JP6979576B2 - 複数成分連続分離分析装置、複数成分連続分離分析方法及び複数成分連続分離分析プログラム - Google Patents

Description

本発明は、複数成分連続分離分析装置、複数成分連続分離分析方法及び複数成分連続分離分析プログラムに関する。

貝毒とは、貝類が特定の有毒プランクトンを捕食して毒素を蓄積し、その貝類を食べることによる食中毒である。これに対して、貝類の毒量のモニタリングが定期的に行われており、食の安全が確保されている。下痢性貝毒（ＤＳＰ）は、貝毒の一種であり、日本では主に東日本から北海道の範囲で、世界ではＥＵ、米国、韓国、オーストラリア等の多くの地域で発生する。毒の蓄積する種は、ホタテガイ、マガキ、アサリ、イガイ類（ムール貝）、アカザラガイ、イタヤガイ、コタマガイ、チョウセンハマグリ、マボヤ、カニ類など多種多様である。

非特許文献１は、ＤＳＰ毒素として、９−アントリルジアゾメタン（ＡＤＡＭ）により誘導体化されたオカダ酸（ＯＡ）類似体を検出する高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）法を開示する。非特許文献１に記載の方法によれば、自動的にカラムの接続を切り替えることにより、カラムの洗浄を単純化することができる。分析対象成分となるＯＡ類似体は、少なくともＯＡ及びジノフィシストキシン−１（ＤＴＸ１）を含む。しかしながら、非特許文献１に記載の方法では、一度の試料注入で複数の分析種を分離分析する場合、クロマトグラムのピーク等が重なる箇所が発生する。

クロマトグラムのピーク等が重なる場合は、１回目の分析でサンプル注入→第１分析種を含む成分の切り取り→第１分析種の定量した後に、２回目の分析でサンプル注入→第２分析種を含む成分の切り取り→第２分析種の定量を行わなければならない。このように、非特許文献１に記載の発明によっては、一度の試料注入に対して単一の分析種しか分析できない場合が発生する。即ち、非特許文献１に記載の発明によっては、複数種類の分析種を分離分析する場合、例えば、ＤＳＰ毒素の測定の場合に問題となるように、サンプルの種類によっては、分析種の種類の数だけ分析過程を繰り返す必要があるので測定に長時間を要する。

内田肇他８名、「カラムスイッチングによる自動試料洗浄を用いた９−アントリルメチルエステルとしてのオカダ酸類似体検出のための簡便なＨＰＬＣ法（A Convenient HPLC Method for Detection of Okadaic Acid Analogs as 9-Anthrylmethyl Esters with Automated Sample Cleanup by Column Switching）」、ＡＯＡＣインターナショナルジャーナル（Journal of AOAC International）、第97巻、第2号、2014年、p.391-397

本発明は、上記問題点を鑑み、クロマトグラムのピーク等が重なる分析種が含まれている場合であっても、１回の分析過程で複数種類の分析種を連続的に分離分析することができる複数成分連続分離分析装置、複数成分連続分離分析方法及び複数成分連続分離分析プログラムを提供することを目的とする。

本発明の第１の態様は、(a)第１移動相となる液体を第１流量で吐出する第１ポンプと、(b)第１固定相となる物質を保持し、第１ポンプによって吐出される第１移動相により、第１分析種及び第２分析種を含む試料溶液を導入する前処理カラムと、(c)第２移動相となる液体を第１流量より大きい第２流量で吐出する第２ポンプと、(d)第２固定相となる物質を保持する分析カラムと、(e)第２ポンプと分析カラムとの間を接続する第１ポジション、又は、前処理カラムと分析カラムとの間を接続する第２ポジションに流路を切り替えるスイッチングバルブと、(f)第１分析種及び第２分析種のそれぞれが、前処理カラムからの溶出を開始するタイミングで第２ポジションに切り替え、前処理カラムからの溶出を終了するタイミングで第１ポジションに切り替えるようにスイッチングバルブを自動制御するコントローラを備える複数成分連続分離分析装置であることを要旨とする。第１の態様に係る複数成分連続分離分析装置は、第１分析種及び第２分析種を含む試料溶液を一度注入すれば、第１及び第２分析種を含む複数成分を、１回の分析過程で連続的に分離分析する。

本発明の第２の態様は、(a)第１固定相となる物質が保持された前処理カラムに、第１分析種及び第２分析種を含む試料溶液を、第１流量の第１移動相を介して導入するステップと、(b)第１分析種が溶出するタイミングで、第１移動相を、第２固定相となる物質を保持する分析カラムに前処理カラムから導入するステップと、(c)第１分析種が溶出を終了するタイミングで、前処理カラムからの導入を停止し、第２移動相となる液体を第１流量より大きい第２流量で分析カラムに導入し、第２移動相により第１分析種の画分を進行させるステップと、(d)第２分析種が溶出を開始するタイミングで、第１移動相を分析カラムに前処理カラムから導入するステップと、(e)第２分析種が溶出を終了するタイミングで、前処理カラムからの導入を停止し、第２移動相となる液体を第２流量で分析カラムに導入し、第２移動相により第２分析種の画分を進行させるステップを含む複数成分連続分離分析方法であることを要旨とする。第２の態様に係る複数成分連続分離分析方法は、第１分析種及び第２分析種を含む試料溶液を一度注入すれば、第１及び第２分析種を含む複数成分を、１回の分析過程で連続的に分離分析することができることができる。

本発明の第２の態様で述べた複数成分連続分離分析方法を実現するためのプログラムは、コンピュータ読取り可能な記録媒体に保存し、この記録媒体をコンピュータシステムによって読み込ませることにより、本発明の複数成分連続分離分析方法を実行することができる。すなわち、本発明の第３の態様は、(a)第１固定相となる物質が保持された前処理カラムに、第１分析種及び第２分析種を含む試料溶液を、第１流量の第１移動相を介して導入させる命令と、(b)第１分析種が溶出するタイミングで、第１移動相を、第２固定相となる物質を保持する分析カラムに前処理カラムから導入させる命令と、(c)第１分析種が溶出を終了するタイミングで、前処理カラムからの導入を停止し、第２移動相となる液体を第１流量より大きい第２流量で分析カラムに導入し、第２移動相により第１分析種の画分を進行させる命令と、(d)第２分析種が溶出を開始するタイミングで、第１移動相を分析カラムに前処理カラムから導入させる命令と、(e)第２分析種が溶出を終了するタイミングで、前処理カラムからの導入を停止し、第２移動相となる液体を第２流量で分析カラムに導入し、第２移動相により第２分析種の画分を進行させる命令含む一連の命令による処理をコンピュータに実行させる複数成分連続分離分析プログラムであることを要旨とする。第３の態様に係る複数成分連続分離分析プログラムは、前処理カラムと分析カラムとの間の流路を切り替えるスイッチングバルブを自動制御して、第１分析種及び第２分析種を含む試料溶液を一度注入すれば、第１及び第２分析種を含む複数成分を、１回の分析過程で連続的に分離分析することができる。第３の態様に係る複数成分連続分離分析プログラムを記録する「記録媒体」とは、例えばコンピュータの外部メモリ装置、半導体メモリ、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどのプログラムを記録することができるような媒体などを意味する。具体的には、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ，ＭＯディスク、カセットテープ、オープンリールテープなどが「記録媒体」に含まれる。

