JP6982863B2 - 高速原子間力顕微鏡による細胞小器官の観察のための試料の調製方法 - Google Patents
高速原子間力顕微鏡による細胞小器官の観察のための試料の調製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6982863B2 JP6982863B2 JP2017223106A JP2017223106A JP6982863B2 JP 6982863 B2 JP6982863 B2 JP 6982863B2 JP 2017223106 A JP2017223106 A JP 2017223106A JP 2017223106 A JP2017223106 A JP 2017223106A JP 6982863 B2 JP6982863 B2 JP 6982863B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- glass substrate
- atomic force
- force microscope
- polybasic amino
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Description
本発明は、高速原子間力顕微鏡によりほ乳類の細胞内小器官の動的挙動を観察するための試料の調製方法に関する。この方法は、ガラス基材をポリ塩基性アミノ酸でコーティングして、ポリ塩基性アミノ酸でコーティングされたガラス基材を準備する工程と、ポリ塩基性アミノ酸でコーティングされたガラス基材上に細胞内小器官を付着させる工程とを含む。
本発明は、高速原子間力顕微鏡によりほ乳類の細胞内小器官の動的挙動を観察する方法にも関し、この方法は、ガラス基材をポリ塩基性アミノ酸でコーティングして、ポリ塩基性アミノ酸でコーティングされたガラス基材を準備する工程と、ポリ塩基性アミノ酸でコーティングされたガラス基材上に細胞内小器官を付着させる工程とを含む。
本発明は、高速原子間力顕微鏡によりほ乳類の細胞内小器官の動的挙動を観察するための試料を調製するためのポリ塩基性アミノ酸でコーティングされたガラス基材にも関する。本発明に係るガラス基材は、高速原子間力顕微鏡で観察する試料を付着させるステージとして用いられる。こうしたステージの寸法及び形状としては、高速原子間力顕微鏡による観察に適したものであれば特に限定されないが、好ましくは円柱状で、直径及び高さは0.5mm〜5mmの範囲内である。
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection, ATCC)から入手したヒト大腸がんHCT1116細胞から、以下に示すプロトコールで核膜を単離した。具体的には、約108個の培養細胞を10mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)中で懸濁した後、4℃、1,300gで5分間遠心して上澄みを取り除き細胞を洗浄した。次いで、3.5mLの低浸透圧緩衝液中で再懸濁し、氷中で40分間インキュベートした。4℃、2,300gで13分間遠心して上澄みを取り除き、核を含む分画を得た。これをショ糖溶液で懸濁し、さらに別の濃度のショ糖溶液を重層した後、4℃、17,000gで40分間遠心した。上澄みを取り除いて沈殿したペレット状の核を回収した。次いで、ペレット状の核を200μLの低浸透圧緩衝液で再懸濁した後、各0.5μLのデオキシリボヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼを加えて室温で15分間インキュベートした。最後に、懸濁液を4℃、10,000gで15分間遠心して沈殿したペレット状の核膜を得た。
実施例
円柱形のガラス製のステージ(直径1.5〜2mm、高さ2mm)を、0.01%(w/w)のポリ−L−リジン(分子量150,000−300,000)水溶液中に室温で24時間浸漬させて、0.01%(w/w)のポリ−L−リジンでコーティングされたガラス製ステージを作成した。
円柱形のガラス製のステージ(直径1.5〜2mm、高さ2mm)上に2mm四方の雲母シートを乗せたものを、0.01%(w/w)のポリ−L−リジン水溶液中に室温で24時間浸漬させて、0.01%(w/w)のポリ−L−リジンでコーティングされた雲母製ステージを作成した。
得られたペレット状の核膜を、200μLの低浸透圧緩衝液(pH7.5)に懸濁し、この核膜懸濁液2μLを得られたガラス製ステージ及び雲母製ステージにそれぞれ滴下し、室温で1時間静置した。次いで、各ステージを低浸透圧緩衝液で洗浄して過剰に付着した核膜サンプルを除き、高速原子間力顕微鏡で観察するための観察試料を得た。
オリンパス社よりアモルファスカーボン製カンチレバー(長さ:6〜7μm、幅2μm、厚さ:90nm)を購入し、電子ビーム蒸着法(ELS−7500、Elionix社製)により、カンチレバー先端に長さ約2μm、半径約8nmの探針を調製した。このカンチレバーを用いて、液中ダイナミック(タッピング)モードの高速走査型原子間力顕微鏡(FS−AFM,NVB500、オリンパス社)を用いて室温で低浸透圧緩衝液(pH7.5)中の試料を観察した。
実施例による試料調製方法により調製された試料を用いて、ヒトの細胞の核膜孔が液中で動いている様子を観察できた。観察結果を図1〜13に示す。一方、比較例の方法により調製された試料では、ヒトの細胞の核膜孔を観察することはできなかった。
Claims (6)
- 原子間力顕微鏡よりも1000倍以上の速度で高速走査が可能な走査型プローブ顕微鏡である高速原子間力顕微鏡によりほ乳類の細胞内小器官の動的挙動を観察するための試料の調製方法であって、
ガラス基材をポリ塩基性アミノ酸でコーティングして、ポリ塩基性アミノ酸でコーティングされたガラス基材を準備する工程と、
前記ポリ塩基性アミノ酸でコーティングされたガラス基材上に前記細胞内小器官を付着させる工程とを含み、
前記ガラス基材のポリ塩基性アミノ酸によるコーティングが、ガラス基材を0.005重量%〜0.05重量%のポリ塩基性アミノ酸溶液中に10時間以上浸漬させることにより行われる、調製方法。 - 前記ポリ塩基性アミノ酸が、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリトリプトファン、ポリヒスチジン、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載の調製方法。
