウェルプレートに接種し、細胞に、ペニシリン−ストレプトマイシン抗生物質（Invitrogen）と、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Invitrogen）とを加え、３７℃及び５％ ＣＯ２の条件下、約２４時間培養した。その後、該培地を、新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地に交換し、前記細胞を血清欠乏状態（serum starving）で２４時間培養した。その後、前記細胞に、選別された抗ＥｒｂＢ３抗体を加え、３７℃及び５％ ＣＯ２の条件下、約２時間インキュベーションした。このとき、４４２Ｐ抗体と４７２Ｐ抗体は、細胞に、６７ｎＭ、１３ｎＭ、３ｎＭ、５３４ｐＭ、１０７ｐＭ、２１ｐＭ及び４ｐＭの濃度で加え、４４２Ｓ１抗体、４４２Ｓ５抗体、４４２Ｍ６抗体、４７２Ｓ２抗体、及び４７２Ｍ１抗体は、細胞に、１３ｎＭ、３ｎＭ、８３４ｐＭ、２０８ｐＭ、５２ｐＭ及び１３ｐＭの濃度で加えた。１時間４５分後、細胞にＨＲＧを加え、約１５分間３７℃及び５％ ＣＯ２の条件下でインキュベーションし、細胞を刺激した（抗体を処理した総時間：２時間）。細胞に、冷却したＰＢＳを加えて洗浄した後、細胞に、細胞溶解液（Cell Signaling Technology）を加えて細胞を収集した。収集された細胞のタンパク質を、ＢＣＡ定量法で定量した後、ＥｒｂＢ３またはＡｋｔのリン酸化レベルを分析した。
ＥｒｂＢ３のリン酸化レベルを分析するために、ホスホＥｒｂＢ３検出キット（Cell Signaling Technology）を使用し、細胞タンパク質を、ＥｒｂＢ３抗体がコーティングされたＥＬＩＳＡ平板に結合させた後、ＥｒｂＢ３特異的な捕獲抗体と、マウスＨＲＰが接合された抗ホスホ−チロシン検出抗体と、をＥＬＩＳＡ平板に展開させた。その後、反応物にＴＭＢ基質を加え、前記キットの反応終了、溶液で反応を中止させた後、プレートリーダで蛍光強度を測定した。
Ａｋｔ１リン酸化レベルを分析するために、ホスホＡｋｔ１検出キット（Cell Signaling Technology）を使用し、抗ホスホセリンがコーティングされたＥＬＩＳＡ平板に、細胞タンパク質を結合させた後、Ａｋｔ１特異的な捕獲抗体と、ＨＲＰに接合された検出抗体とをＥＬＩＳＡ平板状に展開させた。その後、ＴＭＢ基質と反応させた後、キット内反応終了溶液で反応を中止させ、プレートリーダで値を測定した。
測定された蛍光強度から、抗体濃度によるＥｒｂＢ３リン酸化及びＡｋｔリン酸化の比率を示すグラフを、それぞれ図４Ａ及び図４Ｂに示した。また、抗体の５０％阻害濃度（ＩＣ５０：half maximal inhibitory concentration）を算出し、その結果を表４に示した。
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 図４Ａ、図４Ｂ及び表４に示されているように、選別された抗体は、ＥｒｂＢ３リン酸化及びＡｋｔリン酸化を阻害するということを確認した。
同時に、乳房癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及び乳房癌細胞株ＢＴ４７４、皮膚癌細胞株Ａ４３１、膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ３、頭頚部癌細胞株ＦａＤｕ、肺癌細胞株Ａ５４９、大腸癌細胞株ＬｏＶｏ、黒色腫細胞株ＭＡＬＭＥ−３Ｍ、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−８及び前立腺癌細胞株ＤＵ１４５においても、類似して、選別された抗体が、ＥｒｂＢ３リン酸化及びＡｋｔリン酸化を阻害するということを確認した。
５．抗ＥｒｂＢ３抗体による膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ３の増殖阻害能
実施例１．２．で選別された抗体が、ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞の増殖を阻害することができるか否かということを確認した。
具体的には、約１ｘ１０４個のＢｘＰＣ３膵臓癌細胞（American Type Culture Collection）を９６ウェルプレートに接種し、接種された細胞に、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Invitrogen）を加え、３７℃及び５％ ＣＯ２の条件下で約２４時間培養した。その後、０．１％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に交換した。培養された細胞に、０．０２μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌの４４２Ｓ１抗体または４４２Ｍ６抗体を加え、３７℃及び５％ ＣＯ２の条件下で約２時間培養した。培養された細胞に、５０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧをさらに加え、３７℃及び５％ ＣＯ２の条件下で約１２０時間培養した。陰性対照群として、抗体を含まずに培養した細胞を利用した。Celltiter−Ｇｌｏ発光細胞生存能分析法（Promega）で細胞数を測定した。測定された結果から、細胞増殖率を算出し、その結果を図５に示した。
図５に示されているように、選別された抗体は、ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞の増殖を濃度依存的に阻害するということを確認した。
実施例３．抗ＥｒｂＢ３抗体の生体内効果
１．ＢＴ４７４乳房癌異種移植モデルを利用した腫瘍成長阻害
実施例１．２．で選別された抗体が、乳房癌細胞を移植した動物モデルにおいて、腫瘍成長を阻害することができるか否かということを確認した。
具体的には、ヒト乳房癌ＢＴ４７４細胞（American Type Culture Collection）を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Hyclone）で培養した。癌細胞接種１日前、メスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ＨＦＫ Bio−Technology Ｃｏ．Ｌｔｄ．）の皮下に、持続放出１７β−エストラジオールペレット（０．３６ｍｇ／６０日、Innovative Research of America）を移植し、血中エストロゲンレベルを維持させた。約１ｘ１０７個のＢＴ４７４癌細胞を、５０％マトリゲルを含む１００μｌのＰＢＳに懸濁させ、懸濁された癌細胞を、マウスの乳頭下部脂肪組職に接種した（接種０日）。週当たり２回ずつマウス重量を測定し、「0.5a×b2」の式を用いて腫瘍容積を計算した。ここで、aおよびbはそれぞれ腫瘍の長径および短径であった。癌細胞接種７日後、腫瘍体積が約２１０ｍｍ３に逹したとき、マウスを、群当たり１０匹ずつ７群から無作為抽出した。群当たり、ＰＢＳ（陰性対照群）、４４２Ｐ抗体、４４２Ｓ１抗体、４４２Ｓ５抗体、４４２Ｍ６抗体、４７２Ｓ２抗体及び４７２Ｍ１抗体を、それぞれマウスの尾静脈に、週２回、１０ｍｇ／体重ｋｇの用量で４週間投与した。癌細胞接種後、抗体投与による腫瘍体積を算出し、その結果を図６に示した。
図６に示されているように、陰性対照群に比べ、抗体投与により、腫瘍の体積が低減し、選別された抗体が、腫瘍成長を阻害するということを確認した。
２．ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳房癌異種移植モデルを利用した腫瘍成長阻害
ヒト乳房癌ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（American Type Culture Collection）を、１０％ウシ胎児血清を含むＬ１５培地（Hyclone）で培養した。約５ｘ１０６個の癌細胞を、５０％マトリゲルを含む１００μｌのＰＢＳに懸濁させ、メスＮｕ／Ｎｕマウス（Vital River laboratories．Ｌｔｄ）の脇腹皮下に接種した。週当たり２回ずつマウス重量を測定し、「0.5a×b2」の式を用いて腫瘍容積を計算した。ここで、aおよびbはそれぞれ腫瘍の長径および短径であった。癌細胞接種７日後、腫瘍体積が約２１０ｍｍ３に逹したとき、マウスを、群当たり１０匹ずつ７群から無作為抽出した。群当たり、ＰＢＳ（陰性対照群）、４４２Ｐ抗体、４４２Ｓ１抗体、４４２Ｓ５抗体、４４２Ｍ６抗体、４７２Ｓ２抗体及び４７２Ｍ１抗体を、マウスの尾静脈に、週２回、１０ｍｇ／体重ｋｇの用量で７週間投与した。癌細胞接種後、抗体投与による腫瘍体積を算出し、その結果を図７に示した。
図７に示されているように、陰性対照群に比べ、抗体の投与により、腫瘍の体積が低減し、選別された抗体が、腫瘍成長を阻害するということを確認した。
３．Ａ４３１皮膚癌異種移植モデルを利用した腫瘍成長阻害
ヒト皮膚癌Ａ４３１細胞（American Type Culture Collection）を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Hyclone）で培養した。約５ｘ１０６個の癌細胞を、５０％マトリゲルを含む１００μｌのＰＢＳに懸濁させ、メスＢａｌｂ／ｃ nudeマウス（ＨＦＫ Bio−Technology Ｃｏ．Ｌｔｄ．）の脇腹皮下に接種した。週当たり２回ずつマウス重量を測定し、「0.5a×b2」の式を用いて腫瘍容積を計算した。ここで、aおよびbはそれぞれ腫瘍の長径および短径であった。癌細胞接種７日後、腫瘍体積が約１６０ｍｍ３に逹したとき、マウスを、群当たり１０匹ずつ７群から無作為抽出した。群当たり、ＰＢＳ（陰性対照群）、４４２Ｐ抗体、４４２Ｓ１抗体、４４２Ｓ５抗体、４４２Ｍ６抗体、４７２Ｓ２抗体及び４７２Ｍ１抗体を、マウスの尾静脈に、週２回、１０ｍｇ／体重ｋｇの用量で４週間投与した。癌細胞接種後、抗体投与による腫瘍体積を算出し、その結果を図８に示した。
図８に示されているように、陰性対照群に比べ、抗体の投与により、腫瘍の体積が低減し、選別された抗体が腫瘍成長を阻害するということを確認した。
４．腫瘍異種移植モデルを利用した腫瘍成長阻害
実施例３．１．ないし３．３に記載されたように、４４２Ｓ１抗体を、ＦａＤｕ頭頚部癌、膵臓癌または肺癌の動物モデルに投与した場合、及び４４２Ｐ抗体または４７２Ｐ抗体を、胃癌動物モデルに投与した場合においても、陰性対照群に比べ、抗体の投与により、腫瘍の体積が低減し、選別された抗体が腫瘍成長を阻害するということを確認した。
実施例４．抗癌剤と抗ＥｒｂＢ３抗体との併用投与効果
ＦａＤｕ頭頚部癌モデルを利用した、４４２Ｓ１抗体とセツキシマブ（Erbitux）とを併用投与した場合、抗癌効能が向上するか否かということを確認した。
ヒト頭頚部癌ＦａＤｕ細胞（Shanghai Institutes for Biological Sciences）を、１０％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ培地（Hyclone）で培養した。約５ｘ１０６個の癌細胞を、５０％マトリゲルを含む１００μｌのＰＢＳに懸濁させ、メスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ＨＦＫ Bio−Technology Ｃｏ．Ｌｔｄ）の脇腹皮下に接種した。週当たり２回ずつマウス重量を測定し、「0.5a×b2」の式を用いて腫瘍容積を計算した。ここで、aおよびbはそれぞれ腫瘍の長径および短径であった。癌細胞接種７日後、腫瘍体積が約１５０ｍｍ３に逹したとき、マウスを、群当たり１０匹ずつ無作為抽出した。群当たり、ＰＢＳ（陰性対照群）または４４２Ｓ１抗体を、マウスの尾静脈に、週２回、５ｍｇ／体重ｋｇの用量で４週間投与した。併用処理群は、４４２Ｓ１抗体とセツキシマブ（Merck）をマウスの尾静脈に、週２回、それぞれ５ｍｇ／体重ｋｇの用量で、４週間投与した。その後、１週間は、抗体投与なしに、週２回ずつ腫瘍の大きさを測定した。抗体または併用投与による腫瘍体積を算出し、その結果を図９に示した（矢印（↓）：投与時点、＊＊＊：一元分散分析後、Tukey多重比較結果Ｐ＜０．００１）。
図９に示されているように、４４２Ｓ１抗体とセツキシマブとの併用投与群は、投与初期から腫瘍体積が低減し、試験終了時、平均腫瘍体積が約６８ｍｍ３測定された（ｎ＝１０／群）。従って、選別された抗体とセツキシマブとの併用投与により、抗癌効能が上昇するということを確認した。
実施例５．抗ＥｒｂＢ３抗体による抗癌剤抵抗性克服効果
１．乳房癌でのパクリタキセル抵抗性克服効果
乳房癌細胞株ＺＲ−７５−３０は、パクリタキセルによる細胞死滅効果が、ＨＲＧ存在時、ＥｒｂＢ３信号伝達経路の活性化によって低下する（Wang S et al., Oncogene, 29, 4225-4236, 2010）。選別された抗体が、抗癌剤であるパクリタキセルの抵抗性を克服し、さらに抗癌効果が示されるか否かということを確認した。
約１ｘ１０４個のＺＲ−７５−３０細胞（American Type Culture Collection）をプレートに接種し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Invitrogen）で、３７℃及び５％ ＣＯ２の条件下で約２４時間培養した。その後、０．１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含む新鮮な培地（１００ｎｇ／ｍｌＨＲＧ添加）に交換し、３７℃及び５％ ＣＯ２の条件下で約２４時間培養した。培養された細胞に、１０ｎＭのパクリタキセル（Bristol−Myers Squibb）と、２５μｇ／ｍｌの４４２Ｓ１抗体とを加え、３７℃及び５％ ＣＯ２の条件下で約７２時間培養した。その後、培養された細胞を得て、細胞自殺のマーカーであるカスパーゼ３／７活性を、Caspase３／７ substrate assay（Promega）を使用して測定した。測定されたカスパーゼ３／７活性を図１０に示した（ＲＬＵ：相対的蛍光単位（relative luminescence units）、＊＊：ｔ−test結果Ｐ＜０．０１）。
図１０に示されているように、パクリタキセルによるカスパーゼ３／７活性が、ＨＲＧ存在下で低下したが、パクリタキセル及び４４２Ｓ１抗体を共に処理した場合、パクリタキセル単独処理より、カスパーゼ３／７活性がさらに上昇した（ｎ＝３）。従って、パクリタキセルによる細胞死滅効果は、ＨＲＧ存在時に低下するが、４４２Ｓ１抗体の投与により、さらに回復するということを確認した。
２．結腸直腸癌におけるセツキシマブ抵抗性克服効果
結腸直腸癌細胞であるＤｉＦｉにおいて、セツキシマブは、癌細胞増殖抑制効能を有するが、ＨＲＧ存在時には、ＥｒｂＢ３信号伝逹経路が活性化され、その効能を示すことができなくなる。選別された抗体が、セツキシマブに対する抵抗性を復旧し、さらに癌細胞増殖抑制能を示すか否かということを確認した。
具体的には、ＤｉＦｉ大腸癌細胞（American Type Culture Collection）を、抗生物質（Penicillin−Streptomycin，gibco）と、１０％ウシ胎児血清とを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Invitrogen）で培養した。１ｘ１０４個のＤｉＦｉを９６ウェルプレートに接種し、３７℃及び５％ ＣＯ２の条件下で約２４時間培養した。セツキシマブと抗ＥｒｂＢ３抗体は、２００μｇ／ｍｌで同量混合させた後、セツキシマブ／抗ＥｒｂＢ３抗体溶液を、４０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧと同量混合させた。９６ウェルプレートに、セツキシマブ／抗ＥｒｂＢ３抗体／ＨＲＧ溶液を入れ、３７℃及び５％ ＣＯ２の条件下で約７２時間培養した。陰性対照群としては、抗体及びＨＲＧを含まずに培養した細胞を利用した。Celltiter−Ｇｌｏ発光細胞生存能分析法（Promega）で、細胞数を測定した。測定された結果から、細胞の増殖率を算出し、その結果を図１１に示した（＊＊＊：ｔ−test結果Ｐ＜０．００１）。
図１１に示されているように、セツキシマブによる細胞増殖抑制能が、ＨＲＧ存在下で低下するが、セツキシマブと４４２Ｓ１抗体とを共に処理した場合、さらに癌細胞増殖が抑制された。従って、セツキシマブによる細胞増殖抑制能は、ＥｒｂＢ３リガンドであるＨＲＧの存在時に低下するが、４４２Ｓ１抗体によるＨＲＧ−ＥｒｂＢ３ pathway抑制により、さらにその効能が復旧されるということを確認した。
３．セツキシマブ耐性異種移植モデルにおけるセツキシマブ抵抗性克服効果
ヒト頭頚部癌ＦａＤｕ細胞（Shanghai Institutes of Biological Sciences）を、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen）、０．０１ｍＭ ＮＥＡＡ（non-essential amino acid，Hyclone）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Invitrogen）を含むＥＭＥＭ培地（Hyclone）で培養した。約５ｘ１０６個の癌細胞を１００μｌのＰＢＳに懸濁させ、メスＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（ＨＦＫ Bio−Technology Ｃｏ．Ｌｔｄ．）の脇腹皮下に接種した。週当たり２回ずつマウス重量を測定し、「0.5a×b2」の式を用いて腫瘍容積を計算した。ここで、aおよびbはそれぞれ腫瘍の長径および短径であった。癌細胞接種８日後、腫瘍体積が約１３８ｍｍ３に逹したとき、マウスを無作為抽出し、ＰＢＳ（陰性対照群）またはセツキシマブをマウスの尾静脈に週２回、５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。セツキシマブの腫瘍成長抑制能が維持されず、腫瘍がさらに大きくなり始め、腫瘍体積がおよそ８４０ｍｍ３に逹したとき、マウスを、さらに群当たり１０匹ずつ無作為抽出し、群当たりセツキシマブ５ｍｇ／ｋｇ、またはセツキシマブ５ｍｇ／ｋｇと４４２Ｓ１２０ｍｇ／ｋｇとを併用で週２回ずつ４週投与し、週２回ずつ腫瘍体積を算出し、その結果を図１２に示した。
図１２を参照すれば、続けてセツキシマブを投与した群に比べ、４４２Ｓ１とセツキシマブとを併用で投与した群においては、確実な腫瘍縮小効能が観察され、４４２Ｓ１抗体が、セツキシマブに対する耐性を克服し、腫瘍成長を抑制することができるということが確認された。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．配列番号６１ないし８５からなる群から選択された１以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
配列番号８６ないし１０１からなる群から選択された１以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
または前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域を含む、ＥｒｂＢ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
２．前記重鎖可変領域は、
配列番号６１ないし６８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）−Ｈ１と、
配列番号６９ないし７７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
配列番号７８ないし８５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含むことを特徴とする上記１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
３．前記重鎖可変領域は、配列番号１ないし３０からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする上記２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
４．前記軽鎖可変領域は、
配列番号８６ないし８７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
配列番号８８ないし９３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
配列番号９４ないし１０１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含むことを特徴とする上記１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
５．前記軽鎖可変領域は、配列番号３１ないし６０からなる群から選択されたアミノ酸配列をさらに含むことを特徴とする上記４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
６．前記重鎖可変領域は、以下の表に記載されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域−Ｈ１（ＣＤＲ−Ｈ１）、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群から選択されたいずれかを含むことを特徴とする上記１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
Figure 0006989645
Figure 0006989645
。
７．前記軽鎖可変領域は、以下の表に記載されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域−Ｌ１（ＣＤＲ−Ｌ１）、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群から選択されたいずれかを含むことを特徴とする上記１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
Figure 0006989645
Figure 0006989645
。
８．前記抗体またはその抗原結合断片は、ＥｒｂＢ３タンパク質と、それに特異的に結合する物質との結合、ＥｒｂＢ１タンパク質とＥｒｂＢ３タンパク質の二量体形成、ＥｒｂＢ２タンパク質とＥｒｂＢ３タンパク質との二量体形成、ＥｒｂＢ３またはＡｋｔのリン酸化、またはそれらの組み合わせを阻害することを特徴とする上記１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
９．前記ＥｒｂＢ３タンパク質に特異的に結合する物質は、ヘレグリン（ＨＲＧ）であることを特徴とする上記８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
１０．前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭであるか、
前記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であるか、
前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ） ２ 、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） ２ 、またはそれらの組み合わせであるか、あるいは
前記抗体またはその抗原結合断片は、接合、結合、糖化、タグ付着、またはそれらの組み合わせによって修飾されたものであることを特徴とする上記１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
１１．上記１ないし１０のうちいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、ＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病予防用または疾病治療用の薬学的組成物。
１２．前記ＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病は、癌であることを特徴とする上記１１に記載の薬学的組成物。
１３．前記癌は、乳房癌、皮膚癌、頭頚部癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、肝臓癌、腎臓癌、透明細胞肉腫、黒色腫、脳脊髄腫瘍、脳癌、胸腺種、中皮腫、食道癌、胆道癌、睾丸癌、生殖細胞種、甲状腺癌、副甲状線癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、リンパ種、骨髄形成異常症侯群（ＭＤＳ）、骨髄線維症、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄種、ホジキン病、内分泌系癌及び肉腫からなる群から選択されたことを特徴とする上記１２に記載の薬学的組成物。
１４．抗癌剤をさらに含むことを特徴とする上記１１に記載の薬学的組成物。
１５．前記抗癌剤は、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、トラストズマブ、Ｔ−ＤＭ１、ペルツズマブ、ラパチニブ、パクリタキセル、タモキシフェン、シスプラチン、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ゲムシタビン、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする上記１４に記載の薬学的組成物。
１６．前記薬学的組成物は、単一組成物、または個別の組成物をさらに含むことを特徴とする上記１４に記載の薬学的組成物。
