JP6925111B2 - 治療用タンパク質製剤を調製する方法、およびそのような方法により生成される抗体製剤 - Google Patents

Description

本発明は、賦形剤および少なくとも１つの治療用タンパク質を含むタンパク質製剤を調製する方法に関する。

本発明は、治療に使用するのを意図する抗体製剤の分野において特に興味深い発明であり、また、本発明の方法により生成される抗体製剤も、本発明の対象である。

本発明は、より特定すると、
− 前記タンパク質を含む溶液を用意するステップと、
− 溶液中のタンパク質を第１の限外ろ過ステップにより濃縮するステップと、
− こうして得られた溶液を、少なくとも１つの第１の賦形剤を含むダイアフィルトレーション用緩衝液を用いてダイアフィルトレーションするステップであって、それによって、タンパク質および第１の賦形剤を含む保持液が得られるステップと、
− 限外ろ過装置中で、保持液中のタンパク質を第２の限外ろ過ステップによりさらに濃縮するステップと、
− 少なくとも１つの最後の賦形剤を添加するステップであって、それによって、所望のタンパク質濃度を有し、前記第１および最後の賦形剤を含むタンパク質製剤が得られるステップと
を連続的に含む方法に関する。

一般に、治療用抗体のための最終的なタンパク質製剤は少なくとも、ダイアフィルトレーションのステップの間に添加される、ヒスチジン等のアミノ酸、および安定化剤として作用する、トレハロース等の糖を含む。トレハロースは通常、最後の添加のステップで、その他の賦形剤と共に添加される。

治療用抗体に適用される従来法では、上記のステップは、ウイルスを保持するろ過を最後の精製のステップとして通常含むいくつかの精製のステップにより一旦精製されたタンパク質溶液を用いて実施される。タンパク質溶液（または「生成物」）を、第１の限外ろ過ステップにより、（タンパク質に応じて）およそ５〜２０ｇ／ｌの濃度から、約４０〜１００ｇ／ｌの濃度に濃縮する。次いで、濃縮した生成物を、ヒスチジン等のダイアフィルトレーション用緩衝液中でダイアフィルトレーションする。場合によっては、ダイアフィルトレーション用緩衝液は、酢酸塩、トリスまたはリン酸塩等の別の標準的な緩衝液であってもよい。ダイアフィルトレーション用緩衝液は、最終的なタンパク質製剤に基づいて、およびドナン効果に起因して補正が必要となるならそれにも基づいて選ばれる。生成物が濃縮され、その結果、特定の荷電した緩衝種、例えば、ヒスチジンが排除されると、ドナン（Ｄｏｎｎａｎ）効果が発生する。したがって、ダイアフィルトレーション用緩衝液は通常、タンパク質製剤について指定された濃度およびｐＨよりも高い緩衝液の濃度および低いｐＨに調整する。ダイアフィルトレーションが完了したら、生成物は、第２の限外ろ過ステップを経て、最終的なタンパク質製剤に所望されるタンパク質濃度をおよそ５０％上回る濃度に濃縮される。次いで、生成物を限外ろ過システムから取り出し、このシステムを濯いで、追加の生成物を回収する。タンパク質製剤中で所望される濃度を５０％超上回る最終濃度を得たら、全ての濯ぎ液を生成物に添加して戻し、生成物を過剰に希釈することなく、回収率を最大化することができる。次いで、賦形剤（糖、界面活性剤、キレート化剤等）を、濃縮溶液として、通常およそ４の希釈比で添加する。希釈比４とは、濃縮賦形剤溶液の１単位体積を、生成物の３単位体積に添加することを意味する。この希釈比４は、通常、制限因子である賦形剤溶液の糖構成成分の溶解性の最大値に基づいたものである。必要であれば、次いで、生成物を、製剤化緩衝液を用いてさらに希釈して、最終所望濃度に調整する。

したがって、最終的な製剤中に高い濃度のタンパク質を得ることが所望される場合、およびタンパク質が特に高い粘度を示す場合にはなおさら、そのような従来法は適用し得ない。

例えば、１５０ｇ／ｌの所望の最終濃度を有する治療用抗体製剤の場合、分子の粘度により、所望の最終濃度を５０％上回る目標値に濃縮することが妨げられる。

本発明の目的は、高い粘度および高い濃度のタンパク質に適用することができるタンパク質製剤を調製する方法を提供することである。

本発明はさらに、製造プロセスの全体的な収率に望ましくない影響を及ぼしたり、特定の賦形剤の過剰な廃棄物に起因する余分なコストを招いたりすることなく、この方法を製造規模で実行することを可能にすることも狙っている。とりわけ、特に高価である糖構成成分を、従来法に類似するレベルで使用し続けることを目指している。

その上さらに、タンパク質の安定性を方法の全てのステップにわたり維持し、タンパク質を凝集から保護することも目指している。

本発明の第１の態様によれば、第２の限外ろ過ステップの前に、第２の賦形剤を、ダイアフィルトレーションのステップから得られた保持液に添加することをさらに含む、上記のタイプの方法が提供される。

第２の賦形剤、特に、トレハロース（より一般に、糖）の添加を、ダイアフィルトレーションの後に移動させることによって、残りの賦形剤を、それに続くステップで、さらにより高い濃度で添加し、したがって、より低い希釈度の生成物を得ることができる。このことはまた、最大必要濃度として、最終所望濃度をわずか約１０％（場合によっては、５〜１５％）上回るようにするだけでよいことも意味し、これは、従来法の場合の約５０％という値と対照的である。この１０％という値は、分子がより高い粘度を示す場合であっても、標準的な限外ろ過装置を用いて得ることができる。このことによりまた、濯ぎ液から生成物を回収することも可能になり、したがって、限外ろ過／ダイアフィルトレーションのプロセスから９０％の収率を得ることができる。

また、最後の濃縮の前の、第２の賦形剤（糖）の添加により、タンパク質も凝集から保護される。

本発明の好ましい実施形態によれば、
− この方法は、ステップ（ｅ）の後およびステップ（ｆ）の前に、限外ろ過装置を、濯ぎ用緩衝液を用いて濯ぐステップであって、それによって、タンパク質の回収が促進されるステップをさらに含み、
− 濯ぎ用緩衝液は、第１および第２の賦形剤をそれぞれ、タンパク質製剤中の第１および第２の賦形剤の濃度と実質的に等しい濃度で含み、
− 第１の賦形剤は、アミノ酸、好ましくは、ヒスチジンであり、
− タンパク質製剤中の第１の賦形剤は、１６〜２４ｍＭ、好ましくは、１７〜２３ｍＭ、最も好ましくは、約２０ｍＭの濃度を有し、
− 第２の賦形剤は、糖、好ましくは、二糖であり、
− 最後の賦形剤は、界面活性剤、好ましくは、ポリソルベート８０を含み、
− 最後の賦形剤は、キレート化剤、好ましくは、ＥＤＴＡを含み、
− タンパク質製剤は、１１０〜１６５ｇ／ｌのタンパク質濃度を有し、
− タンパク質は抗体である。

第１の好ましい実施形態では、
− 抗体は、抗ＰＣＳＫ９（プロタンパク質変換酵素サブチリシンケキシン９型）抗体であり、
− 抗ＰＣＳＫ９抗体は、ボコシズマブ、エボロクマブ（ＲＥＰＡＴＨＡ（商標））、アリロクマブ（ＰＲＡＬＵＥＮＴ（商標））、ＲＥＧＮ７２８、３１Ｈ４、１１Ｆ１、１２Ｈ１１、８Ａ１、８Ａ３、３Ｃ４、３００Ｎ、１Ｄ０５、ＬＧＴ２０９、ＲＧ７６５２およびＬＹ３０１５０１４からなる群から選択され、
− 抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列の相補性決定領域であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号２に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；または代わって、抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号３、４もしくは５に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号６もしくは７に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、
− タンパク質製剤は、１３５〜１６５ｇ／ｌ、好ましくは、１４２〜１５８ｇ／ｌ、最も好ましくは、約１５０ｇ／ｌのタンパク質濃度を有し、
− タンパク質製剤中の第２の賦形剤は、６７．２〜１００．８ｇ／ｌ、好ましくは、７１．４〜９６．６ｇ／ｌ、最も好ましくは、約８４ｇ／ｌの濃度のトレハロースであり、
− 最後の賦形剤は、タンパク質製剤中で０．１６〜０．２４ｇ／ｌ、好ましくは、０．１７〜０．２３ｇ／ｌ、最も好ましくは、約０．２ｇ／ｌの濃度を有するポリソルベート８０を含み、
− 最後の賦形剤は、タンパク質製剤中で０．０４〜０．０６ｇ／ｌ、好ましくは、０．０４２５〜０．０５７５ｇ／ｌ、最も好ましくは、約０．０５ｇ／ｌの濃度を有するＥＤＴＡを含み、
− タンパク質製剤は、５．２〜５．８、好ましくは、約５．５のｐＨを有し、
− ステップ（ａ）で用意される溶液は、５〜２０ｇ／ｌのタンパク質濃度を有し、
− タンパク質は、第１の限外ろ過ステップにより、８０〜１２０ｇ／ｌ、好ましくは、９０〜１１０ｇ／ｌ、最も好ましくは、約１００ｇ／ｌに濃縮され、
− タンパク質は、第２の限外ろ過ステップにより、１４３〜１７３ｇ／ｌ、好ましくは、１５０〜１６６ｇ／ｌ、最も好ましくは、約１５８ｇ／ｌに濃縮され、
− ダイアフィルトレーション用緩衝液中の第１の賦形剤は、タンパク質製剤中の第１の賦形剤の濃度よりも高い濃度を有し、ダイアフィルトレーション用緩衝液中の第１の賦形剤の前記濃度は、好ましくは、２９．７５〜４０．２５ｍＭ、最も好ましくは、約３５ｍＭの濃度であり、
− ダイアフィルトレーション用緩衝液は、５．１〜５．５、好ましくは、約５．３のｐＨを有し、
− 第２の賦形剤を、ダイアフィルトレーションのステップから得られた保持液に添加することは、第１の添加溶液を保持液に添加することによって行われ、前記第１の添加溶液は、第２の賦形剤を、３４０〜４６０ｇ／ｌ、好ましくは、３８０〜４２０ｇ／ｌ、最も好ましくは、約４００ｇ／ｌの濃度で含み、
− 第１の添加溶液は、第１の賦形剤を、ダイアフィルトレーション用緩衝液中の第１の賦形剤の濃度よりも低く、タンパク質製剤中の第１の賦形剤の濃度よりも高い濃度で含み、第１の添加溶液中の第１の賦形剤の前記濃度は、好ましくは、２５．５〜３４．５ｍＭ、最も好ましくは、約３０ｍＭの濃度であり、
− 第１の添加溶液は、最後の賦形剤をさらに含み、
− 第１の添加溶液は、約３０ｍＭのヒスチジンおよび約４００ｇ／ｌのトレハロースを含み、
− 第１の添加溶液を保持液に添加することは、約４．１５の希釈比で実施され、それによって、第１の添加溶液の１体積が、当該体積のおよそ３．１５倍の保持液に添加され、
− 最後の賦形剤を添加することは、第２の添加溶液を、第２の限外ろ過ステップから得られた溶液に添加するステップを含み、前記第２の添加溶液は、第２の賦形剤を、第１の添加溶液中の第２の賦形剤の濃度よりも低く、タンパク質製剤中の第２の賦形剤の濃度よりも高い濃度で含み、
− 第２の添加溶液は、第１の賦形剤を、タンパク質製剤中の第１の賦形剤の濃度と実質的に等しい濃度で含み、
− 第２の添加溶液は、約２０ｍＭのヒスチジン、約８４ｇ／ｌのトレハロース、約１ｇ／ｌのＥＤＴＡ、および約４ｇ／ｌのポリソルベート８０を含み、
− 第２の添加溶液を添加することは、約２０の希釈比で実施され、それによって、第２の添加溶液の１体積が、当該体積のおよそ１９倍の、第２の限外ろ過ステップから得られた溶液に添加される。

第２の好ましい実施形態では、
− 抗体は、抗ＩＬ７Ｒ抗体であり、
− 好ましくは、抗ＩＬ−７Ｒ抗体は、配列番号１３に示すアミノ酸配列の相補性決定領域であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（そのようなＣＤＲの配列の例がそれぞれ、配列番号１７、１８および１９である）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号１４に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（そのようなＣＤＲの配列の例がそれぞれ、配列番号２０、２１および２２である）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
− より好ましくは、抗ＩＬ−７Ｒ抗体のＶＨ領域は、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含み、抗ＩＬ−７Ｒ抗体のＶＬ領域は、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含み、
− さらにより好ましくは、抗ＩＬ−７Ｒ抗体の重鎖は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含み、抗ＩＬ−７Ｒ抗体の軽鎖は、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有し、
− タンパク質製剤は、１１０〜１３０ｇ／ｌ、好ましくは、約１２０ｇ／ｌのタンパク質濃度を有し、
− タンパク質製剤中の第２の賦形剤は、４２〜５８ｇ／ｌ、好ましくは、約５０ｇ／ｌの濃度のスクロースであり、
− 最後の賦形剤は、タンパク質製剤中で０．０１７〜０．０２３ｇ／ｌ、好ましくは、約０．０２ｇ／ｌの濃度を有するポリソルベート８０を含み、
− 最後の賦形剤は、タンパク質製剤中で０．４２〜０．５８ｇ／ｌ、好ましくは、約０．５ｇ／ｌの濃度を有するＥＤＴＡを含み、
− 最後の賦形剤は、タンパク質製剤中で８５〜１１５ｍＭ、好ましくは、約１００ｍＭの濃度を有するアルギニンを含み、
− タンパク質製剤は、６．５〜７．５、好ましくは、約７．０のｐＨを有し、
− ステップ（ａ）で用意される溶液は、２．６〜３．４ｇ／ｌ、好ましくは、約３ｇ／ｌのタンパク質濃度を有し、
− タンパク質は、第１の限外ろ過ステップにより、３６〜５４ｇ／ｌ、好ましくは、４０〜５０ｇ／ｌ、最も好ましくは、約４５ｇ／ｌに濃縮され、
− タンパク質は、第２の限外ろ過ステップにより、１７０〜２１０ｇ／ｌ、好ましくは、約１９０ｇ／ｌに濃縮され、
− ダイアフィルトレーション用緩衝液中の第１の賦形剤は、タンパク質製剤中の第１の賦形剤の濃度よりも高い濃度を有し、ダイアフィルトレーション用緩衝液中の第１の賦形剤の前記濃度は、好ましくは、１９〜２５ｍＭ、最も好ましくは、約２２ｍＭの濃度であり、
− ダイアフィルトレーション用緩衝液は、アルギニンを、９５〜１２５ｍＭ、好ましくは、約１１０ｍＭの濃度で含み、
− ダイアフィルトレーション用緩衝液は、６．５〜７．５、好ましくは、約７．０のｐＨを有し、
− 第２の賦形剤を、ダイアフィルトレーションのステップから得られた保持液に添加することは、第１の添加溶液を保持液に添加することによって行われ、前記第１の添加溶液は、第２の賦形剤を、２３０〜３２０ｇ／ｌ、好ましくは、約２７５ｇ／ｌの濃度で含み、
− 第１の添加溶液は、第１の賦形剤を、ダイアフィルトレーション用緩衝液中の第１の賦形剤の濃度と実質的に等しく、タンパク質製剤中の第１の賦形剤の濃度よりも高い濃度で含み、第１の添加溶液中の第１の賦形剤の前記濃度は、好ましくは、１９〜２５ｍＭ、最も好ましくは、約２２ｍＭの濃度であり、
− 第１の添加溶液は、最後の賦形剤をさらに含み、
− 第１の添加溶液は、約２２ｍＭのヒスチジン、１１０ｍＭのアルギニンおよび約２７５ｇ／ｌのスクロースを、約７．０のｐＨで含み、
− 第１の添加溶液を保持液に添加することは、約５の希釈比で実施され、それによって、第１の添加溶液の１体積が、当該体積のおよそ４倍の保持液に添加され、
− 最後の賦形剤を添加することは、第２の添加溶液を、第２の限外ろ過ステップから得られた溶液に添加するステップを含み、前記第２の添加溶液は、ＥＤＴＡおよびポリソルベート８０を含み、
− 第２の添加溶液を添加することは、約２０の希釈比で実施され、それによって、第２の添加溶液の１体積が、当該体積のおよそ１９倍の、第２の限外ろ過ステップから得られた溶液に添加される。

本発明の第２の態様によれば、上記の方法により生成される抗体製剤を提供する。

好ましい実施形態では、タンパク質製剤は、
− １３５ｍｇ／ｍｌ〜１６５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約１５０ｍｇ／ｍｌの抗ＰＣＳＫ９抗体、および
− １６ｍＭ〜２４ｍＭ、好ましくは、約２０ｍＭのヒスチジン緩衝液
を含む。

別の好ましい実施形態では、タンパク質製剤は、
− １３５ｍｇ／ｍｌ〜１６５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約１５０ｍｇ／ｍｌの抗ＰＣＳＫ９抗体、および
− ６７．２ｍｇ／ｍｌ〜１００．８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約８４ｍｇ／ｍｌのトレハロース
を含む。

別の好ましい実施形態では、タンパク質製剤は、
− １３５ｍｇ／ｍｌ〜１６５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約１５０ｍｇ／ｍｌの抗ＰＣＳＫ９抗体、および
− ０．１６ｍｇ／ｍｌ〜０．２４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート
を含む。

別の好ましい実施形態では、タンパク質製剤は、
− １３５ｍｇ／ｍｌ〜１６５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約１５０ｍｇ／ｍｌの抗ＰＣＳＫ９抗体、
− １６ｍＭ〜２４ｍＭ、好ましくは、約２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および
− ６７．２ｍｇ／ｍｌ〜１００．８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約８４ｍｇ／ｍｌのトレハロース
を含む。

別の好ましい実施形態では、タンパク質製剤は、
− １３５ｍｇ／ｍｌ〜１６５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約１５０ｍｇ／ｍｌの抗ＰＣＳＫ９抗体、
− １６ｍＭ〜２４ｍＭ、好ましくは、約２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および
− ０．１６ｍｇ／ｍｌ〜０．２４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート
を含む。

別の好ましい実施形態では、タンパク質製剤は、
− １３５ｍｇ／ｍｌ〜１６５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約１５０ｍｇ／ｍｌの抗ＰＣＳＫ９抗体、
− ６７．２ｍｇ／ｍｌ〜１００．８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約８４ｍｇ／ｍｌのトレハロース、および
− ０．１６ｍｇ／ｍｌ〜０．２４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート
を含む。

さらなる好ましい実施形態では、タンパク質製剤は、
− １３５ｍｇ／ｍｌ〜１６５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約１５０ｍｇ／ｍｌの抗ＰＣＳＫ９抗体、
− １６ｍＭ〜２４ｍＭ、好ましくは、約２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、
− ６７．２ｍｇ／ｍｌ〜１００．８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約８４ｍｇ／ｍｌのトレハロース、および
− ０．１６ｍｇ／ｍｌ〜０．２４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート
を含む。

いくつかの実施形態では、抗体製剤は、５．２〜５．８、好ましくは、約５．５のｐＨを有する。

別の好ましい実施形態では、タンパク質製剤は、
− １１０ｇ／ｌ〜１３０ｇ／ｌ、好ましくは、約１２０ｇ／ｌの抗ＩＬ−７Ｒ抗体、；
− １７ｍＭ〜２３ｍＭ、好ましくは、約２０ｍＭのヒスチジン、
− ４２ｇ／ｌ〜５８ｇ／ｌ、好ましくは、約５０ｇ／ｌのスクロース、および
− ０．０１７ｇ／ｌ〜０．０２３ｇ／ｌ、好ましくは、約０．０２ｇ／ｌのポリソルベート
を含み、６．５〜７．５、好ましくは、約７．０のｐＨを有する。

上記で言及した配列番号１〜１２を、下記の表に記載する。

上記の配列番号１３〜１６を、下記の表に記載する。

（ｉ）２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．５）および（ｉｉ）２０ｍＭのヒスチジン、８４ｇ／ｌのトレハロース（ｐＨ５．５）中のボコシズマブの粘度対生成物の濃度をプロットするグラフである。 （ｉ）２０ｍＭのヒスチジン溶液（ｐＨ５．５）および（ｉｉ）２０ｍＭのヒスチジン、８４ｇ／ｌのトレハロース溶液（ｐＨ５．５）中のボコシズマブの密度を示す図である。 （ｉ）２０ｍＭのヒスチジン溶液（ｐＨ５．５）および（ｉｉ）２０ｍＭのヒスチジン、８４ｇ／ｌのトレハロース溶液（ｐＨ５．５）中のボコシズマブの密度を示す図である。 実験室規模のプロセスのフラックスのプロファイルを示す図である。 最後の濃縮における、プロセスの供給チャネルの圧力低下および供給流速を示す図である。

本明細書および特許請求の範囲においては、以下の定義を使用する。
− 用語「タンパク質製剤」は最終生成物を指し、この最終生成物は、目的のタンパク質、および賦形剤を含む。治療に使用するのを意図するタンパク質を指す場合、用語「原薬」を、「タンパク質製剤」の代わりに使用することができ、目的のタンパク質を、用語「活性成分」または「生成物」により指すことができる。「賦形剤」を、「タンパク質」でも「活性成分」でもない、「タンパク質製剤」の構成要素の全てと定義する。賦形剤は典型的には、タンパク質安定化剤、界面活性剤、アミノ酸、例えば、タンパク質の安定化等に寄与するアミノ酸等を含む。
− ダイアフィルトレーションのステップに関連して、用語「保持液」は、膜の保持液側に保持され、目的のタンパク質等の、大き過ぎて膜を通過することができない分子を含有する溶液を指す。保持液は、限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムの後続部へ移動する溶液である。システムのダイアフィルトレーション部中の膜の他方の側（透過側）で循環する他方の溶液を、「ダイアフィルトレーション用緩衝液」（または「基礎緩衝液」）と呼ぶ
− 用語「濃縮プール」は、最後の限外ろ過ステップから直接得られた溶液を指す。
− 用語「最後の賦形剤」は、最後の限外ろ過ステップの後、すなわち、最後の濃縮のステップの後に、「濃縮プール」に添加する賦形剤を指す。
− 用語「ｎ×スパイク」（ｎは数値である）は、タンパク質含有溶液の特定の体積に、ｎに等しい希釈比で添加する賦形剤の溶液を指し、このことは、賦形剤の溶液の１体積を、当該体積の（ｎ−１）倍のタンパク質含有溶液に添加することを意味する。例えば、４×スパイクは、その比に従って、すなわち、スパイクの１体積をタンパク質含有溶液の３体積に対して添加する溶液である。
− 別段の記載がない限り、数値に伴う用語「およそ」、「約」または「実質的に」は、前記の値がその±５％の範囲内にあることを意味する。
− 「粘度」は、本明細書で使用する場合、「絶対粘度」または「動粘度」であり得る。「絶対粘度」は、時には動的粘度または単に粘度とも呼ばれ、液体の、流れに対する抵抗性を記載する分量である。「動粘度」は、絶対粘度と液体の密度との商である。液体の抵抗性の流れを、毛細管粘度計を使用して特徴付ける場合に、動粘度が頻繁に報告される。等しい体積の２つの液体を同一の毛細管粘度計中に入れ、重力により流動させる場合、粘性の液体は、より低い粘性の液体よりも、毛細管を通って流動するのに、より長い時間を要する。１つの液体が流動し終えるのに２００秒を要し、別の液体が４００秒を要する場合、動粘度スケール上では、第２の液体の粘度は、第１の液体の２倍である。両方の液体が等しい密度を有する場合、絶対粘度スケール上では、第２の液体の粘度は、第１の液体の２倍である。動粘度のディメンションは、Ｌ^２／Ｔであり、Ｌは長さを示し、Ｔは時間を示す。動粘度のＳＩ単位は、ｍ^２／秒である。通常、動粘度は、センチストーク、ｃＳｔで表し、これは、ｍｍ^２／秒と同等である。絶対粘度のディメンションは、Ｍ／Ｌ／Ｔであり、Ｍは質量を示し、ＬおよびＴはそれぞれ、長さおよび時間を示す。絶対粘度のＳＩ単位はＰａ・秒であり、これは、ｋｇ／ｍ／秒と同等である。絶対粘度は通常、センチポアズ、ｃＰの単位で表し、これは、ミリパスカル−秒、ｍＰａ・秒と同等である。本発明の文脈では、抗体は、その粘度が少なくとも２０ｃＰである場合には、高い粘度を示すとみなす。

簡潔にするために、頭字語「ＵＦ」、「ＤＦ」および「ＵＦ／ＤＦ」（または「ＵＦＤＦ」）を、本明細書全体で使用することができ、これらの頭字語は、以下の用語を示すことを理解されたい：「ＵＦ」は「限外ろ過」を意味し、「ＤＦ」は「ダイアフィルトレーション」を意味し、「ＵＦ／ＤＦ」（または「ＵＦＤＦ」）は「限外ろ過／ダイアフィルトレーション」を意味する。本発明の方法は、タンパク質製剤を調製する方法と定義されるが、これをＵＦＤＦ法と呼ぶことができる。

ここで、本発明を、以下の実施例によりさらに例証する。そのそれぞれが、特定の治療用モノクローナル抗体およびこうしたモノクローナル抗体の特定の製剤に関連する実施例である。例証する目的に限って実施例を提供するのであって、実施例により本発明の範囲が制限されると解釈してはならない。

（実施例１）
Ａ−実施例１
例証のための実施例１では、目的のタンパク質は、ボコシズマブ、すなわち、ＰＣＳＫ９標的化モノクローナル抗体であり、この抗体は、ＰＣＳＫ９（プロタンパク質変換酵素サブチリシンケキシン９型）、例えば、配列番号１２またはＵｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ８ＮＢＰ７に特異的に結合する。原薬中で１５０ｇ／ｌの生成物の目標濃度を得るように、この方法は設計されており、原薬は、以下の賦形剤を５．５のｐＨで含む：
− ２０ｍＭの濃度のヒスチジン、
− ８４ｇ／ｌの濃度のトレハロース、および
− ０．２ｇ／ｌの濃度のＰＳ８０（ポリソルベート８０）。

上記の要件が、タンパク質濃度に関しては±８ｇ／ｌの許容範囲で、賦形剤濃度に関しては±１５％の許容範囲で、ｐＨ値に関しては±０．２の許容範囲で達成される場合に、これを許容できるとみなす。

収率に関しては、この方法では、９０％超の生成物の回収を達成することが要件である。

実験を実施して、好ましい操作モードを定義し、本発明の方法が上記の要件を達成するのに適切であることを確立するに至った（一方、従来法は適切でない）。これらの実験の一部を、以下に記載する。

Ａ．１ 材料
実験のために使用した出発物質は、十分に精製したボコシズマブ溶液であり、この溶液は、使用に先立って、賦形剤構成成分を除去するために、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）カラムを通して処理しておいた。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）による精製の後に、溶出液を、酢酸によりｐＨ５．０に調整し、１７．０９ｇ／ｌの生成物濃度を得た。

限外ろ過／ダイアフィルトレーションデバイス
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３（３０ＫＤａ、Ｃ−スクリーン、８８ｃｍ^２）再生セルロース膜またはＳａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）（３０ＫＤａ、Ｅ−チャネル、２００ｃｍ^２）再生セルロース膜を取り付けたＧＥ Ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ（登録商標）システム（３００ｍｌのリザーバ）を使用して、全ての実験を実施した。膜間圧（ＴＭＰ）を、およそ１４〜２２ｐｓｉに保ち、Ｐ_Ｆｅｅｄは、５５ｐｓｉ未満であった。別段の特定がない限り、全ての濯ぎ液を、濯ぎ用緩衝液を少なくとも１５分間再循環させることによって得、次いで、これを、システムの最小作業体積まで濃縮した。

Ａ．２ 実験の設計および結果
トレハロースの溶解性の決定
３０ｍＭのヒスチジン溶液（ｐＨ５．３５）中でのトレハロースの溶解性の限界を評価するための最初の実験を完了した（タンパク質濃度の増加に伴って、排除されたヒスチジンイオンを補うために、ヒスチジンの濃度およびｐＨを、最終の規格に照らして調整する）。１５０ｇ／ｌの原薬の最終目標濃度を得るためには、濃縮プールの最小濃度は、６×のトレハロース／ＥＤＴＡ／ＰＳ８０スパイクでは１８０ｇ／ｌであり、または５×のトレハロース／ＥＤＴＡ／ＰＳ８０スパイクでは１８７．５ｇ／ｌであることが必要となるはずである。６×スパイクを行うのに必要なトレハロースの濃度（約５００ｇ／ｌ）では、トレハロースは、室温（２２℃）では、長期に撹拌しても溶解せず（粒子が依然として存在した）、溶解させるためには、３０℃まで加熱しなければならなかった。溶液を、１５ｐｓｉの圧力下で、０．２２μｍのＰａｌｌ Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルターを通してろ過したが、室温での再沈澱は生じなかった。

しかし、この製造方法は、スケールアップするのが困難となる場合があり、したがって、トレハロースによるスパイクを行うための最大実用濃度の上限は５×（約４２０ｇ／ｌのトレハロース）である可能性がある。

したがって、好ましいプロセスでは、スパイク用溶液のトレハロースの濃度は、約４００ｇ／ｌであり得る。

プロセスの開発
ダイアフィルトレーション用溶液中で必要となるヒスチジン濃度を試験し、ダイアフィルトレーションした溶液中のヒスチジン濃度を、異なるタンパク質濃度（７６．６ｇ／ｌおよび１１４ｇ／ｌ）において調べ、密度を測定するための物質を生成するように、第１の実験を設計した。出発物質を、２００ｃｍ^２のＳａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）Ｅ−チャネル膜を使用して、３４５ｇ／ｍ^２のロード容量で、７６．６ｇ／ｌに濃縮し、次いで、３５ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．２６）を用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションのフラックスは、３００ＬＭＨの供給流速および２２ｐｓｉのＴＭＰで、１７ＬＭＨ（リットル／ｍ^２／時間）であった。次いで、物質を、２１３ｇ／ｌにさらに濃縮し（データ未公開）、ダイアフィルトレーションしたプールおよび最終の濃縮した物質の両方の試料を、ヒスチジンおよびトレハロースの濃度について分析した（表１を参照されたい）。

第２の実験を実施して、トレハロースを含有する、ダイアフィルトレーションした物質が、ダイアフィルトレーション用緩衝液中の、トレハロースを含有しない物質と比して、より低い最終濃度を示すかを決定した。出発物質を１１４ｇ／Ｌに濃縮し、３５ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．２６）を用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションのフラックスは、表２、実験２Ａに記載する操作条件下で１０ＬＭＨであった。ダイアフィルトレーションした溶液を、５５ｐｓｉ未満の供給圧および２２ｐｓｉのＴＭＰで、１８４．９ｇ／Ｌに濃縮した。濃縮した物質を、リザーバから流し出し、３５ｍＭのヒスチジン濯ぎ溶液（ｐＨ５．２６）と組み合わせて、１５３．７ｇ／Ｌの濃度を得た。プールに、４×のトレハロース賦形剤緩衝液（３０ｍＭのヒスチジン、４００ｇ／Ｌトレハロース、ｐＨ５．４）を用いてスパイクを行って、１１４ｇ／Ｌの最終タンパク質濃度を得た。次いで、スパイクを行った溶液を、表２、実験２Ｂに記載する操作条件下で２０２．４ｇ／Ｌに濃縮した。濃縮のステップを、ポンプの限界に起因して、１５ＬＭＨの供給流速で停止した。

表１は、全ての濃縮試料中で、ヒスチジン濃度およびトレハロース濃度の両方が、最終目標規格、すなわち、２０ｍＭのヒスチジンおよび８４ｇ／Ｌのトレハロースの１０％内であったことを示している。

この情報は、ダイアフィルトレーションのための濃度の許容操作範囲が７５〜１１４ｇ／Ｌであることを示しており、この範囲内であれば、最終賦形剤濃度は濃度規格を満たす。

濃縮２のステップの終わりに、追加の実験を実施して、ヒスチジンおよびトレハロースの濃度の変化をタンパク質濃度の関数として評価した。２００ｃｍ^２のＳａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）Ｅ−チャネル膜を使用して、出発物質を、１０５．９ｇ／ｌに濃縮し、３５ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．２９）を用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションのフラックスは、３００ＬＭＨの供給流速および２２ｐｓｉのＴＭＰで、１２ＬＭＨであった。次いで、ダイアフィルトレーションした物質に、４×のトレハロース賦形剤溶液を用いてスパイクを行った。スパイク用溶液を、リザーバ内に直接添加し、１５分間混合し、次いで、物質を、１７２、１８８および２０９ｇ／ｌの最終濃度に濃縮した（表３を参照されたい）。表４に示すように、タンパク質濃度の増加に伴って、ヒスチジン濃度は低下したが、全ての値が、２０ｍＭのヒスチジン、８４ｇ／Ｌのトレハロースの目標濃度の１０％内であった。

この方法を、５００Ｌのパイロット規模にスケールアップした（ロット：１２Ｐ１２６Ｊ６０３−ＭＶ−Ｂ）：プロセスの詳細については、表５を参照されたい。０．５ｍ^２のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｖ−スクリーン膜を使用して、５１７ｇの、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ（登録商標）により精製した物質を１０７ｇ／ｌに濃縮し、次いで、３５ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．２９）を用いて、１０００ＬＭＨの供給流速および４０ｐｓｉの供給圧でダイアフィルトレーションした。次いで、保持液に、４×のトレハロース溶液（３０ｍＭのヒスチジン、４００ｇ／ｌのトレハロース、ｐＨ５．２２）を用いてスパイクを行った；この溶液は、システムに残留する体積があることを考慮して、リザーバ内に直接添加した。次いで、スパイクを行った物質を、２０２ｇ／ｌに濃縮し、濃縮した生成物を、システムから取り出した。スキッドを、緩衝液（２０ｍＭのヒスチジン、８４ｇ／ｌのトレハロース、ｐＨ５．５０）を用いて濯ぎ、濯ぎ液を、濃縮した物質に添加した。組み合わせた最終の溶液を測定した濃度は１６０ｇ／ｌであり、全体的な収率は９７．１％であった。

表６に、この実験の場合の賦形剤の濃度および生成物の品質の結果を要約する；この表には、組み合わせたプールの最終レベルは、上記の目標濃度の１０％内であり、過去のＵＦの最終値と比較して、ＳＥＣにより測定した場合、生成物の品質に対する顕著な作用は全く認められなかったことが示されている。

ダイアフィルトレーションプロセスの評価
タンパク質の、異なる濃度における密度および粘度
図１に、（ｉ）２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．５）および（ｉｉ）２０ｍＭのヒスチジン、８４ｇ／ｌのトレハロース（ｐＨ５．５）中のボコシズマブの粘度対生成物の濃度をプロットする。このグラフから、およそ１７５ｇ／ｌで粘度は３０ｃＰの値に達することが示されており、この値は、大規模で実行可能なＵＦＤＦプロセスについてのカットオフであると考えられている。

（ｉ）２０ｍＭのヒスチジン溶液（ｐＨ５．５）および（ｉｉ）２０ｍＭのヒスチジン、８４ｇ／ｌのトレハロース溶液（ｐＨ５．５）中のボコシズマブの密度を、測定し、図２および図３に示す。これらのデータから、ヒスチジン／トレハロース緩衝液と比較して、ヒスチジン緩衝液中の密度は若干より低いことが示されており、このことは予想通りである。

上記の実験に基づいて、製造規模で、ヒスチジンを含有するが、トレハロースは含有しないＤＦ用緩衝液を用いることによって、原薬中の目標濃度を得ることができることが見出された。

実験から得られた結果は、本発明の方法により、許容できる収率、タンパク質および賦形剤の最終濃度が得られることのみならず、また、本発明の方法が必要とする、賦形剤によるスパイクの前のタンパク質濃度は、従来法と比較してより低い（１５８ｇ／Ｌ対１８８ｇ／Ｌ）ことも示した。プロセスをスケールアップする場合、そのようなより低いタンパク質濃度は、恒常的に得るのがより容易である。さらに、ダイアフィルトレーション用緩衝液からトレハロースを取り出すことによって得られるより良好な原価プロファイルによっても、本発明の方法は従来法を上回って好都合である。

Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｃ−スクリーン膜を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｖ−スクリーン膜の代替えとして利用するＵＦＤＦプロセスから、一貫して、１７５ｇ／ｌ超の濃度が得られたことが見出された。これであれば、２０×の、賦形剤によるスパイクの前に必要とする１５８ｇ／ｌを上回る濃度を依然として維持しながら、洗浄プール（濯ぎ液）の添加を可能にするのに十分であった。トレハロースによるスパイクを伴うプロセスが機能することを確実にするために、Ｃ−スクリーン膜を利用するプロセスを、実験室規模およびパイロット規模の両方で評価した。

表７に概要を述べる限外ろ過（ＵＦ）運転条件を用いて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）ＰＬＣＴＫ Ｃ−スクリーンカセットを使用する実験室規模で、プロセスを評価した。

ＴＦＦ（タンジェンシャルフローろ過）装置については、操作限界である、達成可能な圧力の限界のおよそ５０〜５５ｐｓｉで、実験室規模のプロセスを、３０〜３００ＬＭＨの供給流速範囲を用いて実施した。ほとんどの処理を行う、上限の供給流速である３００ＬＭＨは、原理的には処理時間に影響を及ぼし、この場合、供給流量が低下すると、プロセスのフラックスが低下し、これにより、プロセスのポンピング時間が増加する。粘度が高いと、保持液チャネル（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｃｈａｎｎｅｌ）を経るにつれ圧力が低下することになるので、下限の供給流速である３０ＬＭＨは、達成可能な最終濃度にとって決定的に重要であり、したがって、より低い流速により、粘性のより高い溶液のポンピングが可能になる。

実験室規模のプロセスを、およそ８４ｇ／ｌのトレハロースの存在下で運転したところ、最終保持液プール中で１７７ｇ／ｌの最終濃度を得、供給流速は３０ＬＭＨであり、供給圧は５０ｐｓｉであった。別途、実験室規模の運転から得られた洗浄画分を収率について測定し、これを表８に示す。

実験室規模のプロセスのフラックスのプロファイルを、図４に見ることができる。図中、垂直な線は、保持液を開けて（ゼロｐｓｉ）、供給圧を約５０ｐｓｉ未満に保持するために、供給流速を低下させ始めた点を示し、この場合、クロスフローの低下に起因して、プロセスのフラックスの低下が生じる。図５は、最後の濃縮における、プロセスの供給チャネルの圧力低下および供給流速を示す。実験室規模のシステムにおいては、供給圧が約５０ｐｓｉに近づいたら、供給をポンピングする速度を低下させることによって手作業で流量を調整する。

パイロット規模の確認バッチ
Ｃ−スクリーン膜を用いるＵＦＤＦプロセスを５００Ｌの規模で実施して、目標最終濃度を得ることができることを確認した。プロセスを表９に示し、パイロット施設において実施した３つのロットについてのプロセスのデータを表１０に示す。

結果から、このプロセスにより、高い回収率が得られたこと、および濃度は中間目標および最終目標を満たしたことが示されている。さらに、ロット１３Ｐ１２０Ｊ６０４について、賦形剤の濃度を測定したところ、２１．２ｍＭのヒスチジン、８５．４ｇ／ｌのトレハロースおよび０．０５１ｇ／ｌのＥＤＴＡを得、これらは、目標規格の±１５％内である。

Ａ．３ 結論
上記に記載した実験では、９２〜９９％のステップ収率を実証し、かつ原薬の目標を達成することが可能であった。

この実施例は、本発明に従うＵＦＤＦ法が、高い濃度（１５０ｇ／ｌ）のボコシズマブ原薬を、ｐＨ、および賦形剤の濃度の全てを許容できる範囲に保って調製するのに適切であることを実証している。同様に、その他のタンパク質、とりわけ、特に高い粘度を有するタンパク質に対しても、同じ利益をもたらすことができる。

（実施例２）
Ｂ−実施例２
例証のための実施例２では、目的のタンパク質は、抗体Ｃ１ＧＭ、すなわち、ＩＬ−７Ｒに特異的に結合するＩＬ−７Ｒアンタゴニストモノクローナル抗体である。原薬中で１２０ｇ／ｌの生成物の目標濃度を得るように、この方法は設計されており、原薬は、以下の賦形剤を７．０のｐＨで含む：
− ２０ｍＭの濃度のヒスチジン、
− １００ｍＭの濃度のアルギニン、
− ５０ｇ／ｌの濃度のスクロース、
− ０．０２ｇ／ｌの濃度のＰＳ８０（ポリソルベート８０）、および
− ０．５ｇ／ｌの濃度のＥＤＴＡ。

上記の要件が、タンパク質濃度に関しては±１０ｇ／ｌの許容範囲で、賦形剤濃度に関しては±１５％の許容範囲で、ｐＨ値に関しては±０．５の許容範囲で達成される場合に、これを許容できるとみなす。

収率に関しては、この方法では、８５％超の生成物の回収を達成することが要件である。

下記に記載する実験のために使用した出発物質は、十分に精製した溶液であり、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）およびＱ膜クロマトグラフィーにより処理しておいた。

限外ろ過／ダイアフィルトレーションデバイス
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３（登録商標）（３０ＫＤａ、Ｃ−スクリーン、８８ｃｍ^２）再生セルロース膜を取り付けたＧＥ Ｃｒｏｓｓｆｌｏｗシステム（３００ｍＬのリザーバ）またはＱｕａｔｔｒｏｆｌｏｗ（商標）ポンプシステムを使用して、全ての実験を実施した。膜間圧（ＴＭＰ）を、およそ１４〜２２ｐｓｉに保ち、Ｐ_Ｆｅｅｄは、５５ｐｓｉ未満であった。別段の特定がない限り、全ての濯ぎ液を、濯ぎ用緩衝液を１５分間超再循環させることによって得、次いで、これを、システムの最小作業体積まで濃縮した。

分析アッセイ
タンパク質濃度についてのＵＶ／可視分光光度法を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００Ｃ（商標）またはＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．製のＳｏｌｏ ＶＰＥ（商標）を使用して実施した。ＡＲＤにより実験的に決定した２８０ｎｍにおける吸光係数は、１．５１ｍＬ^＊ｍｇ^−１＊ｃｍ^−１である。

実験
実験１
出発物質を、５％の２Ｍ ＮａＣｌを用いてスパイクし、２Ｍのトリス塩基を用いて、ｐＨ７．０に調整し、５０ｇ／Ｌに濃縮し、２２ｍＭのヒスチジン、１１０ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．０を用いてダイアフィルトレーションし、５×のスクロース緩衝液（２２ｍＭのヒスチジン、１１０ｍＭのアルギニン、２７５ｇ／Ｌのスクロース、ｐＨ７．０）を用いてスパイクし、約３４ＬＭＨの供給流速で１４６．９ｇ／Ｌに濃縮した；詳細を表１１に示す。濃縮した溶液のｐＨは、７．００であった。ＵＦシステムを、ダイアフィルトレーション用溶液を用いて単回通過モード（再循環なし）でフラッシュし、その結果、３３ｇ／Ｌの濃度を得た。全体的な収率は、およそ８８％であった。

表１２〜１４に、賦形剤、ＣＧＥおよびＳＥＣアッセイの結果を示す。最終の濃縮した物質中のヒスチジン、アルギニンおよびスクロースの濃度は全て、所望の値の±１０％内であった。ＵＦのプロセスの間に新たな凝集は形成されず、断片化レベルの変化も全く生じなかった。

実験２
表１５に詳細を示すように、この実験を反復した；唯一の違いは、スパイク体積の計算方法であり、スパイク前のＵＦシステム中の総体積を、全体的な物質収支（総ロード量を透析ろ液の濃度で除したもの）から計算したか、それともシステムに残留する体積に、リザーバ中に添加する体積を加算することによって計算したかの違いがあった。５×の、スクロースによるスパイクを行った後に、タンパク質を、約３４ＬＭＨの供給流速および５０ｐｓｉ未満のＰ_ｆｅｅｄで１８３．６ｇ／Ｌに濃縮した。

表１６に、最終的な物質中の賦形剤の濃度、すなわち、ヒスチジン、アルギニンおよびスクロースの濃度は、所望の目標値の±１０％内であったことを示す。スパイク体積の計算方法の差が、最終賦形剤濃度に対して顕著な作用をもたらすようには全く見えなかった。

実験３
最終的な製剤を指名した後に、実験を第３回目として反復し、結果の詳細を表に示す。ダイアフィルトレーションの後に、５×スパイク用溶液を添加する体積を、実験２の概要に従って計算した。タンパク質を、約３４ＬＭＨの供給流速および５０ｐｓｉ未満のＰ_ｆｅｅｄで１９０ｇ／Ｌに濃縮した。ＵＦシステムを、２０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのアルギニン、５０ｇ／Ｌのスクロース、ｐＨ７．０を用いて、単回通過モードで濯いだ。濯ぎプールと組み合わせた保持液中のタンパク質濃度は、１５１ｇ／Ｌであり、およそ８４％の全体的な収率を得た。

表１８に賦形剤の濃度を要約するが、この表には、ヒスチジン、アルギニンおよびスクロースの濃度は全て、所望の値の±１０％内であることが示されている。表１９および表２０から、ＵＦＤＦプロセスの間に追加の凝集も断片化も形成されなかったことが示されている。

上記の実験３で実施したプロセスから、賦形剤の全ておよび目的のタンパク質について、許容できる濃度の値が得られ、このプロセスは、凝集体の形成および断片化のいずれに対しても作用を及ぼすようには見えない。このプロセスを、パイロット規模にスケールアップして、それが予想通りに機能することを確実にする。

パイロット規模でのＵＦＤＦプロセス
上記（実験３）で開発したＵＦのプロセスを、パイロット工場で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｃ−スクリーン再生セルロース膜を使用して試験し、５００Ｌ規模のバイオリアクターからの精製物質を使用した。

表２１に詳細を示す単位操作の間に、２．９２ｇ／Ｌの生成物の最初の濃度の出発物質８６Ｌを、５％の２Ｍ ＮａＣｌを用いてスパイクし、次いで、４４．６ｇ／Ｌに濃縮した。次いで、物質を、２２ｍＭのヒスチジン、１１０ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．０を用いて、およそ１５０ＬＭＨの供給流速および４０ｐｓｉ未満のＰ_ｆｅｅｄでダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションが８ＴＯＶに達した後に、保持液に、２２ｍＭのヒスチジン、１１０ｍＭのアルギニン、２７５ｇ／Ｌのスクロース、ｐＨ７．０を用いてスパイクを行い、これを、１０分間再循環させ、次いで、１９１．４ｇ／Ｌに濃縮した。濃縮のプロセスを、３０ＬＭＨの透過液の流速および５０ｐｓｉ未満のＰ_ｆｅｅｄで停止した。次いで、スキッドを、２０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのアルギニン、５０ｇ／Ｌのスクロース、ｐＨ７．０を用いて、単回通過モードで濯いだ。全体的な収率は、およそ８７％であった。ＵＦのプロセス全体は、完了するのにおよそ５時間を要した。

保持液プール、濯ぎプールおよび追加の濯ぎ用緩衝液を混合することによって、１３５．４ｇ／Ｌの濃度のＵＦプールを作り出した。このプールを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）の０５／０．２ｕｍのＯｐｔｉｃａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣを通して、５９Ｌ／ｍ^２の処理量でろ過した。ＥＤＴＡおよびＰＳ８０からなる２０×賦形剤緩衝液をＵＦプール中にスパイクして、１２９．４ｇ／Ｌの最終濃度の原薬を生成した。

賦形剤の濃度を表２２に要約する；この表は、最終プール中のヒスチジン、アルギニンおよびスクロースの濃度が目標値の±１５％内であったことを示している。実験室規模の場合には、プロセスの開発における目標範囲を、賦形剤の濃度の全てについて、目標値の±１０％に設定したが、大規模の場合には、許容範囲を±１５％に設定して、スケールアップの際の自由裁量を許した。

表２３および表２４に、運転から得られた生成物の品質の結果を要約する；これらの結果は、凝集および断片化の増加は検出されなかったことを示している。

結論
結論として、上記に記載した実験から、目的の抗ＩＬ−７Ｒ抗体について、１２０ｍｇ／ｍｌ超の原薬を得るＵＦＤＦプロセスに関して、プロセスの開発が良好に行われたことが実証される。ＵＦＤＦプロセスは、最初の濃縮、ダイアフィルトレーション、スクロースによるスパイク、それに続く、最後の濃縮、次いで、残りの賦形剤を用いるスパイクを含む。ｐＨ、および賦形剤の濃度の全てが、開発したプロセスにおいては、許容できる範囲内にある。

Claims (31)

1. 賦形剤および少なくとも１つの治療用タンパク質を含むタンパク質製剤を調製する方法であって、連続的なステップ、すなわち、
   （ａ）前記タンパク質を含む溶液を提供するステップと、
   （ｂ）溶液中のタンパク質を第１の限外ろ過ステップにより濃縮するステップと、
   （ｃ）こうして得られた溶液を、少なくとも１つの第１の賦形剤を含むダイアフィルトレーション用緩衝液を用いてダイアフィルトレーションするステップであって、それによって、タンパク質および第１の賦形剤を含む保持液が得られるステップと、
   （ｄ）第２の賦形剤を、ダイアフィルトレーションのステップから得られた保持液に添加するステップであって、該第２の賦形剤が糖であるステップと、
   （ｅ）限外ろ過装置中で、保持液中のタンパク質を第２の限外ろ過ステップによりさらに濃縮するステップと、
   （ｆ）少なくとも１つの最後の賦形剤を添加するステップであって、それによって、所望のタンパク質濃度を有し、前記第１および最後の賦形剤を含むタンパク質製剤が得られるステップと
   を含む方法。
2. ステップ（ｅ）の後およびステップ（ｆ）の前に、限外ろ過装置を、濯ぎ用緩衝液を用いて濯ぐステップであって、それによって、タンパク質の回収が促進されるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 濯ぎ用緩衝液が、第１および第２の賦形剤をそれぞれ、タンパク質製剤中の第１および第２の賦形剤の濃度と実質的に等しい濃度で含む、請求項２に記載の方法。
4. 第１の賦形剤が、アミノ酸、好ましくは、ヒスチジンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. タンパク質製剤中の第１の賦形剤が、１６〜２４ｍＭ、好ましくは、１７〜２３ｍＭ、最も好ましくは、２０ｍＭの濃度を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 第２の賦形剤が二糖である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 最後の賦形剤が、界面活性剤、好ましくは、ポリソルベート８０を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 最後の賦形剤が、キレート化剤、好ましくは、ＥＤＴＡを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. タンパク質製剤が、１１０〜１６５ｇ／ｌのタンパク質濃度を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. タンパク質が抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 抗体が、抗ＩＬ−７Ｒ抗体である、請求項１０に記載の方法。
12. 抗体が、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むＶＬ領域を有する、請求項１０に記載の方法。
13. タンパク質製剤が、１１０〜１３０ｇ／ｌ、好ましくは、１２０ｇ／ｌのタンパク質濃度を有する、請求項１１または１２に記載の方法。
14. タンパク質製剤中の第２の賦形剤が、４２〜５８ｇ／ｌ、好ましくは、５０ｇ／ｌの濃度のスクロースである、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 最後の賦形剤が、タンパク質製剤中で０．０１７〜０．０２３ｇ／ｌ、好ましくは、０．０２ｇ／ｌの濃度を有するポリソルベート８０を含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 最後の賦形剤が、タンパク質製剤中で０．４２〜０．５８ｇ／ｌ、好ましくは、０．５ｇ／ｌの濃度を有するＥＤＴＡを含む、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 最後の賦形剤が、タンパク質製剤中で８５〜１１５ｍＭ、好ましくは、１００ｍＭの濃度を有するアルギニンを含む、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. タンパク質製剤が、６．５〜７．５、好ましくは、７．０のｐＨを有する、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ステップ（ａ）で用意される溶液が、２．６〜３．４ｇ／ｌ、好ましくは、３ｇ／ｌのタンパク質濃度を有する、請求項１１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. タンパク質が、第１の限外ろ過ステップにより、３６〜５４ｇ／ｌ、好ましくは、４０〜５０ｇ／ｌ、最も好ましくは、４５ｇ／ｌに濃縮される、請求項１１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. タンパク質が、第２の限外ろ過ステップにより、１７０〜２１０ｇ／ｌ、好ましくは、１９０ｇ／ｌに濃縮される、請求項１１から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. ダイアフィルトレーション用緩衝液中の第１の賦形剤が、タンパク質製剤中の第１の賦形剤の濃度よりも高い濃度を有し、ダイアフィルトレーション用緩衝液中の第１の賦形剤の前記濃度が、好ましくは、１９〜２５ｍＭ、最も好ましくは、２２ｍＭの濃度である、請求項１１から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. ダイアフィルトレーション用緩衝液が、アルギニンを、９５〜１２５ｍＭ、好ましくは、１１０ｍＭの濃度で含む、請求項１１から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. ダイアフィルトレーション用緩衝液が、６．５〜７．５、好ましくは、７．０のｐＨを有する、請求項１１から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 第２の賦形剤を、ダイアフィルトレーションのステップから得られた保持液に添加することが、第１の添加溶液を保持液に添加することによって行われ、前記第１の添加溶液が、第２の賦形剤を、２３０〜３２０ｇ／ｌ、好ましくは、２７５ｇ／ｌの濃度で含む、請求項１１から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 第１の添加溶液が、第１の賦形剤を、ダイアフィルトレーション用緩衝液中の第１の賦形剤の濃度と実質的に等しく、タンパク質製剤中の第１の賦形剤の濃度よりも高い濃度で含み、第１の添加溶液中の第１の賦形剤の前記濃度が、好ましくは、１９〜２５ｍＭ、最も好ましくは、２２ｍＭの濃度である、請求項２５に記載の方法。
27. 第１の添加溶液が、最後の賦形剤をさらに含む、請求項２５または２６に記載の方法。
28. 第１の添加溶液が、２２ｍＭのヒスチジン、１１０ｍＭのアルギニンおよび２７５ｇ／ｌのスクロースを、７．０のｐＨで含む、請求項２７に記載の方法。
29. 第１の添加溶液を保持液に添加することが、５の希釈比で実施され、それによって、第１の添加溶液の１体積が、当該体積のおよそ４倍の保持液に添加される、請求項１１から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 最後の賦形剤を添加することが、第２の添加溶液を、第２の限外ろ過ステップから得られた溶液に添加するステップを含み、前記第２の添加溶液が、ＥＤＴＡおよびポリソルベート８０を含む、請求項１１から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 第２の添加溶液を添加することが、２０の希釈比で実施され、それによって、第２の添加溶液の１体積が、当該体積のおよそ１９倍の、第２の限外ろ過ステップから得られた溶液に添加される、請求項３０に記載の方法。

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