JP6979875B2 - チクングニヤウイルスの抗体媒介性中和 - Google Patents

チクングニヤウイルスの抗体媒介性中和 Download PDF

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Description

本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられている、２０１５年４月１４日出願の米国仮出願第６２／１４７，３５４号に基づく優先権を主張する。
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から付与された助成金番号Ｋ０８ ＡＩ１０３０３８、Ｆ３２ ＡＩ０９６８３３、およびＵ５４ ＡＩ０５７１５７の下で政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
１．開示の分野
本開示は、概して、医学、感染症、および免疫学の分野に関する。より詳細には、本開示は、チクングニヤウイルスを中和する抗体に関する。
２．背景
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）は、トガウイルス科のアルファウイルス属に属するエンベロープ型のプラス鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡウイルスであり、ヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）の蚊によって伝播される。成熟ＣＨＩＫＶビリオンは、前駆体ポリタンパク質ｐ６２−Ｅ１からタンパク質分解的切断により生じる２つの糖タンパク質Ｅ１およびＥ２を含む。Ｅ２はウイルス付着において機能し、一方Ｅ１は膜融合を媒介してウイルスが侵入できるようにする（非特許文献１）。ヒトでは、ＣＨＩＫＶ感染は発熱と関節痛を引き起こし、これらは重症である場合もあり、また場合によっては何年も続く（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。ＣＨＩＫＶは、アフリカのサハラ以南の大部分の地域で、そしてアジア、ヨーロッパ、ならびにインド洋および太平洋の一部の地域においても大発生を引き起こしている。２０１３年１２月、セント・マーチン島において現地性症例が同定され、西半球で最初のＣＨＩＫＶの伝播が発生した（非特許文献５）。ウイルスは、カリブ海の実質的に全ての島、そして中央、南、および北アメリカにも急速に広まった。１年足らずで、西半球において１００万例を超えるＣＨＩＫＶの疑い例が報告され、米国を含む４０を超える国において地域性伝播が記録された（非特許文献６）。現在のところ、ＣＨＩＫＶ感染の予防または治療のための認可ワクチンも抗ウイルス療法もない。
ヒトにおけるＣＨＩＫＶ感染に対する防御免疫機構は完全には解明されていないが、体液性応答が感染を抑制し、組織損傷を制限する（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。免疫ヒトγ−グロブリンは、培養細胞において感染性を中和し、マウスでは、ウイルス接種の２４時間後までに投与された場合、罹患を阻止する（非特許文献１３）。ＣＨＩＫＶ感染を中和するいくつかのマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が報告されており（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１２、非特許文献１７）、ＣＨＩＫＶの負荷後、組み合わせて用いてマウスまたは非ヒト霊長類を治療した場合に効力があるものもある（非特許文献１２、非特許文献１７）。これに対し、報告されているヒトＣＨＩＫＶｍＡｂの数は限られており、その大部分は中和活性があまり高くない（非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２）。
Ｋｉｅｌｉａｎら、２０１０ Ｓｃｈｉｌｔｅら、２０１３ Ｓｉｓｓｏｋｏら、２００９ Ｓｔａｐｌｅｓら、２００９ ＣＤＣ ２０１３ ＣＤＣ ２０１４ Ｃｈｕら、２０１３ Ｈａｌｌｅｎｇａｒｄら、２０１４ Ｈａｗｍａｎら、２０１３ Ｋａｍら、２０１２ｂ Ｌｕｍら、２０１３ Ｐａｌら、２０１３ Ｃｏｕｄｅｒｃら、２００９ Ｂｒｅｈｉｎら、２００８ Ｇｏｈら、２０１３ Ｍａｓｒｉｎｏｕｌら、２０１４ Ｐａｌら、２０１４ Ｆｏｎｇら、２０１４ Ｆｒｉｃら、２０１３ Ｌｅｅら、２０１１ Ｓｅｌｖａｒａｊａｈら、２０１３ Ｗａｒｔｅｒら、２０１１
したがって、本開示によれば、対象におけるチクングニヤウイルス感染を検出する方法であって、（ａ）前記対象由来のサンプルを、それぞれ表３および表４に記載のクローン対重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗体または抗体フラグメントと接触させること；および（ｂ）前記サンプル中のＥ２に前記抗体または抗体フラグメントを結合させることによって、前記サンプル中のチクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２を検出することを含む、前記方法が提供される。サンプルは、血液、痰、涙、唾液、粘液もしくは血清のような体液、尿、または糞便であり得る。検出は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、またはウェスタンブロットを含み得る。該方法は、２回目の工程（ａ）および（ｂ）を実行すること、ならびに、１回目のアッセイと比較して、Ｅ２レベルの変化量を測定することをさらに含み得る。抗体は、表１に記載のクローン対可変配列にコードされるもの、または表１に記載のクローン対可変配列に対して７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する軽鎖および重鎖可変配列によりコードされるもの、または、表２に記載のクローン対配列に特徴付けられるか、もしくは表２に記載のクローン対配列に対して７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する軽鎖および重鎖可変配列を有するものであり得る。抗体フラグメントは、組換えＳｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはＦｖフラグメントであり得る。抗体はＩｇＧおよび／またはキメラ抗体であり得る。
別の実施形態では、チクングニヤウイルスに感染した対象を処置するか、またはチクングニヤウイルスに罹患するリスクのある対象の感染の可能性を低減させる方法であって、前記対象に、それぞれ表３および表４に記載のクローン対重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗体または抗体フラグメントを送達することを含む、前記方法が提供される。抗体は、表１に記載のクローン対可変配列にコードされるもの、または表１に記載のクローン対可変配列に対して７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する軽鎖および重鎖可変配列によりコードされるもの、または、表２に記載のクローン対配列に特徴付けられるか、もしくは表２に記載のクローン対配列に対して７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する軽鎖および重鎖可変配列を有するものであり得る。抗体フラグメントは、組換えＳｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはＦｖフラグメントであり得る。抗体は、ＩｇＧ、および／またはキメラ抗体であり得る。抗体または抗体フラグメントは、感染前または感染後に投与することができる。送達することは、抗体もしくは抗体フラグメントの投与、または、抗体もしくは抗体フラグメントをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ配列、もしくはベクターによる遺伝子送達を含み得る。
さらに別の実施形態では、モノクローナル抗体であって、該抗体は、それぞれ表３および４に記載のクローン対重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列によって特徴付けられる、前記モノクローナル抗体が提供される。抗体は、表１に記載のクローン対可変配列にコードされるもの、または表１に記載のクローン対可変配列に対して７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する軽鎖および重鎖可変配列によりコードされるもの、または、表２に記載のクローン対配列に特徴付けられるか、もしくは表２に記載のクローン対配列に対して７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する軽鎖および重鎖可変配列を有するものであり得る。抗体フラグメントは、組換えＳｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはＦｖフラグメントであり得る。抗体は、キメラ抗体、または、糖タンパク質以外のチクングニヤウイルス抗原を標的とする二重特異性抗体であり得る。抗体はＩｇＧであり得る。抗体または抗体フラグメントは、細胞浸透性ペプチドをさらに含み、かつ／または、イントラボディである。
また、抗体または抗体フラグメントをコードするハイブリドーマまたは改変細胞であって、該抗体または抗体フラグメントは、それぞれ表３および表４に記載のクローン対重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列によって特徴付けられる、前記ハイブリドーマまたは改変細胞も提供される。抗体または抗体フラグメントは、表１に記載のクローン対可変配列にコードされるもの、または表１に記載のクローン対可変配列に対して７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する軽鎖および重鎖可変配列によりコードされるもの、または、表２に記載のクローン対配列に特徴付けられるか、もしくは表２に記載のクローン対配列に対して７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する軽鎖および重鎖可変配列を有するものであり得る。抗体フラグメントは、組換えＳｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはＦｖフラグメントであり得る。抗体は、キメラ抗体、および／またはＩｇＧであり得る。抗体または抗体フラグメントは、細胞浸透性ペプチドをさらに含むことができ、かつ／またはイントラボディである。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：５３／５４、５５／５６、５７／５８、５９／６０、６１／６２、６３／６４、６５／６６、６７／６８、７０／７１、７２／７３、７４／７５、７６／７７、８１／８２、８３／８４、８５／８６、８７／８８、８９／９０、９１／９２、９３／９４、９５／９６、および９７／９８からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変配列対を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１０３、１０４、および１０５のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：１８７、１８８、および１８９のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１０６、１０７、および１０８のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：１９０、１９１、および１９２のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１０９、１１０、および１１１のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：１９３、１９４、および１９５のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１１２、１１３、および１１４のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：１９６、１９７、および１９８のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１１５、１１６、および１１７のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：１９９、２００、および２０１のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１１８、１１９、および１２０のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２０２、２０３、および２０４のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１２１、１２２、および１２３のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２０５、２０６、および２０７のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１２４、１２５、および１２６のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２０８、２０９、および２１０のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１３０、１３１、および１３２のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２１１、２１２、および２１３のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１３３、１３４、および１３５のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２１４、２１５、および２１６のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１３６、１３７、および１３８のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２１７、２１８、および２１９のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１３９、１４０、および１４１のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２２０、２２１、および２２２のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１５１、１５２、および１５３のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２２３、２２４、および２２５のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１５４、１５５、および１５６のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２２６、２２７、および２２８のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１５７、１５８、および１５９のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２２９、２３０、および２３１のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１６０、１６１、および１６２のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２３２、２３３、および２３４のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１６３、１６４、および１６５のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２３５、２３６、および２３７のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１６６、１６７、および１６８のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２３８、２３９、および２４０のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１６９、１７０、および１７１のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２４１、２４２、および２４３のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１７２、１７３、および１７４のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２４４、２４５、および２４６のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
一実施形態では、チクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号：１７５、１７６、および１７７のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびにそれぞれ配列番号：２４７、２４８、および２４９のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において「含む」という用語と共に使用される場合、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つより多く」という意味とも合致する。「約」という語は、記載された数値のプラスまたはマイナス５％を意味する。
本明細書に記載される任意の方法または組成物は、本明細書に記載される他の任意の方法または組成物に関して実施することができることが企図される。本開示の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すものであるが、例示のみを目的として提供されていることを理解すべきであり、これは、本開示の精神および範囲内における様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかとなるためである。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに明らかにするために含められている。本開示は、これらの図面の１つまたは複数を、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、よりよく理解することができる。
図１Ａは、ｍＡｂ結合に重要なＥ２残基の構造解析を示す図である。（図１Ａ）本試験において用いたＣＨＩＫＶ株由来のＥ２の配列アラインメント。株名を左に示す（Ｓ２７、配列番号：１、受入番号ＡＦ３６９０２４．２；ＳＬ１５６４９、受入番号ＧＵ１８９０６１；ＬＲ２００６＿ＯＰＹ１、受入番号ＤＱ４４３５４４．２；９９６５９、受入番号ＫＪ４５１６２４；ＲＳＵ１、受入番号ＨＭ０４５７９７．１；ＮＩ ６４ ＩｂＨ３５、受入番号ＨＭ０４５７８６．１）。配列の上側の数字は、成熟Ｅ２タンパク質におけるアミノ酸位置に対応する。株Ｓ２７と同一のアミノ酸をダッシュ記号で示す。ＣＨＩＫＶ Ｅ２／Ｅ１ヘテロ二量体の結晶構造から決定されたＥ２のドメイン（Ｖｏｓｓら、２０１０）を配列アラインメントの上側の線図に示し、色分けする（シアン色：ドメインＡ、紫色：β−リボンコネクタ、緑色：ドメインＢ、ピンク色：ドメインＣ、暗灰色の網掛け：結晶構造中に存在しない領域）。アラニンスキャニング変異導入法によって決定した、アラニン置換がｍＡｂ結合を妨害する残基の位置を、各特異的抗体について、アラインメントの上側に色分けしたドットで示す。複数の抗体の結合に影響を与える残基は灰色で網掛けした四角で示すが、網掛けの灰色が濃いほどその残基でのアラニン置換の影響を受ける抗体数が多い。 図１−１の続き。 図１Ｂは、成熟エンベロープ糖タンパク質複合体の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ ３Ｎ４１）上にマッピングした、ｍＡｂ結合に必要な残基の位置を示す図である。Ｅ１／Ｅ２の単一ヘテロダイマーのリボントレースの側面図を、Ｅ１を薄いシアン色に色付けし、Ｅ２のドメインをパネルＡと同様に色付けして示す。抗体結合に必要なアミノ酸の側鎖を空間充填形式で示し、２０個の各抗体について、パネルＡの凡例に従って色分けする。複数の抗体の結合に影響を与える残基を灰色の網掛けで示すが、網掛けの灰色が濃いほど、その残基でのアラニン置換の影響を受ける抗体数が多い（凡例を左側に示す）。図１Ｃは、図１Ｂの構造から９０°回転させたＥ１／Ｅ２ヘテロ二量体の上面図を示す図である。 図２Ａは、ヒト抗ＣＨＩＫＶ ｍＡｂによる中和のメカニズムを示す図である。付着前および付着後中和アッセイ。ＳＬ１５６４９ ＶＲＰを、（ｉ）予冷したベロ細胞に添加する前に、示されたｍＡｂ（ＣＨＫ−１５２、陽性対照ｍＡｂを含む）と共に４℃で１時間インキュベートし、続いて３回洗浄して未結合ウイルスを除去する（付着前；黒丸）か、または（ｉｉ）予冷したベロ細胞に４℃で１時間吸着させ、続いて示されたｍＡｂを４℃で１時間添加した（付着後；白丸）。図２Ｂは、ＦＦＷＯアッセイを示す図である。ＳＬ１５６４９ ＶＲＰを予冷したベロ細胞に４℃で１時間吸着させ、続いて示されたｍＡｂ（ＣＨＫ−１５２、陽性対照マウスｍＡｂを含む）を１時間添加した。非結合ウイルスを除去し、細胞を低ｐＨ培地（ｐＨ５．５；黒丸）に３７℃で２分間暴露して原形質膜におけるウイルス融合を誘発した。陰性対照として、細胞を中性ｐＨ培地（ｐＨ７．４；白丸）に３７℃で２分間暴露した。図２Ａおよび図２Ｂの両方について、感染後１８時間まで細胞を３７℃でインキュベートし、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ陽性細胞を定量した。データは、それぞれ３連で実施した２つの独立した実験から統合した。 図２−１の続き。 図３Ａ〜Ｄは、Ｉｆｎａｒ−／−マウスにおける致死性ＣＨＩＫＶ感染に対するヒトｍＡｂ療法を示す図である。（図３Ａ）マウスに、示されたＣＨＩＫＶ特異的ｍＡｂまたは対照ｍＡｂ ５０μｇを、腹腔内注射により、ＣＨＩＫＶの致死的負荷の２４時間前に投与した（試験したｍＡｂ当たりｎ＝３〜６マウス）。（図３Ｂ）マウスに、示されたＣＨＩＫＶ特異的ｍＡｂまたは対照ｍＡｂ ５０μｇを、腹腔内注射により、ＣＨＩＫＶの致死的負荷の２４時間後に投与した（試験したｍＡｂ当たりｎ＝４〜６マウス）。（図３Ｃ）マウスに、示されたＣＨＩＫＶ特異的ｍＡｂまたは対照ｍＡｂ ２５０μｇを、腹腔内注射により、ＣＨＩＫＶの致死的負荷の４８時間後に投与した（試験したｍＡｂ当たりｎ＝７〜１０マウス）。（図３Ｄ）マウスに、示されたＣＨＩＫＶ特異的ｍＡｂのペアまたは対照ｍＡｂ ２５０μｇを、腹腔内注射により、ＣＨＩＫＶの致死的負荷の６０時間後に投与した（試験したｍＡｂの組み合わせ当たりｎ＝８マウス、ただし、ｎ＝３である４Ｊ２１＋２Ｈ１を除く）。４Ｊ２１または４Ｎ１２による単独療法では、５００μｇの単回用量を投与した（試験したｍＡｂ当たりｎ＝４〜５マウス）。 急性症状時の丘疹発疹を示す図である。対象はかかりつけ医に、３日間の熱（１０２°Ｆ）と同時に、両側の肘および指の関節痛と発疹が発症していることを訴えた。医師は、隆起した非掻痒性の白化した丘疹発疹（図に示す写真）を背中、胸部、および腹部全体に認めた。 ｍＡｂ競合グループの同定を示す図である。Ｏｃｔｅｔベースのバイオレイヤー干渉法を用いた定量的競合結合を用いて、ｍＡｂを競合グループに割り当てた。固定化ＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６ Ｅ２エクトドメインで被覆した抗ペンタＨｉｓバイオセンサチップを、一次ｍＡｂを含有するウェル中に浸漬し、続いて競合ｍＡｂを含有するウェル中に浸漬した。示された値は、第１のｍＡｂの存在下における競合ｍＡｂの結合率（第１のｍＡｂ複合体後に適用した競合ｍＡｂの最大シグナルを競合ｍＡｂ単独の最大シグナルと比較することによって測定する）である。ＭＡｂは、競合ｍＡｂの最大結合がその非競合結合の３０％未満に減少した場合（黒色の四角）同一部位への結合に良好に競合すると判断され、また、競合ｍＡｂの結合がその非競合結合の７０％未満に減少した場合（灰色の四角）部分的競合を示すと判定された。競合ｍＡｂの最大結合がその非競合結合の７０％を超える場合（白色の四角）にはＭＡｂは非競合とみなした。４つの競合結合グループを同定し、色付きの四角で示した。アラニンスキャニング変異導入法によって発見されたｍＡｂへの対応する主要抗原部位（表１および図１Ａ〜Ｃ）を競合マトリックスの右側の列に要約する。ＤＡはドメインＡを示し；ＤＢはドメインＢを示し；ｅはアーク１および２の両方を示し；ＮＴは試験されていないことを示し；ＮｏｔＲｅａｃｔは、ｍＡｂが野生型エンベロープタンパク質に対して反応しなかったことを示し；ＮｏＲｅｄｕｃｔは、ｍＡｂが野生型Ｅタンパク質に結合したが、いずれの変異体についても再現性のある減少は認められなかったことを示す。データは、各ｍＡｂ単独の複数回の読み値と、各競合抗体と組み合わせたｍＡｂの１回の読み値を用いて、１つの実験から統合したものである。 図６Ａ〜Ｆは、ＣＨＩＫＶ ＭＡｂの高分解能エピトープマッピングを示す図である。（Ａ）各アミノ酸を個別にアラニンに変異させた９１０個のＥ２／Ｅ１変異を包含するＣＨＩＫＶエンベロープタンパク質のアラニンスキャニング変異ライブラリを構築した。各変異アレイプレートの各ウェルは規定された置換を有する１つの変異体を含む。反応性の結果を示す代表的な３８４ウェルプレートを示す。各プレートには８個の陽性（野生型Ｅ２／Ｅ１）対照ウェルおよび８個の陰性（モックトランスフェクト）対照ウェルが含まれている。（Ｂ）エピトープマッピングのために、ＣＨＩＫＶエンベロープ変異ライブラリを発現するヒトＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、目的のＭＡｂ（ここではＭＡｂ ４Ｇ２０を示す）との免疫反応性について試験し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔハイスループットフローサイトメーターを用いて測定した。反応性が野生型ＣＨＩＫＶ Ｅ２／Ｅ１に比べて３０％未満であるが、別のＣＨＩＫＶ Ｅ２／Ｅ１ ＭＡｂに対して７０％を超える反応性を有するクローンを、先ずＭＡｂ結合に重要であると同定した。（Ｃ）４つの残基の変異がそれぞれ４Ｇ２０の結合を低下させた（赤色棒グラフ）が、他の立体構造依存性ＭＡｂ（灰色棒グラフ）またはウサギポリクローナル抗体（ｒＰＡｂ、ＩＢＴ Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓからの贈与）の結合には大きく影響しなかった。棒グラフは、少なくとも２つの複製データ点の平均値およびレンジを表す。（Ｄ）ＰＲＮＴ５０が１，０００ｎｇ／ｍｌ未満である中和性ＭＡｂのエピトープをＥ２／Ｅ１の三量体結晶構造（ＰＤＢ Ｅｎｔｒｙ ２ＸＦＣ）上にマッピングする。全ての中和性エピトープが、Ｅ２／Ｅ１のかなり露出した膜遠位ドメインにマッピングされる。明確化のためにＥ２／Ｅ１ヘテロ二量体サブユニットをそれぞれ別の色で示す。複数のＭＡｂにとって重要なエピトープ残基を含む、Ｅ２ドメインＡおよびＢ中の高免疫原性領域をＥ２の単一サブユニット上に赤色で描く。 図６−１の続き。 競合グループに対してマッピングされた抗体についてのｍＡｂ結合に重要なＥ２残基の構造分析を示す図である。Ｅ１／Ｅ２（ＰＤＢ ＩＤ ２ＸＦＢ）の結晶構造上にマッピングされた、異なる競合グループからのヒトｍＡｂまたはマウスｍＡｂの結合に必要な残基（図１Ａ〜Ｃ）の位置。Ｅ１を白色で、各Ｅ２単量体を薄灰色、濃灰色、または黒色で示したＥ１／Ｅ２三量体の空間充填モデル。抗体結合に必要な残基を、それらが属する競合グループに従って色分けする。赤色は残基Ｄ１１７およびＩ１２１を示し、これらは５Ｎ２３の結合に必要であり競合グループ１に属する。青色は残基Ｒ８０およびＧ２５３を示し、これらはＩ０６または５Ｍ１６による結合に必要であり競合グループ２に属する。緑色は残基Ｑ１８４、Ｓ１８５、Ｉ１９０、Ｖ１９７、Ｒ１９８、Ｙ１９９、Ｇ２０９、Ｌ２１０、Ｔ２１２、およびＩ２１７を示し、これらはＣＨＫ−２８５、ＣＨＫ−８８、または３Ａ２による結合に必要であり競合グループ３に属する。オレンジ色は残基Ｈ１８を示し、これは５Ｆ１９の結合に必要であり競合グループ４に属する。紫色は残基Ｅ２４、Ａ３３、Ｌ３４、Ｒ３６、Ｖ５０、Ｄ６３、Ｆ１００、Ｔ１５５を示し、これらは５Ｎ２３、ＣＨＫ−８４、またはＣＨＫ−１４１による結合に必要であり競合グループ１および２に属する。ティール色は残基Ｔ５８、Ｄ５９、Ｄ６０、Ｒ６８、Ｉ７４、Ｄ７７、Ｔ１９１、Ｎ１９３、およびＫ２３４を示し、これらは１Ｈ１２による結合に必要であり競合グループ２および３に属する。茶色は残基Ｄ７１を示し、これはＣＨＫ−８４および１Ｈ１２による結合に必要であり競合グループ１、２、および３に属する。黄色は、競合グループ１、２、および３に属する残基Ｄ７１を除いて推定受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、残基（Ｔ５８、Ｄ７１、Ｎ７２、Ｉ７４、Ｐ７５、Ａ７６、Ｄ７７、Ｓ１１８、およびＲ１１９）を示す。上のパネルは三量体の鳥瞰図を示し、中央のパネルは、上のパネルの構造からｘ軸で４５度回転させた三量体の斜め側面図を示し、そして下のパネルは、中央のパネルの構造からｘ軸で４５度回転させた三量体の側面図を示す。 ２つのヒト抗ＣＨＩＫＶ ｍＡｂ、２Ｈ１または４Ｎ１２による中和のメカニズムを示す図である。付着前および付着後中和アッセイ。ＣＨＩＫＶ株ＳＬ１５６４９ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を、（１）示されたｍＡｂ（２Ｈ１または４Ｎ１２）と共にインキュベートした後、予冷したベロ細胞に添加し、続いて３回洗浄することにより非結合ウイルスを除去する（付着前；黒丸）か、または（２）予冷したベロ細胞に吸着させた後、示されたｍＡｂを添加した（付着後；白丸）。これらのｍＡｂは、付着の前または後に添加された場合、中和した。 Ｂ６マウス急性疾患モデルを示す図である。１日目に投与したＣＨＯ細胞産生組換え抗体は、対照抗体処置に比べて、Ｄ＋３において、足踝のウイルスを減少させる。実験は、４週齢のＷＴマウスで、ＣＨＩＫＶ−ＬＲ １０３ＦＦＵの皮下接種後に行った。Ｄ＋１に抗体を投与し、Ｄ＋３に組織を採取してフォーカス形成アッセイにより滴定した。 Ｂ６マウス急性疾患モデルを示す図である。ＣＨＯ細胞中で産生させ、３日目に全身投与したＣＨＩＫＶ ｍＡｂ ４Ｎ１２は、足踝のウイルス力価を減少させる。実験は、４週齢のＷＴマウスで、ＣＨＩＫＶ−ＬＲ １０ｅ３ＦＦＵの皮下接種後に行った。Ｄ＋３に抗体を投与し、Ｄ＋５に組織を採取してフォーカス形成アッセイにより滴定した。 Ｂ６マウス慢性疾患モデルを示す図である。ＣＨＯ細胞中で産生させ、３日目に全身投与したＣＨＩＫＶ ｍＡｂは、２８日目において、足踝のウイルスゲノム当量を減少させる。実験は、４週齢のＷＴマウスで、ＣＨＩＫＶ−ＬＲ １０ｅ３ＦＦＵの接種後に行った。Ｄ＋３に抗体（３００μｇ）を投与し、Ｄ＋２８に組織を採取してｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。 ＩＦＮＡＲノックアウト致死性疾患マウスモデルを示す図である。ＣＨＯ細胞中で産生させ、感染６０時間後に全身投与したＣＨＩＫＶ ｍＡｂは、生存率を高める。実験は、４〜５週齢のＩＦＮＡＲ−／−マウスで、ＣＨＩＫＶ−ＬＲ １０ｅ３ＦＦＵの皮下接種後に行った。感染６０時間後に抗体を投与し、死亡率を２１日間追跡した。 ハイブリドーマ産生（「旧」）または組換え（「新」）ＣＨＩＫＶ特異的ｍＡｂの中和曲線を示す図である。ＢＨＫ２１細胞で中和曲線を測定した。ＣＨＩＫＶ−ＬＲ １００ＦＦＵを示されたｍＡｂと共に３７℃で１時間混合してから、ＢＨＫ２１細胞に添加した。フォーカス形成アッセイによって感染性を測定した。 図１３−１の続き ハイブリドーマ産生抗体対組換えＣＨＯ細胞産生抗体の最大半量有効阻害濃度（ＥＣ５０；ｎｇ／ｍＬ）を示す図である。データはハイブリドーマで産生されたものと組換え体とで類似している。 アミノ酸としてのＥ１およびＥ２両タンパク質、ならびに該タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチドのアラインメントを示す図である。タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ受入番号をウイルス株と共に記載する。プロトタイプ群：東．中央．南アフリカ型（ＥＣＳＡ）ウイルス３株、アジア型２株、西アフリカ型１株を示す。これらの抗体は、全ての株間で交差反応する。 図１５−１の続き。 図１５−２の続き。 図１５−３の続き。 図１５−４の続き。 図１５−５の続き。 図１５−６の続き。 図１５−７の続き。 図１５−８の続き。 図１５−９の続き。 図１５−１０の続き。 図１５−１１の続き。 図１５−１２の続き。 図１５−１３の続き。 図１５−１４の続き。 図１５−１５の続き。 図１５−１６の続き。
例示的実施形態の説明
本発明者らは、細胞培養物においてＣＨＩＫＶ感染性を中和するヒトｍＡｂの広範なパネルを単離し、そして、致死量のＣＨＩＫＶを接種した（Ｉ型インターフェロン受容体欠損）Ｉｆｎａｒ−／−マウスを、感染後６０時間後になってから投与を行った場合でさえ、成功裡に治療することができた。本発明者らは、ＣＨＩＫＶ感染を広範に超高活性で中和するｍＡｂが認識するための主要抗原部位としてＥ２のＡドメインを同定し、阻害の主要メカニズムが融合の阻止であることを示した。本開示のこれらおよび他の態様を以下に詳細に記載する。
Ｉ．チクングニヤ熱およびチクングニヤウイルス
チクングニヤ熱はチクングニヤウイルスによって引き起こされる感染症である。通常２〜７日間持続する急性の発熱、および、典型的には数週間または数ヶ月、場合によっては数年間続く関節痛を特徴とする。死亡率は１０００人に１人弱であり、高齢者が死亡する可能性が最も高い。ウイルスはヤブカ属の２種の蚊：ヒトスジシマカ（Ａ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）およびネッタイシマカ（Ａ．ａｅｇｙｐｔｉ）によってヒトに伝達される。動物のウイルス保有宿主としては、サル類、鳥類、ウシ、およびげっ歯類が挙げられる。これは、霊長類のみが宿主であるデング熱とは対照的である。
最善の予防手段は、全般的な蚊の防除と、感染した蚊による刺咬の回避である。具体的な治療法は知られていないが、薬物を使用して症状を軽減することができる。また休息および水分摂取も有用である場合がある。
チクングニヤ熱の病の潜伏期は２日から１２日、典型的には３日から７日の範囲である。感染者の７２から９７％が症状を発症することになる。症状としては、突然発症し、場合により二峰性であり、典型的には数日から１週間、場合により最大１０日間続き、通常は３９°Ｃ（１０２°Ｆ）を超え、場合により４１°Ｃ（１０４°Ｆ）に達する発熱、ならびに、通常数週間または数ヶ月、場合により数年間続く強い関節痛または関節のこわばりが挙げられる。また、発疹（通常は黄斑丘）、筋肉痛、頭痛、疲労感、吐き気、または嘔吐もある場合がある。虹彩毛様体炎またはブドウ膜炎のような目の炎症がある場合があり、網膜病変が起こる場合もある。典型的には、発熱は２日間続き、その後突然終了する。しかしながら、頭痛、不眠症、および極度の衰弱は不定期間、通常約５〜７日間続く。
近年の伝染病の観察では、チクングニヤ熱は、急性感染後に長期症状を引き起こす場合があることが示唆されている。２００６年のレユニオン島（Ｌａ Ｒｅｕｎｉｏｎ）の大発生の際には、４５歳以上の対象の５０％超が長期の筋骨格痛を報告し、６０％に上る人々で最初の感染から３年後に長期にわたる関節の痛みが報告されている。フランスの輸入症例の研究では、５９％の人々が急性感染の２年後になお関節痛を患っていたことが報告された。イタリアにおけるチクングニヤ熱の地域的流行の後、６６％の人々で、急性感染の１年後に筋肉痛、関節痛、または無力症が報告された。長期的症状は全くの新しい知見という訳ではなく、１９７９年の大発生後に長期の関節炎が認められている。長期症状の一般的な予測因子は、年齢が高いこと、およびリウマチ性疾患の既往である。これらの慢性症状の原因は現在のところ完全には理解されていない。慢性症状を報告した人々では、自己免疫疾患またはリウマチ疾患のマーカーは発見されていない。しかしながら、ヒトおよび動物モデルから得られたいくつかのエビデンスは、チクングニヤ熱が宿主内で慢性感染を確立できる可能性があることを示唆している。最初の発症の３ヶ月後に疾患の再発エピソードを患っていた人々の筋肉生検において、ウイルス抗原が検出された。さらに、最初の感染の１８ヶ月後に筋骨格系疾患が再発している人の滑膜マクロファージで、ウイルスの抗原およびＲＮＡが見られた。またいくつかの動物モデルでも、チクングニヤウイルスが持続性の感染症を確立し得ることが示唆されている。マウスモデルでは、ウイルスＲＮＡが、接種後少なくとも１６週間、関節関連組織において特異的に検出され、慢性滑膜炎との関連があった。同様に、別の研究では、接種後数週間、マウスの関節組織においてウイルスレポーター遺伝子が検出されることが報告されている。非ヒト霊長類モデルでは、チクングニヤウイルスが少なくとも６週間脾臓に存続していることが判明した。
チクングニヤウイルスは、約１１．６ｋｂのプラス鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを有するアルファウイルスである。セムリキ森林ウイルス複合体のメンバーであり、ロスリバーウイルス、オニョンニョンウイルス、セムリキ森林ウイルスと近縁である。米国では、カテゴリーＣの優先度の病原体に分類され、取り扱いにはバイオセーフティレベルＩＩＩの予防策が必要である。ヒト上皮および内皮細胞、初代線維芽細胞、ならびに単球由来マクロファージはインビトロでチクングニヤウイルスを許容し、ウイルス複製は細胞変性性が高いが、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロン感受性である。インビボでは、チクングニヤウイルスは、線維芽細胞、骨格筋前駆細胞、および筋繊維で複製するものと見られる。
チクングニヤウイルスは、東部馬脳炎および西部馬脳炎を引き起こすウイルスと同様、アルファウイルスである。チクングニヤ熱は一般的にネッタイシマカによる咬傷を介して広がるが、パリのパスツール研究所による最近の研究では、２００５〜２００６年のレユニオン島の大発生におけるチクングニヤウイルス株は、ヒトスジシマカ（Ａｓｉａｎ ｔｉｇｅｒ ｍｏｓｑｕｉｔｏ（Ａ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ））による伝播を容易にする突然変異を受けていたことが示唆されている。
ヒトスジシマカによるチクングニヤウイルス感染は、ウイルスエンベロープ遺伝子（Ｅ１）のうちの１つの点変異によって引き起こされたものである。ヒトスジシマカによるチクングニヤウイルスの伝播の増強は、ヒトスジシマカが存在する他の地域における大発生のリスクの増加を意味し得る。近年のイタリアにおける流行はヒトスジシマカによって長期化された可能性が高い。アフリカでは、チクングニヤ熱は、ヒトの大発生の間に、ウイルスが他の霊長類に広く存在する森林型サイクルによって広まる。
チクングニヤ熱に感染すると、宿主線維芽細胞は１型（αおよびβ）インターフェロンを産生する。インターフェロンアルファ受容体を欠くマウスは、１０２ＰＦＵのチクングニヤに暴露されて２から３日で死亡するが、野生型マウスは１０６ＰＦＵものウイルスに暴露されても生存し続ける。それと同時に、不完全１型欠損（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｔｙｐｅ−１ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）のマウス（ＩＦＮα／β＋／−）が受ける影響は軽度であり、筋力低下や倦怠感などの症状を呈する。Ｐａｒｔｉｄｏｓら（２０１１）は生弱毒株ＣＨＩＫＶ１８１／２５においても同様の結果を認めた。しかしながら、１型インターフェロン欠損（ＩＦＮα／β−／−）マウスは、死に至らずに一時的な障害を負っただけ
であり、不完全１型インターフェロン欠損マウスには何ら症状は無かった。
いくつかの研究は、チクングニヤ熱への感染に対する宿主応答に関与する１型インターフェロン経路の上流要素を見出そうと試みている。これまでのところ、チクングニヤ特異的病原体関連分子パターンは知られていない。しかしながら、Ｃａｒｄｉｆ、ＭＡＶＳ、およびＶＩＳＡとしても知られているＩＰＳ−１が重要な因子であることが判明している。２０１１年に、Ｗｈｉｔｅらは、ＩＰＳ−１による干渉がインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）のリン酸化およびＩＦＮ−βの産生を減少させることを見出した。他の研究では、ＩＲＦ３およびＩＲＦ７が年齢依存的に重要であることを見出されている。これらの調節因子の両方を欠く成体マウスは、チクングニヤ熱に感染すると死亡する。一方、新生児は、これらの因子のうちの１つが欠損しているとこのウイルスのために死亡する。
チクングニヤは、ＲＢＰ１を分解し、宿主細胞のＤＮＡ転写能を遮断する非構造タンパク質であるＮＳ２を産生することによってＩ型インターフェロン応答に対抗する。ＮＳ２はＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に干渉し、ＳＴＡＴのリン酸化を阻む。
チクングニヤ熱の一般的な臨床検査としては、ＲＴ−ＰＣＲ、ウイルス単離、および血清学的検査が挙げられる。ウイルス単離は最も確定的な診断を提供するが、完了までに１〜２週間かかり、バイオセーフティレベルＩＩＩの実験室で実施する必要がある。この技術は、特定の細胞株を全血由来のサンプルに暴露し、チクングニヤウイルス特異的応答を同定することを含む。ネストプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲを用いて全血からいくつかのチクングニヤ特異的遺伝子を増幅する。結果は１〜２日で確定することができる。
血清学的診断は、他の方法よりも大量の血液を必要とし、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてチクングニヤ特異的ＩｇＭレベルを測定する。結果を得るのに２〜３日必要であり、オニョンニョンウイルスやセムリキ森林ウイルスなどの他の関連ウイルスの感染による偽陽性が生じ得る。
鑑別疾患にはデング熱およびインフルエンザなどの他の蚊媒介性ウイルスによる感染が含まれ得る。慢性再発性多発関節痛は、感染１年後にチクングニヤ熱の患者の少なくとも２０％で起こるが、このような症状はデング熱ではまれである。
現在のところ具体的な治療法はない。症状を緩和する試みとしては、ナプロキセンなどのＮＳＡＩＤまたはパラセタモール（アセトアミノフェン）の使用および水分摂取が挙げられる。アスピリンは推奨されていない。関節リウマチを２週間以上患っている人では、リバビリンが有用である場合がある。クロロキンの効果は明らかではない。クロロキンは急性疾患には役立たないようであるが、慢性関節炎患者に役立つ可能性があることを示す暫定的なエビデンスがある。ステロイドも有用でないと思われる。
チクングニヤ熱は大部分が開発途上国に存在する。チクングニヤ熱は、疫学的には、蚊、その環境、人間の行動に関連している。約５，０００年前、蚊が北アフリカの変わりやすい気候に適応したことで、蚊は、ヒトの貯水環境を探し求めるようになった。ヒトの居住地と蚊の環境は非常に密接な関連があった。流行期間中はヒトがウイルスの保有宿主である。他の期間は、サル、鳥類、および他の脊椎動物が保有宿主となっている。
このウイルスには、西アフリカ型、東／中央／南アフリカ型、アジア型の３種の遺伝子型が報告されている。２００５年のインド洋および２０１１年の太平洋諸島、そして現在のアメリカにおける爆発的流行により、遺伝子型の分布は変化し続けている。
２００９年５月２８日、ウイルスが流行しているタイ行政区（Ｃｈａｎｇｗａｔ）であるトラン県の地方病院は、チクングニヤ熱に感染している母親（Ｋｈｗａｎｒｕｅｔｈａｉ Ｓｕｔｍｕｅａｎｇ、２８歳、トラン出身）から、母体−胎児ウイルス感染を防ぐために、男児を帝王切開で出産させることを決定した。しかしながら、出産後、医師は、子が既にウイルスに感染していることを発見し、その感染のために自発呼吸も飲乳もできなくなっていたため、集中治療室に入室させた。医師はこのウイルスが母親から胎児に伝染した可能性があると推測したが、臨床検査による確認は行わなかった。
２０１３年１２月、カリブ諸島のセント・マーチン島において、６６の確定例と約１８１の疑い例によりチクングニヤ熱が確認された。この大発生は、この疾患が感染した蚊の集団からヒトに伝染した西半球における最初の例である。２０１４年１月までにカナダ公衆衛生局は、イギリス領バージン諸島、サン・バルトヘレミー、グアドループ、ドミニカ、マルティニーク、およびフランス領ギアナで症例が確認されたことを報告した。２０１４年４月には、疾病予防管理センター（ＣＤＣ：Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）によりドミニカ共和国でもチクングニヤ熱が確認された。４月末までに、ジャマイカ、セントルシア、セントキッツ・ネイビス、および流行宣言が出されたハイチなど、全１４ヶ国に拡大していた。
２０１４年５月末までに、米国において、ウイルスが流行している地域からフロリダへの旅行者による１０例を超える輸入症例が報告された。カリブ海から米国に広がっているチクングニヤ熱の菌株はネッタイシマカによって最も容易にまん延する。チクングニヤ熱のこの株には、突然変異によりヒトスジシマカベクターがより効果的となる可能性があるという懸念がある。米国では、ヒトスジシマカ（Ａ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓまたはＡｇｉａｎ ｔｉｇｅｒ ｍｏｓｑｕｉｔｏ）が、ネッタイシマカに比べてより広範に存在しより攻撃的であるため、もしこの変異が起こった場合、チクングニヤ熱は米国にとってさらなる公衆衛生上の懸念材料となる。
２０１４年６月、ブラジルで６例のウイルスが確認され、２例はサンパウロ州のカンピーナス市で確認された。この６例は、国際連合ハイチ安定化ミッションのメンバーとして再建に参加しており、その頃ハイチから帰還したばかりのブラジル軍兵であった。この情報は、カンピーナス自治体当局によって公式に発表されたものであり、適切な措置が講じられたものと思われる。
２０１４年６月１６日におけるフロリダ州の累計症例は合計４２例であった。２０１４年９月１１日の時点でプエルトリコにおける年間報告症例数は１，６３６例であった。１０月２８日までに、その数は２，９７４例の確定例、および１０，０００例を超える疑い例に増加した。２０１４年６月１７日、合衆国ミシシッピ州の保健省は、その頃ハイチへ旅行したばかりのミシシッピ居住者の最初の潜在例を調査していることを認めた。２０１４年６月１９日には、ウイルスは米国ジョージア州に広がっていた。２０１４年６月２４日、米国フロリダ州ポーク郡ポインシアーナで症例が報告された。２０１４年６月２５日、合衆国アーカンソー州の保健局は、その州出身者１名がチクングニヤ熱を保菌していることを確認した。２０１４年６月２６日、メキシコのハリスコ州で症例が報告された。
２０１４年７月１７日、フロリダ州において、米国で罹患した最初のチクングニヤ熱の症例が疾病管理予防センターにより報告された。２００６年以来、米国では２００例を超える症例が報告されているが、他の国を旅行したことのある人々のみにおける報告であった。このウイルスが蚊によって人に伝達されたのは米国本土では本例が初めてである。２０１４年９月２日、疾病管理予防センターは、この疾患に国内で（ｌｏｃａｌｌｙ）罹患した人々のチクングニヤ熱の確定例が米国で７例確認されていることを報告した。
２０１４年９月２５日、エルサルバドル当局は、この新規の流行性疾患の３０，０００例を超える確定例を報告している。ジャマイカおよびバルバドスにおいても新たな流行が拡大している。これらの国を訪ねた観光客が自国にウイルスを持ち込む危険性がある。２０１４年１１月、ブラジルは、アメリカ大陸でそれまでに報告されたことのないチクングニヤ熱の異なる株（遺伝子型）の局地的伝播を報告した。これはアフリカ型の遺伝子型であるが、奇妙なことにそれが南アフリカ型であるか西アフリカ型であるかは明らかでない。新規（アメリカ大陸では）の遺伝子型は、現在アメリカ大陸にまん延しているアジア型の遺伝子型よりも重症であり、また、１つの遺伝子型に対する免疫は他の遺伝子型に対して免疫を付与しない。フランス領ポリネシアは、数ある地域の中でも大発生が継続中である地域の１つである。
２０１４年１１月７日、メキシコは、南部のチアパス州における局地的伝播によるチクングニヤ熱の大発生を報告した。この大発生は、海岸線をわたってグアテマラ国境から隣接するオアハカ州まで拡大している。保健当局は、累積で３９例の臨床検査による確定例（第４８週末まで）を報告している。疑い例は報告されていない。２０１５年１月にはコロンビアにおけるチクングニヤ熱の報告症例が９０，４８１例あった。
ＩＩ．モノクローナル抗体およびその産生
Ａ．一般的方法
チクングニヤウイルスに結合するモノクローナル抗体にはいくつかの用途があることが理解されるであろう。これらの用途としては、チクングニヤウイルス感染の検出および診断、ならびにその処置に使用するための診断キットの製造が挙げられる。このような状況では、このような抗体を診断薬または治療薬に連結させて捕捉剤もしくは競合アッセイにおける競合剤として使用するか、または、追加の薬剤をそれらに結合させずに個別に使用することができる。以下でさらに検討するように、抗体を変異または改変させることもできる。抗体を調製する方法および特徴付ける方法は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８；米国特許第４，１９６，２６５号を参照されたい）。
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成するための方法は、一般に、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同じように開始する。これらの両方法における最初の工程は、適切な宿主の免疫化または自然感染の既往による免疫を有する対象の同定である。当技術分野でよく知られているように、免疫化のための組成物によってその免疫原性は異なり得る。このため、ペプチドまたはポリペプチド免疫原を担体に結合することで達成される場合があるように、宿主免疫系を増強することがしばしば必要である。例示的な好ましい担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。またオボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンも担体として使用することができる。ポリペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートさせる手段は当技術分野においてよく知られており、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、およびビス−ジアゾ化ベンジジンが挙げられる。これも当技術分野でよく知られているように、特定の免疫原組成物の免疫原性をアジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激因子の使用によって増強することもできる。例示的な好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス（ｋｉｌｌｅｄ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する免疫応答の非特異的刺激因子）、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原組成物の量は、免疫原の性質および免疫化に使用される動物によって異なる。免疫原の投与には様々な経路（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および腹腔内）を使用することができる。ポリクローナル抗体の産生は、免疫動物の血液を免疫後の様々な時点でサンプリングすることによってモニターすることができる。また２回目の追加免疫注射を行うこともできる。適切な力価が達成されるまで、追加免疫および力価測定のプロセスを繰り返す。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫動物から採血し、血清を単離して保存し、および／または該動物を用いてＭＡｂを生成させることができる。
免疫化後、抗体産生能を有する体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）を、ＭＡｂ生成プロトコールで使用するために選択する。これらの細胞は、生検を行った脾臓もしくはリンパ節から、または循環血液から得ることができる。次いで、免疫動物由来の抗体産生Ｂリンパ球を、一般には免疫化された動物と同種の細胞、またはヒト細胞もしくはヒト／マウスキメラ細胞である不死化骨髄腫細胞の細胞と融合させる。ハイブリドーマ産生融合手順における使用に適した骨髄腫細胞株は、好ましくは、非抗体産生型であり、高い融合効率を有し、特定の選択培地で増殖できないようにして所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支援する酵素欠損を有する。当技術分野で知られているように、様々な骨髄腫細胞の任意の１つを使用することができる（Ｇｏｄｉｎｇ、６５〜６６頁、１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、７５〜８３頁、１９８４）。
抗体産生脾臓またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを生成するための方法は、通常、体細胞を骨髄腫細胞と２：１の割合で混合することを含むが、その割合は、細胞膜の融合を促進する（化学的または電気的）薬剤の存在下で、それぞれ約２０：１〜約１：１に変更することができる。センダイウイルスを用いた融合法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６）により報告されており、３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧのようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた融合法はＧｅｆｔｅｒら（１９７７）により報告されている。電気的融合法の使用も適切である（Ｇｏｄｉｎｇ、７１〜７４頁、１９８６）。融合手順は通常、約１×１０−６〜１×１０−８の低頻度で生存可能なハイブリッドを産生する。しかしながら、このことは、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地で培養することにより注入された親細胞（特に、通常は無限に分裂し続ける注入された骨髄腫細胞）と区別されるため、問題とはならない。選択培地は、一般に、組織培養培地中にヌクレオチドのデノボ合成を阻止する薬剤を含有するものである。例示的な好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成を阻止するが、アザセリンはプリン合成のみを阻止する。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地には、ヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンが補充される（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、培地にはヒポキサンチンが補充される。Ｂ細胞供給源がエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）で形質転換したヒトＢ細胞株である場合、骨髄腫に融合されていないＥＢＶ形質転換株を排除するために、ウアバインが添加される。
好ましい選択培地は、ＨＡＴまたはウアバイン含有ＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を稼働することができる細胞のみがＨＡＴ培地中で生存することができる。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の重要な酵素、例えばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を欠損しており、生存することができない。Ｂ細胞はこの経路を稼働することができるが、培養物では寿命が限られており一般に約２週間以内に死滅する。したがって、選択培地中で生き残ることができる細胞は、骨髄腫とＢ細胞とから形成されるハイブリッドのみである。融合に使用されるＢ細胞の供給源が、本明細書のようにＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株である場合、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞は薬物殺傷に感受性があり、一方、使用される骨髄腫パートナーはウアバイン耐性であるように選択されるため、ウアバインもハイブリッドの薬物選択に使用することができる。
培養によりハイブリドーマの集団が提供され、そこから特定のハイブリドーマが選択される。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートで単一クローン希釈液で細胞を培養し、続いて（約２〜３週間後の）個々のクローン上清を、所望の反応性について試験することによって行われる。このアッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなどのような、感度が高く簡便で迅速なものであるべきである。次いで、選択されたハイブリドーマを連続希釈するか、またはフローサイトメトリーソーティングにより単一細胞選別し、個々の抗体産生細胞株にクローニングし、次いでそのクローンを無限増殖させてｍＡｂを提供することができる。この細胞株を２つの基本的な方法でＭＡｂ産生のために利用することができる。ハイブリドーマのサンプルは動物（例えば、マウス）に（しばしば腹腔に）注入することができる。場合により、動物を炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）のような油で注射前にプライミングする。ヒトハイブリドーマをこの方法で使用する場合には、ＳＣＩＤマウスのような免疫不全マウスに注射して、腫瘍拒絶反応を防ぐことが最適である。注入された動物は、融合細胞ハイブリッドにより産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍が発症する。次いで、血清または腹水のような動物体液を穿刺して採取（ｔａｐ）し高濃度のＭＡｂを提供することができる。また個々の細胞株をインビトロで培養することもでき、この場合ＭＡｂは培地中に自然に分泌され、その培地からＭＡｂを容易に高濃度で得ることができる。あるいは、ヒトハイブリドーマ細胞株をインビトロで使用して細胞上清中に免疫グロブリンを産生させることもできる。細胞株を無血清培地中での増殖に適合させて、高純度のヒトモノクローナル免疫グロブリンの回収能を最適化することができる。
いずれかの手段によって産生されたＭＡｂは、所望により、濾過、遠心分離、およびＦＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を用いて、さらに精製してもよい。本開示のモノクローナル抗体のフラグメントは、精製モノクローナル抗体から、ペプシンもしくはパパインのような酵素による消化および／または化学還元によるジスルフィド結合の切断などの方法によって得ることができる。あるいは、本開示に包含されるモノクローナル抗体フラグメントは、自動ペプチド合成装置を用いて合成することもできる。
また、モノクローナルを生成するために、分子クローニング法を用いることも企図される。このために、ハイブリドーマ株からＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによって抗体遺伝子を得て、免疫グロブリン発現ベクターにクローニングすることができる。あるいは、細胞株から単離したＲＮＡからコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリを作製し、適切な抗体を発現するファージミドをウイルス抗原を用いたパンニングにより選択する。このアプローチは、たった１回のラウンドで約１０４倍もの数の抗体を生成しスクリーニングできること、ならびに、ＨおよびＬ鎖の組み合わせにより新たな特異性を生み出し、それにより適切な抗体を見出す可能性がさらに高まることにおいて、従来のハイブリドーマ技術と比べて有利である。
本開示において有用な抗体の製造方法を教示する他の米国特許としては、コンビナトリアルアプローチを用いたキメラ抗体の製造を記載する米国特許第５，５６５，３３２号；組換え免疫グロブリン調製物を記載する米国特許第４，８１６，５６７号；および抗体−治療薬コンジュゲートを記載する米国特許第４，８６７，９７３号が挙げられ、それぞれ参照によって本明細書中に組み入れる。
Ｂ．本開示の抗体
本開示に係る抗体は、第１の例では、その結合特異性によって規定することができ、この場合の結合特異性は、チクングニヤウイルス糖タンパク質（ＧＰ）に対するものである。当業者であれば、当業者によく知られている技術を用いて所与の抗体の結合特異性／親和性を評価することにより、該抗体が本請求項の範囲内に入るかどうかを決定することができる。一態様では、表３および表４にそれぞれ示した重鎖および軽鎖由来のクローン対ＣＤＲを有するモノクローナル抗体が提供される。そのような抗体は、本明細書に記載の方法を使用して、実施例の項で後述するクローンにより産生することができる。
第２の態様では、抗体は、追加の「フレームワーク」領域を含むその可変配列によって規定することができる。これらは、完全な可変領域をコードするまたは表す表１および表２に記載されている。さらに、抗体配列は、場合により以下に詳細に記載される方法を用いて、これらの配列から変わる場合もある。例えば、核酸配列は、以下の点で上に示したものとは異なり得る：（ａ）可変領域が軽鎖および重鎖の定常ドメインから分離していてもよく、（ｂ）核酸は、それがコードする残基に影響を与えない範囲で、上に示したものから異なっていてもよく、（ｃ）核酸は、所与の比率で、例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性で、上に示したものと異なっていてもよく、（ｄ）核酸は、低塩および／または高温条件に例示されるような高ストリンジェンシー条件下、例えば約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによりもたらされるような条件下でハイブリダイズする能力に基づいて、上に示したものと異なっていてもよく、（ｅ）アミノ酸は、所与の比率で、例えば８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性で、上に示したものと異なっていてもよく、または（ｆ）アミノ酸は、（後述する）保存的置換を許容することによって、上記に示したものと異なっていてもよい。上記はそれぞれ、表１に記載の核酸配列および表２のアミノ酸配列に適用される。
Ｃ．抗体配列の操作
様々な実施形態において、発現の改善、交差反応性の改善、またはオフターゲット結合の低減などの様々な理由で、同定された抗体の配列を操作することを選択することができる。以下は、抗体工学の関連技術の一般的な考察である。
ハイブリドーマを培養し、次いで細胞を溶解し、そして全ＲＮＡを抽出することができる。ＲＴと共にランダムヘキサマーを用いてＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成し、次いで、全ヒト可変遺伝子配列を増幅すると期待されるＰＣＲプライマーの多重混合物を用いてＰＣＲを行うことができる。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにクローニングし、次いで標準的なベクタープライマーを用いた自動ＤＮＡシークエンシングにより配列決定することができる。ハイブリドーマ上清から回収し、プロテインＧカラムを用いてＦＰＬＣで精製した抗体を用いて、結合および中和のアッセイを行うことができる。
クローニングベクターから重鎖および軽鎖ＦｖＤＮＡをＩｇＧプラスミドベクターにサブクローニングし、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞またはＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、２９３またはＣＨＯ細胞上清から抗体を収集して精製することにより組換え完全長ＩｇＧ抗体を生成した。
最終ｃＧＭＰ製造プロセスと同じ宿主細胞および細胞培養プロセスで産生された抗体を迅速に入手できることにより、プロセス開発プログラムの期間を短縮できる可能性がある。Ｌｏｎｚａは、ＣＨＯ細胞中で少量（最大５０ｇ）の抗体を迅速に産生するための、ＣＤＡＣＦ培地で増殖させたトランスフェクタントプールを用いる一般的な方法を開発している。本来の一過性の系よりもわずかに遅いものの、その利点としては、より高い生成物濃度、ならびに産生細胞株と同じ宿主およびプロセスの使用が挙げられる。モデル抗体を使い捨てバイオリアクタで発現させるＧＳ−ＣＨＯプールの増殖および生産性の例：流加培養モードで操作される使い捨てバッグバイオリアクタ培養液（作業容量５Ｌ）において、トランスフェクションの９週間以内に２ｇ／Ｌの回収抗体濃度が達成された。
抗体分子は、例えばｍＡｂのタンパク質分解的切断によって生産されるフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２）、または組換え手段により生産可能な一本鎖免疫グロブリンを含むことになる。そのような抗体誘導体は一価である。一実施形態では、そのようなフラグメントを、互いに、または、「キメラ」結合分子を形成するために他の抗体フラグメントもしくは受容体リガンドと組み合わせることができる。重要なことには、そのようなキメラ分子は、同一分子の異なるエピトープに結合することができる置換基を含み得る。
関連する実施形態では、抗体は、開示した抗体の誘導体、例えば、開示した抗体のものと同一のＣＤＲ配列を含む抗体（例えば、キメラまたはＣＤＲグラフト抗体）である。あるいは、抗体分子に保存的改変を導入するなどの改変を行いたい場合がある。このような改変を行うには、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することができる。タンパク質に相互的な生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野で一般に理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。アミノ酸の相対的な疎水親水性の性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、それがタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡなどとの相互作用を規定することが認められている。
また、同様のアミノ酸の置換を親水性に基づいて効果的に行うことができることも当技術分野で理解されている。参照によって本明細書に組み入れる米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性度がタンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：塩基性アミノ酸：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、およびヒスチジン（−０．５）；酸性アミノ酸：アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、アスパラギン（＋０．２）、およびグルタミン（＋０．２）；親水性、非イオン性アミノ酸：セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、およびスレオニン（−０．４）、硫黄含有アミノ酸：システイン（−１．０）およびメチオニン（−１．３）；疎水性、非芳香族アミノ酸：バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、およびグリシン（０）；疎水性、芳香族アミノ酸：トリプトファン（−３．４）、フェニルアラニン（−２．５）、およびチロシン（−２．３）。
アミノ酸を同等の親水性を有する別のアミノ酸に置換して、生物学的または免疫学的に改変されたタンパク質を生み出すことができることが理解される。そのような変更では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
上に概説したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。前述の様々な特徴を考慮した置換の例は当業者によく知られており、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；および、バリンとロイシンとイソロイシンが挙げられる。
また本開示はアイソタイプ改変も企図する。Ｆｃ領域を改変して異なるアイソタイプを有するようにすることで、異なる機能を得ることができる。例えば、ＩｇＧ１への変更により抗体依存性細胞傷害活性を高めることができ、クラスＡへの切り替えにより組織分布を改善することができ、クラスＭへの切り替えにより結合価を増加させることができる。
改変抗体は、標準的な分子生物学的技術による発現、またはポリペプチド化学合成などの、当業者に知られている任意の技術によって作製することができる。組換え体の発現のための方法を本明細書の別項で述べる。
Ｄ．一本鎖抗体
一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、短い（通常はセリン、グリシン）リンカーで連結された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合体である。このキメラ分子は、定常領域が除去されかつリンカーペプチドが導入されているにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。この改変は、通常、特異性は変化させずに残す。これらの分子は、歴史的には、抗原結合ドメインを単一ペプチドとして発現することが非常に好都合であるファージディスプレイを容易にするために生み出されたものである。あるいは、ｓｃＦｖは、サブクローニングされたハイブリドーマ由来の重鎖および軽鎖から直接作り出すこともできる。一本鎖可変フラグメントは、完全抗体分子中に見られる定常Ｆｃ領域を欠いており、そのため抗体を精製するために使用される共通の（例えば、プロテインＡ／Ｇの）結合部位を欠いている。プロテインＬはカッパ軽鎖の可変領域と相互作用するため、これらのフラグメントは、多くの場合、プロテインＬを用いて精製／固定することができる。
可撓性リンカーは、一般に、アライン、セリン、およびグリシンのようなヘリックスおよびターンを形成しやすいアミノ酸残基を含む。しかしながら、他の残基も機能することができる。Ｔａｎｇら（１９９６）は、タンパク質リンカーライブラリから一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のテーラードリンカーを迅速に選択する手段としてファージディスプレイを使用した。重鎖および軽鎖可変ドメインの遺伝子が様々な組成の１８アミノ酸ポリペプチドをコードするセグメントによって連結されたランダムリンカーライブラリが構築された。ｓｃＦｖレパートリー（約５×１０６メンバー）が繊維状ファージ上に提示され、ハプテンを用いた親和性選択に供された。選択された変異体の集団は、結合活性の顕著な増加を示したが、配列多様性を相当保持していた。続いて、１０５４個の変異体のスクリーニングにより、可溶型で効率的に産生される触媒活性ｓｃＦｖを得た。配列分析により、選択されたテザーの唯一の共通の特徴として、リンカー中、ＶＨＣ末端の２残基後ろにプロリンが保存されていること、および、別の位置にアルギニンおよびプロリンが豊富であることが明らかとなった。
また本開示の組換え抗体は、受容体の二量体化または多量体化を可能にする配列または部分を含み得る。そのような配列としては、Ｊ鎖と連結して多量体の形成を可能にするＩｇＡ由来の配列が挙げられる。別の多量体化ドメインとしてはＧａｌ４二量体化ドメインがある。他の実施形態では、２つの抗体の組み合わせを可能にするビオチン／アビジンのような薬剤で鎖を改質することができる。
別の実施形態では、受容体の軽鎖および重鎖を非ペプチドリンカーまたは化学単位を用いて結合することによって一本鎖抗体を作り出すことができる。一般に、軽鎖および重鎖は、別々の細胞で産生され、精製され、続いて適切な方法で連結される（すなわち、重鎖のＮ末端を適切な化学架橋で軽鎖Ｃ末端に付着させる）。
架橋剤は、２つの異なる分子の官能基を結ぶ分子架橋を形成するために使用される、例えば、安定化および凝固剤である。しかしながら、同一のアナログの二量体もしくは多量体、または、異なるアナログからなるヘテロマー複合体を作り出すことが企図される。２つの異なる化合物を段階的に連結するために、不要なホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤を使用することができる。
例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、一方は第一級アミン基と反応する反応基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）であり、他方はチオール基と反応する反応基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）である２つの反応基を含む。架橋剤は、第一級アミン反応性基を介して一方のタンパク質（例えば、選択された抗体またはフラグメント）のリシン残基と反応することができ、そして、既に最初のタンパク質につながれている架橋剤が、チオール反応基を介して他方のタンパク質（例えば、選択剤）のシステイン残基（遊離スルフヒドリル基）と反応する。
血液中で妥当な安定性を有する架橋剤を採用することが好ましい。様々な種類のジスルフィド結合含有リンカーが知られており、これらを標的化剤および治療／予防剤をコンジュゲートするために成功裡に使用することができる。立体障害のあるジスルフィド結合を含むリンカーは、インビボでより大きな安定性を与え、作用部位に到達する前の標的ペプチドの放出を防止することが判明する場合がある。したがって、これらのリンカーは、連結剤の１つのグループである。
別の架橋剤はＳＭＰＴであり、隣接するベンゼン環およびメチル基による「立体障害のある」ジスルフィド結合を含む二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織および血液中に存在し得るグルタチオンのようなチオレートアニオンによる攻撃から結合を保護する機能を果たし、それにより、付着した薬剤が標的部位に送達される前にコンジュゲートから切り離されるのを阻止するのに役立つと考えられている。
他の多くの既知の架橋剤と同様に、ＳＭＰＴ架橋剤は、システインのＳＨまたは第一級アミン（例えば、リシンのイプシロンアミノ基）などの官能基を架橋する能力を付与する。他の種類の架橋剤の候補としては、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオナートのような切断可能なジスルフィド結合を含むヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドが挙げられる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基は第一級アミノ基と反応し、フェニルアジドは（光分解の際に）任意のアミノ酸残基と非選択的に反応する。
立体障害性架橋剤に加えて、非立体障害性リンカーも本明細書に沿って使用することができる。保護ジスルフィドを含まないまたは生成しないと考えられる他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、および２−イミノチオラン（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ＆Ｔｈｏｒｐｅ、１９８７）が挙げられる。このような架橋剤の使用は、当技術分野において十分に理解されている。別の実施形態は、可撓性リンカーの使用を含む。
米国特許第４，６８０，３３８号は、リガンドとアミン含有ポリマーおよび／またはタンパク質とのコンジュゲートの製造に有用な、特には、キレート剤、薬物、酵素、検出可能な標識などとの抗体コンジュゲートの形成に有用な二官能性リンカーを記載している。米国特許第５，１４１，６４８号および第５，５６３，２５０号は、様々な温和な条件下で切断可能な不安定な結合を含む切断可能なコンジュゲートを開示している。このリンカーは、目的の薬剤をリンカーに直接結合させ、切断により活性物質の放出をもたらすことができるという点で特に有用である。特定の用途としては、遊離アミノまたは遊離スルフヒドリル基を、抗体のようなタンパク質、または薬物に付加することが挙げられる。
米国特許第５，８５６，４５６号は、ポリペプチド構成要素を連結して、融合タンパク質、例えば一本鎖抗体を作製するのに使用するためのペプチドリンカーを提供する。リンカーは、最大約５０アミノ酸長であり、荷電アミノ酸（好ましくはアルギニンまたはリシン）に続くプロリンを少なくとも１回含み、安定性が高くかつ凝集が少ないことを特徴とする。米国特許第５，８８０，２７０号は、様々な免疫診断および分離技術において有用なアミノオキシ含有リンカーを開示している。
Ｅ．イントラボディ
特定の実施形態では、抗体は、細胞内での作用に適した組換え抗体であり、このような抗体は「イントラボディ」として知られている。これらの抗体は、細胞内タンパク質輸送を改変する、酵素機能を妨げる、およびタンパク質−タンパク質またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用を遮断するなどの様々なメカニズムにより標的機能を妨げ得る。それらの構造は、多くの点で、上述の一本鎖抗体および単一ドメイン抗体の構造の模倣であるか、またはそれらと同等である。実際、単一転写物／一本鎖であることは、標的細胞における細胞内発現を可能にする重要な特徴であり、また、細胞膜を介したタンパク質輸送もより実現可能となる。ただし、他の特徴も必要である。
イントラボディ療法の実現に影響を及ぼす２つの主要な課題は、細胞／組織標的化などの送達、そして安定性である。送達に関しては、組織特異的送達、細胞型特異的プロモーターの使用、ウイルスベースの送達、および細胞透過性／膜転座ペプチドの使用などの様々なアプローチが採用されている。安定性に関しては、一般に、ファージディスプレイを伴い、さらに配列成熟またはコンセンサス配列の開発を含み得る方法などの力ずくのスクリーニングか、あるいは、安定化配列（例えば、Ｆｃ領域、シャペロンタンパク質配列、ロイシンジッパー）の挿入およびジスルフィド置換／修飾のようなより直接的な改変のいずれかに向けたアプローチがとられる。
イントラボディが必要とし得るさらなる特徴は、細胞内標的化のためのシグナルである。イントラボディ（または他のタンパク質）を細胞質、核、ミトコンドリア、およびＥＲのような細胞下領域に標的化することができるベクターが設計されており、市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．；Ｐｅｒｓｉｃら、１９９７）。
イントラボディは、細胞に入る能力を有するために、他の種類の抗体が達成できないさらなる用途を有する。本発明の抗体の場合、生細胞内のＭＵＣ１細胞質ドメインと相互作用する能力により、シグナル伝達機能（他の分子への結合）またはオリゴマー形成のようなＭＵＣ１ ＣＤに関連する機能を妨げることができる。特に、そのような抗体を使用してＭＵＣ１二量体の形成を阻害することが企図される。
Ｆ．精製
特定の実施形態では、本開示の抗体を精製してもよい。本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、他の成分から単離可能であり、タンパク質がその自然に得られる状態に対して任意の程度まで精製されている組成物を指すことが意図される。したがって、精製されたタンパク質とは、それが元々存在していた環境を含まないタンパク質も指す。「実質的に精製された」という用語が使用される場合、これは、該タンパク質またはペプチドが組成物の主要成分を形成する、例えば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成するような組成物を指すことになる。
タンパク質精製技術は、当業者によく知られている。これらの技術は、あるレベルで、細胞環境をポリペプチドおよび非ポリペプチドの画分に粗分画することを含む。ポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いて目的のポリペプチドをさらに精製して、部分的または完全な精製（または、均質になるまで精製）を達成することができる。純粋なペプチドの調製に特に好適な分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。タンパク質精製のための他の方法としては、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いた、または熱変性による沈殿後遠心分離；ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、およびアフィニティークロマトグラフィー；そのような技術と他の技術との組み合わせが挙げられる。
本開示の抗体を精製する際に、原核または真核発現系においてポリペプチドを発現させ、変性条件を用いてタンパク質を抽出することが望ましい場合がある。ポリペプチドは、ポリペプチドのタグ部分に結合するアフィニティーカラムを用いて他の細胞成分から精製することができる。当技術分野で一般的に知られているように、様々な精製工程を行う順序を変更してもよく、または、特定の工程を省略してもよく、それでもなお、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適した方法となると考えられている。
一般的に、完全抗体は、抗体のＦｃ部分に結合する薬剤（すなわち、プロテインＡ）を利用して分画される。あるいは、抗原を用いて、適切な抗体を同時に精製および選択することもできる。そのような方法は、カラム、フィルター、またはビーズのような支持体に結合された選択剤をしばしば利用する。抗体は、支持体に結合し、混入物質が除去され（例えば、洗い流され）、条件（塩、熱など）の適用により抗体が放出される。
当業者であれば、本開示を踏まえて、タンパク質またはペプチドの精製度を定量するための様々な方法を理解するであろう。これらの方法としては、例えば、活性画分の比活性を測定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析によって画分中のポリペプチドの量を評価することが挙げられる。画分の純度を評価する別の方法は、画分の比活性を計算し、それを最初の抽出物の比活性と比較し、これにより純度を計算することである。活性量を表すのに使用される実際の単位は、当然のことながら、精製の後の選択された特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかによることとなる。
ポリペプチドの移動度は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの条件によって、時として顕著に変化し得ることが知られている（Ｃａｐａｌｄｉら、１９７７）。そのため、異なる電気泳動条件下では、精製または部分精製された発現産物の見かけの分子量が変わり得ることが理解されるであろう。
ＩＩＩ．チクングニヤ感染症の能動的／受動的免疫付与および治療／予防
Ａ．製剤および投与
本開示は、抗チクングニヤウイルス抗体およびそれを生成するための抗原を含む医薬組成物を提供する。そのような組成物は、予防もしくは治療有効量の抗体もしくはそのフラグメント、またはペプチド免疫原と、および医薬として許容される担体とを含む。特定の実施形態では、「医薬として許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されているか、または、米国薬局方、もしくは動物、特にヒトにおける使用のための一般に認められている薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、医薬と共に投与される希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、滅菌液、例えば、水、および、石油、動物、植物、合成物由来のものなどの油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油など）であり得る。水は、特に、医薬組成物が静脈内投与される場合の担体である。また、生理食塩水、ならびにデキストロース水溶液およびグリセリン水溶液も、液体担体として、特には注射液用に使用することができる。他の好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
また組成物は、所望により、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、液剤、懸濁液剤、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、粉剤、徐放性製剤などの形態を取ることができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的な担体を含むことができる。好適な医薬品の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、予防または治療有効量の抗体またはそのフラグメントを、好ましくは精製された形態で、患者への適切な投与のための形態となるように好適な量の担体と共に含む。製剤は投与様式に適しているべきであり、投与様式は、経口、静脈内、動脈内、口腔内、鼻腔内、ネブライザー、気管支吸入とすることができ、または人工呼吸器により送達することもできる。
また、開示されているもののような抗体が、チクングニヤウイルス感染のリスクがある対象においてインビボで産生される場合は、活性ワクチンも想定され得る。Ｅ１およびＥ２の配列を、添付の配列表に配列番号：２５３〜２７６として列挙する。このようなワクチンは、非経口投与用に製剤化、例えば、皮内、静脈内、筋肉内、皮下注射、さらには腹腔内経路用に製剤化することができる。皮内および筋肉内経路による投与が企図される。あるいは、ワクチンは、局所経路によって粘膜へ直接的に、例えば、点鼻薬、吸入剤により、またはネブライザーにより投与することもできる。医薬として許容される塩としては、酸性塩、ならびに、例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて形成された塩が挙げられる。また、遊離カルボキシル基を用いて形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、および、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインのような有機塩基から得ることができる。
抗体の受動伝達は、人工的に獲得される受動免疫として知られており、一般に、静脈内または筋肉内注射の使用を含む。抗体の形態は、静脈内（ＩＶＩＧ）または筋肉内（ＩＧ）使用のためのヒト免疫グロブリンプールとしての；免疫化された、もしくは疾患から回復中のドナー由来の高力価ヒトＩＶＩＧまたはＩＧとしての；および、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）としての、ヒトまたは動物の血漿または血清であり得る。そのような免疫は一般に短時間しか持続せず、また、過敏症反応、および、特に非ヒト起源のガンマグロブリンによる血清病の潜在的なリスクもある。しかながら、受動免疫は即時型の防御をもたらす。抗体は、注射に適した、すなわち滅菌された注射可能な担体中に製剤化される。
一般的に、本開示の組成物の成分は、個別にまたは単位剤形として混合して、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、有効成分量を示すアンプルまたは小袋のような密封容器に入れて供給される。組成物を輸注によって投与すべき場合は、組成物は、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含む輸注ボトルを用いて調剤することができる。組成物を注射によって投与する場合は、成分を投与前に混合できるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
本開示の組成物は、中性または塩の形態として製剤化することができる。医薬として許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもののようなアニオンを用いて形成された塩、ならびに、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるもののようなカチオンを用いて形成された塩が挙げられる。
ＩＶ．抗体コンジュゲート
本開示の抗体を少なくとも１つの薬剤に連結させて抗体コンジュゲートを形成することができる。診断薬または治療薬としての抗体分子の効力を高めるために、慣習的には、少なくとも１つの所望の分子または部分構造を連結または共有結合または複合化させる。そのような分子または部分構造は、これに限定されるものではないが、少なくとも１つのエフェクター分子またはレポーター分子であり得る。エフェクター分子は、所望の活性、例えば細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に付着しているエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、抗腫瘍薬、治療用酵素、放射性核種、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、成長因子、およびオリゴまたはポリヌクレオチドが挙げられる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを用いて検出することができる任意の部分構造と定義される。抗体にコンジュゲートされているレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、燐光分子、化学発光分子、発色団、光親和性分子、着色粒子、またはビオチンなどのリガンドが挙げられる。
抗体コンジュゲートは、一般に、診断薬としての使用に好ましい。抗体診断は、一般に、様々なイムノアッセイのようなインビトロ診断に使用するものと、一般に「抗体指向性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）イメージング」として知られているインビボ診断プロトコールに使用するもの、の２つのクラスに分類される。多くの適切な造影剤が、それらを抗体へ付着させる方法と同様に、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号、第４，９３８，９４８号、および第４，４７２，５０９号を参照されたい）。使用される造影部分構造は、常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、ＮＭＲ検出可能物質、およびＸ線造影剤であり得る。
常磁性イオンの場合、例として、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、および／またはエルビウム（ＩＩＩ）のようなイオンを挙げることができるが、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線イメージングのような他の状況で有用なイオンとしては、これらに限定されるものではないが、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、そして特にビスマス（ＩＩＩ）が挙げられる。
治療および／または診断用途のための放射性同位体の場合には、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２Ｅｕ、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレン、３５硫黄、テクネチウム９９ｍ、および／またはイットリウム９０を挙げることができる。１２５Ｉは多くの場合特定の実施形態において使用するのに好ましく、またテクネチウム９９ｍおよび／またはインジウム１１１も、それらが低エネルギーであること、および遠距離検出に好適であることから、多くの場合好ましい。本開示の放射性標識されたモノクローナル抗体は当技術分野においてよく知られている方法に従って製造することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムおよび／もしくはヨウ化カリウム、ならびに次亜塩素酸ナトリウムのような化学的酸化剤またはラクトペルオキシダーゼのような酵素的酸化剤との接触によりヨウ素化することができる。本開示に係るモノクローナル抗体は、リガンド交換プロセスによって、例えば、パーテクネートを第一スズ溶液で還元し、還元テクネチウムをＳｅｐｈａｄｅｘカラムにキレート化させ、このカラムに抗体を適用することによって、テクネチウム９９ｍで標識することができる。あるいは、例えば、パーテクネート、ＳＮＣｌ２のような還元剤、フタル酸ナトリウム−カリウム溶液のようなバッファー溶液、および抗体をインキュベートすることによって、直接的標識技術を使用することもできる。金属イオンとして存在する放射性同位体を抗体に結合させるのにしばしば使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
コンジュゲートとしての使用が企図される蛍光標識としては、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドが挙げられる。
