JP6923111B2 - Screening method for skin aging improving agents - Google Patents
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Description
本発明は、皮膚老化改善剤をスクリーニングする方法に関する。 The present invention relates to a method for screening a skin aging improving agent.
シワやタルミ等の皮膚老化症状は、見た目の印象に大きな影響を与えるものであるため、その改善への関心は高い。近年、皮膚老化症状の改善を目的とする、抗老化剤、抗シワ剤、保湿剤等の開発が盛んに行われている。それらは主に、コラーゲンやエラスチンといった肌の張りや弾力を保つ働きをする物質を産生する真皮の線維芽細胞をターゲットとするものや（特許文献１〜２等）、表皮基底細胞をターゲットとするものであった（例えば特許文献３等）。 Since skin aging symptoms such as wrinkles and tarmi have a great influence on the impression of appearance, there is a great deal of interest in improving them. In recent years, anti-aging agents, anti-wrinkle agents, moisturizers and the like have been actively developed for the purpose of improving skin aging symptoms. They mainly target dermal fibroblasts that produce substances that maintain skin tension and elasticity, such as collagen and elastin (Patent Documents 1 and 2 etc.), and epidermal basal cells. (For example, Patent Document 3 etc.).
従来の抗老化剤では、ある程度の抗老化効果は認められるものの、十分に満足のいく効果が得られているとは言い難い。また、皮膚老化症状の生じるメカニズムのさらなる解明も求められている。
本発明は、かかる状況に鑑み、皮膚老化症状に対する新たなアプローチによる皮膚老化改善剤として有効な成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング方法を確立することを課題とする。
Although conventional anti-aging agents have some degree of anti-aging effect, it cannot be said that a sufficiently satisfactory effect is obtained. Further elucidation of the mechanism by which skin aging symptoms occur is also required.
In view of such a situation, an object of the present invention is to search for an effective ingredient as a skin aging improving agent by a new approach to skin aging symptoms, and an object of the present invention is to establish a new screening method for that purpose.
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、真皮の下に存在する皮下組織に着目し、皮下脂肪細胞が血液から受ける刺激も、皮膚老化症状の原因となり得ると考え、皮下脂肪細胞が血中刺激を受けたときのアディポサイトカイン活性への影響、及びアディポサイトカインの活性の真皮線維芽細胞等への影響を検討した。そして、ある種のアディポサイトカインを活性化又は不活性化することにより皮膚老化症状を改善することができるという知見を得て、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventor focused on the subcutaneous tissue existing under the dermis, and considered that the stimulation received from blood by subcutaneous adipocytes could also cause skin aging symptoms. The effect of subcutaneous adipocytes on adipocytocytosis activity when stimulated in the blood and the effect of adipocytosis activity on dermal fibroblasts were investigated. Then, they have obtained the finding that the skin aging symptom can be improved by activating or inactivating a certain adipocytokine, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］皮下脂肪細胞中の老化制御因子の活性を指標として、皮膚老化改善剤をスクリーニングする方法。
［２］前記老化制御因子が、皮膚老化症状の発生に関与する物理量のいずれかを変動させるものである、［１］に記載の方法。
［３］前記皮膚老化症状の発生に関与する物理量が、コラーゲン量、エラスチン量、ヒアルロン酸量、バーシカン量、オートファジー活性、及び皮膚支持構造からなる群から選択される、［２］に記載の方法。
［４］前記老化制御因子が、皮下脂肪細胞への刺激によってその発現量が変動するものである、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記老化制御因子の活性が、前記因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、刺激及び被験物質を添加した皮下脂肪細胞における前記発現量が、刺激を添加し被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して大き
い又は小さい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定する、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記刺激が、生活習慣及又は加齢によって量が変動する物質から選択される、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］前記生活習慣及又は加齢によって量が変動する物質が、酸化ＬＤＬ、グルコース、過酸化水素、エストラジオール、カフェイン、アセトアルデヒド、ビタミン類、オレキシン、プロゲステロン、テストステロン、ＤＨＥＡ、及びメチルグリオキサールからなる群から選択される、［６］に記載の方法。
［８］前記刺激が酸化ＬＤＬであって、前記老化制御因子が、４−１ＢＢ、ＦａｓＬ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＳＰα、ＩＦＮγ、及びＰＡＩ−１からなる群から選択される、［７］に記載の方法。
［９］前記刺激がグルコースであって、前記老化制御因子が、４−１ＢＢ、ＣＲＰ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＡＡ、ＳＤＦ−１、ｓＴＮＦＲＩ、ｓＴＮＦＲＩＩ、ＶＥＧＦ、及びＩＬ−６ｓＲからなる群から選択される、［７］に記載の方法。
［１０］前記刺激が過酸化水素であって、前記老化制御因子が、ＩＬ−８、Ｌｅｐｔｉｎ、ＧＨ１、及びＯＰＧからなる群から選択される、［７］に記載の方法。
［１１］前記刺激がエストラジオールであって、前記老化制御因子が、ＡＣＥ２、ＡｇＲＰ、ＣＲＰ、ＩＧＦＢＰ３、ＬｅｐｔｉｎＲ、ｓＴＮＦＲＩ、ＳＴ２、ＭＣＰ３、ＰＤＧＦＡＢ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される［７］に記載の方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for screening a skin aging improving agent using the activity of an aging regulator in subcutaneous adipocytes as an index.
[2] The method according to [1], wherein the aging control factor changes any of the physical quantities involved in the development of skin aging symptoms.
[3] The amount of physical quantity involved in the development of the skin aging symptom is selected from the group consisting of collagen amount, elastin amount, hyaluronic acid amount, versican amount, autophagy activity, and skin support structure, according to [2]. Method.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the expression level of the aging regulator varies depending on the stimulation of subcutaneous adipocytes.
[5] The activity of the aging control factor is the expression level of the gene encoding the protein constituting the factor or the protein, and the expression level in the subcutaneous adipocytes to which the stimulus and the test substance are added is the expression level of the stimulus. The method according to any one of [1] to [4], wherein the test substance is determined to have an effect of improving skin aging when the expression level is large or small as compared with the expression level in cells to which the test substance is not added.
[6] The method according to [4] or [5], wherein the stimulus is selected from substances whose amount varies depending on lifestyle and aging.
[7] The substance whose amount varies depending on lifestyle and aging consists of oxidized LDL, glucose, hydrogen peroxide, estradiol, caffeine, acetaldehyde, vitamins, orexin, progesterone, testosterone, DHEA, and methylglyoxal. The method according to [6], which is selected from the group.
[8] The method according to [7], wherein the stimulus is oxidized LDL and the aging regulator is selected from the group consisting of 4-1BB, FasL, IGFBP2, MSPα, IFNγ, and PAI-1.
[9] A group in which the stimulus is glucose and the aging regulator is 4-1BB, CRP, IGFBP2, IL-12, RANTES, SAA, SDF-1, sTNFRI, sTNFRII, VEGF, and IL-6sR. The method according to [7], which is selected from.
[10] The method according to [7], wherein the stimulus is hydrogen peroxide, and the aging regulator is selected from the group consisting of IL-8, leptin, GH1, and OPG.
[11] The stimulus is estradiol, and the aging regulator is selected from the group consisting of ACE2, AgRP, CRP, IGFBP3, LeptinR, sTNFRI, ST2, MCP3, PDGFAB, and VEGF [7]. Method.
本発明により、皮膚外用剤や飲食品に含有させるのに好適な、皮膚老化改善剤として有効な成分を探索できるスクリーニング方法が提供される。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a screening method capable of searching for an effective ingredient as a skin aging improving agent, which is suitable for being contained in an external preparation for skin or food and drink.
本発明者らが見出した皮膚老化の新たなメカニズムについて、図１を参照して説明する。
加齢や生活習慣、又は環境等の要因による刺激を受けた皮下脂肪細胞においては、ある種のアディポサイトカインの発現が変動（増加又は減少）する。該アディポサイトカインは、皮膚の老化症状に関与する「老化制御因子」である。例えば、アディポサイトカインの発現の変動によりその活性が増強又は減弱化して、皮膚老化症状の発生に関与する物理量、例えば、コラーゲン量、エラスチン量、ヒアルロン酸量、バーシカン量、オートファジー活性、皮膚支持構造等の変動が引き起こされる。より具体的にはコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、又はバーシカンを分解する酵素が増加してコラーゲン量、エラスチン量、ヒアルロン酸量、又はバーシカン量を減少させたり、オートファジー悪化タンパク質（monodansylcadaverine；ＭＤＣ）が増加してオートファジー活性を減弱したり、皮下組織下部の皮下支持帯の網目構造を構成するタンパク質の発現量が減少して該網目構造が疎になったりする。それらによって、真皮においてシワやタルミ等の皮膚老化症状が発現する。かかる皮膚老化フローにおいて、皮下脂肪細胞における老化制御因子の活性を、前記刺激による変動と逆方向に増強又は減弱化することによって、皮膚老化症状が引き起こされるのを抑制し改善することができる。言い換えると、刺激を受けた皮下脂肪細胞における老化制御因子の変動を抑制させるような物質は、皮膚老化改善剤となり得る。
A new mechanism of skin aging discovered by the present inventors will be described with reference to FIG.
In subcutaneous adipocytes stimulated by factors such as aging, lifestyle, and environment, the expression of certain adipocytokines fluctuates (increases or decreases). The adipocytokine is an "aging regulator" involved in skin aging symptoms. For example, changes in the expression of adipocytocytocytosis enhance or attenuate its activity, and physical quantities involved in the development of skin aging symptoms, such as collagen, elastin, hyaluronic acid, versican, autophagy activity, and skin support structure. Etc. are caused. More specifically, the enzyme that decomposes collagen, elastin, hyaluronic acid, or versican increases to decrease the amount of collagen, elastin, hyaluronic acid, or versican, or the autophagy-deteriorating protein (monodansylcadaverine; MDC) The autophagy activity is increased and attenuated, or the expression level of proteins constituting the network structure of the subcutaneous support zone under the subcutaneous tissue is decreased and the network structure becomes sparse. As a result, skin aging symptoms such as wrinkles and tarmi develop in the dermis. In such a skin aging flow, the activity of the aging regulator in the subcutaneous adipocytes is enhanced or attenuated in the direction opposite to the fluctuation due to the stimulus, whereby the skin aging symptom can be suppressed and improved. In other words, a substance that suppresses fluctuations in aging regulators in stimulated subcutaneous adipocytes can be a skin aging improver.
したがって、本発明の皮膚老化改善剤をスクリーニングする方法は、皮下脂肪細胞中の老化制御因子の活性を指標とすることを特徴とする。 Therefore, the method for screening a skin aging improving agent of the present invention is characterized by using the activity of an aging regulator in subcutaneous adipocytes as an index.
本発明において、老化制御因子は通常、シワやタルミ等の皮膚老化症状の発生に関与す
る物理量を変動させるものをいう。具体的には、コラーゲン量、エラスチン量、ヒアルロン酸量、バーシカン量、オートファジー活性、及び皮膚支持構造（ＲＣ構造）等の変動に関与するアディポサイトカインが好ましく挙げられる。
表１に、皮膚老化の指標と、前記指標の変動に関与するアディポサイトカインの例を示すが、これらに限定されない。
In the present invention, the aging control factor usually refers to a factor that changes a physical quantity involved in the occurrence of skin aging symptoms such as wrinkles and tarmi. Specifically, adipocytokines involved in changes in collagen amount, elastin amount, hyaluronic acid amount, versican amount, autophagy activity, skin support structure (RC structure) and the like are preferably mentioned.
Table 1 shows an index of skin aging and examples of adipocytokines involved in the fluctuation of the index, but is not limited thereto.
コラーゲンやエラスチンは、皮膚構造の支持体としての機能と力学的役割を担っている真皮の９０％以上を構成する線維タンパク質であり、束化した線維会合体として存在し、真皮のほぼ全層に絡み合って網目のような線維状構造を形成している。一般に、加齢や紫外線によって上記線維タンパク質の分解酵素が増加したりして、コラーゲン量やエラスチン量の減少が引き起こされ、真皮層が薄くなったり緩んだりする。また、ヒアルロン酸は、皮膚内部で貯水の役割を担っており、一般に加齢によってその現象が引き起こされる。
バーシカンは、真皮が作られるときに線維芽細胞が働くための足場となるプロテオグリカンで、加齢に伴い減少し、皮膚老化や弾性力低下を招くことが知られている（フレグランスジャーナル 44(1): 88 -88, 2016参照）。後述の実施例に示されるように、特定の老化制御因子が活性化すると、バーシカン分解酵素が増加し、バーシカン量の減少が引き起こされる。
オートファジーは、細胞内のタンパク質及び細胞小器官を分解するための仕組みの一つであり、オートファジー活性が亢進すると抗老化作用が働くことが知られている（N. Engl. J. Med., 2013 Feb 14;368(7):651-62.参照）。後述の実施例に示されるように、特定の老化制御因子が活性化すると、オートファジー悪化タンパク質（ＭＤＣ）が増加し、オートファジー活性が抑制される。
皮膚支持構造（ＲＣ構造）は、皮下組織下部の皮下支持帯（retinacula cutis；ＲＣ）と呼ばれる網目構造をいい、該構造が疎になると皮膚深部の弾力性が低下し、タルミが引き起こされる（フレグランスジャーナル 44(2), 23-27, 2016参照）。後述の実施例に示
されるように、特定の老化制御因子が活性化すると、ＲＣ構造を構成するタンパク質の発現量が減少し、ＲＣ構造の弱化（網目構造の疎化）が生じる。
Collagen and elastin are fibrous proteins that make up more than 90% of the dermis, which functions as a support for skin structure and plays a mechanical role. They exist as bundled fiber aggregates and are present in almost all layers of the dermis. They are intertwined to form a mesh-like fibrous structure. In general, aging and ultraviolet rays increase the amount of fibrous protein-degrading enzymes, causing a decrease in the amount of collagen and elastin, resulting in thinning or loosening of the dermis layer. In addition, hyaluronic acid plays a role of storing water inside the skin, and the phenomenon is generally caused by aging.
Versican is a proteoglycan that serves as a scaffold for fibroblasts to work when the dermis is made, and is known to decrease with age, leading to skin aging and decreased elasticity (Fragrance Journal 44 (1)). : 88 -88, 2016). As shown in the examples below, activation of certain aging regulators increases versican-degrading enzymes, causing a decrease in versican content.
Autophagy is one of the mechanisms for degrading intracellular proteins and organelles, and it is known that when autophagy activity is enhanced, anti-aging action works (N. Engl. J. Med. , 2013 Feb 14; 368 (7): 651-62.). As shown in Examples below, activation of certain aging regulators increases autophagy-deteriorating proteins (MDCs) and suppresses autophagy activity.
The skin support structure (RC structure) refers to a network structure called the subcutaneous support band (retinacula cutis; RC) in the lower part of the subcutaneous tissue, and when the structure becomes sparse, the elasticity of the deep part of the skin decreases and tarmi is caused (fragrance). See Journal 44 (2), 23-27, 2016). As shown in Examples described later, when a specific aging regulator is activated, the expression level of proteins constituting the RC structure is reduced, and the RC structure is weakened (the network structure is sparse).
また、本発明において、老化制御因子は、皮下脂肪細胞への刺激によってその発現量が変動するものが好ましい。
一般に、生活習慣や加齢等により血中の諸成分の存在量は変動するところ、本発明者らは皮下脂肪細胞が血中濃度の増加又は減少する成分による刺激（血中刺激）を受けると、ある種のアディポサイトカインの発現量が変動することを見出した。具体的には、血中刺激によって、アディポサイトカインのタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量が、増加又は減少する。
Further, in the present invention, it is preferable that the expression level of the aging regulator varies depending on the stimulation of subcutaneous adipocytes.
In general, the abundance of various components in blood fluctuates due to lifestyle, aging, etc., but the present inventors receive stimulation (blood stimulation) by components that increase or decrease the blood concentration of subcutaneous adipocytes. , Found that the expression level of certain adipocytokines fluctuates. Specifically, blood stimulation increases or decreases the expression level of the gene encoding the adipocytokine protein or the protein.
前記血中刺激としては、生活習慣又は老化によって量が変動する物質が好ましく、具体的には、特に限定されないが、過酸化水素、グルコース、酸化ＬＤＬ、エストラジオール、カフェイン、アセトアルデヒド、ビタミン類、オレキシン、プロゲステロン、テストステロン、ＤＨＥＡ、メチルグリオキサール等が好ましく挙げられる。
過酸化水素、グルコース、及び酸化ＬＤＬは、加齢により血中濃度が増加し、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、ＤＨＥＡは、加齢により血中濃度が減少することが知られている。また、カフェイン、アセトアルデヒド、ビタミン類、オレキシン、メチルグリオキサールは、摂食行動により血中濃度が変動し得る成分である。
The blood stimulus is preferably a substance whose amount varies depending on lifestyle or aging, and specifically, but not particularly limited, hydrogen peroxide, glucose, oxidized LDL, estradiol, caffeine, acetaldehyde, vitamins, orexin. , Progesterone, testosterone, DHEA, methylglyoxal and the like are preferable.
It is known that hydrogen peroxide, glucose, and oxidized LDL increase in blood concentration with aging, and estradiol, progesterone, testosterone, and DHEA decrease in blood concentration with aging. In addition, caffeine, acetaldehyde, vitamins, orexin, and methylglyoxal are components whose blood concentrations can fluctuate due to feeding behavior.
本発明において、特定の刺激によって発現量が変動する老化制御因子の組み合わせは、例えば表２に示されるものが挙げられる。
皮下脂肪細胞に刺激として過酸化水素を添加すると、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）の発現は増加し、成長ホルモン１（ＧＨ１）、オステオプロテグリン（ＯＰＧ）の発現は減少する。
皮下脂肪細胞に刺激としてがグルコースを添加すると４−１ＢＢ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、活性化調節された発現および分泌正常Ｔ細胞（ＲＡＮＴＥＳ）、血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ）、ストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、ＴＮＦスーパーファミリー１型受容体（ｓＴＮＦＲＩ）、ＴＮＦスーパーファミリー２型受容体（ｓＴＮＦＲＩＩ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、の発現は増加し、インターロイキン−６ｓＲ（ＩＬ−６ｓＲ）の発現は減少する。
皮下脂肪細胞に刺激として酸化ＬＤＬを添加すると、４−１ＢＢ、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＩＧＦＢＰ２、ＭＳＰαの発現は増加し、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、及びプラスミノーゲン活性化抑制因子（ＰＡＩ−１）の発現は減少する。
皮下脂肪細胞に刺激としてエストラジオールを添加すると、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、アグーチ関連ペプチド（ＡｇＲＰ）、ＣＲＰ、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、レプチン受容体（ＬｅｐｔｉｎＲ）、ｓＴＮＦＲＩ、ＳＴ２、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ３）、血小板由来成長因子ＡＢ（ＰＤＧＦＡＢ）、ＶＥＧＦの発現は減少する。
In the present invention, examples of combinations of aging regulators whose expression levels vary depending on a specific stimulus include those shown in Table 2.
When hydrogen peroxide is added to subcutaneous adipocytes as a stimulus, the expression of interleukin-8 (IL-8) and leptin increases, and the expression of growth hormone 1 (GH1) and osteoprotegrin (OPG) decreases. do.
When glucose is added as a stimulus to subcutaneous fat cells, 4-1BB, C-receptor protein (CRP), insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP2), interleukin-12 (IL-12), activated and regulated expression And secretory normal T cells (RANTES), serum amyloid A protein (SAA), stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), TNF superfamily type 1 receptor (sTNFRI), TNF superfamily type 2 receptor (sTNFRII), Expression of vascular endothelial cell growth factor (VEGF) is increased and expression of interleukin-6sR (IL-6sR) is decreased.
Addition of oxidized LDL as a stimulus to subcutaneous adipocytes increases the expression of 4-1BB, Fas ligand (FasL), IGFBP2, MSPα, interferon gamma (IFNγ), and plasminogen activator (PAI-1). Expression is reduced.
When estradiol is added as a stimulus to subcutaneous fat cells, angiotensin converting enzyme 2 (ACE2), agouti-related peptide (AgRP), CRP, insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP3), leptin receptor (LeptinR), sTNFRI, ST2, The expression of monocytrogenic protein 3 (MCP3), platelet-derived growth factor AB (PDGFAB), and VEGF is reduced.
本発明のスクリーニング方法において指標となる老化制御因子の活性とは、通常は老化制御因子の発現量である。ここで、発現量とは、該遺伝子のｍＲＮＡの転写量と、該遺伝子がコードするタンパク質の翻訳量との何れかを指すものとする。 The activity of the aging regulator, which is an index in the screening method of the present invention, is usually the expression level of the aging regulator. Here, the expression level refers to either the transcription amount of mRNA of the gene or the translation amount of the protein encoded by the gene.
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様においては、刺激及び被験物質を添加した皮下脂肪細胞における老化制御因子の発現量が、刺激を添加し被験物質を添加しなかった細胞における発現量（コントロール）と比較して大きい又は小さい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定される。 In a preferred embodiment of the screening method of the present invention, the expression level of the aging control factor in the subcutaneous adipocytes to which the stimulus and the test substance were added is compared with the expression level (control) in the cells to which the stimulus was added and the test substance was not added. When it is large or small, it is determined that the test substance has an effect of improving skin aging.
ここで、加齢により血中で増加する刺激の添加により発現量が増加する老化制御因子の場合は、被験物質を添加したときの発現量がコントロールより小さい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定される。反対に、加齢により血中で増加する刺激の添加により発現量が減少する老化制御因子の場合は、被験物質を添加したときの発現量がコントロールより大きい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定される。
また、加齢により血中で減少する刺激の添加により発現量が増加する老化制御因子の場合は、被験物質を添加したときの発現量がコントロールより大きい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定される。反対に、加齢により血中で減少する刺激の添加により発現量が減少する老化制御因子の場合は、被験物質を添加したときの発現量がコントロールより小さい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定される。
Here, in the case of an aging regulator whose expression level increases due to the addition of a stimulus that increases in blood with aging, when the expression level when the test substance is added is smaller than the control, the test substance improves skin aging. It is determined to have an action. On the contrary, in the case of an aging regulator whose expression level decreases due to the addition of a stimulus that increases in blood with aging, when the expression level when the test substance is added is larger than the control, the test substance improves skin aging. It is determined to have an action.
Further, in the case of an aging regulator whose expression level increases due to the addition of a stimulus that decreases in blood with aging, when the expression level when the test substance is added is larger than the control, the test substance has an effect of improving skin aging. Is determined to have. On the contrary, in the case of an aging regulator whose expression level decreases due to the addition of a stimulus that decreases in blood with aging, when the expression level when the test substance is added is smaller than the control, the test substance improves skin aging. It is determined to have an action.
老化制御因子であるタンパク質をコードする遺伝子の発現量は、任意の方法を用いて測定することができる。例えば、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、上述したアディポサイトカインをコードするヒトの遺伝子配列はそれぞれ公開されており、当業者は適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。
また、例えば、当該タンパク質の細胞膜上の量を、常法で、例えば抗体を用いる免疫学的手法等で測定して、遺伝子の発現量としてもよい。
The expression level of the gene encoding the protein, which is an aging regulator, can be measured by any method. For example, PCR is performed using a DNA fragment having a sequence that specifically binds to the sequence of the gene as a primer to perform quantitative detection. The human gene sequences encoding the above-mentioned adipocytokines have been published, and those skilled in the art can appropriately design primers and use them for PCR.
Further, for example, the amount of the protein on the cell membrane may be measured by a conventional method, for example, by an immunological method using an antibody, and used as the expression level of the gene.
本発明のスクリーニング方法に用いる細胞としては、皮下脂肪細胞を用いる。
細胞の培養の条件としては、通常の培養条件の他、本発明のスクリーニング方法の実行を妨げない、具体的に老化制御因子の発現量の測定を妨げない培養条件であれば、特段の限定なく適用することができる。
Subcutaneous adipocytes are used as the cells used in the screening method of the present invention.
The cell culture conditions are not particularly limited as long as they do not interfere with the execution of the screening method of the present invention, specifically, the measurement of the expression level of the aging regulator, in addition to the normal culture conditions. Can be applied.
本発明のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、純物質、動植物由来の抽出物、またはそれらの混合物等のいずれであってもよい。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物又は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花、花蕾、果実等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される一種又は二種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位又はその乾燥物１質量部に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却した後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
The test substance targeted by the screening method of the present invention may be a pure substance, an extract derived from animals and plants, or a mixture thereof.
The animal or plant-derived extract shall mean not only the animal or plant-derived extract itself, but also the fraction of the extract, the purified fraction, the extract or fraction, and the solvent-removed product of the purified product. Examples of the plant-derived extract include native or grown plants, extracts using those sold as raw materials for Chinese herbal medicine, and commercially available extracts.
In the extraction operation, in addition to using the whole plant part, parts such as the plant body, the above-ground part, the rhizome part, the tree trunk, the leaf part, the stem part, the flower, the flower bud, and the fruit can be used, but these are crushed in advance. Alternatively, it is preferable to cut into small pieces to improve the extraction efficiency. Extraction solvents include water, alcohols such as ethanol, isopropyl alcohol and butanol, polyhydric alcohols such as 1,3-butanediol and polypropylene glycol, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, and ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran. One or more selected from polar solvents such as, etc. can be exemplified as suitable ones. As a specific extraction method, for example, 1 to 30 parts by mass of a solvent is added to 1 part by mass of a part used for extraction of a plant or the like or a dried product thereof, and the solvent is added at room temperature for several days at a temperature near the boiling point. If there is, a method of immersing for several hours, cooling to room temperature, removing insoluble matter and / or solvent if desired, and fractionally purifying by column chromatography or the like can be mentioned.
本発明のスクリーニング方法における手順の一例を以下に挙げるが、本発明の趣旨を逸
脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。
まず、皮下脂肪細胞に刺激物質を添加し、１〜２時間インキュベーションする。その後、被検物質を添加し、２４時間インキュベーションする。その後、該細胞からｍＲＮＡを抽出し、指標とする老化制御因子をコードする遺伝子の発現量を、該遺伝子を特異的に検出するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、定量的に測定する。コントロールとして同刺激物質を添加し被検物質を添加しなかった細胞においても該遺伝子の発現量を測定する。被検物質を添加した細胞における該遺伝子の発現量が、被検物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量（コントロール）に対して変動した場合、前記被検物質は皮膚老化改善作用を有すると判定する。該判定された物質は、マッサージ用皮膚外用剤に好適に含有し得る皮膚老化改善剤となり得る。
なお、発現量の変動の程度としては、発現量増加の場合は、コントロールに対して１２０％以上が好ましく、１３５％以上がより好ましく、１５０％以上がさらに好ましい。発現量減少の場合は、コントロールに対して８０％以下が好ましく、６５％以下がより好ましく、５０％以下がさらに好ましい。
An example of the procedure in the screening method of the present invention is given below, but the content is not limited to the following as long as the gist of the present invention is not deviated, and the procedure can be appropriately modified.
First, a stimulant is added to subcutaneous adipocytes and incubated for 1 to 2 hours. Then, the test substance is added and incubated for 24 hours. Then, mRNA is extracted from the cells, and the expression level of the gene encoding the aging regulator as an index is quantitatively measured by performing RT-PCR using a primer that specifically detects the gene. The expression level of the gene is also measured in cells to which the stimulant is added as a control and the test substance is not added. When the expression level of the gene in the cells to which the test substance is added fluctuates with respect to the expression level (control) of the gene in the cells to which the test substance is not added, the test substance has an effect of improving skin aging. Determined to have. The determined substance can be a skin aging improving agent that can be suitably contained in a skin external preparation for massage.
As for the degree of variation in the expression level, in the case of an increase in the expression level, 120% or more is preferable, 135% or more is more preferable, and 150% or more is further preferable with respect to the control. In the case of a decrease in the expression level, 80% or less is preferable, 65% or less is more preferable, and 50% or less is further preferable with respect to the control.
皮膚老化症状が改善されたことは、例えば、皮膚老化改善剤を適用した被験者の自覚による評価、画像解析によるシワやタルミの評価、皮膚の粘弾物性の評価、皮膚の水分保持量の評価など、周知の方法によって確認することができる。 Improvements in skin aging symptoms include, for example, subjective evaluation of subjects who applied skin aging improving agents, evaluation of wrinkles and tarmi by image analysis, evaluation of skin viscous properties, evaluation of skin water retention, etc. , Can be confirmed by a well-known method.
本発明のスクリーニング方法により皮膚老化症状を改善する作用を有すると判定された物質（皮膚老化改善剤）は、任意の調製方法により組成物に含有させることができ、かかる組成物としては、例えば皮膚外用組成物や、飲食品組成物等を好適に挙げられる。かかる組成物は、抗老化用途に好ましく適用できる。
本発明のスクリーニングにより皮膚老化症状を改善する作用を有すると判定された物質（皮膚老化改善剤）は、皮下脂肪細胞が受ける血中刺激に起因する皮膚老化の発生をターゲットとする新たな機序で皮膚老化症状を改善する点で、新たなアプローチによる有効な抗老化用組成物の配合成分となり得る。
A substance (skin aging improving agent) determined to have an action of improving skin aging symptoms by the screening method of the present invention can be contained in a composition by any preparation method, and such a composition includes, for example, skin. External compositions, food and drink compositions and the like are preferably mentioned. Such compositions are preferably applicable for anti-aging applications.
The substance (skin aging improving agent) determined to have an action of improving skin aging symptoms by the screening of the present invention is a new mechanism targeting the occurrence of skin aging caused by blood irritation received by subcutaneous fat cells. In terms of improving skin aging symptoms, it can be a compounding ingredient of an effective anti-aging composition by a new approach.
本発明に係る抗老化用組成物における、皮膚老化改善剤の含有量（配合量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常１５質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％である。皮膚老化改善剤の含有量（配合量）が少なすぎると所望の効果が得られにくい場合があり、多すぎると効果が頭打ちになるばかりか組成物の処方の自由度を損なう場合があるからである。また、組成物に含有させる皮膚老化改善剤の種類は、１種類のみでなく２種類以上であってもよい。 The content (blending amount) of the skin aging improving agent in the anti-aging composition according to the present invention is usually 0.00001% by mass or more, preferably 0.0001% by mass or more, and more preferably 0.001% by mass. It is usually 15% by mass or less, preferably 10% by mass or less, and more preferably 5% by mass. If the content (blending amount) of the skin aging improving agent is too small, it may be difficult to obtain the desired effect, and if it is too large, the effect may reach a plateau and the degree of freedom in formulating the composition may be impaired. be. Further, the type of the skin aging improving agent contained in the composition may be not only one type but also two or more types.
本発明に係る抗老化用組成物の製造に際しては、化粧料、医薬部外品、医薬品などの製剤化や、飲食品等の経口組成物の製造で通常使用される任意成分を配合することができる。
例えば、皮膚外用組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール等の多価アルコール類、増
粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を任意に配合することができる。
In the production of the anti-aging composition according to the present invention, it is possible to add an optional ingredient usually used in the formulation of cosmetics, quasi-drugs, pharmaceuticals, etc., and the production of oral compositions such as foods and drinks. can.
For example, in the case of external composition for skin, hydrocarbons such as squalane, vaseline and microcrystalin wax, esters such as jojoba oil, carnauba wax and octyldodecyl oleate, triglycerides such as olive oil, beef fat and coconut oil, Fatty acids such as stearic acid, oleic acid and retinoic acid, higher alcohols such as oleyl alcohol, stearyl alcohol and octyldodecanol, anionic surfactants such as sulfosuccinate and sodium polyoxyethylene alkyl sulfate, and both sexes such as alkyl betaine salts. Surfactants, cationic surfactants such as dialkylammonium salts, sorbitan fatty acid esters, fatty acid monoglycerides, these polyoxyethylene adducts, polyoxyethylene alkyl ethers, nonionic surfactants such as polyoxyethylene fatty acid esters, etc. , Polyethylene glycol, glycerin, polyhydric alcohols such as 1,3-butanediol, thickening / gelling agents, antioxidants, ultraviolet absorbers, coloring agents, preservatives, powders, etc. can be arbitrarily blended. can.
また、本発明に係る抗老化用組成物には、本発明のスクリーニングにより皮膚老化症状を改善する作用を有すると判定された物質（皮膚老化改善剤）以外の皮膚老化改善用成分も配合してもよい。
本発明に係る抗老化用組成物は、常法に従って前述の成分を処理・配合することにより製造することができる。その形態は、例えば、皮膚外用組成物であれば、ローション剤型、乳化剤型、オイル剤型等任意の剤型とすることができ、経口組成物であれば、錠剤、顆粒、散剤、液剤等の剤型の他、食品や飲料なども任意に採用できる。
In addition, the anti-aging composition according to the present invention also contains a skin aging improving component other than a substance (skin aging improving agent) determined to have an action of improving skin aging symptoms by the screening of the present invention. May be good.
The anti-aging composition according to the present invention can be produced by treating and blending the above-mentioned components according to a conventional method. The form can be any dosage form such as lotion type, emulsifier type, oil type, etc. in the case of external composition for skin, and tablets, granules, powders, liquids, etc. in the case of oral composition. In addition to the dosage form of, foods and beverages can be used arbitrarily.
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples as long as the gist thereof is not exceeded.
＜試験例１＞刺激によるアディポサイトカイン発現への影響の確認
以下の手順により、刺激を与えたときの皮下脂肪細胞から分泌されるタンパク質の変動を評価した。
増殖培地（CELL製）を用い、正常ヒト皮下脂肪細胞を２４ウェルプレートに１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、３７℃・５％ＣＯ2環境下で２日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、分化培地（CELL社製）に交換し、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、１０日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後
、維持培地（CELL社製）に交換し、６時間培養後、表３に示す刺激のいずれか又は溶媒対照を含む維持培地を加え、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、表３に示す時間培養した。培
養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、維持培地（CELL社製）に交換し、４８時間培養後、培養上清を回収し、Human Adipocytokine(Adipokine) Antibody Array kit（RayBiotech製）を用いて、抗原抗体反応により検出した。溶媒対照群を１とした場合の、
相対発現量を表４に示す。
<Test Example 1> Confirmation of the effect of stimulation on adipocytokine expression The changes in protein secreted from subcutaneous adipocytes when stimulated were evaluated by the following procedure.
Normal human subcutaneous adipocytes were seeded on a 24-well plate at 1.0 × 10 5 cells / well using a growth medium (manufactured by CELL) and cultured for 2 days in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. After culturing, the medium was removed, the cells were washed with PBS, replaced with a differentiation medium (manufactured by CELL), and cultured for 10 days in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. After culturing, the medium was removed, the cells were washed with PBS, replaced with a maintenance medium (manufactured by CELL), and after culturing for 6 hours, any of the stimuli shown in Table 3 or a maintenance medium containing a solvent control was added. The cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment for the time shown in Table 3. After culturing, the medium was removed, the cells were washed with PBS, replaced with a maintenance medium (manufactured by CELL), and after culturing for 48 hours, the culture supernatant was collected, and the Human Adipocytokine (Adipokine) Antibody Array kit (manufactured by Ray Biotech) was collected. ) Was detected by an antigen-antibody reaction. When the solvent control group is 1,
The relative expression levels are shown in Table 4.
＜試験例２＞アディポサイトカインの皮膚老化への影響の確認１
以下の手順により、アディポサイトカインが皮膚老化に影響を及ぼすのか評価した。
ＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）又はTenocyte Culture Medium（Ｄｓファーマバイオ
メディカル社製）を用い、正常ヒト真皮線維芽細胞又は正常ヒト腱細胞を２４ウェルプレ−トに３．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル又は２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、３７℃・５％ＣＯ2環境下で１日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞
を洗浄後、アディポサイトカイン（表５に示すリコンビナントタンパク質）又は溶媒対照を含む、ＤＭＥＭ培地又はTenocyte Culture Mediumを加え、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、２４時間又は４８時間培養した。
RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて上記正常ヒト真皮線維芽細胞又は正常ヒ
ト腱細胞のｍＲＮＡを抽出し、Superscript VILO DNA synthesis Kit（Lifetechnologies製）を用いてｃＤＮＡを合成後、バーシカン・バーシカン分解酵素又はＲＣ構造タンパク質の発現量をリアルタイムｑＰＣＲ法にて測定した。また、内在性コントロール遺伝子であるＡＣＴＢのｍＲＮＡ発現量を同様に測定した。測定には、QuantiFact SYBR GREEN PCR kit（ＱＩＡＧＥＮ製）及び表６のプライマーを用いた。
変動したタンパク質のリコンビナントタンパク質添加群及び溶媒対照群における各ｍＲＮＡ発現量について、ＡＣＴＢの発現量による補正を行い、溶媒対照群の各ｍＲＮＡ発現量を１とした場合の、変動したタンパク質のリコンビナントタンパク質添加群の各ｍＲＮＡ発現量を算出した。結果の一部を、次の試験例３の結果と共に表７に示す。
<Test Example 2> Confirmation of the effect of adipocytokines on skin aging 1
The following procedure was used to evaluate whether adipocytokines affect skin aging.
Using DMEM medium (manufactured by SIGMA) or Tenocyte Culture Medium (manufactured by Ds Pharma Biomedical), normal human dermal fibroblasts or normal human tendon cells were added to a 24-well plate at 3.0 × 10 4 cells / well or 2 Seeded at 0.0 × 10 4 cells / well and cultured for 1 day in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. After culturing, the medium is removed, the cells are washed with PBS, DMEM medium or Tenocyte Culture Medium containing adipocytokine (recombinant protein shown in Table 5) or solvent control is added, and the temperature is 37 ° C. in a 5% CO 2 environment. Was cultured for 24 hours or 48 hours.
After extracting mRNA of the above normal human dermal fibroblasts or normal human tendon cells using RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN) and synthesizing cDNA using Superscript VILO DNA synthesis Kit (manufactured by Lifetechnologies), versican-versican degrading enzyme Alternatively, the expression level of RC structural protein was measured by the real-time qPCR method. In addition, the mRNA expression level of ACTB, which is an endogenous control gene, was measured in the same manner. For the measurement, the QuantiFact SYBR GREEN PCR kit (manufactured by QIAGEN) and the primers shown in Table 6 were used.
The expression level of each mRNA in the recombinant protein addition group and the solvent control group of the fluctuating protein was corrected by the expression level of ACTB, and when the expression level of each mRNA in the solvent control group was set to 1, the recombinant protein addition of the fluctuating protein was added. The expression level of each mRNA in the group was calculated. Some of the results are shown in Table 7 together with the results of the following Test Example 3.
＜試験例３＞アディポサイトカインの皮膚老化への影響の確認２
以下の手順により、変動したタンパク質が皮膚老化に影響を及ぼすのか評価した。
ＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用い、正常ヒト真皮線維芽細胞を９６ウェルプレ−トに５．０×１０3ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、３７℃・５％ＣＯ2環境下で１日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、アディポサイトカイン（表５に示すリコンビナントタンパク質）又は溶媒対照を含むＤＭＥＭ培地を加え、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、２４時間又は４８時間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて
細胞を洗浄後、Autophagy/Cytotoxicity Dual Staining Kit（Cayman Chemical製）を用
いて、アディポサイトカイン添加群又は溶媒対照群のＭＤＣ量を測定した。変動したタンパク質のリコンビナントタンパク質添加群及び溶媒対照群における各ＭＤＣ量について、溶媒対照群の各ＭＤＣ量で補正を行い、溶媒対照群の各ＭＤＣ量を１とした場合の、変動したタンパク質のリコンビナントタンパク質添加群の各ＭＤＣ量を算出した。結果の一部を、試験例２の結果と共に表７に示す。
<Test Example 3> Confirmation of the effect of adipocytokines on skin aging 2
The following procedure was used to evaluate whether the fluctuating protein affects skin aging.
Normal human dermal fibroblasts were seeded in 96-well plates at 5.0 × 10 3 cells / well using DMEM medium (manufactured by SIGMA), and cultured for 1 day in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. After culturing, the medium was removed, the cells were washed with PBS, DMEM medium containing adipocytokine (recombinant protein shown in Table 5) or solvent control was added, and the cells were added at 37 ° C. and 5% CO 2 environment for 24 hours. Alternatively, the cells were cultured for 48 hours. After culturing, the medium was removed, the cells were washed with PBS, and the amount of MDC in the adipocytokine-added group or the solvent control group was measured using the Autophagy / Cytotoxicity Dual Staining Kit (manufactured by Cayman Chemical). Recombinant protein of fluctuating protein Recombinant protein of fluctuating protein when each MDC amount in the solvent control group and the solvent control group was corrected by each MDC amount in the solvent control group and each MDC amount in the solvent control group was set to 1. The amount of each MDC in the addition group was calculated. Some of the results are shown in Table 7 together with the results of Test Example 2.
＜実施例１＞皮膚老化改善剤のスクリーニング
以下の手順で、老化制御因子（アディポサイトカイン）の遺伝子発現を指標に、皮膚老化改善剤のスクリーニングを行った。
増殖培地（CELL社製）を用い、正常ヒト皮下脂肪細胞を２４ウェルプレートに１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、３７℃・５％ＣＯ2環境下で２日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、分化培地（CELL社製）に交換し、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、１０日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄
後、表３に示す刺激物質又は溶媒対照を含む維持培地（CELL社製）を加え、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、表３に示す時間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を
洗浄後、エキス又は溶媒対照を含む維持培地を加え、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、２
４時間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、QIAzol Lysis Reagent（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて上記正常ヒト皮下脂肪細胞のｍＲＮＡを抽出し、Superscript VILO DNA synthesis Kit（Lifetechnologies社製）を用いてｃＤＮＡを合成後、皮膚老化に影響するタンパク質の発現量をリアルタイムｑＰＣＲ法にて測定した。また、内在性コントロール遺伝子であるＡＣＴＢのｍＲＮＡ発現量を同様に測定した。測定には、QuantiFact SYBR GREEN PCR kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）及び表８のプライマーを用いた。
エキス添加群及び溶媒対照群における各ｍＲＮＡ発現量について、ＡＣＴＢの発現量による補正を行い、溶媒対照群の各ｍＲＮＡ発現量を１とした場合の、エキス添加群の各ｍＲＮＡ発現量を算出した。結果の一部を実施例１の結果と共に表９〜１１に示す。
<Example 1> Screening of skin aging improving agent A skin aging improving agent was screened using the gene expression of an aging regulator (adipocytokine) as an index according to the following procedure.
Normal human subcutaneous adipocytes were seeded on a 24-well plate at 1.0 × 10 5 cells / well using a growth medium (manufactured by CELL), and cultured for 2 days in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. After culturing, the medium was removed, the cells were washed with PBS, replaced with a differentiation medium (manufactured by CELL), and cultured for 10 days in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. After culturing, the medium was removed, the cells were washed with PBS, a maintenance medium (manufactured by CELL) containing the stimulant or solvent control shown in Table 3 was added, and the table was prepared in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. The cells were cultured for the time shown in 3. After incubation, the medium was removed and the cells washed, added maintenance medium containing extract or vehicle control, under 37 ℃ · 5% CO 2 environment at PBS, 2
Incubated for 4 hours. After culturing, the medium is removed, the cells are washed with PBS, the mRNA of the above normal human subcutaneous adipocytes is extracted using QIAzol Lysis Reagent (manufactured by QIAGEN), and the Superscript VILO DNA synthesis Kit (manufactured by Lifetechnologies) is used. After synthesizing the cDNA using the cDNA, the expression level of the protein affecting skin aging was measured by the real-time qPCR method. In addition, the mRNA expression level of ACTB, which is an endogenous control gene, was measured in the same manner. For the measurement, the QuantiFact SYBR GREEN PCR kit (manufactured by QIAGEN) and the primers shown in Table 8 were used.
Each mRNA expression level in the extract-added group and the solvent control group was corrected by the expression level of ACTB, and each mRNA expression level in the extract-added group was calculated when each mRNA expression level in the solvent control group was set to 1. Some of the results are shown in Tables 9-11 together with the results of Example 1.
本発明のスクリーニング方法により、皮膚老化改善剤として有効な成分を探索することができる。かかる皮膚老化改善剤は、抗老化用途の皮膚外用剤や飲食品に好適に含有させることができるため、産業上非常に有用である。 According to the screening method of the present invention, an effective ingredient as a skin aging improving agent can be searched for. Such a skin aging improving agent is very useful industrially because it can be suitably contained in an external preparation for skin for anti-aging use and foods and drinks.
Claims (9)
前記老化制御因子が、皮下脂肪細胞への刺激によってその発現量が変動するものであり、
前記老化制御因子の活性が、前記因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、前記刺激及び被験物質を添加した皮下脂肪細胞における前記発現量が、前記刺激を添加し被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して大きい又は小さい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定する、方法（ただし、前記刺激がグルコースである場合を除く）。 It is a method of screening a skin aging improving agent using the activity of an aging regulator in subcutaneous adipocytes as an index.
The expression level of the aging regulator varies depending on the stimulation of subcutaneous adipocytes.
The activity of the aging regulator is the expression level of the gene encoding the protein constituting the factor or the protein, and the expression level in the subcutaneous adipocytes to which the stimulus and the test substance are added is the test to which the stimulus is added. A method for determining that the test substance has an effect of improving skin aging when the expression level is large or small compared to the expression level in cells to which the substance has not been added (except when the stimulus is glucose).
前記老化制御因子が、４−１ＢＢ、ＦａｓＬ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＳＰα、ＩＦＮγ、及びＰＡＩ−１からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。 The stimulus is oxidized LDL and
The method of claim 5 , wherein the aging regulator is selected from the group consisting of 4-1BB, FasL, IGFBP2, MSPα, IFNγ, and PAI-1.
前記老化制御因子が、ＩＬ−８、Ｌｅｐｔｉｎ、ＧＨ１、及びＯＰＧからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。 The stimulus is hydrogen peroxide
The method of claim 5 , wherein the aging regulator is selected from the group consisting of IL-8, Leptin, GH1, and OPG.
前記老化制御因子が、ＡＣＥ２、ＡｇＲＰ、ＣＲＰ、ＩＧＦＢＰ３、ＬｅｐｔｉｎＲ、ｓＴＮＦＲＩ、ＳＴ２、ＭＣＰ３、ＰＤＧＦＡＢ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。 The stimulus is estradiol
The method of claim 5 , wherein the aging regulator is selected from the group consisting of ACE2, AgRP, CRP, IGFBP3, LeptinR, sTNFRI, ST2, MCP3, PDGFB, and VEGF.
前記老化制御因子の活性が、前記因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、刺激及び被験物質を添加した皮下脂肪細胞における前記発現量が、前記刺激を添加し被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して大きい又は小さい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定する方法であり、 The activity of the aging control factor is the expression level of the gene encoding the protein constituting the factor or the protein, and the expression level in the subcutaneous adipocytes to which the stimulus and the test substance are added is the test substance to which the stimulus is added. This is a method for determining that the test substance has an effect of improving skin aging when the expression level is large or small as compared with the expression level in the cells to which the above-mentioned substance is not added.
前記刺激がグルコースであって、 The stimulus was glucose
前記老化制御因子が、４−１ＢＢ、ＣＲＰ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＡＡ、ＳＤＦ−１、ｓＴＮＦＲＩ、ｓＴＮＦＲＩＩ、ＶＥＧＦ、及びＩＬ−６ｓＲからなる群から選択される方法。 A method in which the aging regulator is selected from the group consisting of 4-1BB, CRP, IGFBP2, IL-12, RANTES, SAA, SDF-1, sTNFRI, sTNFRII, VEGF, and IL-6sR.
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