本発明の複数成分連続分離分析装置、複数成分連続分離分析方法及び複数成分連続分離分析プログラムによれば、クロマトグラムのピーク等が重なる分析種が含まれている場合であっても、１回の分析過程で複数種類の分析種を連続的に分離分析することができるので、簡単且つ短時間の高効率測定が可能となる。

本発明の実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の基本的な構成を説明する模式的なブロック図である。 本発明の実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置のスイッチングバルブが第１ポジションの場合の流路を説明する図である。 本発明の実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置のスイッチングバルブが第２ポジションの場合の流路を説明する図である。 本発明の実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の動作の一例を説明するフローチャートである。 前処理カラムに検出器を接続して得られる、溶出時間を決定するためのクロマトグラムの成功例である。 前処理カラムに検出器を接続して得られる、溶出時間を決定するためのクロマトグラムの失敗例である。 カラムスイッチングにより得られる、分析種の定量のためのクロマトグラムの成功例である。 カラムスイッチングにより得られる、分析種の定量のためのクロマトグラムの失敗例である。 カラムスイッチングにより得られる、分析種の定量のためのクロマトグラムの失敗例である。 カラムスイッチングにより得られる、分析種の定量のためのクロマトグラムの失敗例である。 従来法における分析条件及び本発明の実施の形態における分析条件を示す表である。 本発明の実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の分析カラムとして２本のカラムを使用する場合の液体クロマトグラフィーの構成を説明する図である。 毒素が０．０６３mg/kgで添加されたホタテガイの毒量を分析した結果を示すクロマトグラムである。 毒素が０．０３２mg/kgで添加されたホタテガイの毒量を分析した結果を示すクロマトグラムである。 毒素が０．００６mg/kgで添加されたホタテガイの毒量を分析した結果を示すクロマトグラムである。 毒素が０．１０１mg/kgで添加されたムラサキイガイの毒量を分析した結果を示すクロマトグラムである。 毒素が１．００mg/kgで添加されたアサリの毒量を分析した結果を示すクロマトグラムである。

以下、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号を付し、重複する説明を省略する。但し、以下に示す実施の形態は、本発明の技術的思想を具体化するための装置、この装置を用いた方法やプログラムを、代表的な分析対象成分を用いて例示するものであって、本発明の技術的思想は、下記の実施の形態に例示した分析対象成分、装置、方法及びプログラムに特定するものでない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。

（分離分析装置）
本発明の実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置は、図１に示すように、分析種を固定相及び移動相との相互作用の差を利用して分離する分析種分離部１０と、分析種分離部１０に接続され分析種分離部１０の溶出液に含まれる分析種を検出する検出器２０と、分析種分離部１０及び検出器２０を制御するコントローラ３０とを備える液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分析装置である。以下の本発明の実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置は、例えば、オカダ酸（ＯＡ）類似体等の遊離脂肪酸を分析対象成分とするＬＣ分析装置について例示的に記載するが、遊離脂肪酸を分析対象成分とする場合に限定されるものではない。なお、ＯＡ類似体は、ＯＡ、ジノフィシストキシン−１（ＤＴＸ１）及びジノフィシストキシン−２（ＤＴＸ２）を含む。

分析種分離部１０は、ミキサー１１と、第１ポンプ１２と、インジェクタ１３と、前処理カラム１４と、第２ポンプ１５と、スイッチングバルブ１６と、分析カラム１７と、抵抗管１８を収納する機器本体である。分析種分離部１０に内蔵される前処理カラム１４及び分析カラム１７は、それぞれの固定相として、粒子径が約１〜３μｍ程度の充填剤を使用し、超高圧に耐えうる耐圧を有するカラムである。実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の分析カラム１７は、非特許文献１に記載された「濃縮カラム」と「分析カラム」を一体化した構造となっている。即ち、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の分析カラム１７は、非特許文献１に記載された「濃縮カラム」の位置に接続され、非特許文献１に記載された「分析カラム」の位置にはカラムが存在しない。

即ち、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の分析種分離部１０は、超高速液体クロマトグラム（ＵＨＰＬＣ）に用いることのできる超高耐圧カラムを備えている。ＵＨＰＬＣは、超高耐圧カラムを備えることにより、カラムにおける圧力が高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）の数倍になり、ＨＰＬＣより高速の分析が可能であり、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の高速性、測定時間の短縮性能をより有効に発揮できる。

ミキサー１１は、第１溶媒ｓ１及び第２溶媒ｓ２を所定の割合で混合して第１移動相ｍ１を生成し、ミキサー１１に接続された第１ポンプ１２に供給する。第１溶媒ｓ１は、例えば純水であり、第２溶媒ｓ２は、例えば１００％のアセトニトリルを採用可能である。第１溶媒ｓ１及び第２溶媒ｓ２は、ギ酸、ギ酸アンモニウム等の塩の添加が不要である。

第１ポンプ１２は、ミキサー１１から供給された第１移動相ｍ１を第１流量で吐出する。インジェクタ１３は、第１ポンプ１２と前処理カラム１４との間に接続され、第１流量で流れる第１移動相ｍ１に試料溶液を注入する。試料溶液は、ＯＡ及びＤＴＸ１のように、少なくとも第１分析種及び第１分析種と異なる第２分析種を含む。

インジェクタ１３に接続された前処理カラム１４は、試料溶液中の分析種と相互作用する第１固定相を内部に保持する。第１固定相は、例えばシアノプロピル基を有する、粒子径が１〜３μｍのシリカゲル粒子からなる。前処理カラム１４は、第１ポンプ１２及びインジェクタ１３の下流側に接続され、導入された試料溶液を各分析種の極性毎に分離して溶出する。