- 前記ほ乳類がヒトである、請求項1又は2に記載の調製方法。
- 前記細胞内小器官が核膜である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の調製方法。
- 原子間力顕微鏡よりも1000倍以上の速度で高速走査が可能な走査型プローブ顕微鏡である高速原子間力顕微鏡によりほ乳類の細胞内小器官の動的挙動を観察する方法であって、
ガラス基材をポリ塩基性アミノ酸でコーティングして、ポリ塩基性アミノ酸でコーティングされたガラス基材を準備する工程と、
前記ポリ塩基性アミノ酸でコーティングされたガラス基材上に前記細胞内小器官を付着させる工程とを含み、
前記ガラス基材のポリ塩基性アミノ酸によるコーティングが、ガラス基材を0.005重量%〜0.05重量%のポリ塩基性アミノ酸溶液中に10時間以上浸漬させることにより行われる、観察方法。 - 原子間力顕微鏡よりも1000倍以上の速度で高速走査が可能な走査型プローブ顕微鏡である高速原子間力顕微鏡によりほ乳類の細胞内小器官の動的挙動を観察するための試料を付着するための、ポリ塩基性アミノ酸でコーティングされたガラス基材の使用であって、
前記ガラス基材のポリ塩基性アミノ酸によるコーティングが、ガラス基材を0.005重量%〜0.05重量%のポリ塩基性アミノ酸溶液中に10時間以上浸漬させることにより行われる、使用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017223106A JP6982863B2 (ja) | 2017-11-20 | 2017-11-20 | 高速原子間力顕微鏡による細胞小器官の観察のための試料の調製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017223106A JP6982863B2 (ja) | 2017-11-20 | 2017-11-20 | 高速原子間力顕微鏡による細胞小器官の観察のための試料の調製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019095243A JP2019095243A (ja) | 2019-06-20 |
JP6982863B2 true JP6982863B2 (ja) | 2021-12-17 |
Family
ID=66972846
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017223106A Active JP6982863B2 (ja) | 2017-11-20 | 2017-11-20 | 高速原子間力顕微鏡による細胞小器官の観察のための試料の調製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6982863B2 (ja) |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07260801A (ja) * | 1994-03-18 | 1995-10-13 | Nikon Corp | 走査型プローブ顕微鏡 |
JPH1014595A (ja) * | 1996-07-05 | 1998-01-20 | Shimadzu Corp | 微生物試料の観察方法 |
JP2001091440A (ja) * | 1999-09-17 | 2001-04-06 | Jeol Ltd | 走査プローブ顕微鏡による粒子状試料の観察方法及び走査プローブ顕微鏡用粒子状試料体 |
GB0107231D0 (en) * | 2001-03-22 | 2001-05-16 | Imp College Innovations Ltd | Patch clamp |
JP2003098060A (ja) * | 2001-09-26 | 2003-04-03 | Olympus Optical Co Ltd | プローブ顕微鏡を用いて標的部位を選択的に採取する方法、その標的部位に含有される物質をそこにおいて反応させる方法、およびそれらの方法を行うための装置 |
JP4999171B2 (ja) * | 2007-08-06 | 2012-08-15 | 日本電信電話株式会社 | タンパク質機能解析装置 |
JP4674611B2 (ja) * | 2008-03-07 | 2011-04-20 | パナソニック株式会社 | 分析物測定方法および自動遺伝子検出装置 |
JP2011022076A (ja) * | 2009-07-17 | 2011-02-03 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | 膜タンパク質機能測定システムおよび膜タンパク質機能測定方法 |
WO2012017922A1 (ja) * | 2010-08-03 | 2012-02-09 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | 細胞観察用デバイス,細胞観察方法および細胞観察用システム |
JP2017503845A (ja) * | 2014-01-24 | 2017-02-02 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 自己集合性βソレノイドタンパク質スカフォールド |
-
2017
- 2017-11-20 JP JP2017223106A patent/JP6982863B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2019095243A (ja) | 2019-06-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Berthing et al. | Intact mammalian cell function on semiconductor nanowire arrays: New perspectives for cell‐based biosensing | |
Berthing et al. | Cell membrane conformation at vertical nanowire array interface revealed by fluorescence imaging | |
Gilbert et al. | Single-molecule force spectroscopy and imaging of the vancomycin/D-Ala-D-Ala interaction | |
Meyer et al. | Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions | |
Akisaka et al. | Adhesion structures and their cytoskeleton-membrane interactions at podosomes of osteoclasts in culture | |
LI et al. | Drug-induced changes of topography and elasticity in living B lymphoma cells based on atomic force microscopy | |
Lolo et al. | Caveolin-1 dolines form a distinct and rapid caveolae-independent mechanoadaptation system | |
Morton et al. | Atomic force microscopy-based bioanalysis for the study of disease | |
Iwase et al. | Forchlorfenuron, a phenylurea cytokinin, disturbs septin organization in Saccharomyces cerevisiae | |
Liu et al. | Effect of glutaraldehyde fixation on bacterial cells observed by atomic force microscopy | |
Shinto et al. | Effect of interfacial serum proteins on melanoma cell adhesion to biodegradable poly (l-lactic acid) microspheres coated with hydroxyapatite | |
JPWO2018199334A1 (ja) | 細胞の膜電位/膜電流の測定方法 | |
JP6982863B2 (ja) | 高速原子間力顕微鏡による細胞小器官の観察のための試料の調製方法 | |
Caspi et al. | A new dimension in retrograde flow: centripetal movement of engulfed particles | |
da Silva et al. | Nanowire Arrays as Force Sensors with Super‐Resolved Localization Position Detection: Application to Optical Measurement of Bacterial Adhesion Forces | |
Domingues et al. | Antimicrobial peptides: effect on bacterial cells | |
Günther et al. | Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids | |
Kim et al. | Collective behaviors of mammalian cells on amine-coated silicon nanowires | |
Kreplak et al. | Electron microscopy of intermediate filaments: teaming up with atomic force and confocal laser scanning microscopy | |
de Souza et al. | Strategies and results of field emission scanning electron microscopy (FE-SEM) in the study of parasitic protozoa | |
Gustafsson et al. | Scalable Production of Monodisperse Bioactive Spider Silk Nanowires | |
Huang et al. | Towards monitoring transport of single cargos across individual nuclear pore complexes by time-lapse atomic force microscopy | |
JP2006519025A (ja) | 物質を固相支持体に固定するための組成物および方法 | |
JP2015022042A (ja) | 単一細胞を解析するための顕微鏡システム、単一細胞の解析方法及び解析用キット | |
Ortega et al. | Biological samples observed in vitro by atomic force microscopy: morphology and elastic properties |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80 Effective date: 20171129 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201007 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210623 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210629 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210825 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211019 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211115 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6982863 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |