TWI834095B - 表達載體、篩選表現目標蛋白質之宿主細胞的方法、建立穩定細胞株的方法以及製備重組蛋白質的方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供一種篩選表現目標蛋白質之宿主細胞的方法,包含以下步驟:提供表達載體,表達載體包括啟動子、編碼目標蛋白質的基因以及FTH1基因;以表達載體轉染宿主細胞;於培養基中培養宿主細胞;以及於培養基中添加鐵離子,且篩選存活的宿主細胞以得到表現目標蛋白質的宿主細胞。本揭露亦提供一種建立穩定細胞株的方法、一種表達載體以及一種製備重組蛋白質的方法。
Description
本揭露是關於利用FTH1(Ferritin Heavy Chain 1)基因建構表達載體以及應用於篩選表現目標蛋白質之宿主細胞的方法、建立穩定細胞株的方法以及製備重組蛋白質的方法。
醫藥級重組蛋白質藥物的品質提升,除了透過細胞株培養環境之優化、純化及製程技術來改進之外,建立高效能穩定細胞株篩選系統以培育出高性能的生產細胞株同樣是最重要的關鍵。
一般而言,針對產製較為複雜的重組蛋白質藥物,哺乳動物細胞為較理想的宿主細胞,主因在於轉譯作用後所進行的修飾於功能以及藥物動力學上可與人類相容。為了產生表現感興趣之異種基因的穩定哺乳動物細胞株,一般常藉由轉染
(transfection)將異種基因連同可篩選標記(marker)基因(例如,新黴素磷酸轉移酶)一起導入使用的細胞株內,其中包括可藉由單一載體或由被共同轉染的不同載體,來表現異種基因以及可篩選標記基因。此外,於轉染之後的2至3天,如接續將細胞移至含有篩選劑的培養基(例如,於使用新黴素磷酸轉移酶基因時為含有G418的培養基)中培養數週,則之後可篩選分離出具有抗藥性的細胞,並且可進一步研究其基因產物的表現。然而,由於所獲得的細胞族群具有不同比例的異種基因表現,為了確認高度表現感興趣之異種基因的細胞純種系,需檢查並且測試大量的純種系,而其需耗費大量時間、勞力密集且價格相當昂貴。
基因擴大於動物細胞培養中相當普及,可用來產製重組蛋白質藥物,基因擴大改善了許多哺乳動物細胞株一開始相對較低的生產力。常用的擴大技術例如以二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)為基礎之基因擴大系統,常使用於DHFR缺失的中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細胞中。此技術可將帶有編碼DHFR以及感興趣的蛋白質的基因之載體,轉染DHFR缺失的CHO細胞,接著於無甘胺酸、次黃嘌呤以及胸腺核苷的培養基中篩選轉染的細胞,並且藉由逐漸加入胺甲碟呤(Methotrexate)、DHFR的抑制劑,達成高生產力的細胞株擴大。然而,為了建立穩定細胞株,所獲得之高生產力細胞的後續篩選亦為高度勞力密集且相當耗時。
有鑒於此,發展新穎的細胞株篩選系統以建立高效能穩定細胞株仍為醫藥領域致力研究的課題之一。
根據本揭露一些實施例,提供一種篩選表現目標蛋白質之宿主細胞的方法,包含以下步驟:提供表達載體,表達載體包括啟動子、編碼目標蛋白質的基因以及FTH1基因;以表達載體轉染宿主細胞;於培養基中培養宿主細胞;以及於培養基中添加鐵離子,且篩選存活的宿主細胞以得到表現目標蛋白質的宿主細胞。
本揭露提供一種建立穩定細胞株的方法,包含以下步驟:提供表達載體,表達載體包括啟動子、編碼目標蛋白質的基因以及FTH1基因;以表達載體轉染宿主細胞;於培養基中培養宿主細胞;以及於培養基中添加鐵離子,於含有鐵離子的培養基中持續培養該宿主細胞一期間,以篩選獲得穩定表現編碼目標蛋白質的基因的細胞株。
根據本揭露一些實施例,提供一種表達載體,包含啟動子、編碼目標蛋白質的基因以及FTH1基因,啟動子與編碼目標蛋白質的基因以及FTH1基因連接。
根據本揭露一些實施例,提供一種真核宿主細胞,其係由前述之表達載體轉染形成。
根據本揭露一些實施例,提供一種製備重組蛋白質的方法,包含以下步驟:於培養基中培養如前述之真核宿主細胞;以及從培養基中分離出重組蛋白質。
根據本揭露一些實施例,提供一種建立穩定表達外源重組基因之細胞株的方法,其係使用一FTH1基因作為篩選標記,以篩選出帶有一外源重組基因的一宿主細胞。
為讓本揭露之特徵、或優點能更明顯易懂,下文特舉出較佳實施例,並配合所附圖式,作詳細說明如下。
第1A圖至第1C圖顯示根據本揭露一些實施例,建構的表達載體的示意圖;第2圖顯示根據本揭露一些實施例,細胞株篩選系統的作用機制;第3A圖顯示根據本揭露一些實施例,經CRISPR/Cas9基因編輯技術處理後的CHOK1細胞株(CHOK1_Fth1_KO_F4)之核酸序列定序結果;第3B圖顯示根據本揭露一些實施例,以西方墨點法分析CHOK1細胞株的蛋白質表現量之結果(第1~4欄分別代表FTH1基因經剔除的細胞株(CHOK1_Fth1_KO_F4)、野生型細胞株(CHOK1_Fth1_WT)、FTH1基因經編輯的細胞株
(CHOK1_Fth1_F20)及FTH1基因經編輯的細胞株(CHOK1_Fth1_C16));第4A圖顯示根據本揭露一些實施例,CHOK1細胞株Fth1_WT以及Fth1_KO經不同濃度的鐵離子處理後的細胞存活率之分析結果;第4B圖顯示根據本揭露一些實施例,CHOK1細胞株Fth1_WT以及Fth1_KO細胞株於FTH1基因過度表達的情況下,對於鐵離子誘發鐵依賴型細胞死亡的影響之分析結果;第5圖顯示根據本揭露一些實施例,CHOK1細胞株Fth1_WT以及Fth1_KO細胞株於不同的鐵離子來源(C6H8FeNO7及FeSO4)及不同濃度的鐵依賴型細胞死亡誘導劑FINO2處理下,對於鐵離子誘發鐵依賴型細胞死亡的影響之分析結果;第6A圖至第6D圖顯示根據本揭露一些實施例,CHOK1細胞株Fth1_WT以及Fth1_KO細胞株於不同組成的篩選配方中誘發鐵依賴型細胞死亡的效果之分析結果;第7A圖至第7C圖顯示根據本揭露一些實施例,建構的表達載體pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP、pCDNA3.1-CMV-mFth1-p2A-EGFP以及pCDNA3.1-CMV-hFth1-p2A-EGFP的示意圖;第8圖顯示根據本揭露一些實施例,CHOK1細胞株Fth1_WT以及Fth1_KO細胞株經pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP表達載體轉染後的螢光蛋白表現之分析結果;
第9A圖顯示根據本揭露一些實施例,經表達載體pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP、pCDNA3.1-CMV-mFth1-p2A-EGFP以及pCDNA3.1-CMV-hFth1-p2A-EGFP轉染的CHOK1細胞株於鐵離子誘發鐵依賴型細胞死亡的情況下,螢光細胞計數的分析結果;第9B圖顯示根據本揭露一些實施例,經表達載體pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP、pCDNA3.1-CMV-mFth1-p2A-EGFP以及pCDNA3.1-CMV-hFth1-p2A-EGFP轉染的HEK293T細胞株於鐵離子誘發鐵依賴型細胞死亡的情況下,螢光細胞計數的分析結果;第10圖顯示根據本揭露一些實施例,經pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP表達載體轉染的CHOK1細胞株Fth1_WT以及Fth1_KO,於鐵離子誘發鐵依賴型細胞死亡的情況下,螢光蛋白表現之分析結果;第11A圖以及第11B圖為根據本揭露一些實施例,第9圖的實驗結果經處理後所得之量化數據分析結果;第12A圖以及第12B圖為根據本揭露一些實施例,第9圖的實驗結果經處理後所得之量化數據分析結果;第13圖顯示根據本揭露一些實施例,完成篩選後的單一細胞於含有鐵離子的培養基中生長為細胞群落的螢光蛋白表現之分析結果;
第14圖顯示經篩選後的CHOK1細胞株,此細胞株之FTH1為WT於160天持續繼代培養後的螢光蛋白表現之分析結果;第15圖顯示經篩選後的CHOK1細胞株於210天持續繼代培養後的螢光蛋白表現之分析結果;第16A圖顯示根據本揭露一些實施例,經pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP表達載體轉染的HEK293T細胞株,於鐵離子誘發鐵依賴型細胞死亡的情況下,螢光蛋白細胞計數之分析結果;第16B圖顯示根據本揭露一些實施例,經pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP表達載體轉染的VERO細胞株,於鐵離子誘發鐵依賴型細胞死亡的情況下,螢光蛋白細胞計數之分析結果;第17A圖以及第17B圖分別顯示根據本揭露一些實施例,建構的表達載體pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2以及pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1的示意圖;第18A圖顯示根據本揭露一些實施例,以西方墨點法分析CHOK1細胞株的蛋白質表現量之結果(第1~6欄分別為經表達載體pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP、pCDNA3.1-CMV-hFth1-p2A-EGF、pCDNA3.1-CMV-mFth1-p2A-EGF、pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1、pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2以及WT轉染細胞株);
第18B圖顯示根據本揭露一些實施例,以西方墨點法分析HEK293T細胞株的蛋白質表現量之結果(第1~6欄分別為經表達載體pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP、pCDNA3.1-CMV-hFth1-p2A-EGF、pCDNA3.1-CMV-mFth1-p2A-EGF、pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1、pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2以及WT轉染細胞株);第19A圖顯示根據本揭露一些實施例,經表達載體pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2轉染的CHOK1細胞株的FTH1基因的mRNA表現量之分析結果;第19B圖顯示根據本揭露一些實施例,經表達載體pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2轉染的CHOK1細胞株所獲得的Anti-HER2 IgG1(h4D5)抗體的重鏈(VH)以及輕鏈(VL)的mRNA表現量之分析結果;第19C圖顯示根據本揭露一些實施例,以ELISA分析經表達載體pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2轉染的CHOK1細胞株所獲得的Anti-HER2 IgG1(h4D5)抗體的表現量之分析結果;第20A圖顯示根據本揭露一些實施例,經表達載體pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1轉染的CHOK1細胞株所獲得的Anti-HER2 IgG1(h4D5)抗體的重鏈(VH)的mRNA表現量之分析結果;
第20B圖顯示根據本揭露一些實施例,經表達載體pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1轉染的CHOK1細胞株所獲得的Anti-HER2 IgG1(h4D5)抗體的輕鏈(VL)的mRNA表現量之分析結果;第20C圖顯示根據本揭露一些實施例,經表達載體pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1轉染的CHOK1細胞株的FTH1基因的mRNA表現量之分析結果;第20D圖顯示根據本揭露一些實施例,以ELISA分析經表達載體pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1轉染的CHOK1細胞株所獲得的Anti-HER2 IgG1(h4D5)抗體的表現量之分析結果;第21圖顯示根據本揭露一些實施例,以SDS-PAGE蛋白質膠體電泳分析Anti-HER2 IgG1(h4D5)重組蛋白質的構型之結果(第1~6欄分別為Anti-HER2 IgG1重組蛋白質_未還原形式、Anti-HER2 IgG1重組蛋白質_還原形式、Anti-HER2 IgG1重組蛋白質_FAC+未還原形式、Anti-HER2 IgG1重組蛋白質_FAC+還原形式、Anti-HER2 IgG標準品_未還原形式以及Anti-HER2 IgG1純化蛋白標準品_還原形式);第22圖顯示根據本揭露一些實施例,生產之Anti-HER2 IgG1(h4D5)的ADCC生物學活性檢測之結果。
以下針對本揭露實施例的表達載體、篩選表現目標蛋白質之宿主細胞的方法、建立穩定細胞株的方法以及製備重組蛋白質的方法作詳細說明。應了解的是,以下之敘述提供許多不同的實施例或例子,用以實施本揭露一些實施例之不同樣態。以下所述特定的元件及排列方式僅為簡單清楚描述本揭露一些實施例。當然,這些僅用以舉例而非本揭露之限定。
於文中,「約」、「實質上」等用語通常表示在一給定值或範圍的10%內,或5%內、或3%之內、或2%之內、或1%之內、或0.5%之內。在此給定的數量為大約的數量,亦即在沒有特定說明「約」、「實質上」的情況下,仍可隱含「約」、「實質上」之含義。此外,用語「範圍介於第一數值及第二數值之間」或「範圍為第一數值至第二數值」表示所述範圍包含第一數值、第二數值以及它們之間的其它數值。
除非另外定義,於本文中使用的全部用語(包含技術及科學用語)具有與本揭露所屬技術領域的技術人員通常理解的相同涵義。能理解的是,這些用語例如在通常使用的字典中定義用語,應被解讀成具有與相關技術及本揭露的背景或上下文一致的意思,而不應以一理想化或過度正式的方式解讀。為了使本揭露的內容更容易理解,提供以下術語及用詞的定義。
術語「FTH1基因」指的是鐵蛋白重鏈1(Ferritin Heavy Chain 1)基因,其編碼為鐵蛋白重鏈,其為一種亞鐵氧化酶(ferroxidase enzyme)。FTH1基因參與了鐵離子於細胞內的代謝
調控,並且於鐵依賴型細胞死亡機制(ferroptosis)中扮演重要的角色。鐵蛋白為原核生物以及真核生物中用於儲存鐵離子的主要蛋白質,鐵蛋白次單元組成的變化可能會影響不同組織中吸收以及釋放鐵的速率,鐵蛋白的主要功能是以可溶且無毒的狀態儲存鐵,鐵蛋白缺陷與多種神經退行性疾病有關。
術語「鐵依賴型細胞死亡(ferroptosis)」指的是涉及生成由鐵調節的反應性氧化物質且而導致脂質過氧化之細胞死亡形式。術語「鐵依賴型細胞死亡誘導劑」指的是誘導、促進或活化鐵依賴型細胞死亡的藥劑。
根據本揭露的實施例,表達載體中所含有的「目標基因(感興趣的基因)」,包含編碼目標產物之任何長度的核苷酸序列。「基因產物」或「感興趣產物」通常為蛋白質、多肽、胜肽或其片段或衍生物,然而,「基因產物」或「感興趣產物」亦可包含RNA或反義RNA。目標基因可以其全長、縮短之形式,融合基因或已標示之基因的形式存在。目標基因可為基因組DNA、cDNA或相當的融合片段。目標基因可為天然的基因序列,或是經突變或修飾的序列,此類修改可包含適應特殊宿主細胞的密碼子最優化以及人源化作用。
術語「核苷酸序列」或「核酸序列」指的是寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸及其片段,以及基因組或合成來源的DNA或RNA,可以單股或雙股形式存在。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾的核苷酸。核苷由嘌呤(腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)或
其衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或其衍生物)鹼基與糖鍵結組成。DNA中的四種核苷單元(或鹼基)稱為去氧腺苷、去氧鳥苷、胸苷及去氧胞苷。RNA中的四種核苷單元(或鹼基)稱為腺苷、鳥苷、尿苷及胞苷。核苷酸為核苷之磷酸酯。
術語「編碼」指的是於核酸中特定序列之核苷酸的特性或性能,例如於染色體或mRNA中的基因,於生物體作用中作為基質用以合成其它的聚合物及大分子,例如,rRNA、tRNA、mRNA、其它的RNA分子、cDNA或多肽。因此,若藉由mRNA的轉錄以及後續的轉譯作用,於細胞或其它生物系統中產製蛋白質,則稱為「基因編碼蛋白質」。
術語「宿主細胞」指的是將外源核酸引入其中的細胞,包含這類細胞的子代。宿主細胞包含「轉化體」及「轉化細胞」,其包含最初轉化的細胞及從其衍生的子代,並且不考慮傳代數。子代的核酸含量可以不與親本細胞完全相同,且可包含突變。根據本揭露的實施例,宿主細胞包含具有與在最初轉化的細胞中篩選或選擇之相同功能或生物活性的突變體後代。
術語「載體」指的是能夠繁殖與它連接的另一核酸的核酸分子。根據本揭露的實施例,載體包含作為自主複製核酸結構的載體,以及併入其所進入的宿主細胞之基因組的載體。特定的載體能夠指示與它們有效連接的核酸的表現,此類載體於本文中稱為「表達載體」。
術語「轉染(transfect)」指的是傳送核酸、蛋白質或其它巨分子至目標細胞,以在細胞內表現核酸、蛋白質或其它巨分子或者使其具有生物功能。
術語「培養」指的是各種類型培養基中或培養基上體外增殖細胞或生物體。應理解的是,培養中細胞生長的子代可以不完全與親代相同(於形態上、遺傳上、或表現型上)。
術語「啟動子」或「啟動子區」指的是位於所表現核酸序列上游(5’端)且藉由提供RNA聚合酶之識別及結合位點控制序列表現的核酸序列。啟動子區可包含參與調節基因轉錄的其它因子的其它識別及結合位點。啟動子可控制原核基因或真核基因的轉錄。此外,啟動子可為誘導型啟動子且可回應誘導劑而起始轉錄,或於轉錄不受誘導劑控制的情況下可為組成型啟動子。若誘導劑不存在,則受誘導型啟動子控制的基因不表現或僅少量表現,反之,於誘導劑存在下,基因啟動轉錄或轉錄量增加,其一般由特定轉錄因子的結合進行調節。
術語「蛋白質」可與術語「胜肽」及「多肽」可互換使用。術語「重組蛋白質」指的是藉由重組DNA技術製成的蛋白質,其中通常將編碼經表現的蛋白質或RNA的DNA插入適當的表達載體中,而表達載體可用於轉染宿主細胞以產生外源蛋白質或RNA。具有生物藥學重要性的蛋白質或多肽,例如可包含抗體、酵素、細胞激素、淋巴因子、受體及其衍生物或片段,但不限於此。
術語「抗體」於本文中以最廣泛的含義使用並涵蓋多種抗體結構,例如包含單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如,雙特異性抗體)或抗體片段,但不限於此。術語「抗體片段」指的是除了完整抗體以外之包含完整抗體的部分的分子,其與完整抗體結合至相同的抗原。抗體片段可包含Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2;雙抗體(diabody);線性抗體;單鏈抗體分子(例如,scFv);以及從抗體片段形成的多特異性抗體,但不限於此。
根據本揭露的實施例,透過生物資訊以及功能性基因體學的分析從關鍵細胞生合成路徑基因的調控策略,找出多種具有提昇特定細胞株性能或產能之高潛力標的基因,其中發現FTH1基因(X11基因)於細胞生產外源重組蛋白質時會大量表現,FTH1基因主要參與鐵離子於細胞內的代謝調控,並於鐵依賴型細胞死亡機制(ferroptosis)中扮演重要的角色。
本揭露的實施例已驗證FTH1基因調控與誘發細胞中的鐵依賴型細胞死亡的關聯性,並進一步證實FTH1基因過度表達於細胞面對過量鐵離子添加或鐵依賴型細胞死亡誘導劑作用下,能顯著提高細胞株對於所誘導的鐵依賴型細胞死亡之耐受性。本揭露的實施例藉由前述特性進行表達載體以及培養基的配方開發,建構出高效率的細胞株篩選系統,並且藉此建立可穩定表達外源重組基因的細胞株以及促進外源基因於細胞株中的表達,達成提升重組蛋白質藥物產量的效果。
根據本揭露的實施例,提供一種篩選表現目標蛋白質之宿主細胞的方法,包含以下步驟:(a)提供表達載體,表達載體包含啟動子、編碼目標蛋白質的基因以及FTH1基因;(b)以表達載體轉染宿主細胞;(c)於培養基中培養宿主細胞;以及(d)於培養基中添加鐵離子,且篩選存活的宿主細胞以得到表現目標蛋白質的宿主細胞。
可藉由本發明所屬技術領域中習知的技術設計以及建構表達載體。於表達載體中,啟動子與編碼目標蛋白質的基因以及FTH1基因連接。具體而言,如第1A圖所示,根據一些實施例,編碼目標蛋白質的基因(以GOI標示)以及FTH1基因可由不同的啟動子(以箭頭標示)分別驅動,亦即,編碼目標蛋白質的基因可由一個啟動子驅動,而FTH1基因可由另一個啟動子驅動,驅動編碼目標蛋白質的基因的啟動子種類可與驅動FTH1基因的啟動子種類不同。根據另一些實施例,如第1B圖及第1C圖所示,編碼目標蛋白質的基因(以GOI標示)以及FTH1基因可由同一啟動子驅動。如第1B圖所示,根據一些實施例,編碼目標蛋白質的基因可位於FTH1基因的下游。如第1C圖所示,根據一些實施例,編碼目標蛋白質的基因可位於FTH1基因的上游。
根據一些實施例,驅動編碼目標蛋白質的基因或FTH1基因的啟動子可包含CMV啟動子、SV40啟動子、EF1α啟動子或其它合適的啟動子,但不限於此。根據一些實施例,表達載
體可進一步包含內部核醣體進入位點(internal ribosome entry site,IRES),其位於編碼目標蛋白質的基因以及FTH1基因之間。
表達載體可包含編碼目標蛋白質的任何長度的核苷酸序列。根據一些實施例,目標蛋白質可包含重組蛋白質,但不限於此。根據一些實施例,重組蛋白質可包含抗體,但不限於此。根據不同的實施例,可根據需要,選擇任意合適的目標蛋白質進行表達載體的設計。
再者,FTH1基因參與了鐵離子於細胞內的代謝調控,並且於鐵依賴型細胞死亡機制中扮演重要的角色。FTH1基因於不同物種間的相似性高,舉例而言,人類(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)以及中國倉鼠(Cricetulus griseus)三者的FTH1基因的胺基酸序列比對結果顯示大於90%的相同性。根據一些實施例,FTH1基因編碼的胺基酸序列與序列辨識號:1至3之任一者所示的序列具有至少85%的相似度,例如可具有,86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相似度,但不限於此。根據一些實施例,FTH1基因為衍生自中國倉鼠的FTH1基因,其編碼為序列辨識號:1之胺基酸序列。根據一些實施例,FTH1基因為衍生自小鼠的FTH1基因,其編碼為序列辨識號:2之胺基酸序列。根據一些實施例,FTH1基因為衍生自人類的FTH1基因,其編碼為序列辨識號:3之胺基酸序列。
可藉由本發明所屬技術領域中習知的技術進行宿主細胞的轉染,例如,可藉由化學轉染法(例如,脂質體(liposome)轉染法或磷酸鈣法)、病毒轉染法、電轉染法或其它合適的方法,使表達載體攜帶的遺傳訊息進入宿主細胞。根據一些實施例,宿主細胞可包含CHO細胞、HEK293細胞、Hela細胞、VERO細胞、NS0細胞、其它合適的細胞株,但不限於此。
根據一些實施例,可先將宿主細胞於合適的培養基培養一段時間之後,再以表達載體轉染宿主細胞。例如,根據一些實施例,可先將宿主細胞於培養基培養約12小時至約36小時之後,例如,約16小時、約20小時、約24小時、約28小時或約32小時,再進行轉染。
根據一些實施例,於轉染作用之後,可於培養基中添加鐵離子,使培養基中的鐵離子濃度增加以誘導鐵依賴型細胞死亡,進而可篩選得到表現目標蛋白質的宿主細胞。詳細的篩選機制例如請參照第2圖,於添加過量鐵離子的壓力環境下,野生型(WT)的宿主細胞或FTH1基因缺失(FTH1-/-)的宿主細胞內的鐵代謝作用會產生異常,同時亦會導致細胞內大量的細胞膜脂質過氧化產物(例如,脂質活性氧物質(lipid reactive oxygen species,ROS))堆積,進而誘導細胞死亡。另一方面,經轉染而帶有表達載體的宿主細胞因具有FTH1基因,可大量複製載體並且轉譯產生鐵蛋白,因此,即便於添加過量鐵離子的壓力環境下,亦可使細胞存活。值得注意的是,由於表達載體進一步帶有編碼目標蛋白質的基因(以
GOI標示),因此,宿主細胞亦會轉譯產生目標蛋白質。換言之,鐵離子的添加亦可篩選出表現目標蛋白質的宿主細胞。藉由鐵離子誘導鐵依賴型細胞死亡的作用,前述篩選機制可改善編碼目標蛋白質的基因的篩選效率以及目標蛋白質的量產之雙重功效。
根據一些實施例,於培養基中添加的鐵離子的濃度可為約100μM至約1.5mM,或為約125μM至約1mM,例如,約250μM、約500μM或約750μM,但不限於此。根據一些實施例,鐵離子可包含二價的鐵離子或三價的鐵離子。根據一些實施例,鐵離子的來源可包含硫酸鐵(Fe2(SO4)3)、硫酸亞鐵(FeSO4)、檸檬酸鐵銨(C6H8FeNO7)、檸檬酸鐵(C6H5FeO7)、氯化鐵(FeCl3)、硝酸鐵(Fe(NO3)3)、草酸鐵(Fe2(C2O4)3)、磷酸鐵(FePO4)或其它合適的來源,但不限於此。於不同的實施例中,可根據使用的宿主細胞的種類,調整合適的鐵離子的添加濃度範圍。
根據一些實施例,可藉由本發明所屬技術領域中習知的任意方法篩選存活的宿主細胞,以得到表現目標蛋白質的宿主細胞。
再者,根據一些實施例,篩選宿主細胞的步驟可進一步包含於培養基中添加鐵依賴型細胞死亡誘導劑。於篩選過程中使用鐵依賴型細胞死亡誘導劑可進一步促進鐵依賴型細胞死亡的發生,提升細胞對於鐵離子的敏感程度,優化篩選效果。
根據一些實施例,鐵依賴型細胞死亡誘導劑可為可發揮涉及鐵氧化以及GPX4酶活性喪失以誘導鐵依賴型細胞死亡的
雙重功效的誘導劑。例如,根據一些實施例,鐵依賴型細胞死亡誘導劑可包含FINO2(ferroptosis inducer endoperoxide)、愛拉斯汀(Erastin)、哌嗪Erastin(piperazine Erastin,PE)、咪唑酮Erastin(imidazole ketone Erastin,IKE)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、索拉非尼(sorafenib)、麩胺酸(glutamate)、RAS選擇性致死3(RAS-selective lethal 3,RSL3)、ML162(molecular libraries 162)、多樣性藥物抑制劑(diverse pharmacological inhibitor,DPI)化合物7、10、12、13、17、18、19、FIN56(ferroptosis inducer 56)、凋亡蛋白酶依賴性致死56(caspase-independent lethal 56,CIL56)或其它合適的鐵依賴型細胞死亡誘導劑,但不限於此。根據一些實施例,鐵依賴型細胞死亡誘導劑的添加濃度可為約0.5μM至約2mM,或為約1μM至約1.8mM,或為約10μM至約1.5mM,或為約20μM至約1.2mM,或為約50μM至約1mM,例如,約100μM、約200μM、約300μM、約400μM、約500μM、約600μM、約700μM、約800μM或約900μM,但不限於此。於不同的實施例中,可根據使用的宿主細胞的種類,調整合適的鐵依賴型細胞死亡誘導劑的添加濃度範圍。
再者,根據一些實施例,篩選宿主細胞的步驟可進一步包含於培養基中添加脂肪酸。於培養基中添加脂肪酸可進一步促進脂質過氧化產物(例如,ROS)的產生,進而誘導鐵依賴型細胞死亡的發生,優化篩選效果。
脂肪酸可包含飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸或前述之組合。根據一些實施例,脂肪酸可包含棕櫚酸(palmitic acid,PA)、亞麻油酸(Linoleic acid,LA)、花生四烯酸(Arachidonic,AA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)、二十二碳五烯酸(Docosapentaenoic acid,DPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)或其它合適的脂肪酸,但不限於此。根據一些實施例,脂肪酸的添加濃度可為約50μM至約500μM,或為約60μM至約190μM,或為約70μM至約180μM,例如,約約80μM、約90μM、約100μM、約110μM、約120μM、約130μM、約140μM、約150μM、約160μM或約170μM,但不限於此。於不同的實施例中,可根據使用的宿主細胞的種類,調整合適的脂肪酸的添加濃度範圍。
此外,根據一些實施例,宿主細胞可為FTH1基因剔除(knockout)的細胞。根據一些實施例,採用FTH1基因剔除的宿主細胞可進一步提升帶有載體或不帶有載體的宿主細胞對於鐵依賴型細胞死亡的耐受性差異,使篩選效果更為明顯。根據一些實施例,可藉由CRISPR/Cas9技術建構基因剔除的細胞株,但本揭露不以此為限。
承前述,根據本揭露的實施例,篩選表現目標蛋白質之宿主細胞的方法,以FTH1基因作為篩選標記並且搭配特定配方的營養基,藉由鐵依賴型細胞死亡機制篩選具有編碼目標蛋白質
的基因的細胞。由此建立的篩選方法可快速地篩選得到穩定表達外源重組基因的特定細胞,並且可促進外源基因於細胞中的表達。
此外,根據本揭露的實施例,亦提供一種建立穩定細胞株的方法,包含以下步驟:(a)提供表達載體,表達載體包含啟動子、編碼目標蛋白質的基因以及FTH1基因;(b)以表達載體轉染宿主細胞;(c)於培養基中培養宿主細胞;以及(d)於培養基中添加鐵離子,於含有鐵離子的培養基中持續培養宿主細胞一期間,以篩選得到穩定表現編碼目標蛋白質的基因的細胞株。
關於步驟(a)~(c)的詳細說明,可參照前述篩選表現目標蛋白質之宿主細胞的方法,於此便不再重複。根據一些實施例,於培養基中添加鐵離子之後,可持續培養宿主細胞並且持續補充鐵離子以維持培養基中的鐵離子濃度,以持續進行細胞的篩選,得到穩定表現編碼目標蛋白質的基因的細胞株。
根據一些實施例,可持續篩選以及培養宿主細胞約5天至約30天,例如,6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或29天。具體而言,根據一些實施例,在經過約5天至約10天的持續培養及篩選後,即可使得100%的存活的宿主細胞皆帶有表達載體的外源基因,亦即,FTH1基因以及編碼目標蛋白質的基因,於此之後,可將細胞培養於含有鐵離子的培養基中維持其生長,並且保持編碼目標蛋白質的基因的表現。
根據一些實施例,於篩選得到穩定表現編碼目標蛋白質的基因的細胞株之後,可於含有鐵離子的環境中持續篩選以及擴增培養細胞株,以建立穩定細胞株。承前述,篩選宿主細胞的步驟可進一步包含於培養基中添加鐵依賴型細胞死亡誘導劑以及脂肪酸,根據一些實施例,於建立穩定細胞株之後,可不再添加鐵依賴型細胞死亡誘導劑及/或脂肪酸於培養基中。
承前述,根據本揭露的實施例,建立穩定細胞株的方法,以FTH1基因作為篩選標記並且搭配特定配方的營養基,藉由鐵依賴型細胞死亡機制篩選得到穩定表現編碼目標蛋白質的基因的細胞株。此方法可快速地得到穩定表達外源重組基因的細胞株,並且可促進外源基因於細胞株中的表達。值得注意的是,篩選得到的細胞株可長時間穩定地表現目標蛋白質,例如,根據一些實施例,篩選得到的細胞株接近100%皆表現目標蛋白質並且可持續表現目標蛋白質約160天、約200天或甚至約1年以上。
此外,根據本揭露的實施例,亦提供一種真核宿主細胞,其由本揭露實施例提供的表達載體轉染形成。根據一些實施例,真核宿主細胞可為CHO細胞、HEK293細胞、Hela細胞、VERO細胞、NS0細胞其它合適的細胞,但不限於此。
根據本揭露的實施例,亦提供一種製備重組蛋白質的方法,包含以下步驟:(a)於培養基中培養本揭露實施例提供的真核宿主細胞;以及(b)從培養基中分離出重組蛋白質。根據一些實施例,重組蛋白質可含抗體,但不限於此。根據一些實施例,可在適
於抗體表達的條件下培養如前述的真核宿主細胞,以及從宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收抗體。
值得注意的是,由本揭露實施例提供的表達載體轉染而形成的真核宿主細胞可穩定表現重組蛋白質藥物,並且促進目標重組蛋白質藥物的量產。
為了讓本揭露之上述及其它目的、特徵、及優點能更明顯易懂,下文特舉數實施例以及比較例,作詳細說明如下,然其並非用以限定本揭露之內容。
實施例1:FTH1基因的表達與鐵依賴型細胞死亡之關聯性驗證
為了驗證FTH1基因表現與鐵離子誘導產生之鐵依賴型細胞死亡的關連性,利用CRISPR/Cas9技術將FTH1基因剔除(knockout,KO)以及利用載體轉染技術使FTH1基因過度表達(Plasmid Overexpression),以進行功能性驗證。
首先,以CRISPR/Cas9基因編輯技術建立FTH1基因剔除CHOK1細胞株(FTH1-KO),以中國倉鼠的FTH1基因(CgFth1)染色體設計導引核醣核酸(guide RNA),之後Cas9蛋白質及導引核醣核酸所形成的複合體CRISPR/Cas9核糖核蛋白(CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein,RNP)以電穿孔(NEPA21 Electroporator)方式送入CHOK1細胞株進行基因編輯。之後經由單細胞篩選培養並進行突變株的基因定序以確認突變型,並且使
用西方墨點法(Western blotting)以FTH1抗體(ab65080,Abcam)進行突變株的蛋白質分析,驗證細胞株的FTH1蛋白質之表達量。核酸序列以及西方墨點法的結果分別如第3A圖以及第3B圖所示。
請參照第3A圖,核酸定序結果顯示FTH1基因剔除的細胞株(F4)於兩個配對基因染色體上皆發生了單一核酸剔除(single base deletion),由於發生兩類型的單一核酸剔除的點突變位於FTH1基因的外顯子(Exon-1),預測可產生一終止密碼子(stop codon),進行造成蛋白質無法完成轉譯。
請參照第3B圖,第1~4欄分別代表FTH1基因經剔除的細胞株(CHOK1_Fth1_KO_F4)、野生型細胞株(CHOK1_Fth1_WT)、FTH1基因經編輯的細胞株(CHOK1_Fth1_F20)及FTH1基因經編輯的細胞株(CHOK1_Fth1_C16)的結果,beta肌動蛋白(beta-actin)作為控制組。西方墨點法分析的結果顯示,CHOK1_Fth1_KO_F4突變細胞株並未偵測到蛋白質的表現,顯示成功於CHOK1細胞株達成FTH1基因的剔除。亦即,成功以CRISPR/Cas9基因編輯技術建立FTH1基因剔除的細胞株。
接著,分別將兩種CHOK1細胞株Fth1_WT(CHOK1,BCRC)以及Fth1_KO(Fth1_WT為野生型細胞株;Fth1_KO為FTH1基因經剔除的細胞株)以1x104細胞/每孔接種於96孔培養盤,於含10% FBS之F12培養基(Ham's F-
12 Nutrient Mix,Gibco)貼附培養24小時後,添加不同濃度的硫酸亞鐵(FeSO4)作為鐵離子來源以誘發鐵依賴型細胞死亡,並於處理後的第5天(120小時),以AlamarBlueTM cell viability reagent(Thermo Fisher Scientific inc.)進行細胞活性的偵測,藉由將螢光偵測的讀值(Ex/Em:560nm/590nm)以及未經處理的陰性對照組的螢光數值相除,來計算不同濃度的鐵離子處理之下的細胞存活率(viability)的百分比,實驗結果如第4A圖所示。
再者,分別將兩種CHOK1細胞株Fth1_WT(CHOK1,BCRC)以及Fth1_KO以1x104細胞/每孔接種於96孔培養盤,於含10% FBS之F12培養基(Ham's F-12Nutrient Mix,Gibco)貼附培養24小時後,以Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific inc.)進行載體轉染,以促使FTH1基因產生過度表達(pcDNA3.1-CMV-CgFth1-p2A-EGFP)。於載體的DNA轉染後24小時,添加不同濃度的硫酸亞鐵(FeSO4)誘發鐵依賴型細胞死亡,於處理後的第5天(120小時),以AlamarBlueTM cell viability reagent(Thermo Fisher Scientific inc.)進行細胞活性的偵測,藉由偵測螢光的讀值(Ex/Em:560nm/590nm),比較兩種CHOK1細胞株在FTH1過度表達情況下對於鐵離子誘發鐵依賴型細胞死亡的影響。實驗結果如第4B圖所示。
如第4A圖以及第4B圖所示,實驗結果證實FTH1基因的剔除使得CHO細胞株對於鐵離子所誘導的鐵依賴型細胞死
亡更具敏感性。此外,藉由載體過度表達外源性FTH1基因的策略則可顯著減緩鐵離子所誘導的鐵依賴型細胞死亡。由前述結果可知,細胞中FTH1基因的表達量與鐵離子所誘導的鐵依賴型細胞死亡呈現高度相關。
實施例2:細胞的FTH1基因表達於鐵依賴型細胞死亡誘導劑作用下之耐受性變化
為了驗證FTH1基因的表現量與鐵依賴型細胞死亡的相關性,將兩種不同的鐵離子來源檸檬酸鐵銨(C6H8FeNO7)以及硫酸亞鐵(FeSO4)添加於細胞培養液中,並以不同濃度的鐵依賴型細胞死亡誘導劑FINO2進行處理。
分別將兩種CHOK1細胞株Fth1_WT以及Fth1_KO以1x104細胞/每孔接種於96孔培養盤,於貼附培養24小時後,分別添加200μM的檸檬酸鐵銨(C6H8FeNO7)以及硫酸亞鐵(FeSO4)於含10% FBS之F12(Ham's F-12 Nutrient Mix,Gibco)細胞培養液中,並且同時加入不同劑量的鐵依賴型細胞死亡誘導劑FINO2(CAS#869298-31-7;Cayman Chemical)來誘發鐵依賴型細胞死亡。於作用24小時之後,以AlamarBlueTM cell viability reagent(Thermo Fisher Scientific inc.)進行細胞活性的偵測,藉由偵測螢光的讀值(Ex/Em:560nm/590nm),比較兩種CHOK1細胞株發生鐵依賴型細胞死亡的情況差異。實驗結果如第5圖所示。
如第5圖所示,實驗結果顯示上述兩種鐵離子來源皆可於鐵依賴型細胞死亡誘導劑的作用下,誘發鐵依賴型細胞死亡。其中,FTH1基因的表達程度與鐵依賴型細胞死亡的程度呈現負相關,而鐵依賴型細胞死亡誘導劑的添加可以提高細胞毒殺效果,顯示FTH1基因可於鐵依賴型細胞死亡誘導劑的作用下保護CHOK1細胞,抑制鐵依賴型細胞死亡的發生。
實施例3:誘導鐵依賴型細胞死亡的篩選條件測試
為了建構高效率的細胞株篩選方法,以鐵依賴型細胞死亡誘導劑FINO2分別配合鐵離子FeSO4的添加以及脂肪酸棕櫚酸(palmitic acid,PA)的有無,進行細胞毒殺試驗,藉此找出用於細胞株篩選之合適的篩選培養基配方。
分別將兩種CHOK1細胞株Fth1_WT(CHOK1,BCRC)以及Fth1_KO以1x104細胞/每孔接種於96孔培養盤,於貼附培養24小時後,分別添加125μM硫酸亞鐵(FeSO4)於F12(Ham's F-12 Nutrieiit Mix,Gibco)細胞培養液中,並且同時加入不同劑量的鐵依賴型細胞死亡誘導劑FINO2及/或脂肪酸PA(Palmitic acid,P0500Sigma-Aldrich)來誘發鐵依賴型細胞死亡。於作用24小時之後,以AlamarBlueTM cell viability reagent(Thermo Fisher Scientific inc.)進行細胞活性的偵測,藉由偵測螢光的讀值(Fx/Fm:560nm/590nm),比較兩種CHOK1
細胞株於不同的篩選培養基配方下誘發鐵依賴型細胞死亡之作用效果。實驗結果如第6A圖至第6D圖所示。
請參照第6A圖,於培養基同時含有FINO2、125μM的FeSO4以及脂肪酸PA的情況下,Fth1_KO細胞株在2μM的FINO2作用下,於48小時即可以產生明顯的細胞毒殺效果。請參照第6B圖,於僅添加FINO2以及125μM的FeSO4的情況下,於5μM的FINO2劑量添加時產生明顯的細胞毒殺效果,且Fth1_WT細胞株與Fth1_KO細胞株並沒有產生明顯的差異變化。請參照第6C圖,於不添加鐵離子FeSO4的情況下,FINO2以及脂肪酸PA並未產生細胞毒殺作用。再者,請參照第6D圖,於僅添加FINO2的情況下,即使5μM的劑量亦不會造成明顯的細胞毒殺作用。
由前述實驗結果可知,細胞鐵依賴型細胞死亡的發生,於添加鐵離子、FINO2以及脂肪酸的情況下可產生明顯的細胞毒殺效果,而FINO2以及脂肪酸的添加具有促進鐵離子誘發之細胞毒殺作用的效果。
實施例4:建立FTH1重組蛋白質表達載體以用於穩定細胞株的篩選
FTH1基因於物種間的相似性高,其中,對人類(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)以及中國倉鼠(Cricetulus griseus)三者的FTH1基因的胺基酸序列進行比對,比對結果顯示
三者的序列具有大於90%的相同性,可推知其生物功能相近。因此,選擇以此三種物種的FTH1基因進行後續表達載體的建構。
請參照第7A圖至第7C圖,第7A圖至第7C圖顯示以pcDNA3.1-CMV載體pcDNA3.1+P2A-eGFP(GcnScript)(為基礎分別插入中國倉鼠FTH1基因(cgFth1)、小鼠FTH1基因(mFth1)以及人類FTH1基因(hFth1)所建構的表達載體示意圖。
如第7A圖所示,pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP表達載體是以pCDNA3.1-CMV載體為骨架,插入CMV啟動子、cgFth1基因、p2A胜肽、EGFP報導基因以及pA終止子。cgFth1基因與EGFP報導基因以p2A胜肽串接,CMV啟動子具有序列辨識號:7所示的核酸序列,cgFth1基因具有序列辨識號:4所示的核酸序列,p2A胜肽具有序列辨識號:8所示的核酸序列,EGFP報導基因具有序列辨識號:9所示的核酸序列,pA終止子具有序列辨識號:10所示的核酸序列。
如第7B圖所示,pCDNA3.1-CMV-mFth1-p2A-EGFP表達載體是以pCDNA3.1-CMV載體為骨架,插入CMV啟動子、mFth1基因、p2A胜肽、EGFP報導基因以及pA終止子。mFth1基因與EGFP報導基因以p2A胜肽串接,CMV啟動子具有序列辨識號:7所示的核酸序列,mFth1基因具有序列辨識號:5所示的核酸序列,p2A胜肽具有序列辨識號:8所示的核酸序列,EGFP報導基因具有序列辨識號:9所示的核酸序列,pA終止子具有序列辨識號:10所示的核酸序列。
如第7C圖所示,pCDNA3.1-CMV-hFth1-p2A-EGFP表達載體是以pCDNA3.1-CMV載體為骨架,插入CMV啟動子、hFth1基因、p2A胜肽、EGFP報導基因以及pA終止子。hFth1基因與EGFP報導基因以p2A胜肽串接,CMV啟動子具有序列辨識號:7所示的核酸序列,hFth1基因具有序列辨識號:6所示的核酸序列,p2A胜肽具有序列辨識號:8所示的核酸序列,EGFP報導基因具有序列辨識號:9所示的核酸序列,pA終止子具有序列辨識號:10所示的核酸序列。
為了驗證FTH1基因的過度表達可用於穩定細胞株的篩選,使用pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP表達載體對CHOK1細胞株Fth1_WT(CHOK1,BCRC)以及Fth1_KO分別進行轉染(transfection),取1x106細胞在125V條件下進行電穿孔(2mm cuvette,NEPA21 Electroporator)轉染細胞24小時,來促使Fth1基因產生過度表達並於質體轉染24小時後,添加高劑量的硫酸亞鐵(FeSO4,500μM)誘導鐵依賴型細胞死亡發生。請參照第8圖所示的螢光顯微鏡觀察結果,於處理的14天後漸漸地篩選出具有EGFP螢光表達的細胞株,因此證實了FTH1重組蛋白質表達載體搭配鐵離子的添加確實具有篩選穩定細胞株的效果,且Fth1_KO細胞對於FTH1外源基因的保留相較於Fth1_WT細胞具有較高的依賴性。
實施例5:不同物種的FTH1基因用於篩選系統的效率比較
為了進一步驗證不同物種來源的FTH1基因可用於穩定細胞株的篩選,以CHOK1細胞株以及HEK293T細胞株作為宿主細胞,且分別使用pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP表達載體、pCDNA3.1-CMV-mFth1-p2A-EGFP表達載體以及pCDNA3.1-CMV-hFth1-p2A-EGFP表達載體進行實驗驗證。
將CHOK1細胞株以1x104細胞/每孔接種於96孔培養盤,以10% FBS之F12(Ham's F-12 Nutrient Mix,Gibco)細胞培養基於貼附培養24小時後,以Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific inc.)進行前述三種物種的FTH1基因表達載體的轉染,以促使FTH1基因過度表達。於載體的DNA轉染後24小時,添加125μM的硫酸亞鐵(FeSO4)於細胞培養液中,同時依細胞特性加入不同劑量的鐵依賴型細胞死亡誘導劑(FINO2,0μM至5μM)來誘發鐵依賴型細胞死亡,於作用3天(72小時)之後,以Celigo Image Cytometer(Nexcelom)針對螢光細胞進行計數,並與未經FINO2處理的對照組進行比較,藉此估算篩選效能。實驗結果如第9A圖所示。
將HEK293T細胞株以1x104細胞/每孔接種於96孔培養盤,於含有10% FBS DMEM(Gibco)細胞培養基貼附培養24小時後,以Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific inc.)進行前述三種物種的FTH1基因表達載體的轉染,以促使
FTH1基因過度表達。於載體的DNA轉染後24小時,添加125μM的硫酸亞鐵(FeSO4)於細胞培養液中,同時依細胞特性加入不同劑量的鐵依賴型細胞死亡誘導劑(FINO2,0μM至5μM)來誘發鐵依賴型細胞死亡,於作用3天(72小時)之後,以Celigo Image Cytometer(Nexcelom)針對螢光細胞進行計數,並與未經FINO2處理的對照組進行比較,藉此估算篩選效能。實驗結果如第9B圖所示。
根據第9A圖以及第9B圖的結果,可知以中國倉鼠、小鼠以及人類的FTH1基因構建的表達載體於鐵離子以及鐵依賴型細胞死亡誘導劑存在的情況下,相較於Mock載體(空白對照組),含FTH1基因之表現載體可促使轉染後之細胞株對鐵離子凋亡產生抗性,並維持外源基因之表達(EGFP報導基因),結果證實三種物種來源之FTH1基因皆可應用於外源基因表現細胞株之篩選。
實施例6:篩選系統用於建立穩定細胞株的效果評估-1
根據前述實施例的驗證實驗結果,建立細胞株的篩選系統的大致流程如下:將表達載體送入宿主細胞進行表現,培養宿主細胞24小時之後,添加篩選配方(鐵離子、鐵依賴型細胞死亡誘導劑、脂肪酸)進行培養與篩選,經過約8天的篩選後,可使約100%的細胞帶有外源基因(例如,EGFP報導基因)表達,此後將細
胞培養於含有鐵離子(500μM的硫酸亞鐵或1mM的檸檬酸鐵銨)的培養配方中維持生長,並保持外源基因的表現。
依照上述篩選系統,分別將CHOK1細胞株Fth1_WT(CHOK1,BCRC)以及Fth1_KO(CRISPR/Cas9 mediated knockout)以1x104細胞/每孔接種於96孔培養盤,以10% FBS之F12(Ham's F-12 Nutrient Mix,Gibco)細胞培養基貼附培養24小時後,以Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific inc.)進行載體轉染(pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP),促使FTH1基因過度表達,於載體DNA轉染後24小時,添加125μM硫酸亞鐵(FeSO4)於細胞培養液中,並且同時加入不同劑量的鐵依賴型細胞死亡誘導劑FINO2(0μM至20μM)來誘發鐵依賴型細胞死亡,於作用3天(72小時)之後,以Celigo Image Cytometer(Nexcelom)針對細胞型態、存活率、細胞計數、螢光細胞計數以及螢光定量等進行分析,藉此估算篩選效率。
如第10圖所示,細胞毒殺效果呈現劑量依賴性(dose-dependent)變化,隨著鐵依賴型細胞死亡誘導劑的劑量增加,大多數的細胞發生明顯的鐵依賴型細胞死亡,其中表現螢光蛋白的細胞對於篩選產生較高的耐受性,具有較佳的生存優勢。由此可知,本案實施例所建構的表達載體於宿主細胞中的表達可以增強細胞對於篩選配方所誘發的鐵依賴型細胞死亡的耐受性,且於高劑量的鐵依賴型細胞死亡誘導劑的情況下(>15μM),細胞的篩選率可達100%。
第11A圖以及第11B圖為第10圖的實驗結果的量化數據。如第11A圖所示,篩選配方中的FINO2劑量增加與細胞整體的存活量呈現負相關,如第11B圖所示,篩選配方中的FINO2劑量增加與外源基因的表現(EGFP螢光蛋白)量呈現正相關,顯示載體系統可以賦予細胞株維持外源基因表達。
請參照第12A圖以及第12B圖,第12A圖以及第12B圖亦為第10圖的實驗結果的量化數據,其比較篩選後存活細胞的螢光表達量(第12A圖)以及螢光細胞的螢光表達量(第12B圖),結果顯示篩選後存活下來的細胞具有較強的螢光蛋白表達量,且CHOK1細胞株Fth1_KO細胞株亦呈現較高的螢光蛋白表達量。上述結果證實,本案實施例所建構的篩選系統可協助保持外源基因於細胞中表達,具有良好的重組蛋白表達效果。
再者,為驗證外源基因於篩選後維持表達的能力,將實施例6中經篩選後的細胞株轉移至6孔培養盤進行培養,並持續添加篩選藥物FINO2進行3天的篩選,之後維持細胞於含有500μM硫酸鐵的F12培養基(Ham's)中持續繼代培養。請參照第13圖,第13圖顯示完成前述篩選後,由單一細胞於含有鐵離子(硫酸亞鐵500μM)的培養基中生長成為細胞群落的螢光表現結果圖,如第13圖所示,表現螢光蛋白的細胞佔比可達100%。
實施例7:篩選系統用於建立穩定細胞株的效果評估-2
為驗證外源基因於篩選後維持表達的能力,篩選培養,之後維持細胞於含有500μM硫酸鐵的F12培養基(Ham's)中持續繼代培養,並以流式細胞儀(Flow cytometer)評估具有螢光蛋白表達的細胞的比例,藉此驗證外源基因穩定表達之效能。
第14圖以及第15圖分別顯示經篩選後的CHOK1_WT細胞株於160天以及210天持續繼代培養後的螢光表現結果圖。如第14圖以及第15圖所示,結果顯示經過160天及210天的持續繼代培養,表現螢光蛋白的細胞佔比仍可維持100%,顯示透過本案實施例所建構的篩選系統,可以建立穩定表現外源基因的細胞株。
實施例8:篩選系統用於建立穩定細胞株的效果評估-3
為了驗證本案實施例所建構的篩選系統可適用於多種工業級細胞株,進一步使用HEK293T細胞株及VERO細胞株進行驗證實驗。
分別將HEK293T細胞株(HEK293T,ATCC)及VERO細胞株(Vero,CCL-81;ATCC)以1x104細胞/每孔接種於96孔培養盤,於含10% FBS之F12培養基(Ham's F-12 Nutrient Mix,Gibco)貼附培養24小時後,以Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific inc.)進行載體轉染(pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP以及pCDNA3.1-CMV-
p2A-EGFP_Mock作為空白對照組),促使FTH1基因過度表達,於載體DNA轉染後24小時,添加125μM硫酸亞鐵(FeSO4)於細胞培養液中,並且同時加入不同劑量的鐵依賴型細胞死亡誘導劑FINO2(0μM至20μM)來誘發鐵依賴型細胞死亡,於作用3天(72小時)之後,以Celigo Image Cytometer(Nexcelom)針對螢光細胞計數以及螢光定量等進行分析,藉此估算篩選效率。結果如第16A圖以及第16B圖所示。
第16A圖以及第16B圖分別顯示HEK293T細胞株以及VERO細胞株的實驗結果,根據篩選後螢光細胞的數目進行篩選性能的評估,其中顯示篩選配方中的FINO2劑量增加會造成轉染Mock載體(Fth1未過度表達)之細胞顯著死亡,而轉染具有Fth1基因及外源基因的表現之載體,其存活之螢光細胞數明顯增加,顯示載體系統可以賦予細胞抵抗鐵離子凋亡,並維持外源基因表達。此外,兩株細胞都展現劑量依賴(Dose-dependent)的毒殺作用,但是HEK293T細胞對於篩選配方較為敏感,其於1.25uM的FINO2即可產生顯著的篩選效果,而VERO cell則在5μM產生明顯的篩選,實驗結果顯示本案實施例所建構的篩選系統亦可應用此兩種細胞株進行穩定細胞株的篩選。
實施例9:建立FTH1重組蛋白質表達載體以用於生產重組蛋白質
為驗證本案所建立之篩選系統可應用於重組蛋白質的生產,以pBudCE4.1(InvitrogenTM)及pCDNA3.1載體(GenScript)為基礎分別建構的兩種表達載體,用於表現重組抗體蛋白質Anti-HER2 IgG1,包括pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2(V2)及pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1(V3)用以表現Anti-HER2 IgG1(h4D5)重組單株抗體。
請參照第17A圖以及第17B圖,第17A圖以及第17B圖分別顯示表達載體pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2及pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1的建構示意圖。
如第17A圖所示,pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2表達載體是以pBudCE4.1載體為骨架,插入CMV啟動子、GOI1基因(Anti-HER2 IgG1(h4D5)重鏈可變區)、pA終止子、SV40啟動子、cgFth1基因、、EF1α啟動子、GOI2基因(Anti-HER2 IgG1(h4D5)輕鏈可變區)以及pA終止子。cgFth1基因與Anti-HER2 IgG1(h4D5)基因由兩個不同的啟動子驅動。CMV啟動子具有序列辨識號:7所示的核酸序列,GOI1基因(Anti-HER2 IgG1(h4D5)重鏈)具有序列辨識號:11所示的核酸序列,GOI2基因(Anti-HER2 IgG1(h4D5)輕鏈)具有序列辨識號:12所示的核酸序列,cgFth1基因具有序列辨識號:4所
示的核酸序列,EF1α啟動子具有序列辨識號:13所示的核酸序列,pA終止子具有序列辨識號:10所示的核酸序列。
如第17B圖所示,表達載體pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1是以pcDNA3.1載體為骨架,插入CMV啟動子、GOI1基因(Anti-HER2 IgG1(h4D5)重鏈可變區)、furin基因、p2A基因、GOI2基因(Anti-HER2 IgG1(h4D5)輕鏈可變區)、IRES基因、cgFth1基因以及pA終止子。IRES位於cgFth1基因與Anti-HER2 IgG1(h4D5)基因之間。CMV啟動子具有序列辨識號:7所示的核酸序列,基因(Anti-HER2 IgG1(h4D5)重鏈)具有序列辨識號:11所示的核酸序列,GOI2基因(Anti-HER2 IgG1(h4D5)輕鏈)具有序列辨識號:12所示的核酸序列,furin基因具有序列辨識號:14所示的核酸序列,p2A胜肽具有序列辨識號:8所示的核酸序列,IRES基因具有序列辨識號:15所示的核酸序列,cgFth1基因具有序列辨識號:4所示的核酸序列,pA終止子具有序列辨識號:10所示的核酸序列。
為了進一步驗證FTH1基因可以外源性載體表現方式於細胞株中產生重組蛋白質之過度表達,使用前述實施例中建立的表達載體對CHOK1細胞株及HEK293T細胞株進行轉染,促使FTH1基因過度表達,以進行蛋白質表現量分析。
詳細而言,分別將CHOK1及HEK293T兩種細胞株以1x105細胞/每孔接種於6孔細胞培養盤,於貼附培養24小時後,以Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific inc.)
進行載體轉染(pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP、pCDNA3.1-CMV-mFth1-p2A-EGFP、pCDNA3.1-CMV-hFth1-p2A-EGFP、pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2及pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1),促使FTH1基因產生過度表達,於載體DNA轉染72小時後,以RIPA細胞裂解液(含1x蛋白酶抑制劑)製備細胞裂解液,以BCA蛋白質定量法(Pierce BCA Protein Assay Kit,Thermo Fisher Scientific inc.)定量蛋白質後,取8μg總蛋白質(total protein)進行蛋白質膠體電泳。並且使用抗FTH1抗體(ab65080,Abcam inc.)進行西方墨點法(Western blotting)分析FTH1蛋白質的表達。再者,以GAPDH抗體(ab8245,Abcam inc.)進行內源性蛋白質分析作為蛋白質量之對照。後續使用Goat anti-rabbit HRP及Goat anti-mouse HRP作為二級抗體進行反應,並以ECL(SuperSignalTM West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate,Thermo Fisher Scientific inc.)呈色,以冷光影像分析儀(Fujifilm LAS-4000)進行蛋白質表現量的分析。實驗結果如第18A圖以及第18B圖所示。
請參照第18A圖以及第18B圖,第1~6欄分別代表表達載體pCDNA3.1-CMV-cgFth1-p2A-EGFP、pCDNA3.1-CMV-hFth1-p2A-EGF、pCDNA3.1-CMV-mFth1-p2A-EGF、pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1、pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI22以及未轉
染載體之CHOK1細胞株(WT)的結果。由上述實驗結果可知,CHOK1及HEK293T兩種細胞株均可以外源性載體表達的方式於細胞株中達成FTH1重組蛋白質的過度表達。
實施例10:使用FTH1重組蛋白質表達載體生產重組抗體-1
接著,進一步驗證表達載體pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2以及本揭露實施例提供的細胞株篩選方法可用於重組蛋白質的生產應用,將前述載體送入CHOK1細胞株後,以中國倉鼠之FTH1基因(cgFth1)以及Anti-HER2重組抗體基因作為標的,分析其mRNA表現量以及蛋白質表現量。
首先,取1x106的CHOK1細胞(CHOK1,BCRC)在125V條件下進行電穿孔(2mm cuvette,NEPA21 Electroporator),分別將20μg的表達載體pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI22送入細胞,將載體送入CHOK1細胞株後72小時,以中國倉鼠之Fth1基因及Anti-HER2 IgG1(h4D5)重組抗體基因做為標的,分析其mRNA及蛋白表現量。
再者,進行FTH1、Anti-HER2 IgG1(h4D5)的重鏈及輕鏈的RNA萃取及mRNA qPCR分析。取1x106的單細胞株以500μl TRIsure reagent(Bioline Inc.)進行RNA萃取,並且以Direct-zolTM RNA MiniPrep(Zymogen Inc.cat#R2052)
進行純化。RNA定量後取200ng的總RNA(total RNA)以1μg的Oligo dT以及SuperScriptTM IV Reverse Transcriptase進行mRNA反轉錄以得到cDNA,以cDNA使用KAPA SYBR® FAST Universal 2X qPCR Master Mix(1mL)(cat# KK4600,Kapasystems Inc.)針對Anit-Her2重鏈轉錄本(transcript)、輕鏈轉錄本以及中國倉鼠FTH1基因設計引子,以進行qPCR分析。Anti-HER2 IgG1(h4D5)重鏈的引子對如序列辨識號:16及17所示,Anti-HER2 IgG1(h4D5)輕鏈的引子對如序列辨識號:18及19所示,作為控制組的中國倉鼠的beta肌動蛋白(Cg_Actin-beta)的引子對如序列辨識號:20及21所示,中國倉鼠的FTH1(Cg_Fth1)的引子對如序列辨識號:22及23所示。
以ELISA進行Anti-HER2 IgG1(h4D5)重組抗體的定量分析,以0.1M碳酸氫鈉緩衝液配製1μg/ml HER2(HER2-ECD-hFc)重組蛋白質,取100μl添加於96孔培養盤並放置於4℃進行塗覆24小時。後續以SuperblockTM(PBS)進行阻斷(blocking)並且以PBST緩衝液於每個階段進行清洗。細胞培養液樣本以StartingBlock阻斷液進行50倍稀釋,隨後加入已經完成HER2塗覆之96孔培養盤中於37℃反應1小時,之後以200μl PBST進行清洗,再添加二級抗體Goat Anti-Human Ig κ chain Antibody(HRP conjugate(Millipore,AP502P)1:10000 in SuperblockTM(PBS)),於37℃下反應1小時後,以200μl PBST
進行清洗後再添加100μl Ne-blue TMB溶液進行呈色,隨後以2N HCl中止反應,並於OD450以ELISA分析盤讀取分析數值。
以pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2作為表達載體的實驗結果如第19A圖至第19C圖所示。如第19A圖所示,FTH1 mRNA表現的分析結果顯示CHOK1細胞株在三組質體轉染重覆性實驗中(T-1、T-2、T-3)的FTH1基因的mRNA表現量實驗組皆明顯高於控制組(約2.5~4倍)。如第19B圖所示,Anti-HER2 IgG1(h4D5)抗體的重鏈(VH)以及輕鏈(VL)的mRNA被大量表現(VL:約200x/控制組,VH:約500~800x/控制組)。並且,如第19C圖所示,可以ELISA偵測到Anti-HER2 IgG1(h4D5)抗體存在於細胞培養液中,顯示藉由pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2表達載體設計以FTH1基因作為篩選標記,可以本揭露實施例提供的細胞株篩選方法來篩選出穩定表達之細胞株,並且可應用於後續之蛋白質量產。
實施例11:使用FTH1重組蛋白質表達載體生產重組抗體-2
接著,進一步驗證表達載體pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1以及本揭露實施例提供的細胞株篩選方法可用於重組蛋白質的生產應用,將前述載體送入CHOK1細胞株後,以中國倉鼠之FTH1基因(cgFth1)以及Anti-
HER2重組抗體基因作為標的,分析其mRNA表現量以及蛋白質表現量。
首先,取1x106的CHOK1細胞(CHOK1,BCRC)在125V條件下進行電穿孔(2mm cuvette,NEPA21 Electroporator),分別將20μg的表達載體pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1送入細胞,並以本案實施例所建構的篩選系統進行篩選,在經過8天的篩選後,將細胞培養於僅含有鐵離子(500μM硫酸亞鐵或1mM檸檬酸鐵銨)的培養配方中維持生長,並保持基因之表現。篩選後之穩定細胞株以無血清的培養基(HyClone CDM4PERMAb medium,4mM麩醯胺酸)使細胞株進行懸浮化培養,並進行限制性稀釋,挑選單一細胞來源的單細胞株進行後續重組重抗體之分析試驗。
接著,進行Anti-HER2 IgG1(h4D5)重組抗體的小規模量產,將單細胞株以3x105細胞/ml接種於4.5ml無血清的培養基(HyClone CDM4PERMAbmedium,4mM麩醯胺酸),於50ml的TubeSpin® Bioreactor中進行懸浮培養(225rpm,37℃,5%CO2)培養,培養4天後,以離心方法式去除細胞並收取細胞培養液進行酵素免疫分析法(ELISA),以分析抗體濃度。並且,後續使用MabSelect SuReTM LX進行抗體的純化。
再者,進行FTH1、Anti-HER2 IgG1(h4D5)的重鏈及輕鏈的RNA萃取及mRNA qPCR分析。取1x106的單細胞株以500μl TRIsure reagent(Bioline Inc.)進行RNA萃取,並且
以Direct-zolTM RNA MiniPrep(Zymogen Inc.cat#R2052)進行純化。RNA定量後取200ng的總RNA(total RNA)以1μg的Oligo dT以及SuperScriptTM IV Reverse Transcriptase進行mRNA反轉錄以得到cDNA,以cDNA使用KAPA SYBR® FAST Universal 2X qPCR Master Mix(1mL)(cat# KK4600,Kapasystems Inc.)針對Anit-Her2重鏈轉錄本(transcript)、輕鏈轉錄本以及中國倉鼠FTH1基因設計引子,以進行qPCR分析。Anti-HER2 IgG1(h4D5)重鏈的引子對如序列辨識號:16及17所示,Anti-HER2 IgG1(h4D5)輕鏈的引子對如序列辨識號:18及19所示,作為控制組的中國倉鼠的beta肌動蛋白(Cg_Actin-beta)的引子對如序列辨識號:20及21所示,中國倉鼠的PTH1(Cg_Fth1)的引子對如序列辨識號:22及23所示。
以ELISA進行Anti-HER2 IgG1(h4D5)重組抗體的定量分析,以0.1M碳酸氫鈉緩衝液配製1μg/ml HER2(HER2-ECD-hFc)重組蛋白質,取100μl添加於96孔培養盤並放置於4℃進行塗覆24小時。後續以SuperblockTM(PBS)進行阻斷(blocking)並且以PBST緩衝液於每個階段進行清洗。細胞培養液樣本以StartingBlock阻斷液進行50倍稀釋,隨後加入已經完成HER2塗覆之96孔培養盤中於37℃反應1小時,之後以200μl PBST進行清洗,再添加二級抗體Goat Anti-Human Ig κ chain Antibody(HRP conjugate(Millipore,AP502P)1:10000 in SuperblockTM(PBS)),於37℃下反應1小時後,以200μl PBST
進行清洗後再添加100μl Ne-blue TMB溶液進行呈色,隨後以2N HCl中止反應,並於OD450以ELISA分析盤讀取分析數值。
以pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1作為表達載體的實驗結果如第20A圖至第20D圖所示。如第20A圖以及第20B圖所示,對於四組殖株(殖株-3、殖株-4、殖株-8、殖株-11,Anti-HER2 IgG1(h4D5)抗體的重鏈(VH)以及輕鏈(VL)的mRNA皆被大量表現。並且,如第20C圖所示,FTH1 mRNA表現的分析結果顯示CHOK1細胞株的四組殖株(殖株-3、殖株-4、殖株-8、殖株-11)的FTH1基因的mRNA表現量皆明顯高於控制組。此外,如第20D圖所示,可以ELISA偵測到Anti-HER2抗體存在於細胞培養液中,其中殖株-8(細胞株C8)的表達量較高,顯示藉由pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1表達載體設計以FTH1基因作為篩選標記,可以本揭露實施例提供的細胞株篩選方法來篩選出穩定表達之細胞株,並且可應用於後續之蛋白質量產。
實施例12:使用FTH1重組蛋白質表達載體生產之重組抗體的構型驗證
為了驗證表達載體所表達產生的Anti-HER2抗體(IgG抗體)的構型為正確的,以蛋白質膠體電泳進行分析。
以SDS-PAGE蛋白質膠體電泳分析於實施例11中篩選得到細胞株C8所表現的Anti-HER2 IgG1(h4D5)重組蛋
白質及由以潮黴素B(Hygromycin B)為篩選標記之自建載體(pCMV-GOI1-EF1α-GOI2-SV40-Hygromycin B phosphotransferase)所生產Anti-HER2 IgG1(h4D5)重組蛋白質做為標準品進行比較。取用1.5μg純化後的重組蛋白質樣本,分別以100μM DTT還原(reduced)及未還原(non-reduced)之蛋白質進行SDS膠體電泳(NuPAGETM 4~12%,Bis-Tris,Thermo Fisher Scientific inc.)以MOPS緩衝液於200V電壓下進行膠體電泳分析,最終以蛋白質膠體染劑(InstantBlueTM Ultrafast Protein Stain,Sigma-Aldrich)進行染色分析,以蛋白質分子量大小來評估所生產的重組抗體之正確性。實驗結果如第21圖所示。
請參照第21圖,第1~6欄分別代表Anti-HER2 IgG1重組蛋白質_未還原形式、Anti-HER2 IgG1重組蛋白質_還原形式、Anti-HER2 IgG1重組蛋白質_FAC+未還原形式、Anti-HER2 IgG1重組蛋白質_FAC+還原形式、Anti-HER2 IgG1標準品未還原形式以及Anti-HER2 IgG標準品_還原形式的結果,其中使用的蛋白質梯狀標記(ladder Marker)為:BenchMark Protein Ladder SDS page,每一欄均添加1.5μg的重組蛋白質。
如第21圖所示,本揭露實施例提供的表達載體及篩選系統得到的細胞株C8,相較Anti-HER2 IgG1(h4D5)蛋白質標準品,蛋白質在未還原形式以及還原形式,或是培養液含有250μM檸檬酸鐵銨(FAC)時皆能夠表現出完整的IgG1抗體並且具有正確的重鏈(VH)以及輕鏈(VL)分子量,顯示經由本揭露實施例
提供的細胞株篩選方法得到的細胞株,能夠表達出正確的重組抗體蛋白質。
實施例13:使用FTH1重組蛋白質表達載體生產之重組抗體的功能性分析
為了驗證表達載體所表達產生的Anti-HER2 IgG1(h4D5)抗體為功能性抗體,以抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)進行分析試驗。
ADCC生物活性報導基因檢測系統(Promega,#G9790)使用Jurkat-hFcγRIIIa-NFAT基因轉殖細胞作為效應細胞,以富含HER2抗原的SKBR3乳癌細胞作為靶細胞,藉由冷光素酶檢測系統(BioGloTM Luciferase Assay system)進行抗HER2單株抗體Anti-HER2 IgG1的ADCC生物學活性檢測。
針對於實施例11中篩選得到細胞株C8(使用表達載體pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1(V3)),於其篩選過程中添加鐵離子(250μM,Anti-HER2 IgG1_V3_C8-FAC-250μM FAC+)以及未添加鐵離子(Anti-HER2 IgG1_V3_C8)的條件下所生產之重組抗體進行測試,同時亦對表達載體pBudCE4.1-CMV-GOI1-cgFth1-SV40/EF1α-GOI2(V2)所生產之重組抗體(Anti-HER2 IgG1_V2)進行評估。
首先,於96孔培養盤中加入100μl細胞密度為105/ml的SKBR3細胞,置於37℃隔夜培養使細胞貼附生長,隔天移除上清液,加入25μl由含0.5%胎牛血清的GOIMI-1640培養基配置的連續稀釋的重組抗體。接著,再加入25μl細胞密度為6x106/ml的lurkat-hFcγRⅢa-NFAT效應細胞,反應24小時後,加入75μl的Bio-GloTM Luciferase Assay Buffer進行反應,於GloMax® Navigator Microplate Luminometer進行冷光訊號讀取,計量抗體Anti-HER2 IgG1(h4D5)的ADCC效應。實驗結果如第22圖所示。
如第22圖所示,和純化後確效的Anti-HER2 IgG1(h4D5)重組抗體蛋白相互比較,使用表達載體pcDNA3.1-CMV-GOI1-furin-p2A-GOI2-IRES-cgFth1(V3)以及pBudCE4.1-CMV-GOI1-SV40-cgFth1-EF1α-GOI2(V2)得到的重組抗體明顯均可誘導ADCC發生。此外,於篩選製程中添加鐵離子的組別(Anti-HER2 IgG1_V3_C8-FAC-250μM FAC+)亦具有相同效果,顯示鐵離子的添加並不影響重組抗體之功能性。
雖然本揭露的實施例及其優點已揭露如上,但應該瞭解的是,任何所屬技術領域中具有通常知識者,在不脫離本揭露之精神和範圍內,當可作更動、替代與潤飾。再者,每一申請專利範圍構成個別的實施例,且本揭露之保護範圍也包括各個申請專利範圍及實施例的組合。本揭露之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 表達載體、篩選表現目標蛋白質之宿主細胞的方法、建立穩定細胞株的方法以及製備重組蛋白質的方法
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<151> 2020-12-29
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 186
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<210> 2
<211> 184
<212> PRT
<213> Mus musculus
<210> 3
<211> 184
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 4
<211> 559
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<210> 5
<211> 552
<212> DNA
<213> Mus musculus
<210> 6
<211> 554
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<210> 7
<211> 584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV啟動子
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> p2A胜肽
<210> 9
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFP蛋白質
<210> 10
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> polyA終止子
<210> 11
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Anti-HER2 IgG1抗體VH
<210> 12
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Anti-HER2 IgG1抗體VL
<210> 13
<211> 1163
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF1α啟動子
<210> 14
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> furin protease
<210> 15
<211> 587
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRES
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 21
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
Claims (28)
- 一種篩選表現目標蛋白質之宿主細胞的方法,包括:提供一表達載體,該表達載體包括一啟動子、一編碼目標蛋白質的基因以及一FTH1(Ferritin Heavy Chain 1)基因;以該表達載體轉染一宿主細胞,其中該宿主細胞包括一真核宿主細胞;於一培養基中培養該宿主細胞;以及於該培養基中添加鐵離子,且篩選存活的該宿主細胞以得到表現該目標蛋白質的該宿主細胞。
- 如請求項1所述之方法,其中編碼該目標蛋白質的基因以及該FTH1基因由同一啟動子驅動。
- 如請求項1所述之方法,其中編碼該目標蛋白質的基因以及該FTH1基因由不同的啟動子分別驅動。
- 如請求項1所述之方法,其中該真核宿主細胞包括CHO細胞、HEK293細胞、Hela細胞、VERO細胞或NS0細胞。
- 如請求項1所述之方法,其中該宿主細胞為FTH1基因剔除(knockout)的細胞。
- 如請求項1所述之方法,其中於該培養基中添加的鐵離子的濃度為100μM至1.5mM。
- 如請求項1所述之方法,其中篩選該宿主細胞的步驟更包括於該培養基中添加一鐵依賴型細胞死亡(ferroptosis)誘導劑。
- 如請求項7所述之方法,其中該鐵依賴型細胞死亡誘導劑的添加濃度為0.5μM至2mM。
- 如請求項1所述之方法,其中篩選該宿主細胞的步驟更包括於該培養基中添加一脂肪酸。
- 如請求項9所述之方法,其中該脂肪酸的添加濃度為50μM至500μM。
- 如請求項1所述之方法,其中該目標蛋白質包含一重組蛋白質。
- 如請求項11所述之方法,其中該重組蛋白質包含一抗體。
- 一種建立穩定細胞株的方法,包括:提供一表達載體,該表達載體包括一啟動子、一編碼目標蛋白質的基因以及一FTH1基因;以該表達載體轉染一宿主細胞,其中該宿主細胞包括一真核宿主細胞;於一培養基中培養該宿主細胞;以及於該培養基中添加鐵離子,於含有鐵離子的該培養基中持續培養該宿主細胞一期間,以篩選獲得穩定表現該編碼目標蛋白質的基因的一細胞株。
- 如請求項13所述之方法,其中培養該宿主細胞的該期間為5天至30天。
- 如請求項13所述之方法,其中該編碼目標蛋白質的基因以及該FTH1基因由同一啟動子驅動。
- 如請求項13所述之方法,其中該編碼目標蛋白質的基因以及該FTH1基因由不同的啟動子分別驅動。
- 如請求項13所述之方法,其中該真核宿主細胞包括CHO細胞、HEK293細胞、Hela細胞、VERO細胞或NS0細胞。
- 如請求項13所述之方法,其中該宿主細胞為FTH1基因剔除的細胞。
- 如請求項13所述之方法,其中於該培養基中添加的鐵離子的濃度為100μM至1.5mM。
- 如請求項13所述之方法,其中於持續培養該宿主細胞的步驟中,持續補充該培養基中的鐵離子。
- 如請求項13所述之方法,其中篩選該宿主細胞的步驟更包括於該培養基中添加一鐵依賴型細胞死亡誘導劑。
- 如請求項21所述之方法,其中該鐵依賴型細胞死亡誘導劑的添加濃度為0.5μM至2mM。
- 如請求項13所述之方法,其中篩選該宿主細胞的步驟更包括於該培養基中添加一脂肪酸。
- 如請求項23所述之方法,其中該脂肪酸的添加濃度為50μM至500μM。
- 如請求項13所述之方法,其中該目標蛋白質包含一重組蛋白質。
- 如請求項25所述之方法,其中該重組蛋白質包含一抗體。
- 如請求項13所述之方法,於篩選得到穩定表現該編碼目標蛋白質的基因的該細胞株之後,於含有鐵離子的環境中持續篩選以及擴增培養該細胞株。
- 一種建立穩定表達外源重組基因之細胞株的方法,其係使用一FTH1基因作為篩選標記,以篩選出帶有一外源重組基因的一細胞株,該方法包括:提供一表達載體,該表達載體包括一啟動子、該外源重組基因以及該FTH1基因;以該表達載體轉染一宿主細胞,其中該宿主細胞包括一真核宿主細胞;於一培養基中培養該宿主細胞;以及於該培養基中添加鐵離子,於含有鐵離子的該培養基中持續培養該宿主細胞一期間,以篩選獲得穩定表現該外源重組基因的該細胞株。
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