スイッチングバルブ１６は、円周状に配置された第１ポートｐ１〜第６ポートｐ６を有する６方自動スイッチングバルブである。スイッチングバルブ１６は、第１ポートｐ１〜第６ポートｐ６間の接続が異なる第１ポジション及び第２ポジションを有し、第１ポジション又は第２ポジションに切り替えることにより分析種分離部１０の流路を切り替える流路切り替え装置である。

実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の分析カラム１７が、非特許文献１に記載された「濃縮カラム」の位置に接続されているので、分析カラム１７はスイッチングバルブ１６の第２ポートｐ２に直結される。

第２ポンプ１５は、スイッチングバルブ１６の第３ポートｐ３と第２溶媒ｓ２の溶媒容器の間に接続されている。例えば、第２溶媒ｓ２を第２移動相ｍ２として、第２ポンプ１５は第１ポンプ１２の第１流量より大きい第２流量で吐出することが、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の一つの特徴である。即ち、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置においては、第２移動相ｍ２をなす第２溶媒ｓ２を、第１移動相ｍ１をなす第１溶媒ｓ１よりも大きな流量で吐出する。分析カラム１７は、スイッチングバルブ１６の第２ポートｐ２と検出器２０との間に接続され、試料溶液中の分析種との相互作用が第１固定相より強い第２固定相を内部に保持する。第２固定相は、例えばトリアコンチル基を有する、粒子径が１〜３μｍのシリカゲル粒子からなる。

上述したように、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の分析カラム１７は、非特許文献１に記載された濃縮カラムと分析カラムを一体化した構造を一つの特徴としている。即ち、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置においては、非特許文献１に記載された「分析カラム」の位置にはカラムが存在しない。非特許文献１に記載された分析カラムの位置に何もなくなるため、バルブ切り替え時に第２ポンプ１５の圧力がゼロになってしまう。これによりバルブ復帰時の圧力回復が遅れ、結果に支障が出る場合もある。このため、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置においては、スイッチングバルブ１６の第４ポートｐ４に抵抗管１８が接続されている。第４ポートｐ４に抵抗管１８を接続することにより、液体の流れに抵抗を付与することにより流路の圧力を調整し、バルブ切り替え時に第２ポンプ１５の圧力がゼロになってしまう問題を解決している。

また、第３ポートｐ３は第２ポンプ１５の下流側に、第４ポートｐ４は抵抗管１８の上流側に、第５ポートｐ５は抵抗管１８の下流側に接続される。そして、スイッチングバルブ１６の第１ポートｐ１は、前処理カラム１４の下流側に接続され、第６ポートｐ６は、廃液容器ｗに接続される。

スイッチングバルブ１６は、第１ポジションにおいて、図２に示すように、第１ポートｐ１及び第６ポートｐ６、第２ポートp２及び第３ポートp３、第４ポートp４及び第５ポートp５の各間を接続する。スイッチングバルブ１６は、図３に示すように、第２ポジションにおいて、第１ポートｐ１及び第２ポートｐ２、第３ポートp３及び第４ポートp４、第５ポートp５及び第６ポートp６の各間を接続する。

分析カラム１７の下流側に接続された検出器２０は、例えば蛍光分光光度計等の蛍光検出器（ＦＬＤ）からなる。検出器２０は、分析種分離部１０の溶出液に特定波長の励起光を照射して分析種の蛍光強度を測定することにより、試料溶液の成分を分析する。

コントローラ３０は、図１に示すように入力装置３１と、出力装置３２と、記憶装置３３と、処理装置４０とを備えるコンピュータである。入力装置３１は、例えば、キーボード、ポインティングデバイス、各種スイッチや入力コネクタ等含む入力インターフェースからなる。出力装置３２は、液晶ディスプレイ等の表示装置、スピーカ、プリンタ等の出力インターフェースからなる。

記憶装置３３は、分析条件ファイル３４と、溶出時間ファイル３５を格納する。記憶装置３３は、半導体メモリやディスクメディア等のコンピュータにより読み取り可能な媒体である記憶装置からなり、レジスタ、キャッシュメモリ、主記憶装置等を含み得る。例えば、図１に示すコンピュータシステムにおいて、記憶装置３３は、複数のレジスタ、複数のキャッシュメモリ、主記憶装置、補助記憶装置を含む一群の内から適宜選択された任意の組み合わせとすることも可能である。又、キャッシュメモリは１次キャッシュメモリと２次キャッシュメモリの組み合わせとしてもよく、更に３次キャッシュメモリを備えるヒエラルキーを有しても構わない。その他、記憶装置３３は、本発明の実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の動作に必要な一連の処理を示す制御プログラム（分離分析プログラム）や、分析種の検量に必要な標準物質のクロマトグラムに関するデータ等を格納する。

分析条件ファイル３４は、第１溶媒ｓ１及び第２溶媒ｓ２の種類、第１移動相ｍ１の組成比、第１ポンプ１２の第１流量、第２ポンプ１５の第２流量、前処理カラム１４及び分析カラム１７の温度等、分析種分離部１０による分析種の分離に必要な各種データを含むデータファイルである。分析条件ファイル３４は、その他、検出器２０の励起光波長、検出する蛍光波長等、検出器２０による蛍光強度の測定に必要な各種データを含む。

溶出時間ファイル３５は、試料溶液に含まれる各分析種が、前処理カラム１４から溶出する間の時間に関する情報を格納したデータファイルである。溶出時間ファイル３５は、例えば、インジェクタ１３により試料溶液が流路に注入された時刻を基準として、各分析種の前処理カラム１４からの溶出が開始する溶出開始時刻と、溶出が終了する溶出終了時刻とを含むトランザクションファイルである。

処理装置４０のハードウェア資源の構成は、例えば図１のように、分析条件設定部４１、溶出時間設定部４２、ＬＣ制御部４３、ＦＬＤ制御部４４等の論理演算回路を論理構造として有するブロック図として論理的に表現できる。例えば、図１に示した処理装置４０を、マイクロチップとして実装されたマイクロプロセッサ（ＭＰＵ）等を用いた中央演算処理装置（ＣＰＵ）等として、コンピュータシステムを構成することが可能である。又、コンピュータシステムを構成する処理装置４０として、算術演算機能を強化し信号処理に特化したデジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）や、メモリや周辺回路を搭載し組込み機器制御を目的としたマイクロコントローラ（マイコン）等を用いてもよい。或いは、現在の汎用コンピュータのメインＣＰＵを処理装置４０に用いてもよい。

更に、処理装置４０の一部の構成又はすべての構成をフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）のようなプログラマブル・ロジック・デバイス（ＰＬＤ）で構成してもよく、各機能を実行するようにアレンジされた特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）や回路部品等の装置であってもよい。ＰＬＤによって、処理装置４０の一部又はすべてを構成した場合は、記憶装置３３は、ＰＬＤを構成する論理ブロックの一部に含まれるメモリブロック等のメモリ要素として構成することができる。更に、処理装置４０は、ＣＰＵコア風のアレイとＰＬＤ風のプログラム可能なコアを同じチップに搭載した構造でもよい。このＣＰＵコア風のアレイは、あらかじめＰＬＤ内部に搭載されたハードマクロＣＰＵと、ＰＬＤの論理ブロックを用いて構成したソフトマクロＣＰＵを含む。

つまりＰＬＤの内部においてソフトウェア処理とハードウェア処理を混在させた構成でもよい。いずれにせよ、処理装置４０は、コントローラ３０にインストールされた制御プログラムを実行することにより、分析条件設定部４１、溶出時間設定部４２、ＬＣ制御部４３及びＦＬＤ制御部４４を実現する。

分析条件設定部４１は、入力装置３１により入力された情報に応じて、分析条件ファイル３４のデータを設定し、記憶装置３３に格納する。例えば、分析条件設定部４１は、ディスプレイ及び入力装置３１を用いて、予め用意された複数の選択肢から各条件をユーザに選択させたり、条件となる各値を入力させたりすることにより分析条件ファイル３４のデータを取得する。

溶出時間設定部４２は、入力装置３１により入力された情報に応じて、溶出時間ファイル３５のデータを設定し、記憶装置３３に格納する。溶出時間ファイル３５のデータは、前処理カラム１４までの流路を試料溶液の分析と同一の条件として、標準物質の前処理カラム１４からの溶出時間を取得することにより決定される。溶出時間ファイル３５のデータは、検出器２０から自動的に取得されてもよく、ユーザの入力操作により取得されてもよい。

ＬＣ制御部４３は、記憶装置３３に格納された分析条件ファイル３４のデータ、溶出時間ファイル３５のデータ及び制御プログラムに基づいて、分析種分離部１０の動作を制御する。即ち、ＬＣ制御部４３は、ミキサー１１、第１ポンプ１２、インジェクタ１３、第２ポンプ１５及びスイッチングバルブ１６に加えて、前処理カラム１４及び分析カラム１７の温度を調節するカラムオーブンの動作を制御する。

ＦＬＤ制御部４４は、記憶装置３３に格納された分析条件ファイル３４のデータ及び制御プログラムに基づいて、検出器２０の動作を制御する。具体的には、ＦＬＤ制御部４４は、励起光の波長、検出する蛍光波長を含む分析条件ファイル３４のデータを記憶装置３３から読み出し、検出器２０に設定することにより、分析カラム１７からの溶出液の蛍光強度を検出器２０に測定させる。

（分離分析方法）
図４のフローチャートを参照して、本発明の実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の動作の一例を説明する。初期状態において、スイッチングバルブ１６は、ＬＣ制御部４３の制御により第１ポジションに切り替えられる。分析カラム１７は、スイッチングバルブ１６が第１ポジションである間、第２ポンプ１５により第２移動相ｍ２が流され続けることにより、非特許文献１に記載された「濃縮カラム」と「分析カラム」の両方の機能をなして、安定した平衡状態を維持する。

先ず、図４のステップＳ１において、ＬＣ制御部４３は、予め設定された分析条件ファイル３４のデータ及び溶出時間ファイル３５のデータを記憶装置３３から読み込む。また、ミキサー１１は、ＬＣ制御部４３の制御に応じて、分析条件ファイル３４に格納された初期状態のデータにおける組成比となるように、第１溶媒ｓ１及び第２溶媒ｓ２を混合して第１移動相ｍ１を生成する。

ステップＳ２において、ＬＣ制御部４３は、第１ポンプ１２、第２ポンプ１５及びインジェクタ１３の駆動を開始する。第１ポンプ１２は、ミキサー１１から供給される第１移動相ｍ１を第１流量で吐出する。第２ポンプ１５は、第２溶媒ｓ２を第２移動相ｍ２として、第１流量より大きい第２流量で吐出する。

ステップＳ３において、ＬＣ制御部４３は、第１流量で流れる第１移動相ｍ１に予め調整された試料溶液を所定量注入するようにインジェクタ１３を制御する。ＬＣ制御部４３は、第１流量で流れる第１移動相ｍ１にインジェクタ１３により試料が注入された時刻からの経過時間をカウントする。試料溶液は、第１ポンプ１２から吐出される第１移動相ｍ１と共に前処理カラム１４に向かって流れる。

ステップＳ４において、前処理カラム１４は、第１ポンプ１２から吐出される第１移動相ｍ１により試料溶液を導入する。前処理カラム１４は、試料溶液に含まれる各成分と第１固定相との相互作用により、試料溶液の各成分を極性に応じて分離して試料溶液を展開する。このとき、スイッチングバルブ１６は第１ポジション（図２参照）であるため、前処理カラム１４からの溶出液は、第６ポートｐ６に接続された廃液容器ｗに流出する。

ステップＳ５において、ＬＣ制御部４３は、ステップＳ３でカウントを開始した経過時間が、ステップＳ１で読み込んだ溶出開始時刻に一致するタイミングで、スイッチングバルブ１６を第２ポジション（図３参照）に切り替える。即ち、スイッチングバルブ１６は、分析種が前処理カラム１４からの溶出を開始する時刻で、前処理カラム１４と分析カラム１７との間を接続する。

ステップＳ６において、分析カラム１７は、第１ポンプ１２から吐出される第１移動相ｍ１により、前処理カラム１４からの溶出液に含まれる分析種を導入する。分析カラム１７の第２固定相は、前処理カラムの第１固定相より分析種との相互作用（吸着力）が強いため、第２移動相ｍ２より濃度の低い第１移動相ｍ１では、分析種は分析カラム１７の入口付近で止まってしまう。

ステップＳ７において、ＬＣ制御部４３は、ステップＳ３でカウントを開始した経過時間が、ステップＳ１で読み込んだ溶出終了時刻に一致するタイミングで、スイッチングバルブ１６を第１ポジション（図２参照）に切り替える。即ち、スイッチングバルブ１６は、分析種が前処理カラム１４からの溶出を終了する時刻で、前処理カラム１４と分析カラム１７との間の接続を解除し、第２ポンプ１５と分析カラム１７との間を接続する。

ステップＳ８において、第２ポンプ１５は、第１流量より大きい第２流量で吐出され、第１移動相ｍ１より濃度が高い第２移動相ｍ２により、分析カラム１７において分析種の画分を進行させながら分離する。このように、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置は、スイッチングバルブ１６のバルブ切り替え操作により分画するハートカット（粗分離）法により分析種の画分（フラクション）を選択的に分析カラム１７に導入する。

ステップＳ９において、ＬＣ制御部４３は、ステップＳ１で読み込んだ溶出時間ファイル３５のデータから、全ての分析種の前処理カラム１４からの溶出が終了したか否かを判定する。全ての分析種の溶出が終了していない場合、ステップＳ５に処理を戻す。

全ての分析種の前処理カラム１４からの溶出が終了している場合、引き続き第１ポジションにおいて取り分けられた各分析種の画分は、第２ポンプ１５から第２流量で吐出される第２移動相ｍ２により、分析カラム１７を通過し、検出器２０に導入される。

上述したとおり、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置においては、非特許文献１に記載された「分析カラム」の位置にはカラムが存在しない。このため、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置においては、抵抗管１８を備えることにより、液体の流れに抵抗を付与することにより流路の圧力を調整し、バルブ切り替え時に第２ポンプ１５の圧力がゼロになってしまう問題が解決されているので、各分析種の画分が効率良く検出器２０に導入される。

なお、全ての分析種が前処理カラム１４から溶出した後、前処理カラム１４は、ミキサー１１により洗浄用の組成比とされた第１移動相ｍ１が第１ポンプ１２から流されることにより洗浄される。前処理カラム１４が洗浄される間、ＬＣ制御部４３は、第２溶媒ｓ２の組成比を１００％に増加させるようにミキサー１１を制御する。

検出器２０は、分画操作によって取り分けられたカラム流出分である各分析種の画分を含む溶出液の時々刻々の蛍光強度を測定する。コントローラ３０は、検出器２０により測定された蛍光強度を入力し、時間に対してプロットすることにより、分析種の溶出状態を示すクロマトグラムを作成する。コントローラ３０は、作成したクロマトグラムから、分析種のピーク高さ、ピーク面積等を取得して試料溶液を分析する。

実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置においては、極性の互いに異なる第１分析種及び第２分析種を少なくとも含む試料溶液を対象とするため、ステップＳ５〜Ｓ８の一連の処理は、少なくとも２回実行される。

即ち、初回のステップＳ５では、ＬＣ制御部４３は、前処理カラム１４から最も早く溶出される分析種である第１分析種が、前処理カラム１４からの溶出を開始するタイミングで、スイッチングバルブ１６を第２ポジションに切り替える。これにより、前処理カラム１４と分析カラム１７との間が接続され、続くステップＳ６において、第１ポンプ１２から第１流量で吐出される第１移動相ｍ１により、前処理カラム１４から分析カラム１７に第１分析種の画分が導入される。

そして、続くステップＳ７において、ＬＣ制御部４３は、第１分析種が前処理カラム１４の溶出を終了するタイミングで、スイッチングバルブ１６を第１ポジションに切り替える。これにより、第２ポンプ１５と分析カラム１７との間が接続され、続くステップＳ８において、第２ポンプ１５から第２流量で吐出される第２移動相ｍ２により、分析カラム１７内を第１分析種の画分が進行する。

続くステップＳ９では、ＬＣ制御部４３は、第１分析種の画分のみしか分析カラム１７に導入されていないため、他の第２分析種の画分を分析カラム１７に導入するために、２回目のステップＳ５に処理を進める。

２回目のステップＳ５では、ＬＣ制御部４３は、第１分析種の溶出が終了した後に溶出される第２分析種が、前処理カラム１４からの溶出を開始するタイミングで、スイッチングバルブ１６を第２ポジションに切り替える。これにより、第２ポンプ１５と分析カラム１７との間の接続が解除され、前処理カラム１４と分析カラム１７との間が接続される。よって、続くステップＳ６において、第１ポンプ１２から第１流量で吐出される第１移動相ｍ１により、前処理カラム１４から分析カラム１７に第２分析種の画分が導入される。

そして、続くステップＳ７において、ＬＣ制御部４３は、第２分析種が前処理カラム１４からの溶出を終了するタイミングで、スイッチングバルブ１６を第１ポジションに切り替える。これにより、第２ポンプ１５と分析カラム１７との間が接続され、続くステップＳ８において、第２ポンプ１５から第２流量で吐出される第２移動相ｍ２により、分析カラム１７内を第２分析種の画分が進行する。

（分析条件の決定）
以下、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置の分析条件ファイル３４のデータを用いた分析条件の決定方法の一例を説明する。

先ず、検出器２０を前処理カラム１４の下流側に接続し、各分析種の標準物質を含む溶液を試料溶液として、分析時と同様に第１移動相ｍ１により前処理カラム１４に導入する。前処理カラム１４からの溶出液の蛍光強度を検出器２０において測定することにより、標準物質のクロマトグラムを取得する。

分析条件ファイル３４のデータは、図５に示すように、複数の分析種が分析画分においてそれぞれ単離するような条件とするデータであることが必要である。図５に示すクロマトグラムでは、ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ２が、分析画分において単離されている。図５のようなクロマトグラムが得られる場合、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置は、１回の分析過程で複数種類の分析種を連続的に分離分析することができる。即ち、一度の試料注入に対して、複数種類の分析種を連続的に分離分析することができる。

なお、「分析画分」は、第１移動相ｍ１の組成比が、試料溶液の展開及び溶出を行うための第１組成比である画分である。第１組成比は、例えば第２溶媒ｓ２であるアセトニトリルが約５７％程度の組成比である。第１組成比は、アセトニトリルが概ね５７％以上６２％以下の組成比であってもよい。「洗浄画分」は、第１移動相ｍ１の組成比が、前処理カラム１４の洗浄を行うための第２組成比である上清の画分である。第２組成比は、例えば第２溶媒ｓ２であるアセトニトリルが１００％の組成比である。

一方、図６に示すように、各分析種のピークが夾雑物として上清（洗浄画分）に入り込む場合、検出器２０における正確な検出ができない。この場合、第１移動相ｍ１の第１組成比、第１ポンプ１２の流量、前処理カラム１４を洗浄するタイミング及び前処理カラム１４の種類等の分析条件を調整する必要がある。

図５のように、各分析種が単離されたクロマトグラムが得られる場合、各分析種の溶出時間が決定される。例えば、図５のクロマトグラムにおいて、試料溶液の注入時刻を基準として、ＯＡの溶出開始時刻は約５．７分、溶出終了時刻は約６．０分である。同様に、ＤＴＸ１及びＤＴＸ２の溶出時間が決定することにより、溶出時間ファイル３５のデータが設定される。

溶出時間ファイル３５のデータが決定されると、前処理カラム１４の下流側がスイッチングバルブ１６の第１ポートｐ１に接続されている状態に分析種分離部１０を戻す。そして、溶出時間ファイル３５のデータのみでスイッチングバルブ１６を第２ポジションに切り替えることにより、分析種分離部１０は、各分析種の画分を分析カラム１７に導入することが可能な状態となる。

分析カラム１７に導入された各分析種の画分は、分析カラム１７において分離された後、検出器２０に蛍光強度を測定される。これにより、コントローラ３０においてクロマトグラムが作成され、作成されたクロマトグラムを用いて各分析種が定量される。

但し、各分析種の定量は、図７に示すように、各分析種の画分が互いに重ならずに各分析種が単離されることが必要である。図７のクロマトグラムでは、オカダ酸（ＯＡ）のピークの裾がベースライン付近まで下がった後に次のジノフィシストキシン−１（ＤＴＸ１）の画分が検出されている。これにより、ＯＡのピーク面積が正確に定量可能であり、ＯＡの毒量を正確に定量することができる。ＤＴＸ１のピークについても同様である。

なお、図７に示す例では、ジノフィシストキシン−２（ＤＴＸ２）画分の分析カラム１７への導入を省略している。下痢性貝毒（ＤＳＰ）の分析対象成分は、主にＯＡ及びＤＴＸ１の２種類である。公定法では、ＤＴＸ２についてピークを確認できることと付されるが、ＤＴＸ２は、現状日本の貝から検出されていない。各分析種は、ホタテガイ等の貝の体内で代謝されて類似体になるため、貝に存在するのは数種類である。代謝物は、分析時において加水分解されて遊離脂肪酸に戻されるため、日本ではＯＡ及びＤＴＸ１を定量できることは実用性が高い。

一方、図８に示すように、ＯＡのピークの一部がＤＴＸ１の画分に重なる場合、ＯＡの正確な定量ができない。この場合、第１ポンプ１２及び第２ポンプ１５の流量、第１移動相ｍ１の組成比等の分析条件を調整する必要がある。

また、図９に示すように、ＯＡのピークがＤＴＸ１の画分に入り込む場合、ＯＡのピークの両裾がベースライン近くまで下がっていたとしても、試料に含まれるＯＡを正確に定量することができない。図９のクロマトグラムは、分析条件の決定段階において、高純度に精製された各分析種の標準物質を含む溶液を分析した結果であり、実際の試料によるＤＴＸ１画分には、図９に示すように貝の夾雑物に由来する巨大なピークが現れる。よって、実際の試料によるＯＡピークは確認できない可能性が高いため、図８の例と同様に分析条件を調整する必要がある。

また、図１０に示すように、ＯＡのピークがＤＴＸ１に比べて著しく太い場合、スイッチングバルブ１６の切り替えによる影響から正確なピークとなっていない可能性がある。試料溶液は、第２ポンプ１５により所定のスピードで検出器２０に導入されて随時検出される。このため、ＯＡが検出器２０のフローセルに導入されたタイミングでスイッチングバルブ１６により流路が切り替わると、溶出液の流れがフローセルにおいても一時的に遅くなり、結果としてＯＡのピークが過大評価となる。よって、図８及び図９の例と同様に分析条件を調整する必要がある。

以上のように、分析条件ファイル３４のデータ及び溶出時間ファイル３５のデータが決定されることにより、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置は、一度の試料注入に対して、複数種類の分析種を連続的に分離分析できるので、簡単且つ短時間の高効率測定が可能となる。

（実測）
以下、上述の方法により決定された分析条件に対応するように調節された分離分析装置による、標準物質の毒素を添加した各試料の実測について説明する。

図１１に示すように、第１溶媒ｓ１は純水、第２溶媒ｓ２は１００％のアセトニトリルが採用され、何れも塩が無添加である。第１ポンプ１２の第１流量は、０．２５〜０．３mL/minである。第１ポンプ１２により吐出される第１移動相ｍ１は、試料の分析（展開及び溶出）時においてアセトニトリルが５７％の第１組成比であり、前処理カラム１４の洗浄時においてアセトニトリルが１００％の第２組成比である。第２ポンプ１５の第２流量は、０．４〜０．６mL/minである。第２ポンプ１５により吐出される第２移動相ｍ２は、１００％のアセトニトリルである。また、カラムオーブンの温度を３５℃、検出器２０の励起波長を３６５ｎｍ、蛍光波長を４１２ｎｍに設定した。

前処理カラム１４としては、粒子径１．８μｍ、内径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍのウォーターズ（Waters）社製アクイティ(ACQUITY(登録商標)) UPLC HSS CYANOが採用された。前処理カラム１４は、２μｍ程度の粒子が充填されるため、高耐圧に設計されている。

分析カラム１７としては、図１１に示すように、３つの組み合わせ（ａ）〜（ｃ）が採用可能であった。組み合わせ（ａ）〜（ｃ）のうち「濃縮カラム」の項目に記載されるカラムは、図１に示す分析カラム１７の位置に接続され、「分析カラム」の項目に記載されるカラムは、図１に示す抵抗管１８の位置に接続される。

即ち、組み合わせ（ａ）の場合、図１２に示すように、分析種分離部１０は、第２ポートｐ２と第５ポートｐ５との間に接続された第１分析カラム（濃縮カラム）１７１と、第４ポートｐ４と検出器２０との間に接続された第２分析カラム（分析カラム）１７２とを備える。第１分析カラム１７１は、粒子径３μｍ、内径２．０ｍｍ×長さ５０ｍｍの野村化学製デベロシル(Develosil（登録商標）)HBC30 UG-3であり、第２分析カラム１７２は、粒子径３μｍ、内径２．０ｍｍ×長さ１００ｍｍのデベロシルHB C30 UG-3である。

