JP6929368B2 - Adcc活性の改良された定量のためのシステム及び製品 - Google Patents
Adcc活性の改良された定量のためのシステム及び製品 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6929368B2 JP6929368B2 JP2019538726A JP2019538726A JP6929368B2 JP 6929368 B2 JP6929368 B2 JP 6929368B2 JP 2019538726 A JP2019538726 A JP 2019538726A JP 2019538726 A JP2019538726 A JP 2019538726A JP 6929368 B2 JP6929368 B2 JP 6929368B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- target
- cell
- effector
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
i)本発明による細胞と;
ii)抗体が特異的である内因性標的が無効化された(突然変異した)細胞標的細胞と;
iii)抗体が特異的である標的の発現が増強された標的細胞と
を含んでもよい。
i)抗体のFc領域に結合することができる、本発明によるエフェクター細胞(E)と;
ii)標的/抗原が細胞によって発現されないように、前記抗体が特異的である内因性標的/抗原が無効化され(突然変異し)た細胞(T−)と;
iii)前記抗体が特異的である標的の発現が増強されたか又は過剰発現された標的細胞(T+)と
を含むキットに関する。
a)抗体の投与を含む処置を受けている患者から得た試料を、キット及び本発明による標的細胞ii)と接触させるステップと、
b)細胞i)の存在下で得たシグナルを、細胞i)及び標的細胞iii)の存在下で得たシグナルから減算するステップと、
c)a)及びb)で測定したシグナルの関係に基づいて、ADCC活性を決定するステップと
を含むことができる。
a)抗体の投与を含む処置を受けている患者から得た試料を、本発明による標的細胞iii)と接触させるステップと、
b)薬物標的が無効化されている本発明による細胞ii)の存在下で得たシグナルを、本発明によるエフェクター細胞i)及び本発明による標的細胞iii)の存在下で得たシグナルから減算するステップと、
c)a)及びb)で測定したシグナルの関係に基づいて、ADCC活性を決定するステップであり、式[(E+T++薬物+NHS)−(E+T−+NHS)+(E+T+)]/E+T+、又は[(E+T++NHS)−(E+T−+NHS)+(E+T+)]/E+T+[式中、(E)は本発明によるエフェクター細胞であり、(T+)細胞は本発明による細胞であり、(T−)は本発明による細胞であり、NHS=正常なヒト血清試料である]を使用して、血清試料に対する陽性の結果(すなわち、検出可能なADCC活性)は、エフェクター細胞i)及び標的++細胞iii)/エフェクター細胞i)及び標的−/−細胞ii)に対するシグナルの関係が≧1である場合に存在し、血清試料に対する陰性の結果(すなわち、検出不可能なADCC活性)は、エフェクター細胞i)及び標的++細胞iii)に関する値/エフェクター細胞i)及び標的−/−細胞ii)に関する値が≦1である場合に存在するステップと
を含む上記方法に関する。
[(E+T++薬物+NHS)−(E+T−+NHS)+(E+T+)]/E+T+ (I)
又は
[(E+T++NHS)−(E+T−+NHS)+(E+T+)]/E+T+ (II)
である
[式中、(E)=エフェクター細胞、(T+)=抗原陽性標的細胞、(T−)=抗原陰性標的細胞、及び「NHS」=正常なヒト血清試料]。「薬物」は、薬物と標的細胞の存在下で必要とされるNHSの存在下でのADCC活性の測定値を示す。計算を実施する際に使用される測定値は、上記式の各実体に対して測定されたRLU(相対ルシフェラーゼ単位又はより一般的には使用した酵素に応じた相対発光単位)である。第1の方程式/式(I)は、例えば、ヒト血清の試料中の中和抗体の定量に関するものであり、第2の方程式/式(II)は、ヒト血清における薬物の効能(活性)の定量に関するものである。
GGAAGCGAAA ATGAAATTGA CTGGGACTTT CCGGAGGAAA AACTGTTTCA TACAGAAGGC GTGGATGTCC ATATTAGGAT GAGTCAGTGA CGTCAGAGCC TGATTTCCCC GAAATGATGA GCTAG
と少なくとも約70%の配列同一性を有するDNA配列に関する。
本明細書で互換的に使用される用語「無効化された」又は「突然変異した」は、特定の遺伝子をノックアウトして、最終的に、細胞の表現型を変化させることを意味する。事実上、この用語は、遺伝子を非機能性にすることを包含することを意味する。例は、表面細胞受容体の発現を除去するある特定の遺伝子の無効化であり得る。
操作されたエフェクター細胞系の確立
FcγRIIIa受容体(CD16)のライゲーションに対して最適に応答するレポーター−遺伝子構築物を確立するために、異なるスペーシング配列と共に、NFAT、NFkB、AP1、CREB、及びSTAT認識配列(4〜6)のバリアントからなる一連の構築物をin silicoで開発した。これらの構築物に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、ヒトT細胞系Jurkatを使用して、インターフェロンアルファ及びガンマ(100IU/ml)、TNFα(100ng/ml)、ジブチリルcAMP(100μM)、ロノマイシン(500mM)、及びPMA(10ng/ml)の単独又は組合せによる誘導の後、最小SV40プロモーターからホタルルシフェラーゼ(FL)レポーター遺伝子の転写を駆動するそれらの能力について、一過性トランスフェクション実験において試験した。次いで、これらの機能的レポーター遺伝子構築物を、1:1の比のJurkat及びRaji細胞並びにリツキシマブ(500ng/ml)の存在下で、ADCC反応において試験した。これらの実験の結果を使用して、FLレポーター遺伝子構築物(図2)の発現を調節するために使用される合成キメラプロモーター配列(図1)を設計した。次いで、薬物に誘導されるFL活性がRLの構成的発現に関して正規化されるのを可能とする構成的プロモーターの制御下で、FLレポーター遺伝子構築物、FcRγIIIa(vバリアント)に対する発現ベクター、及びウミシイタケルシフェラーゼ(RL)レポーター遺伝子を、FuGENE HDトランスフェクション試薬(Promega カタログ番号E2311)を使用して、Jurkat細胞に順次トランスフェクトした(図3)。安定なクローンを単離し、所与の治療用抗体及び適当な標的細胞の存在下で、ADCC活性について特徴付けた。適切なクローンを単離し、特徴付け、次いで、サブクローニングし、特徴付け、増殖させて、クローンのiLite(登録商標)エフェクター細胞系をもたらした。
細胞表面で高い一定レベルのCD20を発現する操作された標的細胞系の確立
CD20をコードする遺伝子を、CRISPR−Cas9ゲノム編集(7)を使用して、B細胞系Raji(ATCC(登録商標)CCL−86)において無効化した。簡潔には、ガイドRNA配列(図4)を設計し、合成し、Cas9二重鎖DNAエンドヌクレアーゼをCD20遺伝子のエクソン1内の特異的部位にガイドして、CD20−/−Raji細胞を単離するために、ヌクレアーゼベクターGeneArt CRISPR(Invivogen、カタログ番号:A21174)にクローニングした(図5)。
最適なE:T比の確立
様々な濃度のiLite(登録商標)エフェクター細胞(E)を、様々な濃度のCD20++標的細胞(T)とインキュベートして、リツキシマブのADCC活性の定量のために最適なエフェクター標的細胞比(E:T)を決定した(図6A及び6B)。培養物中のエフェクター細胞及びRAV2.1S8標的細胞に対する最適なE:T比は、容易に測定可能なレベルのFL活性を与える(図6A)一方、同時に、濃度の増加するリツキシマブの存在下で、エフェクター細胞及び標的細胞の4時間のインキュベーション後に、最適なダイナミックレンジをもたらす(図6B)、3:1であることが判明した。
ヒト血清の存在下でのリツキシマブのADCC活性の定量
ADCCアッセイにおいてヒト血清が存在することは、ヒト血清中に存在するIgGの標的細胞表面への非特異的結合による、治療用抗体の非存在下でのエフェクター細胞のレポーター遺伝子活性の濃度依存的増加をもたらす。特異的薬物標的がゲノム編集によって無効化されている相同な標的細胞のアベイラビリティによって、同じ濃度のヒト血清の存在下で特異的薬物標的を発現する相同な細胞に関して実測したものから減算することができる、標的陰性細胞及び所与の濃度のヒト血清の存在下での非特異的活性のレベルを推定する手段が提供される。ヒト血清の標的細胞との非特異的相互作用は、治療用抗体と特異的標的細胞との相互作用に関して観測した4PL曲線の傾きを有意に変化させない低い親和性のものである(図10及び関連付けた表)。
細胞表面で高い一定レベルのerbB2を発現する操作された標的細胞系の確立
erbB2をコードする遺伝子を、CRISPR−Cas9ゲノム編集(7)を使用して、HEK293細胞(ATCC(登録商標)CRL−1573)及びSKBR3細胞(ATCC(登録商標)HTB−30)中で無効化した。簡潔には、ガイドRNA配列(図12)を設計し、合成し、Cas9二重鎖DNAエンドヌクレアーゼをERBB2遺伝子のエクソン6内の特異的部位にガイドして、erbB2−/−HEK293細胞及びerbB2−/−SKBR3細胞を単離するために、ヌクレアーゼベクターGeneArt CRISPR(Invivogen、:A21174)にクローニングした。
iLite(登録商標)エフェクター細胞及びハーセプチンの存在下でADCC活性について特徴付け、次いで、サブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特徴付け、増殖させて、erbB2++KEK293及びerbB2++SKBR3標的細胞系をもたらした。
細胞表面で高い一定レベルのmTNFαを発現する操作された標的細胞系の確立
TNFαアンタゴニストのADCC活性の定量には、膜結合型TNFαを発現する標的細胞を必要とする。TNFαは、最初に膜結合するが、次に、ADAM17(TACE)プロテアーゼによって切断される。したがって、膜結合型の、非切断性TNFαを発現する細胞系を確立するために、部位特異的突然変異誘発を使用して、プロテアーゼ切断部位を突然変異させ、ヒトTNFαをコードする遺伝子の76〜77位におけるアミノ酸AVをLLに変化させた(図17)。
細胞表面で高い一定レベルのEGFRを発現する操作された標的細胞系の確立
EGFR陰性HEK293細胞(ATCC(登録商標)CRL−1573)の細胞に、FuGENE HDトランスフェクション試薬(Promega カタログ番号E2311)を使用して、ヒトEGFRa発現ベクター(pUNO1−hefgr、Invivogen)をトランスフェクトした。陽性のクローンを、蛍光活性化細胞選別及びFITC標識抗EGFRモノクローナル抗体(R&D Systems、FAB10951P)を使用して濃縮した。安定なクローンを単離し、iLite(登録商標)エフェクター細胞及びセツキシマブを使用して、ADCC活性について特徴付け、次いで、サブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特徴付け、増殖させて、EGFR++標的細胞系をもたらした(図21)。
項目:
1.NF−AT、AP1、NFkB、及びSTAT5によって活性化される組換えレポーター遺伝子又は構築物を有するエフェクター細胞。
2.抗体が特異的である内因性標的が無効化された組換え標的細胞。
3.抗体が特異的である標的の発現が増強された組換え標的細胞。
4.配列番号1のヌクレオチド配列を含む、NF−AT、AP1、NFkB、及びSTAT5に結合する調節配列。
5.
NF−AT、AP1、NFkB、CREB、及びSTAT5によって活性化される組換えレポーター遺伝子アッセイ又は構築物を有するエフェクター細胞と;
抗体が特異的である内因性標的が無効化された組換え標的細胞(従属請求項、CD20、mTNFα、erbB2(SKBR3及びHEK293)、EGFR)と;
抗体が特異的である標的の発現が増強された組換え標的細胞と
を含むキット。(従属請求項、CD20、mTNFα、erbB2(SKBR3及びHEK293)、EGFR)
6.エフェクター細胞及び薬物標的が無効化されている標的細胞の存在下で得たシグナルを、エフェクター細胞及び薬物標的を発現する標的細胞の存在下で得たシグナルから減算することによって、ヒト血清の存在下でレポーター遺伝子シグナルの非特異的増加を補うための方法。
7.治療用抗体で処置した患者由来の臨床試料のex vivoでのADCC活性を定量するための方法。
1.下流プロモーターに作動可能に連結したシス作用調節配列を含むポリヌクレオチドであって、NF−AT、AP1、NFkB、STAT1、STAT3及びSTAT5のうちの1つ又は複数が、前記シス作用調節配列に結合することができる上記ポリヌクレオチド。
2.NF−AT、AP1、NFkB、及びSTAT5がすべて、前記シス作用調節配列に結合することができることを特徴とする、項1に記載のポリヌクレオチド。
3.プロモーターが、第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム配列に作動可能に連結している、項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
4.レポーターが酵素である、項1から3までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
5.酵素が、例えば、ルシフェラーゼである、項1から4までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
6.酵素が、蛍光タンパク質である、項1から5までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
7.配列番号1と少なくとも約70%の配列同一性、例えば、少なくとも約75%の配列同一性など、例えば、少なくとも約80%の配列同一性など、例えば、少なくとも約85%の配列同一性など、例えば、少なくとも約90%の配列同一性など、例えば、少なくとも約95%の配列同一性など、例えば、少なくとも約98%の配列同一性など、例えば、少なくとも約99%の配列同一性などを有するヌクレオチド配列又は配列番号1と同一のDNA配列を含む、項1から6までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
8.項1から7までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター構築物。
9.前記ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、項8に記載のベクター。
10.項8又は9に記載のベクターを含む細胞。
11.哺乳動物細胞である、項10に記載の細胞。
12.前記ベクターが、エピソーム性であるか又は前記細胞のゲノムに組み込まれている、項10又は11に記載の細胞。
13.細胞が、第1のレポータータンパク質と異なる第2のレポータータンパク質をさらに発現する、項10から12までのいずれか一項に記載の細胞。
14.細胞が、Jurkat、SKBR3、又はHEK293細胞である、項10から13までのいずれか一項に記載の細胞。
15.
i)請求項10から14までのいずれか一項に記載の細胞と;
ii)抗体が特異的である内因性標的が無効化された(突然変異した)細胞と;
iii)抗体が特異的である標的の発現が増強された細胞と
を含むキット。
16.ii)で標的細胞において無効化された標的が、CD20、mTNFα、erbB2、EGFRのうちの1つ又は複数を含む、項15に記載のキット。
17.iii)で標的細胞において増強された標的が、CD20、mTNFα、erbB2、EGFRのうちの1つ又は複数を含む、項15に記載のキット。
18.2つのバイアルを含む、項15から17までのいずれか一項に記載のキット。
19.i)及びiii)の細胞が、最適なE:T比で、1つの同じバイアルに存在する、項15から18までのいずれか一項に記載のキット。
20.i)の細胞とiii)の標的細胞との間の比が、約24:1から約2:1、又は例えば約6:1、又は例えば約3:1、又は例えば約1.5:1の範囲内である、項15から19までのいずれか一項に記載のキット。
21.治療用抗体で処置した患者由来の臨床試料のex vivoでのADCC活性を定量するための方法であって、
a)抗体の投与を含む処置を受けている患者から得た試料を、項15の標的細胞ii)と接触させるステップと、
b)薬物標的が無効化されている細胞i)の存在下で得たシグナルを、エフェクター細胞i)及び標的細胞iii)の存在下で得たシグナルから減算するステップと、
c)a)及びb)で測定したシグナルの関係に基づいて、ADCC活性を決定するステップと
を含む上記方法。
22.血清試料に対する陽性の結果(すなわち、検出可能なADCC活性)は、エフェクター細胞i)及び標的++細胞iii)/エフェクター細胞i)及び標的−/−細胞ii)に対するシグナルの関係が≧1である場合に存在し、血清試料に対する陰性の結果(すなわち、検出不可能なADCC活性)は、エフェクター細胞i)及び標的++細胞iii)に関する値/エフェクター細胞i)及び標的−/−細胞ii)に関する値が≦1である場合に存在する、項21に記載の方法。
23.ヒト血清の存在下で、レポーター遺伝子シグナルの非特異的増加を補うための方法であって、細胞i)の存在下で得たシグナルを、項15のエフェクター細胞i)及び薬物標的を発現する標的細胞iii)の存在下で得たシグナルから減算するステップを含む上記方法。
24.エフェクター細胞及び標的陰性細胞が>1である場合に、調査下の抗体に特異的なADCC活性に関連しない活性を示す血清試料を排除するための、項23に記載の方法。
Claims (15)
- 下流プロモーターに作動可能に連結したシス作用調節配列を含むポリヌクレオチドであって、NF−AT、AP1、NFkB、STAT1、STAT3及びSTAT5の全てが、前記シス作用調節配列に結合することができ、該ポリヌクレオチドが配列番号1に記載のDNA配列を含む、上記ポリヌクレオチド。
- プロモーターが、第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム配列に作動可能に連結している、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- レポーターが、例えば、ルシフェラーゼなどの酵素又は蛍光タンパク質である、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項2又は3に記載のポリヌクレオチドを含むベクター構築物。
- プラスミド又はウイルスベクターである、請求項4に記載のベクター。
- 請求項4又は5に記載のベクターを含む細胞。
- 前記ベクターが、エピソーム性であるか又は前記細胞のゲノムに組み込まれている、請求項6に記載の細胞。
- 第1のレポータータンパク質と異なる第2のレポータータンパク質をさらに発現する、請求項6又は7に記載の細胞。
- i)エフェクター細胞上に発現するFcガンマ受容体によって抗体のFc領域に結合することができる、請求項6から8までのいずれか一項に記載の細胞であるエフェクター細胞(E);
ii)抗原が細胞によって発現されないように、前記抗体が特異的である内因性抗原が無効化された(突然変異した)標的陰性細胞(T−);及び
iii)前記抗体が特異的である抗原の発現が増強されたか又は過剰発現された標的細胞(T+)
を含むキット。 - ii)の細胞及びiii)の細胞は、ii)の細胞が、抗体によって認識される抗原を発現しないことを除いてすべての点において同一の全く同じ細胞である、請求項9に記載のキット。
- 抗原が、CD20、mTNFα、erbB2、EGFRのうちの1つ又は複数である、請求項9又は10に記載のキット。
- 2つのバイアルを含み、i)及びiii)の細胞が、最適なE:T比で、1つの同じバイアルに存在する、請求項9から11までのいずれか一項に記載のキット。
- i)のエフェクター細胞とiii)の標的細胞との間の比(E:T比)が、約24:1から約2:1、又は約6:1、又は約3:1、又は約1.5:1の範囲内である、請求項9から12までのいずれか一項に記載のキット。
- 治療用抗体で処置した患者由来の臨床試料のex vivoでの抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)活性を定量するための方法であって、
a)治療用抗体の投与を含む処置を受けている患者から得た試料を、請求項9 iii)に記載の標的細胞(T+)と接触させるステップ、
b)内因性抗原が無効化されている、請求項9 ii)に記載の標的陰性細胞(T-)の存在下で得たシグナルを、請求項6から8までのいずれか一項に記載の細胞であるエフェクター細胞(E)及び請求項9 iii)に記載の標的細胞(T+)の存在下で得たシグナルから減算するステップ、及び
c)a)及びb)で測定したシグナルの関係に基づいて、ADCC活性を決定するステップであって、式[(E+T++抗体+NHS)−(E+T−+NHS)+(E+T+)]/E+T+、又は[(E+T++NHS)−(E+T−+NHS)+(E+T+)]/E+T+[式中、(E)は請求項6から8までのいずれか一項に記載の細胞であるエフェクター細胞であり、(T+)細胞は請求項9 iii)に記載の標的細胞であり、(T−)は請求項9 ii)に記載の標的陰性細胞であり、NHS=正常なヒト血清試料である]を使用して、血清試料に対する陽性の結果(すなわち、検出可能なADCC活性)は、エフェクター細胞(E)及び標的++細胞(T+)/エフェクター細胞(E)及び標的−/−細胞(T-)に対するシグナルの関係が≧1である場合に存在し、血清試料に対する陰性の結果(すなわち、検出不可能なADCC活性)は、エフェクター細胞(E)及び標的++細胞(T+)に関する値/エフェクター細胞(E)及び標的−/−細胞(T−)に関する値が≦1である場合に存在する上記ステップ
を含む、上記方法。 - ヒト血清の存在下でレポーター遺伝子シグナルの非特異的増加を補うための方法であって、
式[(E+T++抗体+NHS)−(E+T−+NHS)+(E+T+)]/E+T+、又は[(E+T++NHS)−(E+T−+NHS)+(E+T+)]/E+T+[式中、(E)は請求項6から8までのいずれか一項に記載の細胞であるエフェクター細胞であり、(T+)細胞は請求項9 iii)に記載の標的細胞であり、(T−)は請求項9 ii)に記載の標的陰性細胞であり、NHS=正常なヒト血清試料である]を使用して、
エフェクター細胞(E)及び標的細胞(T + )/エフェクター細胞(E)及び標的陰性細胞(T - )が>1である場合に、
請求項6から8までのいずれか一項に記載の細胞であるエフェクター細胞(E)及び抗原が細胞によって発現されないように、前記抗体が特異的である内因性抗原が無効化された(突然変異した)請求項9 ii)に記載の標的陰性細胞の存在下で得たシグナルを、
エフェクター細胞(E)、抗原を発現する請求項9 iii)に記載の標的細胞(T+)、及び調査下の抗体に特異的なADCC活性に関連しない活性を示す血清試料の存在下で得たシグナル
から減算するステップを含む、上記方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP16192246 | 2016-10-04 | ||
EP16192246.3 | 2016-10-04 | ||
PCT/EP2017/075053 WO2018065401A1 (en) | 2016-10-04 | 2017-10-03 | System and products for improved quantification of adcc activity |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019534713A JP2019534713A (ja) | 2019-12-05 |
JP6929368B2 true JP6929368B2 (ja) | 2021-09-01 |
Family
ID=57153279
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019538726A Active JP6929368B2 (ja) | 2016-10-04 | 2017-10-03 | Adcc活性の改良された定量のためのシステム及び製品 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11280790B2 (ja) |
EP (1) | EP3523652B1 (ja) |
JP (1) | JP6929368B2 (ja) |
KR (1) | KR102162096B1 (ja) |
ES (1) | ES2894323T3 (ja) |
WO (1) | WO2018065401A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11261462B2 (en) | 2016-01-27 | 2022-03-01 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Inducible expression from transposon-based vectors and uses |
US11098310B2 (en) | 2016-01-27 | 2021-08-24 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Expression from transposon-based vectors and uses |
ES2823173T3 (es) | 2016-01-27 | 2021-05-06 | Just Biotherapeutics Inc | Promotor híbrido y usos del mismo |
JP7059390B2 (ja) | 2018-03-19 | 2022-04-25 | スワール ライフ サイエンス エービー | Adcc及びadcp活性の改善された定量化のためのシステム及び製品 |
CA3221154A1 (en) * | 2021-06-03 | 2022-12-08 | Jonathan M. LEVY | Genome editing compositions and methods for treatment of wilson's disease |
CN116536274B (zh) * | 2023-06-20 | 2023-09-19 | 上海精翰生物科技有限公司 | Claudin18.2表达稳转细胞株、制备方法及应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5874304A (en) * | 1996-01-18 | 1999-02-23 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Humanized green fluorescent protein genes and methods |
DK2262905T3 (en) | 2008-03-04 | 2015-05-26 | Centre Nat Rech Scient | Cell, method and kit for carrying out a test for neutralizing antibodies |
WO2012121911A2 (en) | 2011-03-04 | 2012-09-13 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Cd16a reporter assay for evaluation of adcc potential of biologics |
-
2017
- 2017-03-10 US US16/339,327 patent/US11280790B2/en active Active
- 2017-10-03 JP JP2019538726A patent/JP6929368B2/ja active Active
- 2017-10-03 KR KR1020197012926A patent/KR102162096B1/ko active IP Right Grant
- 2017-10-03 ES ES17786845T patent/ES2894323T3/es active Active
- 2017-10-03 EP EP17786845.2A patent/EP3523652B1/en active Active
- 2017-10-03 WO PCT/EP2017/075053 patent/WO2018065401A1/en active Search and Examination
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2019534713A (ja) | 2019-12-05 |
EP3523652B1 (en) | 2021-07-21 |
KR20190082214A (ko) | 2019-07-09 |
US20190310251A1 (en) | 2019-10-10 |
ES2894323T3 (es) | 2022-02-14 |
EP3523652A1 (en) | 2019-08-14 |
WO2018065401A1 (en) | 2018-04-12 |
KR102162096B1 (ko) | 2020-10-06 |
US11280790B2 (en) | 2022-03-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6929368B2 (ja) | Adcc活性の改良された定量のためのシステム及び製品 | |
US20050095627A1 (en) | Multiple antigen detection assays and reagents | |
US9175284B2 (en) | Puro-DHFR quadrifunctional marker and its use in protein production | |
Al-Hashimi et al. | Significance of nuclear cathepsin V in normal thyroid epithelial and carcinoma cells | |
US20210293784A1 (en) | System for the adaptation of cell-based assays for analysis on automated immuno-assay platforms | |
JP4796059B2 (ja) | 細胞内修飾の分析 | |
US20200072820A1 (en) | Method of Selecting for Antibodies | |
Puckette et al. | Evaluation of Gaussia luciferase and foot-and-mouth disease virus 2A translational interrupter chimeras as polycistronic reporters for transgene expression | |
CN112513286B (zh) | 细胞培养系统中的原位细胞分析 | |
WO2014007242A1 (ja) | Hb-egfの測定方法 | |
JP7059390B2 (ja) | Adcc及びadcp活性の改善された定量化のためのシステム及び製品 | |
WO2006095654A1 (ja) | レポータ遺伝子アッセイ法 | |
CN109072236A (zh) | 用于生产分泌蛋白质的哺乳动物细胞 | |
KR101560849B1 (ko) | 자가면역 질환을 확인하기 위해 키메라 수용체를 사용하는 민감하고 신속한 방법 | |
TWI834095B (zh) | 表達載體、篩選表現目標蛋白質之宿主細胞的方法、建立穩定細胞株的方法以及製備重組蛋白質的方法 | |
US20230016623A1 (en) | Method for the selection of a long-term producing cell using histone acylation as markers | |
Schofield et al. | Sequencing and affinity determination of antigen-specific B lymphocytes from peripheral blood | |
Verweij et al. | Methods to Study the Molecular Pharmacology of the Histamine H 4 Receptor | |
Xu et al. | Bioanalytical Scheme for Antidrug Neutralizing Antibody Assays | |
Kim et al. | A genetically encoded bioluminescent indicator for illuminating proinflammatory cytokines | |
WO2024101303A1 (ja) | 抗がん剤の評価方法及び抗がん剤評価用キット | |
Barrett et al. | Chimeric antigens displaying GPR65 extracellular loops on a soluble scaffold enabled the discovery of antibodies, which recognized native receptor | |
WO2019128857A1 (zh) | 一种外源抗体基因拷贝数的检测方法和试剂盒 | |
US7326530B2 (en) | Method for localizing polypeptide on cell surface | |
CN116068198A (zh) | Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A529 | Written submission of copy of amendment under section 34 (pct) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A529 Effective date: 20190523 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190523 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200528 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200825 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201218 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210316 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210716 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210810 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6929368 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |