JP6917163B2

JP6917163B2 - 小胞体ストレス軽減用組成物及び該組成物を含む食品、医薬品、飼料

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Publication number: JP6917163B2
Application number: JP2017042318A
Authority: JP
Inventors: 荒井　達也; 達也荒井; 聡志日暮; 森田　如一; 如一森田
Original assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Current assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2017-03-07
Publication date: 2021-08-11
Anticipated expiration: 2037-03-07
Also published as: JP2018145140A

Description

本発明は、小胞体ストレス軽減用組成物及び該組成物を含む食品、医薬品、飼料に関する。

小胞体とは、細胞内に存在する膜の約半分を占める小器官であり、タンパク質合成、膜脂質合成、カルシウム貯蔵など、多岐にわたる生理機能を有している。
分泌タンパク質や膜タンパク質は小胞体膜に結合したリボソームにおいて合成され、小胞体に挿入される。これらのタンパク質は、小胞体において分子シャペロンなどの作用により様々な化学修飾を受け、糖鎖の付与、ジスルフィド結合の形成などを経て適正な立体構造が与えられる。
このとき、正常な立体構造を持ったタンパク質のみがゴルジ装置以降の分泌経路に進み、細胞膜や細胞外へと輸送され、異常な立体構造を持ったタンパク質は小胞体関連分解により処分される。

虚血、低酸素、熱ショック、遺伝子変異などの要因により、小胞体内に正常な高次構造を持たないタンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）が蓄積し、小胞体の機能障害を引き起こすことが知られている（小胞体ストレス）。
細胞はこの小胞体ストレスに対して、小胞体の状態を正常に向かわせるための防御システムである小胞体ストレス応答（ｕｎｆｏｌｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅ）を働かせる。
小胞体ストレス応答は、ストレスが軽度のときは、タンパク質翻訳の抑制による小胞体への流入量の抑制、分子シャペロンの誘導による変性タンパク質の修復、修復できないタンパク質の小胞体外への排出と分解を行うことにより細胞機能を維持する方向へと向かわせるが、過度なストレスを受けたときにはアポトーシスが誘導され個体の保護が優先される。

近年、小胞体ストレスおよび小胞体ストレス応答の破綻は、パーキンソン病やアルツハイマー病、ポリグルタミン病、プリオン病、筋萎縮生側索硬化症（ＡＬＳ）等に代表される神経変性疾患、糖尿病、脂肪肝など非常に多様な疾患の発症に関わっていることが報告されている。
従って、小胞体ストレスを軽減することは、上記疾患の予防または治療に有効であることが期待される。

上記のことから、小胞体ストレスを軽減する食品、医薬品、飼料の開発が望まれている。特許文献１は黒米を有効成分とする小胞体ストレス軽減剤を開示している。特許文献２はポリヌクレオチドを有効成分とする小胞体ストレス調節剤を開示している。
また、非特許文献１は、乳由来リン脂質混合物が小胞体ストレスにより誘導される神経細胞死を抑制することを開示している。
しかし、小胞体ストレスを軽減する組成物として、ホエイタンパク質の一種であるβ‐ラクトグロブリンとリン脂質とを含む組成物を開示した文献等はない。さらに該組成物を含む食品、医薬品、飼料を開示した文献等もない。

特開２０１３−１５１４５９号公報ＷＯ２０１３／０４７８１５号パンフレット

Ｎａｇａｉ，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１４，４６６−４７１，２０１２

本発明は、新たな小胞体ストレスを軽減する組成物、該組成物を含む食品、医薬品、及び飼料を提供することを課題とする。

上記課題を解決するため、本発明者らは、小胞体ストレスを軽減する有用な方法について検討を進めた結果、β‐ラクトグロブリンとリン脂質を組み合せることで生体内の小胞体ストレスを効果的に軽減させることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明には以下の構成が含まれる。
（１）β‐ラクトグロブリン及び／又はβ−ラクトグロブリン加水分解物と、リン脂質とを有効成分として含む小胞体ストレス軽減用組成物。
（２）前記β‐ラクトグロブリン及び／又はβ−ラクトグロブリン加水分解物と、前記リン脂質との合計が１重量％以上１００重量％以下である（１）に記載の小胞体ストレス軽減用組成物。
（３）前記β‐ラクトグロブリン及び／又はβ−ラクトグロブリン加水分解物の重量％の値を、前記リン脂質の重量％の値で除することで得られる値が０．１以上１０以下である（１）に記載の小胞体ストレス軽減用組成物。
（４）（１）から（３）のいずれかに記載した小胞体ストレス軽減用組成物を含む小胞体ストレス軽減用食品。
（５）（１）から（３）のいずれかに記載した小胞体ストレス軽減用組成物を含む小胞体ストレス軽減用医薬品。
（６）（１）から（３）のいずれかに記載した小胞体ストレス軽減用組成物を含む小胞体ストレス軽減用飼料。

本発明は、新たな小胞体ストレスを軽減する組成物として、β‐ラクトグロブリンとリン脂質とを含む組成物と該組成物を含む食品、医薬品、及び飼料を提供することを提供するものである。本発明の組成物の摂取により小胞体ストレスを安全かつ簡易に軽減することが可能となった。

ヒト肝癌由来細胞を各培地で処理した場合の細胞生存率（％）を示すグラフである。左からＮｏｒｍａｌ（無血清培地）。Ｃｏｎｔｒｏｌ（小胞体ストレス誘導剤（ツニカマイシン）＋無血清培地）。ツニカマイシン＋無血清培地＋βラクトグロブリン（０.２５ｍｇ／ｍｌ）＋ホスファチジルコリン（０,０.１２５，０.２５，０.５，１ｍｇ／ｍｌ）。ツニカマイシン＋無血清培地＋ホスファチジルコリン（０.２５ｍｇ／ｍｌ）＋βラクトグロブリン（０,０.１２５，０.２５，０.５，１ｍｇ／ｍｌ）。ヒト肝癌由来細胞を各培地で処理した場合の細胞生存率（％）を示すグラフである。左からＮｏｒｍａｌ（無血清培地）。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ツニカマイシン＋無血清培地）。ツニカマイシン＋無血清培地＋ホスファチジルエタノールアミン（０.２５ｍｇ／ｍｌ）＋βラクトグロブリン（０,０.１２５，０.２５，０.５，１ｍｇ／ｍｌ）。ツニカマイシン＋無血清培地＋βラクトグロブリン（０.２５ｍｇ／ｍｌ）＋ホスファチジルエタノールアミン（０,０.１２５，０.２５，０.５，１ｍｇ／ｍｌ）。（Ａ）各試験群の肝臓総脂質濃度（ｍｇ／ｇ肝臓）を示すグラフである。（Ｂ）各試験群の肝臓トリグリセリド濃度（ｍｇ／ｇ肝臓）を示すグラフである。各グラフともに、左からツニカマイシン非添加、普通食投与群。ツニカマイシン非添加、β‐ラクトグロブリンとリン脂質の混合食（以下、Ｐ＋ｂＬＧ食とする）投与群。ツニカマイシン投与、普通食投与群。ツニカマイシン投与、Ｐ＋ｂＬＧ食投与群。各試験群のマウス肝臓脂質のＣＨＯＰタンパク質の発現をウエスタンブロッディングにより検出した写真を示す。左からツニカマイシン非添加、普通食投与群。ツニカマイシン非添加、Ｐ＋ｂＬＧ食投与群。ツニカマイシン投与、普通食投与群。ツニカマイシン投与、Ｐ＋ｂＬＧ食投与群。図４のＣＨＯＰタンパク質の発現量を測定した結果を示す。

本発明の小胞体ストレス軽減用組成物について以下に詳細に説明する。

（小胞体ストレス軽減用組成物）
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物は、β‐ラクトグロブリンとリン脂質とを含むものである。
小胞体ストレス軽減用組成物におけるβ‐ラクトグロブリンとリン脂質の含量は、β‐ラクトグロブリンとリン脂質との合計が小胞体ストレス軽減用組成物の１重量％以上１００重量％以下であればよく、１０重量％以上１００重量％以下が好ましく、２０重量％以上１００重量％以下がさらに好ましく、３０重量％以上１００重量％以下が最も好ましい。
また、小胞体ストレス軽減用組成物に含まれるβ−ラクトグロブリンは０．１重量％以上９０重量％以下が好ましく、３％以上８０％以下が最も好ましい。また、小胞体ストレス軽減用組成物に含まれるリン脂質は０．１重量％以上９０重量以下が好ましく、３％以上７０％以下が最も好ましい。
また、小胞体ストレス軽減用組成物に含まれるβ‐ラクトグロブリンとリン脂質との重量比は、小胞体ストレス軽減用組成物中のβ‐ラクトグロブリンの重量％を小胞体ストレス軽減用組成物中のリン脂質の重量％で除した値が０．１以上１０以下であればよく、０．２以上８以下が好ましく、０．３以上５以下が最も好ましい。
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物は、後述するβ‐ラクトグロブリンを含む素材とリン脂質を含む素材を用いて上記した組成物を調製することができる。また、乳などから上記した組成となるよう調製した組成物をそのまま用いてもよい。

（β‐ラクトグロブリン）
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物に用いるβ‐ラクトグロブリンについて説明する。
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物に用いるβ‐ラクトグロブリンは、ウシ、馬、羊、山羊等の獣乳中に存在するβ‐ラクトグロブリンを用いることができ、前記獣乳から得られたもの、合成したもののいずれも用いることができる。
また、β‐ラクトグロブリンをタンパク質分解酵素で処理したβ‐ラクトグロブリン分解物も用いることができる。β‐ラクトグロブリン分解物の分子量は２００Ｄａ程度以上１０ＫＤａ程度以下であればよく、２００Ｄａ程度以１ＫＤａ上程度以下がより好ましい。

本発明の小胞体ストレス軽減用組成物に用いるβ‐ラクトグロブリンは、不純物の少ない試薬グレードのβ‐ラクトグロブリンだけでなく、β‐ラクトグロブリンを含む乳素材をそのまま用いることもできる。
前記乳素材はβ‐ラクトグロブリンを含むものであればどのようなものでも用いることができ、脱脂粉乳、甘性ホエイ粉、酸ホエイ粉、脱塩ホエイ粉、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ、ＷｈｅｙＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）、ホエイタンパク質精製物（ＷＰＩ、ＷｈｅｙＰｒｏｔｅｉｎＩｓｏｌａｔｅ）などを例示できる。このうち、β‐ラクトグロブリンの含量が高いＷＰＣやＷＰＩを用いることが好ましい。
β‐ラクトグロブリンの分解物は、不純物の少ない試薬グレードのβ‐ラクトグロブリン、β‐ラクトグロブリンを含む乳素材をタンパク質分解酵素で処理したものを用いればよい。タンパク質分解酵素はβ‐ラクトグロブリンのペプチド結合を加水分解できるものであればどのようなものでも用いることができるが、食品製造に用いられるペプシン、トリプシン、パパイン等が好ましい。

（リン脂質）
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物に用いるリン脂質は、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質であればどのようなものでも用いることができるが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールから選択される１種類以上を用いることが好ましい。
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物に用いるリン脂質は試薬グレードのものだけでなく、鶏卵、大豆、乳等から調製したリン脂質をそのまま用いることもできる。
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物に用いるリン脂質は、鶏卵、大豆由来のものが好ましく、獣乳由来のリン脂質がさらに好ましい。

（小胞体ストレス軽減用組成物の摂取量）
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物の有効摂取量は、β‐ラクトグロブリンとリン脂質の合計量として摂取量が２ｍｇ／日以上となるように摂取すればよい。
また、本発明の小胞体ストレス軽減用組成物は、以下に記載のとおり、食品、医薬品、飼料に添加することができるが、その際の小胞体ストレス軽減用組成物の添加量は前記した有効量が摂取できるよう適宜調製すればよい。

（小胞体ストレス軽減用組成物を含む食品、医薬品、及び飼料）
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物はそのまま使用してもよいが、食品、医薬品、及び飼料に通常含まれる他の原材料とともに使用できることから、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に用いることも出来る。また、ヨーグルト、乳飲料、ウエハース等の飲食品、及び飼料に配合することも可能である。

（小胞体ストレス軽減用組成物中のβ‐ラクトグロブリンの定量方法）
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物中のβ‐ラクトグロブリン含量は、Ｂｏｒｄｉｎらの方法（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ.(２００１)９２８、１、６３―７６）により測定することができる。

（小胞体ストレス軽減用組成物中のリン脂質の定量方法）
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物中のリン脂質含量と組成は、春田らの方法（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, & Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(２００８)７２、８、２１５１-２１５７）により測定することができる。

（小胞体ストレス軽減用組成物の小胞体ストレス軽減作用の評価）
本発明の小胞体ストレス軽減用組成物の小胞体ストレス軽減作用は、例えば、小胞体ストレス誘導体等により試験対象となる動物や細胞にストレスを与えた場合において、本発明組成物を付与した場合と付与しなかった場合におけるストレス応答を比較することにより評価できる。小胞体ストレス誘導剤には、例えばツニカマイシンが挙げられる。ツニカマイシンはタンパク質への糖鎖の付与を阻害することで、小胞体内に構造が異常なタンパク質を蓄積させ、小胞体ストレスを引き起こすことが知られており、小胞体ストレスを対象とした研究で広く用いられる。ストレス応答の評価指標は、細胞障害性、細胞生存率、小胞体ストレス応答関連遺伝子の発現などが挙げられる。より具体的には、実施例に示したｉｎｖｉｔｒｏ、およびｉｎｖｉｖｏにおける方法で評価することができる。

以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔試験例１〕小胞体ストレス軽減効果確認試験（１）
小胞体ストレス誘導剤により細胞にストレスを負荷した場合に、本発明組成物により、前記ストレスによる細胞の障害性が抑制されることを確認するための試験を行った。
１．試験方法
ヒト肝癌由来細胞を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間培養後、
（ｉ）血清１％添加培地（Ｎｏｒｍａｌ）、
（ｉｉ）小胞体ストレス誘導剤（ツニカマイシン（２０μｇ／ｍｌ））を混合した血清１％添加培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、
（ｉｉｉ）ツニカマイシン（２０μｇ／ｍｌ）およびβ‐ラクトグロブリン（シグマ-アルドリッチ）０．２５ｍｇ／ｍｌにホスファチジルコリン（シグマ-アルドリッチ；０ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルコリン＝０．３７５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルコリン＝２）、０．２５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルコリン＝０．５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルコリン＝１）、０．５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルコリン＝０．７５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルコリン＝０．５）、１ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルコリン＝０．１２５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルコリン＝０．２５））を混合した血清１％添加培地、
（ｉｖ）ホスファチジルコリン０．２５ｍｇ／ｍｌにβ‐ラクトグロブリン（０、０．１２５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルコリン＝０．３７５、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルコリン＝０．５）、０．２５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルコリン＝０．５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルコリン＝１）、０．５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルコリン＝０．７５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルコリン＝２）、１ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルコリン＝１．２５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルコリン＝４））を混合した血清１％添加培地、
（ｖ）β‐ラクトグロブリン０．２５ｍｇ／ｍｌにホスファチジルエタノールアミン（０、０．１２５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルエタノールアミン＝０．３７５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルエタノールアミン＝２）、０．２５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルエタノールアミン＝０．５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルエタノールアミン＝１）、０．５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルエタノールアミン＝０．７５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルエタノールアミン＝０．５）、１ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルエタノールアミン＝１．２５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルエタノールアミン＝０．２５））を混合した血清１％添加培地、
（ｖｉ）ホスファチジルエタノールアミン０．２５ｍｇ／ｍｌにβ‐ラクトグロブリン（０、０．１２５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルエタノールアミン＝０．３７５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルエタノールアミン＝０．５）、０．２５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルエタノールアミン＝０．５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルエタノールアミン＝１）、０．５ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルエタノールアミン＝０．７５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルエタノールアミン＝２）、１ｍｇ／ｍｌ（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルエタノールアミン＝１．２５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルエタノールアミン＝４））を混合した血清１％添加培地、にそれぞれ培地交換した。
その後、３７℃で２４時間培養し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-ＢｌｕｅＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-ＢｌｕｅＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙキット、ｐｒｏｍｅｇａ）に供し、細胞生存率を評価した。
細胞生存率（％）は、ツニカマイシンを添加していないＮｏｒｍａｌ培地における細胞生存率を１００とした場合の各試験培地での細胞生存率を示す（各群ｎ=３）。
結果は、統計処理ソフトを用いて処理し、Ｄｕｎｎｅｔｔ型の多重比較によりコントロール群とそれ以外の群との差をそれぞれ検定した。実験結果を図１と図２に示す。

２．試験結果
図１に示したホスファチジルコリンとβ‐ラクトグロブリンを添加した系では、小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシンの添加により減少した細胞生存率が、ホスファチジルコリン０．２５ｍｇ／ｍｌの添加により改善したが、β‐ラクトグロブリンを加えることでさらに改善した。また、細胞生存率はβ‐ラクトグロブリン０．２５ｍｇ／ｍｌの添加により改善したが、ホスファチジルコリンを加えることでさらに改善した。
特に、ホスファチジルコリン０．２５ｍｇ／ｍｌとβ‐ラクトグロブリン０．５ｍｇ／ｍｌを添加した試料の効果が高かった（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルコリン＝０．７５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルコリン＝２）。

図２に示したホスファチジルエタノールアミンとβ‐ラクトグロブリンを添加した系では、小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシンの添加により減少した細胞生存率が、ホスファチジルエタノールアミン０．２５ｍｇ／ｍｌの添加により改善したがβ‐ラクトグロブリンを加えることでさらに改善した。
また、細胞生存率はβ‐ラクトグロブリン０．２５ｍｇ／ｍｌの添加により改善したが、ホスファチジルエタノールアミンを加えることでさらに改善した。
特に、ホスファチジルエタノールアミン０．５ｍｇ／ｍｌとβ‐ラクトグロブリン０．２５ｍｇ／ｍｌを添加した試料の効果が高かった（β‐ラクトグロブリン＋ホスファチジルエタノールアミン＝０．７５ｍｇ／ｍｌ、β‐ラクトグロブリン／ホスファチジルエタノールアミン＝０．５）。

〔実施例品１〕乳由来リン脂質濃縮物の調製方法
乳由来リン脂質濃縮物はバターミルク粉（雪印メグミルク社製）より原らの方法（成蹊大学理工学研究報告、２００７年、４４、２、６５−７３）により得た。乳由来リン脂質濃縮物は固形当たりリン脂質を９７．６重量％、中性脂肪を２．４重量％含有していた。また、前記リン脂質中にホスファチジルエタノールアミンは３１．１重量％、ホスファチジルイノシトールは１５．７重量％、ホスファチジルセリンは１３．３重量％、ホスファチジルコリンは１９．５重量％、スフィンゴミエリンは２０．４重量％含有されていた。

〔実施例品２〕β‐ラクトグロブリン精製物の調製方法
β‐ラクトグロブリン精製物はＷＰＩ８８５５（Ｆｏｎｔｅｒｒａ社製）よりＡｌｏｍｉｒａｈらの方法（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＤａｉｒｙＪｏｕｒｎａｌ、（２００４）１４、４１１-４１９）により得た。β‐ラクトグロブリン精製物は固形あたり９９．９重量％以上のβ‐ラクトグロブリンを含有していた。

〔試験例２〕小胞体ストレス軽減効果確認試験（２）
試験例１は細胞を用いた試験であるが、本試験では、動物を用いて本発明組成物の効果を確認するための試験を行った。
１．試験方法（１）飼料の調製
（ｉ）Ｎｏｒｍａｌ食
ＡＩＮ−９３Ｇ食（表１）を用いた。表中の数値は配合重量比を示す。
（ｉｉ）β‐ラクトグロブリンとリン脂質の混合食（以下、Ｐ＋ｂＬＧ食とする）（本発明組成物）
ＡＩＮ−９３Ｇ食をベースに実施例品１を３．７８％、実施例品２を１．１９％となるように添加した（表１）。
（２）マウスの飼育方法
下記の手順により動物実験を行なった。
６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本ＳＬＣ株式会社）を２０匹入手し、１週間の予備飼育後、５匹ずつ４群に分け、下記条件で１１日間本飼育を行った。
（ｉ）Ｖｅｈｉｃｌｅ−Ｎｏｒｍａｌ群：飼料としてＮｏｒｍａｌ食を投与。ツニカマイシンを投与しない。
（ｉｉ）Ｖｅｈｉｃｌｅ−Ｐ＋ｂＬＧ群：飼料としてＰ＋ｂＬＣ食を投与。ツニカマイシンを投与しない。
（ｉｉｉ）ツニカマイシン−Ｎｏｒｍａｌ群：飼料としてＮｏｒａｍｌ食投与。本飼育開始８日目から１１日目にツニカマイシンを４００μｇ／ｋｇ体重の濃度で毎日腹腔投与した。
（ｉｖ）ツニカマイシン−Ｐ＋ｂＬＧ群：飼料としてＰ＋ｂＬＣ食を投与。本飼育開始８日目から１１日目にツニカマイシンを４００μｇ／ｋｇ体重の濃度で毎日腹腔投与した。
（２）各種測定方法
全群、本飼育開始１２日目に解剖を行い、肝臓を採取し、以下の測定を行った。
（ｉ）肝臓中脂質の測定
肝臓は一定重量サンプリングしてホモジナイズし、Ｆｏｌｃｈ法を用いて全脂質を抽出して重量を測定した。さらに、抽出した脂質をイソプロパノールに溶解し、トリアシルグリセロール濃度を測定キット（Ｅ−テストワコー、和光純薬工業株式会社）を使って測定した。
（ｉｉ）アポトーシス関連遺伝子（ＣＨＯＰ）発現量の測定
肝臓よりタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッド法により小胞体ストレス応答関連アポトーシスの指標であるＣＨＯＰの発現量を測定した。発現量は、ツニカマイシン−Ｎｏｒｍａｌ群の発現量を１とした場合の比率を示す。
結果は、統計処理ソフトを用いて処理し、二元配置分散分析を行い、交互作用があった場合にＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ型の多重比較により全群間の差をそれぞれ検定した。

２．試験結果
ツニカマイシン投与群において、Ｐ＋ｂＬＧ摂食により肝臓総脂質量（図３（Ａ））、肝臓トリアシルグリセロール量（図３（Ｂ））、ＣＨＯＰのタンパク発現量が減少した（図４、図５）。これより、乳由来リン脂質とβ−ラクトグロブリンの摂食が小胞体ストレス誘導性の脂肪肝および肝細胞のアポトーシスを抑制することが明らかとなった。

〔実施例品４〕小胞体ストレス軽減用カプセル剤の調製
表２に示す配合で原材料を混合後、常法により造粒し、カプセルに充填して、本発明の小胞体ストレス軽減用カプセル剤を製造した。

〔実施例品５〕
（小胞体ストレス軽減用錠剤の調製）
表３に示す配合で原材料を混合後、常法により１ｇに成型、打錠して本発明の小胞体ストレス軽減用錠剤を製造した。

〔実施例品６〕小胞体ストレス軽減用ゲル状食品の調製
リン脂質濃縮物（実施例品１）２．５ｇとβ‐ラクトグロブリン精製物（実施例品２）７．５ｇを７００ｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸＴ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。この溶液に、ソルビトール４０ｇ、酸味料２ｇ、香料２ｇ、ペクチン５ｇ、乳清タンパク質濃縮物５ｇ、乳酸カルシウム１ｇ、脱イオン水２３５ｇを添加して、撹拌混合した後、２００ｍｌのチアパックに充填し、８５℃、２０分間殺菌後、密栓し、本発明の小胞体ストレス軽減用ゲル状食品５袋（２００ｇ入り）を調製した。このようにして得られた小胞体ストレス軽減用ゲル状食品は、すべて沈殿等は認められず、風味に異常は感じられなかった。
なお、この小胞体ストレス軽減用ゲル状食品には、１００ｇあたり乳由来リン脂質が２４４ｍｇとβ‐ラクトグロブリンが７５０ｍｇ含まれていた。

〔実施例品７〕小胞体ストレス軽減用飲料の調製
酸味料２ｇを７００ｇの脱イオン水に溶解した後、リン脂質濃縮物（実施例品１）１．０ｇとβ‐ラクトグロブリン精製物（実施例品２）９．０ｇを溶解し、５０℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸＴ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。マルチトール１００ｇ、還元水飴２０ｇ、香料２ｇ、脱イオン水１６６ｇを添加した後、１００ｍｌのガラス瓶に充填し、９０℃、１５分間殺菌後、密栓し、小胞体ストレス軽減用飲料１０本（１００ｍｌ入り）を調製した。このようにして得られた小胞体ストレス軽減用飲料は、すべて沈殿は認められず、風味に異常は感じられなかった。
なお、この小胞体ストレス軽減用飲料には、１００ｇあたり乳由来リン脂質が９７．６ｍｇとβ‐ラクトグロブリンが９００ｍｇ含まれていた。

〔実施例品８〕小胞体ストレス軽減用飼料の調製
リン脂質濃縮物（実施例品１）１．８ｋｇとβ‐ラクトグロブリン精製物（実施例品２）０．２ｋｇを９８ｋｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫＩＩ１６０型；特殊機化工業社製）にて、３６００ｒｐｍで４０分間撹拌混合して乳由来リン脂質１７５７ｍｇ／１００ｇ、β‐ラクトグロブリン２００ｍｇ／ｍｌの混合溶液を得た。この溶液１０ｋｇに大豆粕１２ｋｇ、大豆タンパク質１４ｋｇ、大豆油４ｋｇ、コーン油２ｋｇ、パーム油２３．２ｋｇ、トウモロコシ澱粉１４ｋｇ、小麦粉９ｋｇ、ふすま２ｋｇ、ビタミン混合物５ｋｇ、セルロース２．８ｋｇ、ミネラル混合物２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間殺菌して、本発明の小胞体ストレス軽減用イヌ飼育飼料１００ｋｇを製造した。
なお、この小胞体ストレス軽減用イヌ飼育飼料には、１００ｇあたり乳由来リン脂質が１７５．７ｍｇとβ‐ラクトグロブリンが２０．０ｍｇ含まれていた。

本発明は、新たな小胞体ストレスを軽減する組成物として、β−グロブリンとリン脂質を含む組成物と、該組成物を含む食品、医薬品、及び飼料を提供する。本発明の組成物等を摂取することにより小胞体ストレスを安全かつ簡易に軽減することが期待できる。

Claims

β‐ラクトグロブリンと、リン脂質を有効成分として含む小胞体ストレス軽減用組成物。
前記β‐ラクトグロブリンと、前記リン脂質との合計が１重量％以上１００重量％以下である請求項１に記載の小胞体ストレス軽減用組成物。
前記β‐ラクトグロブリンの重量％の値を、前記リン脂質の重量％の値で除することで得られる値が０．１以上１０以下である請求項１に記載の小胞体ストレス軽減用組成物。
請求項１から請求項３のいずれかに記載した小胞体ストレス軽減用組成物を含む小胞体ストレス軽減用食品。
請求項１から請求項３のいずれかに記載した小胞体ストレス軽減用組成物を含む小胞体ストレス軽減用医薬品。
請求項１から請求項３のいずれかに記載した小胞体ストレス軽減用組成物を含む小胞体ストレス軽減用飼料。