本開示において企図される別の種類の抗体コンジュゲートは、主にインビトロでの使用を意図したものであり、ここで、該抗体は、二次結合リガンド、および／または、色素生成性基質と接触すると着色生成物を生成する酵素（酵素タグ）に連結される。好適な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい二次結合リガンドは、ビオチンおよびアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。そのような標識の使用は当業者によく知られており、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、および第４，３６６，２４１号に記載されている。
抗体に対する分子の部位特異的な付着のさらに別の既知の方法は、抗体とハプテンベースの親和性標識との反応を含む。本質的に、ハプテンベースの親和性標識は、抗原結合部位中のアミノ酸と反応し、それによりこの部位を破壊して特異的抗原反応を遮断する。しかしながら、これは抗体コンジュゲートによる抗原結合の喪失をもたらすため、有利ではない場合もある。
またアジド基を含む分子も、低強度紫外線によって生成する反応性ナイトレン中間体を介してタンパク質に対する共有結合を形成するために使用され得る（ＰｏｔｔｅｒおよびＨａｌｅｙ、１９８３）。特に、プリンヌクレオチドの２−および８−アジドアナログは、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位指向性フォトプローブとして使用されている（Ｏｗｅｎｓ＆Ｈａｌｅｙ、１９８７；Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８５）。また２−および８−アジドヌクレオチドは、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするためにも使用されており（Ｋｈａｔｏｏｎら、１９８９；Ｋｉｎｇら、１９８９；Ｄｈｏｌａｋｉａら、１９８９）、また抗体結合剤として使用することができる。
抗体のそのコンジュゲート部分構造に対する付着またはコンジュゲーションのためのいくつかの方法が当技術分野において知られている。いくつかの付着方法は、抗体に付着している、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ）；エチレンジアミン四酢酸；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド；および／またはテトラクロロ−３α−６α−ジフェニルグリクリル−３のような有機キレート剤を用いた金属キレート錯体の使用を含む（米国特許第４，４７２，５０９号および第４，９３８，９４８号）。またモノクローナル抗体も、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下で酵素と反応させることができる。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって作製される。米国特許第４，９３８，９４８号では、乳房腫瘍の画像化は、モノクローナル抗体と、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾイミダートまたはＮ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオナートのようなリンカーを用いて該抗体に結合させた検出可能な画像化部分構造とを用いて達成されている。
他の実施形態では、抗体結合部位を変化させない反応条件を使用して、スルフヒドリル基を免疫グロブリンのＦｃ領域に選択的に導入することによる免疫グロブリンの誘導体化が企図される。この方法に従って製造された抗体コンジュゲートは、改善された寿命、特異性、および感度を示すことが開示されている（米国特許第５，１９６，０６６号、参照によって本明細書に組み入れる）。レポーター分子またはエフェクター分子がＦｃ領域の炭水化物残基にコンジュゲートされているエフェクター分子またはレポーター分子の部位特異的付着も文献に開示されている（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら、１９８７）。このアプローチは、現在臨床評価中の診断上および治療上有望な抗体をもたらすことが報告されている。
Ｖ．免疫検出法
よりさらなる実施形態では、本開示は、チクングニヤウイルスおよびその関連抗原に結合、またはそれらを精製、除去、定量化するための、あるいは一般的に検出するための免疫検出方法に関する。このような方法は従来の意味で適用することもできるが、他の使用としては、ワクチンおよび他のウイルスストックの品質管理およびモニタリングにおける使用であり、この場合、本開示に係る抗体を、ウイルス中のＨＩ抗原の量または完全性（すなわち、長期安定性）を評価するために使用することができる。あるいは、該方法を用いて、様々な抗体を適切な／所望の反応性プロファイルについてスクリーニングすることができる。
いくつかの免疫検出法としては、一部を挙げるだけでも、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線測定アッセイ、フルオロイムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウェスタンブロットが挙げられる。また、特には、サンプル中の特定の寄生生物エピトープ指向性のチクングニヤウイルス抗体の検出および定量のための競合アッセイも提供される。様々な有用な免疫検出法の工程が、例えば、ＤｏｏｌｉｔｔｌｅおよびＢｅｎ−Ｚｅｅｖ（１９９９）、ＧｕｌｂｉｓおよびＧａｌａｎｄ（１９９３）、Ｄｅ Ｊａｇｅｒら（１９９３）、ならびにＮａｋａｍｕｒａら（１９８７）のような科学文献に記載されている。一般に、免疫結合法は、チクングニヤウイルスを含むと疑われるサンプルを得ること、および、場合により免疫複合体を形成させるのに効果的な条件下で、サンプルを本開示に係る第１の抗体と接触させることを含む。
これらの方法は、サンプルからチクングニヤウイルスまたは関連する抗原を精製するための方法を含む。抗体を、好ましくは、カラムマトリックスの形態のような固体支持体に連結し、チクングニヤウイルスまたは抗原性成分を含むことが疑われるサンプルを、固定化された抗体に適用する。不要な成分をカラムから洗い流して、固定化された抗体と免疫複合体化しているチクングニヤウイルス抗原を残し、次いでこれをカラムから該生物体または抗原を取り出すことによって回収する。
また免疫結合法は、サンプル中のチクングニヤウイルスまたは関連成分の検出およびその量の定量、ならびに結合プロセスの間に形成された任意の免疫複合体の検出および定量のための方法も含む。ここでは、チクングニヤウイルスまたはその抗原を含む疑いのあるサンプルを入手し、該サンプルをチクングニヤウイルスまたはその成分に結合する抗体と接触させた後、形成された免疫複合体を、特定の条件下で検出し、そしてその量を定量する。抗原検出に関して、分析される生物学的サンプルは、組織切片または標本、ホモジネート組織抽出物、血液および血清などの生体液、または糞便もしくは尿のような分泌物などの、チクングニヤウイルスまたはチクングニヤウイルス抗原を含むことが疑われる任意のサンプルであってよい。
選択された生物学的サンプルを、免疫複合体（一次免疫複合体）を形成させるのに効果的な条件下で、そして十分な時間、抗体に接触させることは、一般には、単に抗体組成物をサンプルに添加し、抗体が免疫複合体を形成する、すなわち存在するチクングニヤウイルスまたは抗原に結合するために十分長い時間インキュベートするということである。この後、一般には、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロット、またはウェスタンブロットなどのサンプル−抗体組成物を洗浄して非特異的に結合した抗体種を除去し、一次免疫複合体内に特異的に結合している抗体のみが検出されるようにする。
一般に、免疫複合体形成の検出は当技術分野でよく知られており、様々なアプローチの適用によって達成することができる。これらの方法は、一般に、放射性、蛍光、生物学的、および酵素的タグのいずれかのような標識またはマーカーの検出に基づく。そのような標識の使用に関する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、および第４，３６６，２４１号が挙げられる。当然のことながら、当技術分野で知られているように、第２の抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合の配置のような二次結合リガンドの使用によるさらなる利点も見出すことができる。
検出に用いられる抗体は、それ自体が検出可能な標識に連結されていてもよく、この場合、単にこの標識を検出し、それにより組成物中の一次免疫複合体の量を測定できるようにする。あるいは、一次免疫複合体内に結合した第１の抗体を、該抗体に対する結合親和性を有する第２の結合リガンドによって検出することもできる。これらの場合、該第２の結合リガンドを検出可能な標識に連結してもよい。該第２の結合リガンドは、多くの場合それ自体が抗体であるため、「二次」抗体と称される場合がある。一次免疫複合体を、二次免疫複合体を形成させるのに効果的な条件下および十分な時間、標識された二次結合リガンドまたは抗体と接触させる。次いで、一般には、二次免疫複合体を洗浄して非特異的に結合した標識二次抗体またはリガンドを全て除去し、その後二次免疫複合体中に残っている標識を検出する。
さらなる方法としては、二段階アプローチによる一次免疫複合体の検出が挙げられる。該抗体に対する結合親和性を有する抗体のような第２の結合リガンドを用いて、上記のような二次免疫複合体を形成する。洗浄後、二次免疫複合体を、第２の抗体に対する結合親和性を有する第３の結合リガンドまたは抗体に、この場合も免疫複合体（三次免疫複合体）を形成させるのに効果的な条件下および十分な時間、接触させる。第３のリガンドまたは抗体は検出可能な標識に連結されており、それにより形成された三次免疫複合体を検出できるようにする。この系は、所望によりシグナル増幅をもたらすことができる。
免疫検出の１つの方法は、２つの異なる抗体を使用する。第１のビオチン化抗体を用いて標的抗原を検出し、次に第２の抗体を用いて複合化ビオチンに付着したビオチンを検出する。この方法では、試験すべきサンプルを先ず第１段階の抗体を含有する溶液中でインキュベートする。標的抗原が存在する場合、抗体の一部は抗原に結合してビオチン化抗体／抗原複合体を形成する。次いで、抗体／抗原複合体を、ストレプトアビジン（またはアビジン）、ビオチン化ＤＮＡ、および／または相補的ビオチン化ＤＮＡの連続溶液中でインキュベートし、各工程で抗体／抗原複合体にさらなるビオチン部位を付加することにより増幅する。増幅工程を適切な増幅レベルに達するまで繰り返し、その時点でビオチンに対する第２工程の抗体を含有する溶液中でサンプルをインキュベートする。この第２工程の抗体は、例えば色素生成性基質を用いて組織酵素学的に抗体／抗原複合体の存在を検出するために使用することができる酵素を用いて標識される。適切に増幅することにより、巨視的に視認可能なコンジュゲートを生成することができる。
免疫検出の別の既知の方法は、イムノ−ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を利用する。ＰＣＲ法は、ビオチン化ＤＮＡとのインキュベーションまではＣａｎｔｏｒ法と類似しているが、ストレプトアビジンとビオチン化ＤＮＡのインキュベーションを複数回行う代わりに、ＤＮＡ／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体を、抗体を放出する低ｐＨまたは高塩バッファーで洗い出す。次いで、得られた洗浄液を使用して、適切なプライマーで、適切な対照を用いてＰＣＲ反応を行う。少なくとも理論的には、ＰＣＲの非常に高い増幅能力および特異性を利用して、ただ１つの抗原分子を検出することができる。
Ａ．ＥＬＩＳＡ
イムノアッセイは、最も単純で直接的な意味では、結合アッセイである。特定の好ましいイムノアッセイは、当技術分野で知られている様々なタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片を用いた免疫組織化学的検出も特に有用である。しかしながら、検出はこのような技術に限定されず、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、ＦＡＣＳ解析なども用いることができることは容易に理解されるであろう。
１つの例示的なＥＬＩＳＡでは、本開示の抗体は、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのようなタンパク質親和性を示す選択された表面上に固定化される。次いで、チクングニヤウイルスまたはチクングニヤウイルス抗原を含む疑いのある試験組成物をウェルに添加する。結合および洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去した後、結合した抗原を検出することができる。検出は、検出可能な標識に連結された別の抗チクングニヤウイルス抗体の添加によって達成することができる。この種のＥＬＩＳＡは、単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。また検出は、第２の抗チクングニヤウイルス抗体を添加し、その後該第２の抗体に対する結合親和性を有する第３の抗体（ここで、第３の抗体は検出可能な標識に連結されている）を添加することによって達成することもできる。
別の例示的なＥＬＩＳＡでは、チクングニヤウイルスまたはチクングニヤウイルス抗原を含むことが疑われるサンプルをウェル表面に固定化し、次いで本開示の抗チクングニヤウイルス抗体と接触させる。結合および洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去した後、結合した抗チクングニヤウイルス抗体を検出する。最初の抗チクングニヤウイルス抗体が検出可能な標識に連結されている場合は、免疫複合体を直接検出することができる。またこの場合も、免疫複合体は、第１の抗チクングニヤウイルス抗体に対する結合親和性を有する第２の抗体（ここで、第２の抗体は検出可能な標識に連結されている）を用いて検出することができる。
使用される形式にかかわらず、ＥＬＩＳＡは、コーティング、インキュベーションおよび結合、非特異的に結合した種を除去するための洗浄、ならびに結合した免疫複合体の検出のような共通の特徴を有する。これらについて以下に記載する。
抗原または抗体のいずれかによるプレートのコーティングでは、一般に、プレートのウェルを、抗原または抗体の溶液と共に、一晩または特定時間インキュベートする。次いで、プレートのウェルを洗浄して不完全に吸着した物質を除去する。次いで、ウェルの残りの利用可能な表面を全て、試験抗血清に関して抗原的に中性な非特異的タンパク質で「コーティング」する。これらの非特異的タンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、または粉乳溶液が挙げられる。コーティングにより、固定化表面上の非特異的吸着部位のブロッキングが可能となり、それにより該表面への抗血清の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドが低減される。
ＥＬＩＳＡでは、おそらく、直接的な手順ではなく、二次的または三次的な検出手段を用いることがより慣習的である。したがって、ウェルにタンパク質または抗体を結合させ、バックグラウンドを減少させるために非反応性物質でコーティングし、そして洗浄して非結合物質を除去した後、免疫複合体（抗原／抗体）を形成させるのに効果的な条件下で、固定化表面を試験すべき生物学的サンプルと接触させる。その後免疫複合体の検出には、標識された二次結合リガンドまたは抗体、および、標識三次抗体または第３の結合リガンドと連結した二次結合リガンドまたは抗体が必要である。
「免疫複合体（抗原／抗体）を形成させるのに効果的な条件下」とは、該条件が、好ましくは、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎのような溶液を用いて抗原および／または抗体を希釈することを含むことを意味する。またこれらの添加された薬剤は、非特異的バックグラウンドの減少を助ける傾向もある。
また「適切な」条件は、インキュベーションが効果的な結合を可能にするのに十分な温度でまたは時間行われることを意味する。インキュベーション工程は、典型的には、約１から２から４時間程度、好ましくは２５℃〜２７℃程度の温度であり、または、約４℃程度で一晩としてもよい。
ＥＬＩＳＡにおける全てのインキュベーション工程の後、複合化されなかった物質を除去するために、接触した表面を洗浄する。好ましい洗浄手順としては、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎまたはホウ酸バッファーのような溶液を用いた洗浄が挙げられる。試験サンプルと元々結合している物質との間の特異的免疫複合体を形成させその後洗浄を行うと、極微量の免疫複合体の存在であっても測定することができる。
検出手段を提供するために、第２または第３の抗体は、検出を可能にするための結合された標識を有することになる。好ましくは、該標識は、適切な色素生成性基質と共にインキュベートすると発色する酵素である。したがって、例えば、第１および第２の免疫複合体を、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または水素ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体と、さらなる免疫複合体形成の発達に好都合な時間および条件下（例えば、ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎのようなＰＢＳ含有溶液中、室温で２時間のインキュベーション）で、接触またはインキュベートすることが望ましい。
標識抗体とのインキュベーションと、その後の非結合物質の除去のための洗浄の後、例えば、尿素、またはブロモクレゾールパープル、または２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、または酵素標識がペルオキシダーゼの場合にはＨ２Ｏ２のような色素生成性基質とインキュベートすることにより、標識量を定量する。定量は、その後、例えば可視スペクトル分光光度計を使用して、生成された色の程度を測定することによって達成される。
別の実施形態では、本開示は、競合形式の使用を企図する。これは、サンプル中のチクングニヤウイルス抗体の検出に特に有用である。競合ベースのアッセイでは、既知量の標識された抗体または被分析物を置き換える能力によって、未知量の被分析物または抗体を測定する。したがって、シグナルの定量可能な消失は、サンプル中の未知の抗体または被分析物の量の指標である。
本明細書において本発明者らは、サンプル中のチクングニヤウイルス抗体の量を測定するための標識チクングニヤウイルスモノクローナル抗体の使用を提案する。基本的な構成は、既知量の（検出可能な標識に連結された）チクングニヤウイルスモノクローナル抗体をチクングニヤウイルス抗原または粒子と接触させることを含む。チクングニヤウイルス抗原または生物体は、好ましくは支持体に付着している。標識モノクローナル抗体を支持体に結合させた後、サンプルを添加し、サンプル中の全ての未標識抗体が標識モノクローナル抗体に競合し、それにより置き換えることを可能な条件下でインキュベートする。消失した標識または残存標識のいずれかを測定することにより（そして元の結合標識の量からそれを差し引くことにより）、非標識抗体がどれくらい支持体に結合しているか、そしてそれにより、サンプル中にどのくらいの抗体が存在しているかを測定することができる。
Ｂ．ウェスタンブロット
ウェスタンブロット（あるいは、タンパク質イムノブロット）は、所与の組織ホモジネートまたは抽出物のサンプル中の特定のタンパク質を検出するために使用される分析技術である。これは、ゲル電気泳動を用いて、ポリペプチドの長さ（変性条件）またはタンパク質の３−Ｄ構造（天然／非変性条件）により天然または変性タンパク質を分離する。次いで、タンパク質を膜（典型的にはニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）に移行させ、そこで該タンパク質を、標的タンパク質に特異的な抗体を用いてプローブ（検出）する。
サンプルは組織全体または細胞培養物から採取することができる。ほとんどの場合、固体組織を先ず、ブレンダーを用いて（サンプル量の多い場合）、ホモジナイザーを用いて（少量の場合）、または超音波処理により機械的に破壊する。また、上記の機械的方法のうちの１つによって細胞を破り開いてもよい。しかしながら、細菌、ウイルス、または環境サンプルがタンパク質供給源となる場合もあり、したがってウェスタンブロッティングは細胞研究のみに限定されるものではないことに留意されたい。種々の界面活性剤、塩、バッファーを使用して、細胞の溶解を促進し、タンパク質を可溶化することができる。自己の酵素によるサンプルの消化を防ぐために、プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤がしばしば添加される。タンパク質の変性を避けるために組織の調製はしばしば低温で行われる。
ゲル電気泳動を用いてサンプルのタンパク質を分離する。タンパク質の分離は、等電点（ｐＩ）、分子量、電荷、またはこれらの因子の組み合わせにより行うことができる。分離の種類は、サンプルの処理およびゲルの性質に依存する。これはタンパク質の決定に非常に有用な方法である。また、単一サンプルのタンパク質を２次元に展開する２次元（２−Ｄ）ゲルを使用することも可能である。タンパク質は、１次元目では等電点（タンパク質が中性正味電荷を有するｐＨ）により、そして２次元目では分子量により分離される。
タンパク質を抗体検出に利用できるようにするために、タンパク質をゲル内からニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）でできた膜上に移行させる。膜をゲルの上に置き、その上に濾紙の束を置く。束全体をバッファー溶液に入れると、バッファーは、タンパク質を伴って、毛管作用によって紙の中を上に移動する。タンパク質を移行させる別の方法はエレクトロブロッティングと呼ばれ、電流を用いて、タンパク質をゲルからＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に引き込む。タンパク質は、ゲル中で有していた構造を維持しながら、ゲル中から膜上に移動する。このブロッティングプロセスの結果として、タンパク質は、検出のために薄い表層に露出される（下記を参照されたい）。いずれの膜も非特異的タンパク質結合特性を有する（すなわち、全てのタンパク質に同等に良好に結合する）ことから、様々な膜を選択することができる。タンパク質の結合は、膜とタンパク質との間の疎水性相互作用、そして荷電相互作用に基づく。ニトロセルロース膜はＰＶＤＦよりも安価であるが、はるかに脆弱であり、プロービングの繰り返しにあまり持ちこたえることができない。タンパク質のゲルから膜への移動の均一性および全体的な有効性は、膜をクマシーブリリアントブルーまたはポンソーＳ色素で染色することによって確認することができる。タンパク質は、移行された後、標識一次抗体を用いて、または、未標識一次抗体に続き一次抗体のＦｃ領域に結合する標識プロテインＡまたは二次標識抗体を用いる間接的検出を用いて検出される。
Ｃ．免疫組織化学
また本開示の抗体は、免疫組織化学（ＩＨＣ）による研究のために作製された新鮮凍結組織ブロックおよび／またはホルマリン固定、パラフィン包埋組織ブロックのいずれとも組み合わせて用いることもできる。これらの粒子標本から組織ブロックを作製する方法は、これまでの様々な予後因子のＩＨＣ研究において成功裡に使用されており、当業者によく知られている（Ｂｒｏｗｎら、１９９０；Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏら、１９９０；Ａｌｌｒｅｄら、１９９０）。
凍結切片は、簡潔には、小さなプラスチックカプセル中で、凍結「粉砕（ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｄ）」組織５０ｎｇを室温でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再水和し；遠心分離によって粒子をペレット化し；それらを粘性の包埋媒体（ＯＣＴ）中に再懸濁し；カプセルを倒立させ、および／もしくは遠心分離によって再度ペレット化し；−７０℃のイソペンタン中で急速凍結し；プラスチックカプセルを切断し、および／もしくは凍結した円筒状の組織を取り出し；クライオスタットミクロトームチャック上に円筒状の組織を固定し；ならびに／または、カプセルから２５〜５０個の連続切片を切り出すことによって作製することができる。あるいは、凍結組織サンプル全体を連続切片の切り出しに使用してもよい。
永久切片は、サンプル５０ｍｇをプラスチック微量遠心チューブ中で再水和し；ペレット化し；１０％ホルマリン中で再懸濁して４時間固定化し；洗浄／ペレット化し；温めた２．５％アガー中に再懸濁し；ペレット化し；冷水中で冷却してアガーを固化させ；組織／アガーブロックをチューブから取り出し；ブロックをパラフィンで浸潤させおよび／または包埋し；および／または最大５０個の連続永久切片を切り出すことを含む同様の方法によって作製することができる。この場合も、組織サンプル全体を置換してもよい。
Ｄ．免疫検出キット
なおさらなる実施形態では、本開示は、上記の免疫検出法と共に使用するための免疫検出キットに関する。抗体はチクングニヤウイルスまたはチクングニヤウイルス抗原の検出に用いることができるため、該抗体をキットに含めることができる。したがって、免疫検出キットは、好適な容器手段中に、チクングニヤウイルスまたはチクングニヤウイルス抗原に結合する第１の抗体、および場合により免疫検出試薬を含むこととなる。
特定の実施形態では、チクングニヤウイルス抗体は、カラムマトリックスおよび／またはマイクロタイタープレートのウェルのような固体支持体に予め結合させることができる。キットの免疫検出試薬は、所与の抗体に結合または連結された検出可能な標識などの様々な任意の形態とすることができる。二次結合リガンドに結合または付着した検出可能な標識も企図される。例示的な二次リガンドとしては、第１の抗体に対して結合親和性を有する二次抗体がある。
本キットで使用するためのさらに好適な免疫検出試薬としては、第１の抗体に対する結合親和性を有する二次抗体を、該第２の抗体に対する結合親和性を有する第３の抗体（第３の抗体は検出可能な標識に連結されている）と共に含む二成分試薬が挙げられる。上記のように、多くの例示的な標識が当技術分野において知られており、このような標識は全て本開示と関連して使用することができる。
キットは、検出アッセイのための標準曲線の作成に使用することができるように、チクングニヤウイルスまたはチクングニヤウイルス抗原（標識化されていても未標識でもよい）の適切に分注された組成物をさらに含むことができる。キットは、抗体−標識コンジュゲートを、完全にコンジュゲートされた形態か、中間体の形態か、またはキットの使用者によってコンジュゲートすべき別個の部分構造として、含むことができる。キットの構成要素は、水性媒体中または凍結乾燥形態のいずれかにパッケージ化することができる。
キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器を含むこととなり、その中に抗体を入れるか、または好ましくは適切に分注する。また本開示のキットは、典型的には、抗体、抗原、および任意の他の試薬容器を、市販用に厳重に密閉して収容するための手段も含む。そのような容器としては、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器を挙げることができ、所望のバイアルをその中に保持する。
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、好ましい実施形態を示すために含まれる。当業者であれば、以下の実施例に開示された技術は、本発明者らが、実施形態の実施において良好に機能することを発見した技術を表すものであり、したがって、その実施のための好ましい様式を構成するものとみなすことができることを理解されるはずである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態において様々な変更を行うことができ、それでもなお、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果が得られることを認識するはずである。
材料および方法
ヒトｍＡｂの単離。スリランカで記録された症候性ＣＨＩＫＶ感染の約５年後のヒトからＰＢＭＣを得た。Ｂ細胞をＣｐＧの存在下でＥＢＶを含む３８４−ウェルプレートで形質転換した。得られたＢ細胞リンパ芽球細胞株由来の上清を、抗原として生ＣＨＩＫＶワクチン株１８１／２５ウイルスを用いたＥＬＩＳＡによってヒトＣＨＩＫＶ特異的結合抗体の存在についてスクリーニングした。形質転換Ｂ細胞を収集し、骨髄腫細胞株に融合させ、培養プレートに分配して増殖させ、ウアバインを含むヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地中で増殖させることにより選択した。ハイブリドーマを単一細胞ソーティングによりクローニングした。無血清培地中で増殖しているクローン化ハイブリドーマ由来の上清を収集し、清澄化培地からプロテインＧクロマトグラフィーを用いて精製および濃縮した。
中和アッセイ。精製ＩｇＧ ｍＡｂタンパク質を、ＣＨＩＫＶウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）、または様々な遺伝的および地理的プロファイルを表す４種の生チクングニヤウイルスを用いて、中和活性について試験した。ＧＦＰをコードするＣＨＩＫＶ ＶＲＰを、ＣＨＩＫＶ株ＳＬ１５６４９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＵ１８９０６１．１）ゲノム配列の完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドに基づく３プラスミドＣＨＩＫＶレプリコンヘルパー系の開発により、ＰＣＲベースのクローニング法を用いて作製した。ＶＲＰをｍＡｂと共に希釈液中でインキュベートし、次いでベロ（Ｖｅｒｏ）８１細胞単層上に１８時間接種し；感染細胞および（核マーカーで同定される）全細胞を蛍光イメージングシステムで同定した。ｍＡｂの幅（ｂｒｅａｄｔｈ）および中和効力を決定するために、本発明者らは、各ＣＨＩＫＶ遺伝子型から少なくとも１つの代表的な株を用いて、３つの遺伝子型からプロトタイプウイルスそれぞれ１株と、現在のカリブ海型の大発生からの株とを含む、４つの代表的な生ウイルス株を使用した。中和活性は、フォーカス減少中和試験（ｆｏｃｕｓ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）で測定した。精製ヒトｍＡｂの連続希釈液をＣＨＩＫＶ １００フォーカス形成単位と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＭＡｂ−ウイルス複合体を９６ウェルプレート中のベロ細胞に添加し、次いで細胞固定後に免疫ペルオキシダーゼ検出法を用いてプラークを検出し、そしてＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．０．３７マクロアナライザー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ）を用いて定量した。抗体の非存在下でＣＨＩＫＶを接種したウェルとの比較後、非線形回帰分析を用いてＥＣ５０値を計算した。
Ｅ２ ＥＬＩＳＡ。組換えＣＨＩＫＶ Ｅ２エクトドメインタンパク質（ＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６株に対応）を大腸菌で産生し、マイクロタイタープレートに吸着させた。ヒトｍＡｂを適用し、結合したＣＨＩＫＶ特異的ｍＡｂをビオチンコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧで検出した。
競合結合アッセイ。本発明者らは、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄバイオセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）の抗ペンタＨｉｓバイオセンサチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＃１８−５０７７）に取り付けられたポリヒスチジンタグを含むＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６ Ｅ２エクトメインタンパク質への結合について抗体のペアを競合させることにより、同一の主要抗原部位に結合する抗体のグループを同定した。
エピトープマッピングのためのアラニンスキャニング変異導入法。Ｃ末端Ｖ５タグを有するＣＨＩＫＶエンベロープタンパク質発現コンストラクト（株Ｓ２７、Ｕｎｉｐｒｏｔリファレンス＃Ｑ８ＪＵＸ５）をアラニンスキャニング変異導入法に供して包括的変異ライブラリを作製した。プライマーを、エンベロープタンパク質のＥ２、６Ｋ、およびＥ１領域内（構造ポリタンパク質の残基Ｙ３２６〜Ｈ１２４８）の各残基をアラニンに変異させるように設計し；アラニンコドンをセリンに変異させた。合計で、９１０個のＣＨＩＫＶエンベロープタンパク質変異体を作製した。高スループットフローサイトメーターで検出される細胞蛍光を用いた免疫蛍光結合アッセイを用いて、各コンストラクトに対するｍＡｂの結合の消失を試験した。
中和のメカニズム。ＭＡｂをベロ８１細胞への付着の前または後にＶＲＰと相互作用させ、次いで、ＶＲＰ中和アッセイについて記載したとおり、細胞を染色、画像化、そして分析して、ｍＡｂがどの段階で抗ウイルス効果を発揮するのかを決定した。細胞と細胞の融合アッセイ（ｆｕｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｗｉｔｈｉｎ ａｓｓａｙ）および外部からの融合アッセイ（ｆｕｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｓｓａｙ）を補足実験手順で詳述したように行った。
マウスにおけるインビボ防御試験。Ｉｆｎａｒ−／−のマウスを無菌動物施設で飼育し、感染実験をＡ−ＢＳＬ３施設で行った。足蹠注射は麻酔下で行った。予防研究については、ヒトｍＡｂを、腹腔内注射により、６週齢のＩｆｎａｒ−／−マウスに、ＣＨＩＫＶ−ＬＲ １０ＦＦＵを足蹠に皮下接種する１日前に投与した。治療研究については、ＣＨＩＫＶ−ＬＲ １０ＦＦＵを、ヒトｍＡｂを、特定の用量で、個別にまたは組み合わせて投与する２４、４８、または６０時間前に送達した。
ヒト対象および末梢血細胞の単離。２００６年１０月にＣＨＩＫＶ感染を示した以外は健常な成人対象。ＣＨＩＫＶ感染の症状は、１年間のスリランカ訪問からの帰国と一致しており、この間、患者は、都市部（主にコロンボ）と、熱帯雨林および沿岸地域を含む地方環境とに滞在していた。患者は訪問期間中に昆虫咬傷を複数回経験したが、滞在期間中は良好な健康状態を維持していた。米国に帰国した際、対象は、かかりつけ医に、熱（１０２°Ｆ）が３日間持続していることを訴えた。患者は、全身的な「体の痛み」と頭痛を伴った、両側の肘および指の関節痛、ならびに、背中と腹部の隆起した非掻痒性の発疹が同時に発症していることを報告した。患者は診察時には健康で急迫症状は無いように見えた。軽度の白化した丘疹発疹が背中、胸部および腹部に広がっていた（図４参照）。軽度の結膜炎が認められた。骨格検査では、触ると痛みを感じる指、膝および肘の腫れが顕著であったが、紅斑や滲出物はなかった。罹患した関節の筋力および可動域は損なわれていなかったが、関節の動きにより痛みが誘発された。
ＣＢＣ、血清学的検査、およびマラリア塗抹標本用に採血し、患者を退院させた。白血球数は４．０×１０４細胞／ｍｍ３、ヘマトクリットは４１％、そして血小板数は１８０，０００／ｍｍ３であった。総リンパ球数は１．０×１０４細胞／ｍｍ３であった。マラリア塗抹標本および血清学的検査は陰性であり、患者は病因不明なウイルス性疾患を有すると仮診断された。
患者は２週間後に再度来院し、熱は無かったが、手指において最も顕著な持続性の関節痛があった。患者は、前回の訪院時に比べて、痛みとこわばりは改善しておらず、おそらく悪化していると説明した。患者は、以前旅行した地域でチクングニヤ熱の大発生が起きていることを報告した。採血して血清を分離し、ＰＣＲおよび血清学的検査のためにＣＤＣに送り、これにより、チクングニヤ熱の感染の診断が確定した。
感染の兆候から５年半後の２０１２年４月に、Ｆｉｃｏｌｌの密度勾配分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離したが、米国に居住していたその間の期間には、ＣＨＩＫＶまたは他の関節炎誘発性アルファウイルスへの認識している暴露はなかった。細胞を凍結保存し、試験まで液体窒素中で保存した。被験者募集および対象からの血液サンプルの採取のためのプロトコールは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校およびヴァンダービルト大学医療センターの治験審査委員会による承認を受けたものである。
ヒトハイブリドーマの作製。凍結保存ＰＢＭＣサンプルを、記載されているように、３７℃で迅速に解凍し洗浄してから、エプスタイン−バーウイルスで形質転換した（Ｓｍｉｔｈら、２０１２）。培養物を３７℃、５％ＣＯ２で１０日間インキュベートし、ＶＲＰ中和アッセイおよびＥＬＩＳＡを用いて、上清中にＣＨＩＫＶ特異的抗体を分泌する細胞の存在についてスクリーニングした。本発明者らは、同一の血液サンプルの別々のアリコートを用いて２つの独立した形質転換を行った。
１回目の形質転換では、本発明者らは、培養物当たり平均４２個の形質転換Ｂ細胞コロニーを含む３，８４０個の培養物（１０×３８４ウェルプレート）を、推定で合計約１６１，０００個のＢ細胞コロニーのために樹立した。本発明者らは、ＢＳＬ２条件下でＣＨＩＫＶに対する中和活性を示す抗体をスクリーニングするために、緑色蛍光タンパク質をレポーターとして発現するＣＨＩＫＶレプリコン粒子（ＶＲＰ）を用いたハイスループット蛍光減少中和アッセイを開発した。ＶＲＰは、天然のウイルス糖タンパク質を提示するが、完全長ウイルスゲノムを欠いており、そのため感染性の子孫を生み出すことができないビリオンである（Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎら、２０１２）。本発明者らは２００６年にスリランカから単離されたＳＬ１５６４９株由来のＶＲＰ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２０１１）を使用した。ＳＬ１５６４９は、ドナーに感染した株と同時期に発生した株であり、配列が非常に類似している可能性が高い。この実験から、本発明者らは、阻害率９０％で中和を媒介する上清を有する１６０個のＢ細胞培養物を同定し、これは、全Ｂ細胞あたり０．０９９％（約１，０００分の１）のウイルス特異的Ｂ細胞の発生率を示唆する。これらの株のうち合計で６０個が９８％を超えるレベルで阻害し、二次スクリーニングでは６０個中５８個の上清に、ＥＬＩＳＡにおいてイムノアッセイプレートに捕捉された細胞培養物産生ＣＨＩＫＶ（株１８１／２５）に結合する抗体が含まれていた。本発明者らは、ハイブリドーマ融合のために、この５８個の中で、最も高い中和能および結合活性を有する３５個を選択し、融合およびプレーティング後にウイルス結合上清を有する２２個のハイブリドーマを同定し、そして、さらなる研究のために１４クローンを成功裡に単離した。２回目の形質転換では、本発明者らは、培養物当たり平均３８個の形質転換Ｂ細胞コロニーを含む１，５３６個の培養物（４×３８４ウェルプレート）を、試験した推定合計約５８，０００個のＢ細胞コロニーのために樹立し、０．１％（今回も、約１，０００分の１）のウイルス特異的Ｂ細胞の発生頻度が示唆された。この実験において、本発明者らは、事前に中和試験を行わずに、ＣＨＩＫＶ株１８１／２５に結合するＥＬＩＳＡの一次スクリーニングを用いた。本発明者らは、ＥＬＩＳＡ光学密度シグナルがバックグラウンドレベルの４倍を超える６０株を同定し、融合用に、ＥＬＩＳＡにおいて光学密度シグナルが最も高い３０個のＢ細胞株を選択し、融合およびプレーティング後にウイルス結合上清を有する１８個のハイブリドーマを同定し、そして、さらなる研究のために１６クローンを成功裡に単離した。
骨髄腫細胞との融合。ＣＨＩＫＶ感染を中和することができる上清を有するウェル由来の細胞を、記載されているように、ＨＭＭＡ２．５非分泌性骨髄腫細胞と融合させた（Ｓｍｉｔｈら、２０１２）。得られたハイブリドーマを、ウアバイン含有ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地中で増殖させることにより選択し、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、単一細胞ＦＡＣＳにより生物学的にクローニングし、増殖させた。
ヒトｍＡｂの産生および精製。ＣＨＩＫＶ特異的抗体を産生するハイブリドーマを含むウェルを、３ラウンドの限界希釈により、またはＣｌｏｎｅＰｉｘ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて製造業者の指示に従って、クローニングした。個々のクローンが得られたら、各ハイブリドーマを７５ｃｍ２フラスコ中で５０％コンフルエントになるまで増殖させた。抗体発現のために細胞をセルスクレーパーで収集し、無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製ＧＩＢＣＯ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ、１２０４５０８４）で洗浄し、無血清培地２５０ｍＬを含む２２５ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、４３１０８２）４個に均等に分配した。細胞を２１日間インキュベートした後、培地を遠心分離により清澄化し、０．２μｍの滅菌フィルターを通した。清澄化した培地から抗体をプロテインＧクロマトグラフィー（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ）によって精製した。
細胞。ＢＨＫ−２１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％トリプトースホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を含有するように補充したアルファ最小必須培地（αＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。ベロ８１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）を５％ＦＢＳを含むように補充したαＭＥＭ中で維持した。全ての細胞の培地は、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）０．２９ｍｇ／ｍＬ、ペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）１００μｇ／ｍＬ、およびアンホテリシンＢ ５００ｎｇ／ｍＬを含有するように補充した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で維持した。
ＣＨＩＫＶ ＶＲＰプラスミドコンストラクトの作製。ＰＣＲベースのクローニング法を用いて、ＣＨＩＫＶ株ＳＬ１５６４９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＵ１８９０６１．１）ゲノム配列の完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドから３プラスミドＣＨＩＫＶレプリコンヘルパーシステムを得た。ＣＨＩＫＶレプリコンゲノムは、多重クローニングサイト（ＭＣＳ）で置換されたＣＨＩＫＶ完全長構造カセットを有する中間クローニングベクターの作製を含む２段階プロセスを用いて構築した。改変型（ｅｎｈａｎｃｅｄ）緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をこのプラスミドの多重クローニング部位にサブクローニングしてｐＭＨ４１（ＣＨＩＫＶ ＳＬ１５６４９ ｅＧＦＰレプリコン）を作製した。２プラスミドヘルパーシステムの構築には、先ずＣＨＩＫＶ非構造カセットの大部分（６，８９１ｎｔ）の除去による完全長構造遺伝子ヘルパープラスミドの作製を含む多段階クローニングプロセスが含まれた。完全長構造カセットをさらに２つのコンストラクト、すなわち、キャプシド遺伝子配列とそれに続く固有ＡｖｒＩＩ制限部位とを含むｐＭＨ３８（ＣＨＩＫＶ ＳＬ１５６４９キャプシドヘルパー）、および、カプシドＲＮＡ結合ドメインのインフレーム欠失と、それに続くインタクトなエンベロープ糖タンパク質（Ｅ３−Ｅ１）コード配列とを含むｐＭＨ３９（ＣＨＩＫＶ ＳＬ１５６４９糖タンパク質ヘルパー）に細分した。
組換えＣＨＩＫＶｐ６２−Ｅ１産生。ＣＨＩＫＶｐ６２（すなわち、Ｅ３［ａａＳ１−Ｒ６４］−Ｅ２［ａａＳ１−Ｅ３６１］−１６アミノ酸リンカー−Ｅ１［ａａＹ１−Ｑ４１１］に続くＨｉｓタグ）を含むプラスミド（Ｖｏｓｓら、２０１０）を、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。７２時間のインキュベーションの後、上清を除去し、細胞をさらに７２時間培養した。プールした上清をニッケルアガロースビーズカラム（ＧｏｌｄＢｉｏ）にロードし、イミダゾールで溶出した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてタンパク質をさらに精製した。ＣＨＩＫＶ ｐ６２−Ｅ１タンパク質を含有する画分をプールし、凍結し、−８０℃で保存した。
ＣＨＩＫＶ株ＳＬ１５６４９由来のＶＲＰストックの製造。ＶＲＰストックを、組換えＣＨＩＫＶプラスミドから、ヴァンダービルト大学環境保健安全部門（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｈｅａｌｔｈ， ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ）およびヴァンダービルト施設バイオセーフティ委員会（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたプロトコールに従って、認定生物学的安全性レベル３（ＢＳＬ３）施設において生物学的安全キャビネット中で回収した。３つのＳＬ１５６４９レプリコン系プラスミドをＮｏｔＩ−ＨＦで消化することにより線状化し、フェノール−クロロホルム抽出により精製し、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ ＳＰ６転写キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた転写反応の鋳型として用いて、キャップされた完全長ＲＮＡ転写物をインビトロで生成した。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーターを用いたエレクトロポレーションにより、ウイルスＲＮＡ転写物をＢＨＫ２１細胞に導入した。ＶＲＰを含む培養上清をエレクトロポレーションの２４時間後に収集し；上清を８５５×ｇで２０分間遠心分離することにより清澄化し、分注し、そして−８０℃で保存した。ＶＲＰストックを、伝播能を有する組換えウイルスについて、ベロ８１細胞を用い、ストック２０％と継代１代目の培養上清１０％とを連続継代し、感染７２時間後の細胞変性効果（ＣＰＥ）について検査することにより評価した。ストックは、最終継代でＣＰＥが検出されなかった場合に、本安全性試験に合格したとみなした。その後ストックをＢＳＬ３実験室から取り出した。
ＶＲＰ中和およびＧＦＰレポーターアッセイ。ベロ８１細胞（２．２５×１０３細胞／ウェル）を３８４ウェルプレートのウェルに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。未希釈の（ｎｅａｔ）ハイブリドーマ上清または精製ｍＡｂの連続希釈液を、ＶＲＰと共に、約５感染単位／細胞のＭＯＩで、ウイルス希釈バッファー（ＶＤＢ；１％ＦＢＳを含むように補充した２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有ＲＰＭＩ培地）中、３７℃で１時間インキュベートし、次いで細胞に吸着させた。細胞を３７℃で１８時間インキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色で染色して核を標識し、ヴァンダービルトハイスループットスクリーニング施設でＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ ＸＬイメージングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して画像化した。全細胞および（ＧＦＰ発現により標識された）ＣＨＩＫＶ感染細胞を、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ウェルあたり２つの視野で定量した。各抗体について、９５％信頼区間におけるＥＣ５０値を、非線形回帰を用いて、Ｒ統計プログラム（Ｒ．Ｃ．Ｔｅａｍ、２０１４）を用いて別々のロジスティック増殖曲線に当てはめて決定した。
ＥＬＩＳＡ用の抗原として製造したウイルスストック。ＣＨＩＫＶワクチン株１８１／２５のための感染性クローンプラスミド（Ｌｅｖｉｔｔら、１９８６、およびＭａｉｎｏｕら、２０１３）をＮｏｔＩ−ＨＦで線状化し、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ ＳＰ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてインビトロで転写した。ウイルスＲＮＡをエレクトロポレーションによりＢＨＫ２１細胞に導入した。培養上清を２４時間後に収集し、８５５×ｇ、２０分間の遠心分離によって清澄化し、分注し、そして−８０℃で保存した。
ハイブリドーマスクリーニングのためのウイルス捕捉ＥＬＩＳＡ。ウイルス粒子への抗体結合は、０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３および０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．３の結合バッファー中１μｇ／ｍＬで調製した精製マウスｍＡｂ ＣＨＫ−１８７（Ｐａｌら、２０１３）でアッセイプレートをコーティングすることにより行い、これを用いてＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ２４２７５７）をコートし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをブロッキングバッファー（Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ［ＰＢＳ−Ｔ］中、粉乳１％およびヤギ血清２％）と共に１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＣＨＩＫＶワクチン株１８１／２５に感染させた単層ＢＨＫ２１細胞の培養上清２５μＬと共にインキュベートした。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳで１０回洗浄し、Ｂ細胞培養上清１０μｌを２５μＬ／ウェルのブロッキングバッファーに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。アルカリホスファターゼにコンジュゲートした二次抗体（ヤギ抗ヒトＦｃ；Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗ９９００８Ａ）を、２５μＬ／ウェルのブロッキングバッファー中に１：５，０００希釈で適用し、プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した後、ホスファターゼ基質溶液（１Ｍトリスアミノメタン中ホスファターゼ基質１ｍｇ／ｍＬ［Ｓｉｇｍａ、Ｓ０９４２］）を２５μＬ／ウェルで添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした後、４０５ｎｍでの光学密度をＢｉｏｔｅｋプレートリーダーを用いて測定した。
ＣＨＩＫＶ特異的対照ヒトｍＡｂ。いくつかのアッセイにおいて、２つの既述のヒトＣＨＩＫＶ特異的ｍＡｂ、５Ｆ１０および８Ｂ１０（Ｗａｒｔｅｒら、２０１１）を陽性対照として用いた。これらのｍＡｂは、Ｃｈｅｎｇ−Ｉ ＷａｎｇおよびＡｌｅｓｓａｎｄｒａ Ｎａｒｄｉｎ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｎｅｔｗｏｒｋ、Ａ＊ＳＴＡＲ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）によって提供された配列に基づく５Ｆ１０および８Ｂ１０抗体可変遺伝子領域の配列最適化ｃＤＮＡを含むＩｇＧ１発現プラスミド（Ｌｏｎｚａ）を用いてトランスフェクションした後、２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で発現させた。
Ｅ２タンパク質へのｍＡｂ結合のＥＬＩＳＡ。組換えＣＨＩＫＶ Ｅ２エクトドメインタンパク質（ＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６株に対応する）を記載されているように大腸菌で生成し（Ｐａｌら、２０１３）、４℃で一晩、マイクロタイタープレートに吸着させた（０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、および０．１％ＮａＮ３［ｐＨ９．３］中２μｇ／ｍＬのＥ２タンパク質溶液を１００μＬ）。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで３回リンスし、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および２％［ｗ／ｖ］ＢＳＡ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。一次ヒトｍＡｂ（ブロッキングバッファーに１０μｇ／ｍＬに希釈）を室温で１時間ウェルに添加した。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで３回リンスし、二次抗体（ブロッキングバッファー中に１／２０，０００で希釈した、マウス血清タンパク質に対する交差反応性が最小のビオチンコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ鎖およびＬ鎖）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））およびストレプトアビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ中に希釈；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、それぞれ室温で１時間、連続して添加し、各工程の間にプレートをリンスした。ＰＢＳで４回リンスした後、プレートを室温でＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）色素生成性基質溶液（Ｄａｋｏ）１００μＬと共に５分間インキュベートし、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を停止させた。生成物強度をＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの光学密度で測定した。
表面プラズモン共鳴による親和性測定。精製ヒトｍＡｂとＣＨＩＫＶタンパク質との相互作用を、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００装置を用いて記載されたように動態学的に分析した（Ａｕｓｔｉｎら、２０１２）。可溶性ＣＨＩＫＶ ｐ６２−Ｅ１を用いたインタクトＩｇＧでは、抗ヒトＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５チップ上に固定し、抗ＣＨＩＫＶ抗体または対照抗体（ｈｕ−ＷＮＶ Ｅ１６）を捕捉するために使用した。ＣＨＩＫＶ ｐ６２−Ｅ１を表面上に６５μＬ／分で１８０秒間注入し、１０００秒間解離させた後、サイクル間に３Ｍ ＭｇＣｌ２で再生させた。いくつかの抗体は単量体Ｅ１タンパク質に結合しなかったため、本発明者らはそれらをＶＬＰへの結合について試験した。ＣＨＩＫＶ ＶＬＰによる動態測定については、抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を固定化して、ナノモル以下の親和性を有するマウス抗ＣＨＩＫＶ抗体のセットを捕捉し、次にこれを使用してＣＨＩＫＶ ＶＬＰを捕捉した。抗ＣＨＩＫＶ ＩｇＧまたはＦａｂをチップ表面上に６５μＬ／分で１８０秒間注入し、１０００秒間解離させた後、サイクル間に１０ｍＭグリシンｐＨ１．７で再生させた。全データを、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア（バージョン１．１．１）および該曲線のグローバル１：１ ラングミュアフィットを使用して処理した。結果は、少なくとも３回の独立した実験から得た。
フォーカス減少中和試験に使用されるウイルス株。ｍＡｂの幅および中和能を決定するために、本発明者らは、各ＣＨＩＫＶ遺伝子型から少なくとも１つの代表的な株を用いて、３つの遺伝子型からプロトタイプウイルスそれぞれ１株と、現在のカリブ海型の大発生からの株とを含む、４つの代表的な株を使用した。ＬＲ２００６＿ＯＰＹ１（ＬＲ）株（ＣＨＩＫＶ東／中央／南アフリカ［ＥＣＳＡ］遺伝子型）はＳｔｅｐｈｅｎ Ｈｉｇｇｓ（Ｍａｎｈａｔｔａｎ、ＫＳ）より提供された。株ＮＩ ６４ ＩｂＨ ３５（西アフリカ遺伝子型）ならびに株ＲＳＵ１および株９９６５９（アジア遺伝子型；英国バージン諸島の対象から２０１４年に単離された（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ＆Ｖａｌａｄｅｒｅ、２０１４））はＲｏｂｅｒｔ Ｔｅｓｈ（Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｒｂｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ、ＴＸ）より提供された。
感染性ＣＨＩＫＶを用いたフォーカス減少中和試験（ＦＲＮＴ）。精製ヒトｍＡｂの連続希釈液をＣＨＩＫＶ １００フォーカス形成単位（ＦＦＵ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。ｍＡｂ−ウイルス複合体を９６ウェルプレート中のベロ細胞に添加した。９０分間のインキュベーション後、２％ＦＢＳを含むように補充した改変イーグル培地（ＭＥＭ）中の１％（ｗ／ｖ）メチルセルロースで細胞を覆った。細胞を１８時間インキュベートし、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を、５００ｎｇ／ｍＬのマウスＣＨＫ−１１（Ｐａｌら、２０１３）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧと共に、順次、０．１％サポニンおよび０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むよう補充したＰＢＳ中でインキュベートした。ＣＨＩＫＶ感染病巣をＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）を用いて視覚化し、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．０．３７マクロアナライザー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ）を用いて定量した。抗体の非存在下でＣＨＩＫＶを接種したウェルとの比較後、非線形回帰分析を用いてＥＣ５０値を計算した。
バイオレイヤー干渉法競合結合アッセイ。ポリヒスチジンタグ含有ＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６ Ｅ２エクトドメインタンパク質（２０μｇ／ｍＬ）を抗ペンタＨｉｓバイオセンサチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＃１８−５０７７）上に２分間固定化した。ベースラインシグナルをキネティクスバッファー（ＫＢ、１×ＰＢＳ、０．０１％ＢＳＡおよび０．００２％Ｔｗｅｅｎ２０）中で１分間測定した後、バイオセンサチップを、一次抗体を濃度１００μｇ／ｍＬで含むウェルに５分間、次いで競合ｍＡｂを濃度１００μｇ／ｍＬで含むウェルに５分間浸漬した。第１のｍＡｂの存在下での競合ｍＡｂの結合率を、最初のｍＡｂ複合体の後に適用した競合ｍＡｂの最大シグナルを競合ｍＡｂ単独の最大シグナルと比較することにより測定した。競合ｍＡｂの最大結合が単独の結合親和性の３０％未満に減少した場合、該抗体は同一部位への結合について競合すると判定した。競合ｍＡｂの最大結合が非競合結合の７０％を超える場合、該抗体を非競合とみなした。非競合結合の３０〜７０％のレベルは、中間的競合とみなした。
変異導入エピトープマッピング。Ｃ末端Ｖ５タグを有するＣＨＩＫＶエンベロープタンパク質発現コンストラクト（株Ｓ２７、Ｕｎｉｐｒｏｔリファレンス＃Ｑ８ＪＵＸ５）をアラニンスキャニング変異導入法に供して包括的変異ライブラリを作製した。プライマーを、エンベロープタンパク質のＥ２、６Ｋ、およびＥ１領域内（構造ポリタンパク質の残基Ｙ３２６〜Ｈ１２４８）の各残基をアラニンに変異させるように設計し；アラニンコドンをセリンに変異させた（Ｆｏｎｇら、２０１４）。合計で９１０個のＣＨＩＫＶエンベロープタンパク質変異体を作製し（カバレッジ９８．５％）、配列を確認し、３８４ウェルプレートにアレイした。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を３８４ウェルプレートでＣＨＩＫＶ変異ライブラリでトランスフェクトし、２２時間インキュベートした。細胞をカルシウムおよびマグネシウム含有ＰＢＳ（ＰＢＳ＋／＋）中の４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定し、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ；Ｓｉｇｍａ）中に希釈した０．２５〜１．０μｇ／ｍＬの精製ｍＡｂまたは２．５μｇ／ｍＬの精製Ｆａｂフラグメントで染色した。一次抗体濃度を、野生型ＣＨＩＫＶエンベロープタンパク質に対する独立した免疫蛍光滴定曲線を用いて測定してシグナルが確実に線形検出範囲内に含まれるようにした。抗体を、１０％ＮＧＳ中の３．７５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて検出した。細胞を、マグネシウムおよびカルシウムを含まないＰＢＳ（ＰＢＳ−／−）で２回洗浄し、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）含有Ｃｅｌｌｓｔｒｉｐｐｅｒ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）に再懸濁した。平均細胞蛍光を、ハイスループットフローサイトメーター（ＨＴＦＣ、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を用いて検出した。モックトランスフェクト対照からシグナルを差し引き、野生型トランスフェクト対照からのシグナルに対して正規化することにより、各変異体クローンに対する抗体反応性を、野生型タンパク質反応性に対して算出した。対応するアラニン変異体が試験ｍＡｂと反応しないが他のＣＨＩＫＶ抗体と反応した場合、アミノ酸をｍＡｂ結合に必要であると同定した。このカウンタースクリーニング法により、ミスフォールドされた、または発現欠損を有する変異体の排除が容易になる（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２０１３、Ｐａｅｓら、２００９、およびＳｅｌｖａｒａｊａｈら、２０１３）。抗体結合に必要なアミノ酸を、ＣＨＩＫＶエンベロープタンパク質結晶構造（モノマーＰＤＢ ＩＤ＃３Ｎ４１、およびトリマーＰＤＢ ＩＤ＃２ＸＦＢ）上で、ＰｙＭｏｌソフトウェアを用いて視覚化した。
付着前および付着後中和アッセイ。ベロ８１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１；約７．５×１０３細胞／ウェル）を９６ウェルプレートのウェルに播種し、３７℃で約２４時間インキュベートした。付着前アッセイについては、ｍＡｂの希釈液を４℃でウイルス希釈バッファー（ＶＤＢ）中に調製し、ＶＲＰと共に４℃で１時間、事前にインキュベートした。抗体−ウイルス複合体を予冷したベロ８１細胞に４℃で１時間添加した。非吸着ウイルスをＶＤＢで３回洗浄することにより除去し、細胞を完全培地中、３７℃で１８時間インキュベートした。付着後アッセイは、等価ＭＯＩのＶＲＰを最初にベロ８１細胞に４℃で１時間吸着させ、非結合ＶＲＰをウイルス希釈バッファーで３回洗浄して除去し、細胞をｍＡｂの連続希釈液を含む予冷したＶＤＢと共に４℃で１時間インキュベートしたことを除いて、同様に実施した。非結合ｍＡｂをＶＤＢで３回洗浄して除去し、細胞を完全培地中、３７℃で１８時間インキュベートした。細胞を染色し、画像化し、ＶＲＰ中和アッセイについて記載したように、ＧＦＰ発現について分析される細胞がサンプル当たり合計約８００〜１，０００個得られるウェルあたり４つの視野を用いて分析した。
融合阻害アッセイ。原形質膜とのウイルス融合を、ＦＦＷＯアッセイ（Ｅｄｗａｒｄｓ＆Ｂｒｏｗｎ、１９８６）を用いて評価した。ベロ８１細胞（約３．７５×１０３細胞／ウェル）を９６ウェルプレートのウェルに播種し、３７℃で約２４時間インキュベートした。細胞を結合培地（１％ＦＢＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、およびエンドソーム融合による感染を防ぐために２０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌを含有するように補充したＲＰＭＩ１６４０）で１回洗浄し、結合培地中、４℃で１５分間インキュベートした。ＶＲＰを含有する接種源を結合培地中に希釈し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。非結合ＶＲＰを、結合培地で２回洗浄することにより除去した。ＶＤＢ中のｍＡｂの連続希釈液を細胞と共に４℃で１時間インキュベートし、ＶＤＢで２回洗浄することにより非結合ｍＡｂを除去した。予熱した融合培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ＦＢＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、およびｐＨ５．５の３０ｍＭコハク酸）を３７℃で２分間添加することによりＦＦＷＯを誘導した。平行ウェルにおいて、対照培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ＦＢＳ、ｐＨ７．４の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）を３７℃で２分間添加した。培地を除去し、細胞を、５％ＦＢＳ、２０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ（ｐＨ依存性原形質膜融合によってのみ感染が起こることを確実にするため）、および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］を含むように補充したＤＭＥＭ中でインキュベートした。感染１８時間後に、細胞を染色し、画像化し、そして、記載したように、ＧＦＰ発現について分析される細胞がサンプル当たり合計約８００〜１，０００個得られるウェル当たり４つの視野を用いて分析した。
マウスにおけるインビボ防御試験。この試験は、国立衛生研究所の実験動物のケアおよび使用のための手引き（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）の勧告に厳密に従って行った。このプロトコールは、ワシントン大学医学部の施設の動物のケアおよび使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）による承認を受けたものである（承認番号：Ａ３３８１−０１）。Ｉｆｎａｒ−／−マウスをワシントン大学医学部の無菌動物施設で飼育し、ワシントン大学の動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を得てＡ−ＢＳＬ３施設で感染実験を行った。足蹠注射はケタミン塩酸塩およびキシラジンで誘導および維持した麻酔下で行った。予防研究については、ヒトｍＡｂを、腹腔内注射により、６週齢のＩｆｎａｒ−／−マウスに、１％熱不活化ＦＢＳ含有ＨＢＳＳ中に希釈したＣＨＩＫＶ−ＬＲ １０ＦＦＵを足蹠に皮下接種する１日前に投与した。治療研究については、ＣＨＩＫＶ−ＬＲ １０ＦＦＵを、ヒトｍＡｂを特定の用量で個々にまたは組み合わせて単回投与する２４、４８、または６０時間前に送達した。
結果
ＣＨＩＫＶ特異的ヒトｍＡｂの単離。本発明者らは、２００６年にスリランカでＣＨＩＫＶ感染を獲得し、発熱、関節痛、および発疹を呈した１人の個体から、ｍＡｂのパネルを単離した（図４）。臨床経過およびＢ細胞形質転換およびスクリーニング手順は、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｔｈｏｄｓに記載されている。本発明者らは、自然感染後５年半のドナーから採取した単一の血液サンプルから２つの別々の実験でＢ細胞を形質転換した。本発明者らは、全Ｂ細胞１，０００個中約１個の発生率でウイルス特異的Ｂ細胞を認め、Ｂ細胞株からウイルスに結合する抗体を分泌する３０個の安定したハイブリドーマを樹立した。ｍＡｂのパネルは、２４個のＩｇＧ１、３個のＩｇＧ２、および２個のＩｇＧ３と、ハイブリドーマの増殖が不良であったために決定されなかった１つとを含む複数のサブクラスのＩｇＧを含んでいた（表５）。
ｍＡｂ中和の評価。１８個のｍＡｂが、アジア型ＣＨＩＫＶ株ＳＬ１５６４９−ＧＦＰウイルスレポーター粒子（ＶＲＰ）に対して、ＥＣ５０値４０ｎｇ／ｍＬ未満の中和活性を示し、このうち１１個は超高効力の阻害活性を示した（ＥＣ５０値１０ｎｇ／ｍＬ未満、表５）。４個のｍＡｂは阻害活性が弱く（０．１〜５μｇ／ｍＬの範囲のＥＣ５０値）、８個のｍＡｂは試験した最高濃度で阻害活性を有さなかった（ＥＣ５０値１０μｇ／ｍＬ超）。
中和活性の幅。本発明者らは、東／中央／南アフリカ型（ＥＣＳＡ）遺伝子型（ＬＲ２００６ ＯＰＹ１［ＬＲ］株）、西アフリカ型遺伝子型（ＮＩ６４ ＩｂＨ３５株）、およびアジア型遺伝子型（ＲＳＵ１および９９６５９［２０１４年カリブ海］株）の代表的な感染性ＣＨＩＫＶ株に対する各抗体のＥＣ５０値を、ハイスループットフォーカス減少中和試験（ＦＲＮＴ）（Ｐａｌら、２０１３）を用いて測定した。２５個のｍＡｂが少なくとも１つのＣＨＩＫＶ株に対して中和活性を示し（ＥＣ５０値１０μｇ／ｍＬ未満）、このうち、８個のｍＡｂが高効力範囲の中和を示し（ＥＣ５０値１０〜９９ｎｇ／ｍＬ）、１３個のｍＡｂが超高効力範囲の中和を示した（ＥＣ５０値１０ｎｇ／ｍＬ未満）（表５）。本発明者らはまた、比較目的のために、既に報告のある３つの遺伝子型のウイルス全てに対してヒトｍＡｂ ５Ｆ１０および８Ｂ１０を試験し、いずれの場合も、ＥＣ５０値は１００ｎｇ／ｍＬより大きかった（１６１〜１３３７の範囲）。ほとんどの場合、本発明者らが単離したｍＡｂは、３つの遺伝子型のウイルス全てに対して相対的に同程度の中和活性を示した。６個のｍＡｂ（２Ｂ４、２Ｈ１、４Ｊ２１、４Ｎ１２、５Ｍ１６、および９Ｄ１４）は、３つの遺伝子型のウイルス全てを超高活性で阻害した（ＥＣ５０値１０ｎｇ／ｍＬ未満）。これらのデータは、単一の個体が、超高効力で広範な中和能を有する複数のＣＨＩＫＶ特異的抗体を発生させることができることを示している。
Ｅ２タンパク質への結合。ＣＨＩＫＶ Ｅ２タンパク質は、マウス（Ｇｏｈら、２０１３；Ｌｕｍら、２０１３）、非ヒト霊長類（Ｋａｍら、２０１４）、およびヒト（Ｆｏｎｇら、２０１４；Ｋａｍら、２０１２ａ；Ｋａｍら、２０１２ｂ；Ｓｅｌｖａｒａｊａｈら、２０１３）の体液性応答の主要標的である。本発明者らは、ヒトｍＡｂを、大腸菌で発現されたＥ２タンパク質の単量体型エクトドメインへの結合について試験した（Ｐａｌら、２０１３）。９個のｍＡｂがＥ２エクトドメインに強く結合し、６個は中程度の結合を示し、１つは結合が弱く、１４個はバックグラウンドを超える結合を示さなかった（表５）。インビトロでの精製Ｅ２タンパク質への結合能力は、中和能と直接的に相関しなかった（表５）。１７個のヒトｍＡｂのサブセットを、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、哺乳動物細胞由来のｐ６２−Ｅ１タンパク質への結合についての試験した（Ｖｏｓｓら、２０１０）。全てのｍＡｂがｎＭ範囲で結合し、ＫＤ値は０．５〜２０ｎＭであった。結合動態の差は、抗原特異性または機能活性と相関しなかった（表Ｓ１）。
競合結合試験。種々の中和ｍＡｂによって認識される組換えＥ２タンパク質中のオーバーラップしない抗原性領域を同定するために、本発明者らは定量的競合結合アッセイを使用した。また本発明者らは、比較のために、既に報告のある４つのマウスｍＡｂ（ＣＨＫ−８４、ＣＨＫ−８８、ＣＨＫ−１４１、およびＣＨＫ−２６５）（Ｐａｌら、２０１３）、ならびに既に報告のあるヒトｍＡｂ ５Ｆ１０（Ｗａｒｔｅｒら、２０１１）も評価した（図５）。競合パターンは複雑であったが、発明者がグループ１（赤色の四角）、グループ２（青色の四角）、またはグループ３（緑色の四角）と称した３つの主要な競合グループが明らかとなった。また本発明者らは、１つのみのヒトｍＡｂ、５Ｆ１９（オレンジ色の四角）を含む第４のグループも規定した。これらの競合試験は、ＣＨＩＫＶ特異的抗体によって認識される３つの主要な抗原性領域があることを示唆している。
アラニンスキャニング変異導入法を用いたエピトープマッピング。本発明者らは、アラニンスキャニング変異導入ライブラリを、細胞ベースの発現およびフローサイトメトリーと組み合わせて用いて、ＣＨＩＫＶ株Ｓ２７（ＥＣＳＡ遺伝子型）のＥ２およびＥ１タンパク質中の抗体結合に必要なアミノ酸を同定した（Ｆｏｎｇら、２０１４）（図６Ａ〜Ｆ）。２０個のヒトｍＡｂのサブセットについて、ＣＨＩＫＶ糖タンパク質に対する抗体結合に必要な残基を表６に列挙する。これらの２０個のｍＡｂの結合に影響を及ぼす変異を、株Ｓ２７、ならびに、本試験で使用した全てのＣＨＩＫＶ遺伝子型を代表する株の完全長Ｅ２配列のアラインメント中に示す（図１Ａ）。Ｅ２中の結合に影響を及ぼすアミノ酸は、ドメインＡおよびＢ、ならびに、ドメインＡおよびＢを連結するβリボンコネクタのアーチ１および２の溶媒に暴露される領域に主に位置する（Ｖｏｓｓら、２０１０）（図１Ａ）。競合結合分析を用いたアラニンスキャニング変異導入法を用いた結合損失実験によって同定された抗原部位の比較（図５）により、競合グループ１および２は概してドメインＡおよびアーチ内の部位に対応し、一方グループ３はドメインＢ中の領域に対応することが示された。
抗原性領域の構造解析。ドメインＡおよびＢならびにアーチ内の多数の表面残基が少なくとも１つのｍＡｂと接触している（図１Ｂ〜Ｃ）。Ｅ２における２つの主要な抗原性領域は、複数のｍＡｂの結合の主要因であった。第１の領域はドメインＡ中のアミノ酸５８と８０の間に位置し、推定レセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む（Ｓｕｎら、２０１４；Ｖｏｓｓら、２０１０）。第２の領域は、ドメインＢ中のアミノ酸１９０と２１５の間に位置する。いずれの配列領域も、ウイルスエンベロープから突出しており、Ｅ２三量体先端近くに位置している（図６Ａ〜Ｆおよび図７）。
中和のメカニズム。本発明者らは、広範な阻害活性を示すｍＡｂを用いて付着前および付着後中和アッセイを行った。予想されたとおり、ＶＲＰと共に事前にインキュベートした場合、試験した５つｍＡｂ全てが効率的に感染を中和した（図２Ａ）。しかしながら、ｍＡｂ ４Ｂ８は、高濃度においても完全にはＶＲＰを中和せず、このｍＡｂに対して耐性のあるＣＨＩＫＶビリオンの画分が存在することが示唆され；この傾向は、３種類のＣＨＩＫＶ遺伝子型に対応する生ＣＨＩＫＶ株を用いたアッセイにおいても認められた（データは示さず）。対照的に、ｍＡｂ ３Ｅ２３、４Ｊ２１、５Ｍ１６、および９Ｄ１４は、付着前に投与した場合、感染を完全に中和した。５つのヒトｍＡｂは全て、付着後に添加した場合もＣＨＩＫＶ感染を中和したが、本発明者らは３つの異なる活性パターンを認めた（図２Ａ）。ｍＡｂ ４Ｂ８は、付着後に添加した場合には完全な中和ができず、耐性ビリオンの画分が付着前の中和の後に観察されたものに比べて大きかった。ｍＡｂ ９Ｄ１４は、付着前または付着後のいずれに添加しても同等の効果でＶＲＰを中和した。ＭＡｂ ３Ｅ２３、４Ｊ２１、および５Ｍ１６は、ＶＲＰの完全な中和を示したが、付着後の中和の効果は、付着前の中和後の効果よりも低かった。ｍＡｂ ２Ｈ１および４Ｎ１２も、付着前または付着後に添加した場合、効果的にＶＲＰを中和した（図８）。
超高効力の中和性ｍＡｂのうちの５つ（３Ｅ２３、４Ｂ８、４Ｊ２１、５Ｍ１６、または９Ｄ１４）の外部からの融合（ＦＦＷＯ：ｆｕｓｉｏｎ−ｆｒｏｍ−ｗｉｔｈｏｕｔ）アッセイ試験により、全てが融合を阻害することが明らかとなった（ＥｄｗａｒｄｓおよびＢｒｏｗｎ、１９８６）。予想されたとおり、ｍＡｂで前処理したビリオンを中性ｐＨに緩衝した培地で連続してインキュベートした場合、感染はほとんどまたは全く認められなかった（図２Ｂ）。抗体処理を行わなかった場合、酸性ｐＨ緩衝培地の短いパルスにより感染細胞が生じ、これは、ウイルスエンベロープと原形質膜との間の融合を示す。注目すべきことに、５つのヒトｍＡｂは全て、原形質膜融合および感染を阻害し、中でもｍＡｂ ９Ｄ１４がこのアッセイにおいて最大の効力を示した。これらの試験は、超高効力の中和性ｍＡｂがＣＨＩＫＶ融合を阻止することを示唆する。
インビボでのｍＡｂによる予防。本発明者らは、様々なレベルの中和活性を示すｍＡｂのサブセット（表７）を、６週齢の高度免疫不全のＩｆｎａｒ−／−マウスを用いた致死性感染モデルにおいて試験した。マウスを、致死量のＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６の皮下注射の２４時間前に、５０μｇの単回用量（約３ｍｇ／ｋｇ）のヒト抗ＣＨＩＫＶ ｍＡｂまたは西ナイルウイルス特異的アイソタイプ対照ｍＡｂ（ＷＮＶ ｈＥ１６）で事前に処置した。アイソタイプ対照ｍＡｂで処置したマウスは全て、接種４日後までに感染により死亡した。ｍＡｂ ４Ｂ８、４Ｊ２１、または５Ｍ１６を用いた前処置はＩｆｎａｒ−／−を完全に防御したが、一方ｍＡｂ ３Ｅ２３または９Ｄ１４を用いた処置は感染動物を部分的に防御し、生存率は６７％であった（図３Ａ）。驚くべきことに、インビトロでは中和が弱かったｍＡｂ ２Ｄ１２は、動物の８３％を防御した。
インビボでのｍＡｂ暴露後療法。Ｉｆｎａｒ−／−マウスに致死量のＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６を接種し、その後、ウイルス接種の２４時間後に代表的なｍＡｂを５０μｇ（約３ｍｇ／ｋｇ）の単回用量で投与した。これらのｍＡｂの治療的投与は完全な防御をもたらしたが、アイソタイプの対照ｍＡｂでは防御されなかった（図３Ｂ）。効力のある治療濃度域をさらに規定するために、ＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６による負荷の４８時間後に、Ｉｆｎａｒ−／−マウスに、２５０μｇ（約１４ｍｇ／ｋｇ）の単回用量の代表的なｍＡｂを投与した。５Ｍ１６、４Ｊ２１、および４Ｂ８による処置は、それぞれ動物の８５％、５０％、および１２．５％を防御した（図３Ｃ）。注目すべきことに、６０時間後という遅い時点での４Ｎ１２による単独療法は、５００μｇ（約２８ｍｇ／ｋｇ）の用量で用いた場合、１００％の動物を防御した（図３Ｄ）。これらのデータは、ヒトｍＡｂは、感染確立後相当時間が経過していても、ＣＨＩＫＶ誘導死に対する防御が可能であることを立証する。
同様に、ＣＨＩＫＶの急性および慢性関節炎に対するヒトｍＡｂの影響を評価するために、ＷＴマウスで試験を行った。感染後１または３日目にＭＡｂを投与し、感染後Ｄ３、５、または２８にウイルス量またはＲＮＡを分析した。調査した組織および時間に応じて、１Ｈ１２または４Ｊ１４のどちらかが最も顕著なウイルス学的防御をもたらす。また４Ｎ１２も、これらのアッセイにおいて顕著な防御をもたらした。
インビボでの併用ｍＡｂ療法。単一の抗ＣＨＩＫＶｍＡｂで処置された動物におけるインビボでの耐性選択の可能性（Ｐａｌら、２０１３）を考慮して、本発明者らは、２つの抗ＣＨＩＫＶヒトｍＡｂの併用によって致死的負荷からマウスを防御できるかどうかを試験した。本発明者らは、インビトロにおける個々のｍＡｂの効力に基づいて中和性ｍＡｂの組み合わせを選択した。Ｉｆｎａｒ−／−マウスに、接種６０時間後に、最も効力の高いｍＡｂを、単回併用抗体処置用量（それぞれ２５０μｇ、合計で約２８ｍｇ／ｋｇ）で投与した。いくつかのｍＡｂの組み合わせ（［４Ｊ２１＋２Ｈ１］および［４Ｊ２１＋５Ｍ１６］）はほとんどまたは全く防御をもたらさなかったが、他の組み合わせ（［４Ｊ２１＋４Ｎ１２］）はこのように非常に遅い時点で６３％の生存率をもたらした（図３Ｄ）。このように、併用ｍＡｂ療法は、高度免疫不全マウスにおいて、動物が感染してから２４〜３６時間以内に投与した場合でも、致死性ＣＨＩＫＶ感染に対する防御をもたらした。この条件では、４Ｎ１２の単剤療法実験における用量（５００μｇ）は併用療法における４Ｎ１２成分の用量（２５０μｇ）の２倍であったが、４Ｎ１２は、４Ｊ２１との併用の方が単剤療法よりも効果が低かった。
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考察
本発明者らは、その大部分がＣＨＩＫＶ Ｅ２タンパク質を認識し、インビトロで顕著な中和活性を、そしてインビボで治療効力を示す、単一個体由来の天然のヒトｍＡｂの多様なパネルを単離したことを報告する。クラスとしては、最も阻害活性の高い抗体は広範な活性も示し、現在カリブ海においてまん延している株を含めた、３つのＣＨＩＫＶ遺伝子型全てのウイルスを中和した。本試験において単離されたヒトＣＨＩＫＶ特異的ｍＡｂの大部分は、１００ｎｇ／ｍＬ未満の濃度でウイルスを中和し、多くは１０ｎｇ／ｍＬ未満で阻害活性を示した。この活性は、本発明者らが、ＨＩ、Ｈ２、Ｈ３、またはＨ５インフルエンザウイルス（Ｈｏｎｇら、２０１３；Ｋｒａｕｓｅら、２０１２；Ｋｒａｕｓｅら、２０１１ａ；Ｋｒａｕｓｅら、２０１ｌｂ；Ｋｒａｕｓｅら、２０１０；Ｔｈｏｍｂｕｒｇら、２０１３；Ｙｕら、２００８）、デングウイルス（Ｍｅｓｓｅｒら、２０１４；Ｓｍｉｔｈら、２０１３ａ；Ｓｍｉｔｈら、２０１４；Ｓｍｉｔｈら、２０１３ｂ；Ｓｍｉｔｈら、２０１２）などを含めた他の病原性ヒトウイルスに対するヒトｍＡｂの以前の研究において観察した活性より高活性である。多くのヒトＣＨＩＫＶｍＡｂの効力は、追加免疫の繰り返しおよび親和性成熟の後に生じたその種で最高のマウスの中和性ＣＨＩＫＶｍＡｂの能力に匹敵するかそれを上回る（Ｆｏｎｇら、２０１４；Ｆｒｉｃら、２０１３；Ｐａｌら、２０１３；Ｗａｒｔｅｒら、２０１１）。ＣＨＩＫＶに対する他の中和性ヒトｍＡｂの大部分は効力がかなり低い（Ｆｏｎｇら、２０１４；Ｓｅｌｖａｒａｊａｈら、２０１３；Ｗａｒｔｅｒら、２０１１）。既に報告されているヒトＣＨＩＫＶ特異的ｍＡｂのうちただ１つ（ＩＭ−ＣＫＶ０６３）が、本明細書において報告した超高効力の中和性ｍＡｂに匹敵する活性を示す（Ｆｏｎｇら、２０１４）。
本発明者らは、試験した種々の中和性ＣＨＩＫＶ ｍＡｂによるＥ２におけるエピトープ認識パターンの多様性を観察した。アラニン置換ＣＨＩＫＶ糖タンパク質を用いた精細エピトープマッピングは、Ｅ２中の３つの構造領域の認識がｍＡｂ媒介性中和に関連することを示し：ここで、３つの構造領域は、推定ＲＢＤを含むドメインＡ（Ｓｕｎら、２０１３；Ｖｏｓｓら、２０１０）、Ｅ１中の融合ループに接触し保護するドメインＢ（Ｖｏｓｓら、２０１０）、ならびに、酸感受性領域を含み、ドメインＡおよびＢを連結するβリボンコネクタのアーチ１および２（Ｖｏｓｓら、２０１０）である。Ｅ２のエピトープに対してマッピングされた抗体のうち、大半（競合グループ１および２のもの）はドメインＡならびにアーチ１および２中の部位を優先的に認識したが、少数のグループ（競合グループ３のもの）はドメインＢ中の部位を認識した。これらのデータは、ドメインＡおよびアーチの表面露出領域が、ヒト中和性抗体応答を誘発する支配的な抗原部位であることを示唆する。本発明者らは、ドメインＡおよびアーチ２中の高度に保存された領域が、広範な防御免疫応答を誘発する可能性があり、エピトープに注目したワクチン設計の魅力的な候補として役立つと結論する。
注目すべきことに、重要なＥ２ドメインの表面露出残基のほぼ４分の１に、単一個体由来の１つまたは複数のｍＡｂが関与しているものと見られる。主要抗原部位上の機能的に多様な結合様式の存在が、以下の２つの観察結果から導かれる：（ａ）いくつかのｍＡｂは類似エピトープに結合したが桁違いに異なる阻害活性を示し、そして（ｂ）中和能力とＥ２タンパク質への結合親和性との間に相関関係がほとんどなかった。７つの最も効力の高い中和性ヒトｍＡｂ（２Ｈ１、３Ｅ２３、４Ｂ８、４Ｊ２１、４Ｎ１２、５Ｍ１６、および９Ｄ１４）は、付着後の段階でＣＨＩＫＶ感染を阻害したが、これは、おそらくｐＨ依存性の構造変化を妨げて、ヌクレオカプシドの細胞質への浸透を妨げることによる（Ｋｉｅｌｉａｎら、２０１０）。
マウスにおける治療効力から非ヒト霊長類における実験的に誘導された感染症および関節炎の治療転帰が予測されると思われるため（Ｐａｌら、２０１３；Ｐａｌら、２０１４）、本明細書におけるデータはＣＨＩＫＶ特異的ヒトｍＡｂによるヒトの予防が感染を妨げることを示唆する。単独療法による耐性変異体の選択についての懸念を考慮すると（Ｐａｌら、２０１３）、Ｅ２の異なる領域を標的とする超高効力中和性抗体を用いた併用療法が望ましい可能性がある。重篤な基礎疾患を有する者（例えば、晩期妊婦、免疫不全を有する者、および高齢者）などの重度疾患のリスクが著しく高い患者集団は、大発生の標的となる可能性がある。中和性ヒトｍＡｂがヒトにおける確立された関節疾患を予防または改善できるかどうかを決定するためのさらなる臨床試験が計画されている。
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本開示を踏まえれば、本明細書に開示されるおよび特許請求される組成物および方法は全て、過度の実験を行うことなく作製および実行することができる。本開示の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点から記載されているが、本開示の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および方法ならびに該方法の工程ま
たは一連の工程に変更を適用することができることは当業者には明らかであろう。より具体的には、本明細書に記載の薬剤を、同一または類似の結果を達成しつつ、化学的にも生理学的にも関連した特定の薬剤で置き換えることができることは明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似代替物および変更は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の精神、範囲、および概念の範囲内であるとみなされる。
ＶＩＩ．参考文献
本明細書中に示したものを補足する例示的な手順またはその他の詳細を提供する範囲で、以下の参考文献を、参照により本明細書に具体的に組み入れる。
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Claims (22)

  1. チクングニヤウイルスのＥ２エクトドメインに結合する単離および／または組換えモノクローナル抗体であって、該抗体または抗体フラグメントは、以下に記載のクローン対重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列：
    配列番号１０３からなるＣＤＲＨ１、配列番号１０４からなるＣＤＲＨ２、配列番号１０５からなるＣＤＲＨ３、配列番号１８７からなるＣＤＲＬ１、配列番号１８８からなるＣＤＲＬ２、および配列番号１８９からなるＣＤＲＬ３；
    を含む、前記単離および／または組換えモノクローナル抗体。
  2. 前記抗体または抗体フラグメントは、以下に記載のクローン対軽鎖および重鎖可変配列：
    配列番号３の軽鎖可変配列、および配列番号２の重鎖可変配列；
    によってコードされる、請求項１に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体。
  3. 抗体または抗体フラグメントは、請求項２に記載のクローン対配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖および重鎖可変配列によってコードされる、請求項１に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体。
  4. 抗体または抗体フラグメントは、請求項２に記載のクローン対配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖および重鎖可変配列によってコードされる、請求項１に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体。
  5. 前記抗体または抗体フラグメントは、以下に記載のクローン対軽鎖および重鎖可変配列：
    配列番号５３を含む若しくはからなる重鎖可変領域、および配列番号５４を含む若しくはからなる軽鎖可変領域；
    を含む、請求項１に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体。
  6. 抗体または抗体フラグメントは、請求項５に記載のクローン対配列に対して９５％の同一性を有する軽鎖および重鎖可変配列を含む、請求項１に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体。
  7. 前記抗体フラグメントは、組換えＳｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、またはＦｖフラグメントである、請求項１に
    記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体。
  8. 前記抗体はキメラ抗体であるか、または糖タンパク質以外のチクングニヤウイルス抗原を標的とする二重特異性抗体である、請求項１に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体。
  9. 前記抗体はＩｇＧである、請求項１に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体。
  10. 前記抗体または抗体フラグメントは細胞浸透性ペプチドをさらに含む、および／またはイントラボディである、請求項１に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離および／または組換え抗体または抗体フラグメントをコードするハイブリドーマ。
  12. 対象におけるチクングニヤウイルス感染を検出する方法であって：
    （ａ）前記対象由来のサンプルを、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離および／または組換え抗体または抗体フラグメントと接触させること；および
    （ｂ）前記サンプル中のＥ２に前記抗体または抗体フラグメントを結合させることによって、前記サンプル中のチクングニヤウイルス糖タンパク質Ｅ２を検出すること；
    を含む、前記方法。
  13. 前記サンプルは体液である、請求項１２に記載の方法。
  14. ２回目の工程（ａ）および（ｂ）を実行すること、ならびに、１回目のアッセイと比較してＥ２レベルの変化量を測定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  15. 対象におけるチクングニヤウイルスの感染の処置または予防における使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離および／または組換え抗体または抗体フラグメントを含む、医薬。
  16. 前記単離されたおよび／または組換え抗体または抗体フラグメントは感染前に投与される、請求項１５に記載の医薬。
  17. 前記単離および／または組換え抗体または抗体フラグメントは感染後に投与される、請求項１５に記載の医薬。
  18. 前記単離および／または組換え抗体または抗体フラグメントが投与される、または該抗体もしくは抗体フラグメントをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ配列もしくはベクターによる遺伝子送達を含む、請求項１５に記載の医薬。
  19. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体または抗体フラグメントを含む、チクングニヤウイルスの感染の処置または予防のための
    医薬組成物。
  20. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体または抗体フラグメントを産生する細胞株。
  21. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体または抗体フラグメントを生産する方法であって、以下の工程：
    （ａ）前記単離および／または組換えモノクローナル抗体または抗体フラグメントを産生する細胞株を培養する；
    （ｂ）産生された単離および／または組換えモノクローナル抗体または抗体フラグメントを精製する；および、場合により
    （ｃ）前記単離および／または組換えモノクローナル抗体または抗体フラグメントを医薬組成物中に製剤化する；
    を含む、前記方法。
  22. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離および／または組換えモノクローナル抗体または抗体フラグメント、および場合により包装材料を含むキット。
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