１７．上記１ないし１０のうちいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を個体に投与する段階を含む、個体のＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病を予防または治療する方法。
１８．前記個体に抗癌剤を投与する段階をさらに含むことを特徴とする上記１７に記載の方法。
１９．前記抗癌剤は、上記１ないし１０のうちいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片と同時、個別または順に投与することを特徴とする上記１８に記載の方法。
２０．前記抗体、その抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせは、経口、静脈内、筋肉内、経皮、粘膜、鼻内、器官内、皮下投与、及びそれらの組み合わせによって個体に投与されることを特徴とする上記１８に記載の方法。
２１．前記抗体、その抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせは、全身的にまたは局所的に投与されることを特徴とする上記１８に記載の方法。
２２．上記１ないし１０のうちいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を個体に投与する段階を含む、個体の抗癌剤抵抗性を予防または治療する方法。

Claims (7)

  1. 重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ）及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ）を含む、ＥｒｂＢ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、ＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病予防用または疾病治療用の薬学的組成物であって、前記抗体が以下：
    （１）配列番号６１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６９の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７８の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８８の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号９４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （２）配列番号６１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７０の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７８の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８８の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号９５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （３）配列番号６１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７８の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８８の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号９４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （４）配列番号６１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７４の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７９の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８７の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８９の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号９４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （５）配列番号６１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７６の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９２の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号１００の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （６）配列番号６３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７６の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９２の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号１００の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （７）配列番号６６の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７６の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９２の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号１００の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    からなる群から選択される、薬学的組成物。
  2. 前記ＥｒｂＢ３タンパク質の活性化または過生成に係わる疾病は、癌であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
  3. 前記癌は、乳房癌、皮膚癌、頭頚部癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、肝臓癌、腎臓癌、透明細胞肉腫、黒色腫、脳脊髄腫瘍、脳癌、胸腺種、中皮腫、食道癌、胆道癌、睾丸癌、生殖細胞種、甲状腺癌、副甲状線癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、リンパ種、骨髄形成異常症侯群（ＭＤＳ）、骨髄線維症、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄種、ホジキン病、内分泌系癌及び肉腫からなる群から選択されたことを特徴とする請求項２に記載の薬学的組成物。
  4. 抗癌剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
  5. 前記抗癌剤は、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、トラストズマブ、Ｔ−ＤＭ１、ペルツズマブ、ラパチニブ、パクリタキセル、タモキシフェン、シスプラチン、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ゲムシタビン、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項４に記載の薬学的組成物。
  6. 前記抗体またはその抗原結合断片、及び前記抗癌剤は、単一組成物、または個別の組成物中にあることを特徴とする請求項４に記載の薬学的組成物。
  7. 個体における抗癌剤抵抗性の予防又は治療のための薬学的組成物であって、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ）及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ）を含む、ＥｒｂＢ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、前記抗体が以下：
    （１）配列番号６１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６９の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７８の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８８の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号９４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （２）配列番号６１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７０の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７８の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８８の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号９５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （３）配列番号６１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７８の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８８の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号９４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （４）配列番号６１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７４の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７９の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８７の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８９の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号９４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （５）配列番号６１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７６の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９２の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号１００の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （６）配列番号６３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７６の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９２の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号１００の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    （７）配列番号６６の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７６の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９２の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号１００の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体；
    からなる群から選択され、前記抗癌剤はセツキシマブまたはパクリタキセルであることを特徴とする、薬学的組成物。
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