組み合わせ（ｂ）の場合、分析カラム１７は、粒子径３μｍ、内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍのデベロシルHB C30 UG-3であり、第２分析カラム１７２は不要である。組み合わせ（ｃ）の場合、分析カラム１７は、粒子径１．８μｍ、内径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍのウォーターズ社製C18 T3であり、第２分析カラム１７２は不要である。組み合わせ（ｂ）及び（ｃ）の場合、図１に示すように、第４ポートｐ４と第５ポートｐ５との間に抵抗管１８が接続される。

図１３〜図１７は、実際の試料に所定の濃度で毒素を添加し、上述の方法により決定された分析条件及び溶出時間に用いて、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置（ＬＣ分析装置）により試料溶液を分析した結果を示すクロマトグラムである。試料溶液は、貝の可食部又は中腸腺のホモジネートを抽出し、所定の濃度でＯＡ及びＤＴＸ１の標準物質を添加した後に加水分解し、ＯＡ類似体が有するカルボキシル基と反応する蛍光試薬である９−アントリルジアゾメタン（ＡＤＡＭ）により誘導体化することにより調整される。

図１３は、ＯＡ及びＤＴＸ１が０．０６３mg/kgの濃度で添加されたホタテガイの試料溶液に対して、ＯＡ及びＤＴＸ１の定量結果を示すクロマトグラムである。毒素の定量は、一点検量線法により行われた。ＯＡの定量結果は０．０５６mg/kgとなり、回収率は８９％であった。ＤＴＸ１の定量結果は０．０５８mg/kgとなり、回収率は９２％であった。

図１４は、ＯＡ及びＤＴＸ１が０．０３２mg/kgの濃度で添加されたホタテガイの試料溶液に対して、ＯＡ及びＤＴＸ１の定量結果を示すクロマトグラムである。ＯＡの定量結果は０．０２９mg/kgとなり、回収率は９１％であった。ＤＴＸ１の定量結果は０．０３０mg/kgとなり、回収率は９４％であった。

図１５は、ＯＡ及びＤＴＸ１が０．００６mg/kgの濃度で添加されたホタテガイの試料溶液に対して、ＯＡ及びＤＴＸ１の定量結果を示すクロマトグラムである。ＯＡの定量結果は０．００６mg/kgとなり、回収率は１００％であった。ＤＴＸ１の定量結果は０．００７mg/kgとなり、回収率は１１７％であった。

図１６は、ＯＡ及びＤＴＸ１が０．１０１mg/kgの濃度で添加されたムラサキイガイの試料溶液に対して、ＯＡ及びＤＴＸ１の定量結果を示すクロマトグラムである。ＯＡの定量結果は０．１０１mg/kgとなり、回収率は１００％であった。ＤＴＸ１の定量結果は０．１１９mg/kgとなり、回収率は１１８％であった。

図１７は、ＯＡ及びＤＴＸ１が１．００mg/kgの濃度で添加されたアサリの試料溶液に対して、ＯＡ及びＤＴＸ１の定量結果を示すクロマトグラムである。ＯＡの定量結果は０．９５６mg/kgとなり、回収率は９６％であった。ＤＴＸ１の定量結果は０．９３６mg/kgとなり、回収率は９４％であった。

図１３〜図１７に示したとおり、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置によれば、良好な回収率が達成可能であり、高精度に分析種を定量可能であることが確認された。

特に、従来法によれば、前処理カラムから始めに溶出する分析種のピークと、次に溶出する分析種の画分の夾雑物によるピークとが干渉することから、一回の試料注入毎に異なる分析種の画分をスイッチングバルブ１６を用いて選択的にハートカット（粗分離）する必要があり、複数回の試料注入による複数回の測定が必要になっていた。

これに対して、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置によれば、第１ポンプ１２により前処理カラム１４から分析カラム１７に分析種を導入し、第１ポンプ１２より流量の大きい第２ポンプ１５により分析カラム１７内の分析種の画分を進行させる。第２ポンプ１５側の流量を大きくすることにより、分析種のピークと夾雑物によるピークとが干渉することを回避できるので、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置は、一度の試料注入に対して、複数種類の分析種を連続的に分離分析すること可能である。

また、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置によれば、前処理カラム１４から分画された画分の分離及び濃縮を行うカラムを１本の分析カラム１７とすることができ、分析に必要なコストを低減することができる。従来法によれば、濃縮カラム及び分析カラムとして１本のカラムを採用すると、前処理カラムの内圧が高くなり前処理カラムが破損するため、２本のカラムが採用されていた。これに対して、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置によれば、ＵＨＰＬＣに用いることが可能な高耐圧カラムを採用することにより、分析カラム１７の耐圧が向上され、結果として１本のカラムによる分離及び濃縮が可能となった。

実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置は、スイッチングバルブ１６の第４ポートｐ４と第５ポートｐ５との間に接続された抵抗管１８を備える。ここで、抵抗管１８がない場合、第２ポジションにおいて、第２ポンプ１５の圧力が０になるため、第１ポジションに切り替わった時に第２ポンプ１５の圧力回復が遅れて分析結果に影響を及ぼす可能性がある。実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置は、抵抗管１８を備えることにより流路の圧力低下による影響を抑制することができる。

また、実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置によれば、第１溶媒ｓ１として純水を採用し、第２溶媒ｓ２として１００％のアセトニトリルを採用しており、何れもギ酸アンモニウム等の塩が無添加である。よって、塩の調整、計量、混合等の作業が不要であるため、作業により誤差の発生を防止できる他、分析過程の簡略化、試薬の節減が可能である。

（その他の実施の形態）
上記のように、本発明の実施の形態を記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。

冒頭で述べたとおり、上記の実施の形態に係る複数成分連続分離分析装置、複数成分連続分離分析方法及び複数成分連続分離分析プログラムの技術的説明は、ＯＡ類似体等の遊離脂肪酸を分析対象成分とする分離分析について着目し、例示的に記載した。しかし、複数成分連続分離分析装置、複数成分連続分離分析方法及び複数成分連続分離分析プログラムは、クロマトグラムのピーク等が重なる分析種が含まれている場合であれば、種々の場合において、複数成分連続分離分析を好適に適用できるものであり、遊離脂肪酸を分析対象成分とする場合に限定されるものではない。

又、例えば、既に述べた実施の形態において、検出器２０は、蛍光検出器に限るものでなく、質量分析計、タンデム質量分析計等の他の検出器であってもよい。

上記の他、上記の実施の形態において説明される各構成を任意に応用した構成等、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。

１０ 分析種分離部（機器本体）
１１ ミキサー
１２ 第１ポンプ
１３ インジェクタ
１４ 前処理カラム
１５ 第２ポンプ
１６ スイッチングバルブ
１７ 分析カラム
１８ 抵抗管
２０ 検出器
３０ コントローラ
３１ 入力装置
３２ 出力装置
３３ 記憶装置
３４ 分析条件ファイル
３５ 溶出時間ファイル
４０ 処理装置
４１ 分析条件設定部
４２ 溶出時間設定部
４３ ＬＣ制御部
４４ ＦＬＤ制御部

Claims (7)

1. 第１移動相となる液体を第１流量で吐出する第１ポンプと、
   第１固定相となる物質を保持し、前記第１ポンプによって吐出される前記第１移動相により、第１分析種及び第２分析種を含む試料溶液が導入される前処理カラムと、
   第２移動相となる液体を前記第１流量より大きい第２流量で吐出する第２ポンプと、
   前記第１分析種及び前記第２分析種の吸着力が前記第１固定相より強く、前記第１分析種及び前記第２分析種を吸着した場合、前記第１移動相では前記第１分析種及び前記第２分析種を脱離させず、前記第２移動相では前記第１分析種及び前記第２分析種を脱離させる第２固定相となる物質を保持する分析カラムと、
   前記第２ポンプと前記分析カラムとの間を接続し、前記分析カラムには前記第２移動相が流れる第１ポジション、又は、前記前処理カラムと前記分析カラムとの間を接続し、前記分析カラムには前記前処理カラムを介して前記第１移動相が流れる第２ポジションに流路を切り替えるスイッチングバルブと、
   前記第１分析種が前記前処理カラムからの溶出を開始するタイミングで前記第２ポジションに切り替え、前記第１分析種が前記前処理カラムからの溶出を終了するタイミングで前記第１ポジションに切り替え、前記第２分析種が前記前処理カラムからの溶出を開始するタイミングで前記第２ポジションに切り替え、前記第２分析種が前記前処理カラムからの溶出を終了するタイミングで前記第１ポジションに切り替えるように前記スイッチングバルブを自動制御するコントローラと、
   を備え、前記第１及び第２分析種を含む複数成分を連続的に分離分析することを特徴とする複数成分連続分離分析装置。
2. 前記第２ポジションが規定する前記第２ポンプの流路の下流側に含まれるように、前記スイッチングバルブに接続された抵抗管を更に備えることを特徴とする請求項１に記載の複数成分連続分離分析装置。
3. 前記第１分析種がオカダ酸であり、前記第２分析種がジノフィシストキシン−１であることを特徴とする請求項１又は２に記載の複数成分連続分離分析装置。
4. 前記第１固定相は、シアノプロピル基を有し、前記第２固定相は、トリアコンチル基を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の複数成分連続分離分析装置。
5. 前記第２移動相が１００％アセトニトリルであることを特徴とする請求項３又は４に記載の複数成分連続分離分析装置。
6. 第１固定相となる物質が保持された前処理カラムに、第１分析種及び第２分析種を含む試料溶液を、第１流量の第１移動相を介して導入するステップと、
   前記第１分析種が溶出するタイミングで、前記第１移動相を、前記第１分析種及び前記第２分析種の吸着力が前記第１固定相より強く、前記第１分析種及び前記第２分析種を吸着した場合、前記第１移動相では前記第１分析種及び前記第２分析種を脱離させず、前記第２移動相では前記第１分析種及び前記第２分析種を脱離させる第２固定相となる物質を保持する分析カラムに前記前処理カラムから導入し、前記分析カラムの入り口で前記第１分析種を濃縮するステップと、
   前記第１分析種が溶出を終了するタイミングで、前記前処理カラムからの前記第１移動相の導入を停止し、第２移動相となる液体を前記第１流量より大きい第２流量で前記分析カラムに導入し、前記第２移動相により前記第１分析種の画分を進行させるステップと、
   前記第２分析種が溶出を開始するタイミングで、前記第１移動相を前記分析カラムに前記前処理カラムから導入し、前記分析カラムの入り口で前記第２分析種を濃縮するステップと、
   前記第２分析種が溶出を終了するタイミングで、前記前処理カラムからの前記第１移動相の導入を停止し、前記第２移動相となる液体を前記第２流量で前記分析カラムに導入し、前記第２移動相により前記第２分析種の画分を進行させるステップと、
   を含み、前記第１及び第２分析種を含む複数成分を連続的に分離分析することを特徴とする複数成分連続分離分析方法。
7. 第１固定相となる物質が保持された前処理カラムに、第１分析種及び第２分析種を含む試料溶液を、第１流量の第１移動相を介して導入させる命令と、
   前記第１分析種が溶出するタイミングで、前記第１移動相を、前記第１分析種及び前記第２分析種の吸着力が前記第１固定相より強く、前記第１分析種及び前記第２分析種を吸着した場合、前記第１移動相では前記第１分析種及び前記第２分析種を脱離させず、前記第２移動相では前記第１分析種及び前記第２分析種を脱離させる第２固定相となる物質を保持する分析カラムに前記前処理カラムから導入させ、前記分析カラムの入り口で前記第１分析種を濃縮させる命令と、
   前記第１分析種が溶出を終了するタイミングで、前記前処理カラムからの前記第１移動相の導入を停止し、第２移動相となる液体を前記第１流量より大きい第２流量で前記分析カラムに導入し、前記第２移動相により前記第１分析種の画分を進行させる命令と、
   前記第２分析種が溶出を開始するタイミングで、前記第１移動相を前記分析カラムに前記前処理カラムから導入させ、前記分析カラムの入り口で前記第２分析種を濃縮させる命令と、
   前記第２分析種が溶出を終了するタイミングで、前記前処理カラムからの前記第１移動相の導入を停止し、前記第２移動相となる液体を前記第２流量で前記分析カラムに導入し、前記第２移動相により前記第２分析種の画分を進行させる命令と、
   を含む一連の命令による処理をコンピュータに実行させ、前記前処理カラムと前記分析カラムとの間の流路を切り替えるスイッチングバルブを自動制御して、前記第１及び第２分析種を含む複数成分を連続的に分離分析することを特徴とする複数成分連続分離分析プログラム。

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