JP6961202B2 - 植物細胞に遺伝子を導入するための複合体 - Google Patents
植物細胞に遺伝子を導入するための複合体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6961202B2 JP6961202B2 JP2017063568A JP2017063568A JP6961202B2 JP 6961202 B2 JP6961202 B2 JP 6961202B2 JP 2017063568 A JP2017063568 A JP 2017063568A JP 2017063568 A JP2017063568 A JP 2017063568A JP 6961202 B2 JP6961202 B2 JP 6961202B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- complex
- protein
- gene
- vire2
- vird2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
(1)下記タンパク質:
(a)1個のVirD2タンパク質、
(b)1個以上のVirE2タンパク質、または
(c)1個のVirD2タンパク質および1個以上のVirE2タンパク質
および植物細胞に導入される遺伝子
を含む複合体であって、VirD2タンパク質、VirE2タンパク質のいずれかまたは両方に細胞膜透過ペプチド(CPP)を融合させた複合体;
(2)CPPの80%以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、CPPの長さが8アミノ酸以上である、(1)記載の複合体;
(3)CPPの長さが16アミノ酸以上である、(2)記載の複合体;
(4)CPPのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である(1)〜(3)のいずれか記載の複合体;
(5)下記の2つのプラスミド:
(a)1個のVirD2タンパク質、
(b)1個以上のVirE2タンパク質、または
(c)1個のVirD2タンパク質および1個以上のVirE2タンパク質
をコードする遺伝子を含むプラスミド;および
植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、請求項1記載の複合体の製造方法であって、VirD2タンパク質をコードする遺伝子、VirE2タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にCPPをコードするポリヌクレオチドが融合されている、方法;
(6)下記のプラスミド:
(a)1個のVirD2タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド、
(b)1個以上のVirE2タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド、または
(c)1個のVirD2タンパク質および1個以上のVirE2タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、請求項1記載の複合体の製造方法であって、VirD2タンパク質をコードする遺伝子、VirE2タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にCPPをコードするポリヌクレオチドが融合されている、方法;
(7)CPPの80%以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、CPPの長さが8アミノ酸以上である、(5)または(6)記載の方法;
(8)CPPの長さが16アミノ酸以上である、(7)記載の方法;
(9)CPPのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である(5)〜(8)のいずれか記載の方法;
(10)(1)〜(4)のいずれか記載の複合体を植物細胞に導入することを含む、植物細胞への遺伝子導入方法。
(a)1個のVirD2タンパク質、
(b)1個以上のVirE2タンパク質、または
(c)1個のVirD2タンパク質および1個以上のVirE2タンパク質
および植物細胞に導入される遺伝子
を含む複合体であって、VirD2タンパク質、VirE2タンパク質のいずれかまたは両方に細胞膜透過ペプチド(CPP)を融合させた複合体(以下、「本発明の複合体」という)に関する。
(a)1個のVirD2タンパク質、
(b)1個以上のVirE2タンパク質、または
(c)1個のVirD2タンパク質および1個以上のVirE2タンパク質
をコードする遺伝子を含むプラスミド;および
植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、本発明の複合体の製造方法であって、VirD2タンパク質をコードする遺伝子、VirE2タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にCPPをコードするポリヌクレオチドが融合されている、方法に関する。
(a)1個のVirD2タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド、
(b)1個以上のVirE2タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド、または
(c)1個のVirD2タンパク質および1個以上のVirE2タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、請求項1記載の複合体の製造方法であって、VirD2タンパク質をコードする遺伝子、VirE2タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にCPPをコードするポリヌクレオチドが融合されている、方法に関する。
(a)1個のVirD2タンパク質を含む組換えタンパク質、
(b)1個以上のVirE2タンパク質を含む組換えタンパク質、または
(c)1個のVirD2タンパク質および1個以上のVirE2タンパク質を含む組換えタンパク質
および
植物細胞に導入される遺伝子
をインビトロにて混合することにより、本発明の複合体を製造してもよい(VirD2タンパク質、VirE2タンパク質のいずれかまたは両方にCPPが融合されている)。
ポリヒスチジン融合T−DNA複合体を発現させるアグロバクテリウムとしてGV3101株を使用した。一方で、植物細胞としてタバコ培養細胞であるBY−2株(rpc00001)を使用した。
T−DNA複合体を構成するVirD2、VirE2の両タンパク質に、ポリヒスチジンを融合したポリヒスチジン融合VirD2、VirE2を発現するプラスミド「プラスミド#1」を構築した(図1A)。この際、VirD2とVirE2にそれぞれ5通りの鎖長のポリヒスチジン(ヒスチジン0、8、12、16、20残基)を融合した組み合わせを設計したため、プラスミド#1は全25種類(5種類×5種類)を構築した。また、遺伝子導入を評価するためのレポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子(Luc遺伝子)を導入したプラスミド「プラスミド#2」を構築した(図1B)。これらプラスミド#1および#2を一緒にアグロバクテリウムに導入することで、組換えアグロバクテリウム(全25種類)を構築した。
上記で構築した全25種類の組換えアグロバクテリウムを、5mLのLB液体培地に植菌し、28℃で一晩振とう培養した(前培養)。一晩培養した前培養液4mLを、50mLのLB液体誘導培地[カナマイシン50μg/mL、スペクチノマイシン100μg/mL、アセトシリンゴン20μM、MES−KOH(pH5.7)10mM]に加え、28℃で一晩振とう培養した。その後、遠心分離(5,000g x 20分、室温)により沈殿を回収した後、Agro−infiltration Buffer[MgCl2 10mM、MES−KOH(pH5.7)10mM、アセトシリンゴン200μM]にてOD600=0.5になるように懸濁した。次いで、遮光した状態で、室温で一晩インキュベーションした。その後、10mLを15mLファルコンチューブに移し、遠心分離(4,000rpm x 15分、4℃)により沈殿を回収した。沈殿に1mLのLS培地を加え懸濁した。この懸濁液を超音波破砕に供することで、菌体破砕液を得た。菌体破砕液を遠心分離(13,000rpm x 10分、4℃)に供し、上清を0.22μmシリンジフィルターに通過させることで、ポリヒスチジン融合T−DNA複合体抽出液を得た。
最後に、回収した複合体にLuc遺伝子が含まれているか(ポリヒスチジンが融合されたVirD2またはVirE2とLuc遺伝子が複合体を形成しているか)を、PCRで確認した。回収した複合体を鋳型として、またLuc遺伝子に選択的なプライマーを用いて、PCRを行った。
継代3日目のBY−2細胞(1mL)を2.0 mLエッペンドルフチューブに分注した。このBY−2細胞1mLに対して、上記で得たポリヒスチジン融合T−DNA複合体抽出液1mLを加え、28℃にて一晩振とう培養した。次いで、遠心分離(4,000rpm x 10分、4℃)によりBY−2細胞を回収し、100μLの×1 Passive lysis buffer(Promega社製品)に懸濁した後、室温で10分インキュベーションすることでBY−2細胞を破砕した。細胞破砕液を遠心分離(15,000rpm x 10分、室温)し、上清にセレンテラジンを終濃度2μMになるように添加し、室温で10分インキュベーションした。ルミノメーター(GENE LIGHT GL−220A)を用いて、細胞破砕液中のルシフェラーゼ活性を測定することで、BY−2細胞に対するポリヒスチジン融合T−DNA複合体の導入を評価した。
全25種類の組換えアグロバクテリウムから調製したポリヒスチジン融合T−DNA複合体について、BY−2細胞に対する遺伝子の直接導入を評価した。その結果、5種類のポリヒスチジン融合T−DNA複合体(VirD2−H8 + VirE2−H0、VirD2−H16 + VirE2−H0、VirD2−H8 + VirE2−H8、VirD2−H16 + VirE2−H12、VirD2−H20 + VirE2−H20)を処理したBY−2細胞において、ルシフェラーゼ活性が検出されたことから、これら5種類のポリヒスチジン融合T−DNA複合体はBY−2細胞に導入され、機能している(Luc遺伝子が発現している)ことが確認された(図3)。特に、VirD2−H20 + VirE2−H20から構成されるポリヒスチジン融合T−DNA複合体において、もっとも高いルシフェラーゼ活性が検出された。なお、上の表記、例えば「VirD2−H20 + VirE2−H20」という場合は、VirD2タンパク質に20個のヒスチジン残基からなるポリヒスチジンが融合し、VirE2タンパク質に20個のヒスチジン残基からなるポリヒスチジンが融合しているT−DNA複合体を意味する。
Claims (4)
- 下記タンパク質:
1個のVirD2タンパク質および1個以上のVirE2タンパク質
および植物細胞に導入される遺伝子
を含む複合体であって、VirD2タンパク質、VirE2タンパク質のいずれかまたは両方に細胞膜透過ペプチド(CPP)が融合されており、該CPPの長さが16アミノ酸から20アミノ酸であり、該CPPのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である、複合体。 - 下記の2つのプラスミド:
1個のVirD2タンパク質および1個以上のVirE2タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミド;および
植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、請求項1記載の複合体の製造方法であって、VirD2タンパク質をコードする遺伝子、VirE2タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にCPPをコードするポリヌクレオチドが融合されており、該CPPの長さが16アミノ酸から20アミノ酸であり、該CPPのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である、方法。 - 下記のプラスミド:
1個のVirD2タンパク質および1個以上のVirE2タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、請求項1記載の複合体の製造方法であって、VirD2タンパク質をコードする遺伝子、VirE2タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にCPPをコードするポリヌクレオチドが融合されており、該CPPの長さが16アミノ酸から20アミノ酸であり、該CPPのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である、方法。 - 請求項1記載の複合体を植物細胞に導入することを含む、植物細胞への遺伝子導入方法であって、導入が、複合体と細胞を培地中でインキュベーションすることにより行われる、方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017063568A JP6961202B2 (ja) | 2017-03-28 | 2017-03-28 | 植物細胞に遺伝子を導入するための複合体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017063568A JP6961202B2 (ja) | 2017-03-28 | 2017-03-28 | 植物細胞に遺伝子を導入するための複合体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018164436A JP2018164436A (ja) | 2018-10-25 |
JP6961202B2 true JP6961202B2 (ja) | 2021-11-05 |
Family
ID=63921777
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017063568A Active JP6961202B2 (ja) | 2017-03-28 | 2017-03-28 | 植物細胞に遺伝子を導入するための複合体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6961202B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114790225A (zh) * | 2021-01-26 | 2022-07-26 | 清华大学 | 一种新型内体逃逸肽及其应用 |
-
2017
- 2017-03-28 JP JP2017063568A patent/JP6961202B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2018164436A (ja) | 2018-10-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gordon et al. | The agrobacterium Ti plasmids | |
Dürrenberger et al. | Covalently bound VirD2 protein of Agrobacterium tumefaciens protects the T-DNA from exonucleolytic degradation. | |
Okamoto et al. | Localization and orientation of the VirD4 protein of Agrobacterium tumefaciens in the cell membrane | |
Li et al. | Direct visualization of A grobacterium‐delivered V ir E 2 in recipient cells | |
Oh et al. | Positive-selection and ligation-independent cloning vectors for large scale in planta expression for plant functional genomics | |
AU2016350610A1 (en) | Methods and compositions of improved plant transformation | |
CN112063643B (zh) | 一种用于检测细菌中膜蛋白相互作用的表达载体及方法 | |
Liu et al. | Functional subsets of the VirB type IV transport complex proteins involved in the capacity of Agrobacterium tumefaciens to serve as a recipient in virB-mediated conjugal transfer of plasmid RSF1010 | |
EP3105254B1 (en) | Hybrid proteins and uses thereof | |
CN113136374A (zh) | 一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用 | |
JP6961202B2 (ja) | 植物細胞に遺伝子を導入するための複合体 | |
CN113444743A (zh) | 含佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的构建方法 | |
Özyiğit | Agrobacterium tumefaciens and its use in plant biotechnology | |
Aly et al. | The type IV secretion system component VirB5 binds to the trans-zeatin biosynthetic enzyme Tzs and enables its translocation to the cell surface of Agrobacterium tumefaciens | |
CN114410608A (zh) | 一种高效表达及纯化Cas9蛋白的方法和应用 | |
CA2730741C (en) | Self-replicating vector lacking an antibiotic-resistance gene | |
EP2537928A1 (en) | Novel promoter for use in transformation of algae | |
ES2897017B2 (es) | PROTEINA QUIMERICA RELAXASA-Cas | |
CN106170551B (zh) | 生产不耐热肠毒素b亚单位的质粒、方法及其套组 | |
CN117286178B (zh) | 一种双组份病毒载体的简化构建方法及其相关应用 | |
KR102285748B1 (ko) | 수박모자이크바이러스 감염성 클론 및 이의 용도 | |
Mani et al. | Agrobacterium-mediated transformation and gus gene expression in Amaranthuscaudatus | |
CN115974981A (zh) | DNA结合结构域、融合型phi29 DNA聚合酶及其制备方法和应用 | |
US20220041977A1 (en) | Matrix-mediated cell culture system | |
US20170166909A1 (en) | Improved strains of agrobacterium tumefaciens for transferring dna into plants |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200303 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210204 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210224 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210423 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210914 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211006 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6961202 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |