JP6892965B2 - 流路デバイス - Google Patents

Description

本発明は、薬学の研究等に用いられる流路デバイスに関する。

近年、マイクロ流路と呼ばれるマイクロメートルオーダーの幅の流路を有する流路デバイスを、血管、腸管、肝臓および肺等の臓器モデルとして使用することが試みられている。

例えば、特許文献１には、中央マイクロ流路（マイクロチャネル）を内部に有する本体、および、中央マイクロ流路内に配置された少なくとも部分的に多孔質の膜を含み、多孔質の膜が、中央マイクロ流路を分離して第１中央マイクロ流路と第２中央マイクロ流路とを形成するように構成され、第１流体が第１中央マイクロ流路に流され、第２流体が第２中央マイクロ流路に流され、さらに、多孔質の膜に複数種の細胞（生体細胞）が固定されている、流路デバイス（マイクロチャネルを有する臓器模倣装置）が記載されている。

この流路デバイスは、多孔質の膜に細胞を固定した状態で、第１中央マイクロ流路および第２中央マイクロ流路に、空気、血液、水、細胞、化合物、粒子および培養液等を流すことで、臓器を再現した多孔質の膜に対して、様々な解析を行うことができる。

一例として、マイクロ流路に、蛍光標識をつけた大分子（例えば重量の異なるデキストラン）を流して、蛍光を測定することによって、多孔質膜に形成した細胞層の透過性を評価できる。
また、マイクロ流路に液体を流して、透過型電子顕微鏡、免疫組織細胞化学、共焦点顕微鏡および他の適切な手段を使って、多孔質膜上の細胞を撮像（可視化）することで、多孔質膜に形成した細胞層等の構造を評価できる。
さらに、センサーとして、電極、赤外線または光検出手段（カメラおよびＬＥＤ（Light Emitting Diode）、磁気検出手段等を用いることで、多孔質膜に形成した細胞層等の特性および状態等をモニタリングすることもできる。例えば、電極を用いて電位差、抵抗および短絡回路電流等の電気特性を測定することで、多孔質膜に形成した細胞層等を通した流体およびイオン等の輸送機能および障壁の形成等を確認できる。

特開２０１１−５２８２３２号公報

ところで、人体は複雑であるため、流路デバイスを用いて細胞等の評価を正確に行うためには、１つの測定のみでは不十分である。すなわち、流路デバイスを用いた細胞等の正確な評価を行うためには、例えば、多孔質膜上の細胞の撮像と電極を用いる抵抗値の測定とを同時に行うなど、複数の測定を同時に行って、複数の測定結果に基づいて評価を行うのが好ましい。

ところが、従来の流路デバイスでは複数の測定を同時に行うこと、特に、蛍光標識を用いる測定および細胞の撮像などの光学的な測定と、電極を用いる電気的な測定とを、同時に行うことが困難である。

本発明の目的は、このような従来技術の問題点を解決することにあり、臓器モデル等として利用される流路デバイスであって、光学的な測定と電気的な測定とを、同時に行うことができる流路デバイスを提供することにある。

この課題を解決するために、本発明は、以下の構成を有する。
［１］ 第１流路を有する第１流路部材と、
第２流路を有する第２流路部材と、
第１流路部材と第２流路部材との間に設けられる多孔質膜と、
第１流路部材と第２流路部材との間に設けられ、第１流路と第２流路とを覆うと共に、隔てている多孔質膜と、
第１流路に接触して多孔質膜と対向して設けられる第１透明電極と、
第２流路に接触して多孔質膜と対向して設けられる第２透明電極と、を有し、
第１流路は、第１流路部材と多孔質膜との間に形成され、
第２流路は、第２透明電極と第２流路部材と多孔質膜との間に形成されることを特徴とする流路デバイス。
［２］ 第１流路部材が、第１流路を形成する凹部を有する板材である、［１］に記載の流路デバイス。
［３］ 第１透明電極および第２透明電極の少なくとも一方が、面状電極である、［１］または［２］に記載の流路デバイス。
［４］ 第１流路部材の主面と直交する方向から見た際に、第１透明電極および第２透明電極の少なくとも一方が、多孔質膜を内包する面状電極である、［３］に記載の流路デバイス。
［５］ 第１流路部材の第１流路の形成面の全面に、第１透明電極が形成される、［１］〜［４］のいずれかに記載の流路デバイス。
［６］ 第２流路部材が、第２流路となる貫通孔を有する板材であり、さらに、第２流路部材に当接して、第２流路となる貫通孔を閉塞する保持プレートを有し、第２透明電極が、保持プレートの第２流路部材の当接面の全面に形成される、［１］〜［５］のいずれかに記載の流路デバイス。
［７］ 第１流路部材、または、第１流路部材および第２流路部材が、高分子材料で構成され、第１透明電極および第２透明電極が、カーボンナノチューブを含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の流路デバイス。
［８］ 保持プレートが高分子材料で構成され、保持プレートの第２流路部材の当接面の全面に形成される第２透明電極が、カーボンナノチューブを含む、［６］に記載の流路デバイス。
［９］ 多孔質膜は、ハニカム状に配列された貫通孔を有する、［１］〜［８］のいずれかに記載の流路デバイス。
［１０］ 多孔質膜が、高分子材料で構成される、［１］〜［９］のいずれかに記載の流路デバイス。
［１１］ 多孔質膜に、細胞が固定されている、［１］〜［１０］のいずれかに記載の流路デバイス。
［１２］ 多孔質膜に固定される細胞が、多孔質膜の一方の面と他方の面とで異なる細胞である、［１１］に記載の流路デバイス。

本発明の流路デバイスによれば、光学的な測定と電気的な測定とを、同時に行うことができる。

図１は、本発明の流路デバイスの一例の全体構造を示す概略斜視図である。 図２は、図１に示す流路デバイスの全体構造を示す概略分解斜視図である。 図３は、図１に示す流路デバイスの多孔質膜の一例を示す概略平面図である。 図４は、図３のＢ−Ｂ線概略断面図である。 図５は、流路ユニットが固定される前の流路デバイスを示す図１におけるＡ−Ａ線概略断面図である。 図６は、流路ユニットが固定された後の流路デバイスを示す図１におけるＡ−Ａ線概略断面図である。 図７は、図１に示す流路デバイスを用いる測定方法の一例を概念的に示す図である。 図８は、図１に示す流路デバイスの作製工程を示す概略断面図である。 図９は、図１に示す流路デバイスの作製工程を示す概略断面図である。 図１０は、図１に示す流路デバイスの作製工程を示す概略断面図である。 図１１は、図１に示す流路デバイスの作製工程を示す概略断面図である。

以下、本発明の細胞培養ユニットについて、添付の図面に示される好適な実施形態を基に、詳細に説明する。
なお、以下に示す実施形態は本発明の一例を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。また、各構成部材の説明を明確に行うために、図中の各構成部材の寸法は、適宜、変更している。このため、図中の縮尺は実際とは異なっている。

＜流路ユニット＞
図１に、本発明の流路デバイスの一例の概略斜視図を、図２に、図１に示す流路デバイスを分解した概略斜視図を有する。
なお、図示例は、あくまで本発明の一実施形態であり、本発明の流路デバイスは、この実施形態に制限はされない。

図１および図２に示すように、流路デバイス１０は、厚さ方向に積層された第１流路部材１２と第２流路部材１４とで構成された流路ユニット１６を有している。以下の説明では、図１および図２中の上側を『上』、図１および図２中の下側を『下』、ともいう。図１および図２中の上側は、第１流路部材１２側であり、図１および図２中の下側は、第２流路部材１４側である。

第１流路部材１２および第２流路部材１４の材料は、一例としてＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の弾性を有する透明な材料であるのが好ましい。
なお、第１流路部材１２および第２流路部材１４を構成する材料としては、ＰＤＭＳの他、エポキシ系樹脂、ウレタン系樹脂、スチレン系熱可塑性エラストマー、オレフィン系熱可塑性エラストマー、アクリル系熱可塑性エラストマー、および、ポリビニルアルコール等の高分子材料（樹脂材料、ポリマー）が挙げられる。

ここで、第１流路部材１２および第２流路部材１４は、ゴム硬度が２０〜８０度であるのが好ましく、５０〜７０度であるのがより好ましい。
「ゴム硬度」は、ＪＩＳ Ｋ６２５３：２０１２に規定される方法で、タイプＡのデュロメータによって第１流路部材１２および第２流路部材１４の硬さを測定することによって評価できる。

図２に示すように、第１流路部材１２の下面、すなわち、第２流路部材１４との対向面１２Ａには、第１流路１８（第１マイクロ流路１８）を画成する凹部２０が形成されている。凹部２０は、流入口２０Ａおよび流出口２０Ｂ、ならびに、流入口２０Ａと流出口２０Ｂとを連通する流路部２０Ｃを有している。また、第１流路部材１２には、第１流路部材１２を厚さ方向に貫通し、下端が流入口２０Ａおよび流出口２０Ｂに連通する貫通孔２２Ａおよび２２Ｂがそれぞれ形成されている。第１流路１８（凹部２０）の幅および深さは、流路デバイス１０のサイズおよび用途等に応じて、適宜、設定すればよい。
また、後に詳述するが、第１流路部材１２の下面には、凹部２０（第１流路１８）を含む全面に、第１透明電極６０が形成される（貫通孔は除く）。

他方、第２流路部材１４には、第２流路部材１４を厚さ方向に貫通して、第２流路２４（第２マイクロ流路２４）を画成する貫通孔２６が形成されている。第２流路２４は、第２流路部材１４の下面（第１流路部材１２と逆面）に当接して、後述する保持プレート３８Ｂが設けられ、貫通孔２６の下面側を閉塞することで形成される。第２流路２４（貫通孔２６）の幅および深さは、流路デバイス１０のサイズおよび用途等に応じて、適宜、設定すればよい。
貫通孔２６は、流入口２６Ａおよび流出口２６Ｂ、ならびに、流入口２６Ａと流出口２６Ｂとを連通する流路部２６Ｃを有している。

ここで、第２流路部材１４の流入口２６Ａおよび流出口２６Ｂは、第１流路部材１２の流入口２０Ａおよび流出口２０Ｂと、平面視で重ならない位置に設けられている。一方、第２流路部材１４の流路部２６Ｃは、第１流路部材１２の流路部２０Ｃと、平面視で重なる位置に設けられている。
なお、平面視とは、言い換えれば、本発明の流路デバイス１０を、第１流路部材１２の主面と直交する方向から見た際を示す。また、主面とは、シート状物、板状物およびフィルム状物等の最大面を示す。

また、第１流路部材１２には、第１流路部材１２を厚さ方向に貫通し、下端が第２流路部材１４の流入口２６Ａおよび流出口２６Ｂに連通する貫通孔２８Ａおよび２８Ｂが形成されている。
さらに、流路ユニット１６（第１流路部材１２および第２流路部材１４）の外周面（側面）には、後述するスペーサ４６が配置される位置に、凹部２９が設けられている。

＜多孔質膜＞
第１流路部材１２および第２流路部材１４の対向面１２Ａと１４Ａとの間には、多孔質膜３０が配置されている。多孔質膜３０は、一例として高分子材料で構成され、特に、疎水性の有機溶媒に溶解可能な疎水性の高分子材料から構成されるのが好ましい。なお、疎水性の有機溶媒は、２５℃の水に対する溶解度が１０（ｇ／１００ｇ水）以下の液体である。

高分子材料としては、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、ポリラクトン、ポリアミドおよびポリイミド、ポリウレタン、ポリウレア、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリアロマティックス、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、および、セルロースアシレートなどが挙げられる。
ポリエステルとしては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸およびポリ−３−ヒドロキシブチレート等が例示される。ポリラクトンとしては、例えば、ポリカプロラクトン等が例示される。ポリアミドおよびポリイミドとしては、例えば、ナイロンおよびポリアミド酸等等が例示される。セルロースアシレートとしては、例えば、トリアセチルセルロース、セルロースアセテートプロピオネートおよびセルロースアセテートブチレート等が例示される。

これらの高分子材料は、溶剤への溶解性、光学的物性、電気的物性、膜強度、および、弾性等の観点から、必要に応じてホモポリマー、コポリマー、ポリマーブレンドおよびポリマーアロイ等であってもよい。また、これらの高分子材料は、１種単独でまたは２種以上を混合して使用してよい。なお、多孔質膜３０の素材は高分子材料には制限されず、細胞の接着性の観点等から種々の素材を選択することが可能である。

多孔質膜３０の上面３０Ａおよび下面３０Ｂは、第１流路１８および第２流路２４の流路部２０Ｃおよび流路部２６Ｃを略覆う大きさを有する。
多孔質膜３０は、第１流路１８および第２流路２４を覆うよう設けられる。これにより、多孔質膜３０が、第１流路１８と第２流路２４とを隔てている。

具体的には、多孔質膜３０の上面３０Ａ、すなわち第１流路部材１２に面する主面が、第１流路部材１２の凹部２０と共に第１流路１８を画成している。
また、多孔質膜３０の下面３０Ｂ、すなわち第２流路部材１４に面する主面が、第２流路部材１４の貫通孔２６と共に第２流路２４を画成している。

図３および図４に示すように、多孔質膜３０には、多孔質膜３０を厚さ方向に貫通する複数の貫通孔３２が形成されており、多孔質膜３０の上面３０Ａおよび下面３０Ｂには貫通孔３２の開口３２Ａがそれぞれ設けられている。また、図３に示すように、開口３２Ａは平面視で円形状とされている。開口３２Ａ同士は互いに離間して設けられており、隣り合う開口３２Ａの間には平坦部３４が延在している。なお、開口３２Ａは円形状には限られず、多角形状、楕円形状および不定形状等であってもよい。

複数の開口３２Ａは規則的に配置されている。本発明では、一例として、開口３２Ａはハニカム状に配置されている。
ハニカム状の配置とは、平行六辺形、または、これに近い形状を単位とし、これら図形の頂点および対角線の交点に開口３２Ａの中心が位置する配置である。平行六辺形は、好ましくは正六角形である。
ここで「開口の中心」とは、開口３２Ａの平面視における中心を意味する。

なお、開口３２Ａの配置はハニカム状に限られず、格子状または面心格子状とされていてもよい。格子状の配置とは、平行四辺形またはこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点に開口の中心が位置する配置である。面心格子状の配置とは、平行四辺形またはこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点および対角線の交点に開口の中心が位置する配置である。上記記載において、平行四辺形には、正方形、長方形および菱形が含まれ、好ましくは正方形である。
なお、以下に示す開口率を達成しやすい点で、開口３２Ａの配置はハニカム状であるのが好ましい。

多孔質膜３０において、開口３２Ａの開口径の変動係数は、１０％以下が好ましく、小さいほど好ましい。開口径の変動係数が小さいほど、多孔質膜３０の複数の貫通孔３２を赤血球等が均一に通過することができる。
また、多孔質膜３０の開口率（空隙率）は５０％以上が好ましい。開口率を５０％以上とすることで、多孔質膜３０によって赤血球等の移動が阻害されることを抑制できる。なお、空隙率が大きすぎると、必要とされる強度に対して多孔質膜３０の強度が不足するため、空隙率は９５％以下が好ましい。
ここで、「開口率」とは、多孔質膜３０の主面が平滑であると仮定した場合、すなわち開口３２ＡＡが無いと仮定した場合の多孔質膜３０の単位体積をＶ１、この単位体積あたりに設けられている貫通孔３２および連通孔３６の容積の和をＶ２とし、Ｖ１とＶ２の単位を同じとした場合に、Ｖ１に対するＶ２の割合を百分率で示すものである。

図４に示すように、多孔質膜３０の貫通孔３２は球体の上端および下端を切り取った球台形状とされている。また、互いに隣り合う貫通孔３２同士は、多孔質膜３０の内部において連通孔３６によって連通している。

１つの貫通孔３２は、隣り合う全部の貫通孔３２と連通しているのが好ましい。本発明のように、複数の貫通孔３２の開口３２Ａがハニカム状に配置されている場合には、１つの貫通孔３２は、６つの連通孔３６によって隣り合う６つの貫通孔３２とそれぞれ連通しているのが好ましい。
なお、貫通孔３２はバレル形状、円柱形状および多角柱形状等であってもよく、また、連通孔３６は隣り合う貫通孔３２同士を繋ぐ筒状の空隙であってもよい。

貫通孔３２が形成された多孔質膜３０を作製する方法としては、例えば、ナノプリント法、結露法、エッチング法、サンドブラスト法、および、プレス成形等の方法が挙げられる。
ナノプリント法とは、凹凸形状を有する型に多孔質膜３０を構成する素材を流し込む、または、型を、多孔質膜３０を構成する素材に押し当てることにより、貫通孔３２を作製する方法である。また、結露法とは、多孔質膜３０を構成する素材の表面を結露させ、水滴を型として貫通孔３２を形成する方法である。

結露法は、他の方法と比較して、多孔質膜３０の膜厚を薄くできるとともに、空隙率および開口３２Ａの開口率を大きくすることが可能であり、また、多孔質膜３０内に連通孔３６を設けることが可能である。このため、本発明では、多孔質膜３０を結露法によって作製している。
結露法の詳細は、例えば、特許第４９４５２８１号公報、特許第５４２２２３０号公報、特開２０１１−７４１４０号公報、および、特許第５４０５３７４号公報等に記載されている。

なお、本発明の流路デバイス１０において、多孔質膜は、このような貫通孔を有するものに限定はされず、不織布および三次元的に空隙が形成された膜等、公知の多孔質膜（多孔質材）が、各種、利用可能である。

なお、本発明の流路デバイス１０は、多孔質膜３０の少なくとも主面の細胞が播種される領域が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テネイシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス、および、ポリリジンからなる群から選択される少なくとも１種によって被覆されているのが好ましい。コラーゲンとしては、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンおよびＶ型コラーゲン等が例示される。
多孔質膜３０を、これらの材料で被覆することにより、細胞の接着性を高めることが可能となる。

また、本発明の流路デバイス１０を臓器模擬装置（臓器モデル）等として用いる場合、多孔質膜３０の主面に模擬対象の臓器を構成する細胞層を有してもよい。
多孔質膜３０の主面に細胞層を有することで、第１流路１８内および第２流路２４内を模擬対象の臓器内に近い環境とすることが可能となる。
すなわち、本発明の流路デバイスは、細胞を培養するための細胞培養デバイスであってもよく、あるいは、細胞層を有する、細胞および／または薬液などの評価等を行うための測定を行う、測定用の流路デバイスであってもよい。

多孔質膜３０の主面に設ける細胞としては、例えば、実質細胞、間質細胞、筋細胞、線維芽細胞、神経細胞、内皮細胞、上皮細胞、および、このいずれかに分化する細胞などが例示される。
実質細胞としては、例えば、肝実質細胞および膵実質細胞等が例示される。間質細胞としては、例えば、周皮細胞が例示される。筋細胞としては、例えば、平滑筋細胞、心筋細胞および骨格筋細胞等が例示される。内皮細胞としては、例えば、血管内皮細胞およびリンパ管内皮細胞等が例示される。上皮細胞としては、例えば、肺胞上皮細胞、口腔上皮細胞、胆管上皮細胞、腸管上皮細胞、膵管上皮細胞、腎上皮細胞、尿細管上皮細胞および胎盤上皮細胞等が例示される。これらのいずれかに分化する細胞としては、例えば、前駆細胞、間葉系幹細胞および多能性幹細胞等が例示される。

多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell；ＡＰＳ細胞）、および、Ｍｕｓｅ細胞（multi-lineage differentiating stress enduring cell）；などが挙げられる。

細胞として、病態を再現する目的で、遺伝子変異を有する細胞および／または患者由来の細胞を用いてもよい。

多孔質膜３０の主面に設ける細胞層は、両面に同じ細胞層を設けてもよく、あるいは、１面ずつ互いに異なる細胞層を設けてもよい。
一例として、多孔質膜３０の一方の面に血管内皮細胞層を設け、多孔質膜３０の他方の面に平滑筋細胞層を設けることで、血管壁モデルとなる流路デバイス１０を得られる。

＜保持プレート＞
図１および図２に示すように、流路デバイス１０は、流路ユニット１６を厚さ方向に圧縮した状態で保持する保持部材として、上側（第１流路部材１２側）の保持プレート３８Ａと下側（第２流路部材１４側）の保持プレート３８Ｂとを有している。
保持プレート３８Ａおよび保持プレート３８Ｂは、流路ユニット１６の厚さ方向における両端、すなわち第１流路部材１２の上側および第２流路部材１４の下側に流路ユニット１６と別体に設けられており、第１流路部材１２の上面全体および第２流路部材１４の下面全体を覆う大きさを有する。

保持プレート３８Ａおよび保持プレート３８Ｂは、共に、硬質で透明な高分子材料で構成されるのが好ましい。
従って、保持プレート３８Ａおよび保持プレート３８Ｂの構成材料としては、シクロオレフィンポリマー、アクリル、ポリカーボネート、ポリスチレン、および、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。また、保持プレート３８Ａおよび保持プレート３８Ｂは、上述の第１流路部材１２および第２流路部材１４よりも硬いのが好ましく、さらに、ゴム硬度が８０度以上であるのが好ましく、９０度以上であるのがより好ましい。

図２に示すように、保持プレート３８Ａおよび保持プレート３８Ｂの互いに対応する位置には、厚さ方向に貫通する複数のボルト孔４０がそれぞれ形成されている。ボルト孔４０は、図示例では８つである。また、第１流路部材１２の上側に設けられている保持プレート３８Ａには、第１流路部材１２の貫通孔２２Ａ、２２Ｂ、２８Ａおよび２８Ｂに、それぞれ連通する、貫通孔４２Ａ、４２Ｂ、４４Ａおよび４４Ｂが、形成されている。

なお、貫通孔４２Ａ、４２Ｂ、４４Ａおよび４４Ｂには、それぞれ、図示しないチューブが接続されており、チューブを通して第１流路１８および第２流路２４に溶液および細胞懸濁液等を流入し、第１流路１８および第２流路２４から溶液および細胞懸濁液等が流出する。

一対の保持プレート３８間における流路ユニット１６の凹部２９の外側には、保持プレート３８の間隔を規定する複数のスペーサ４６がそれぞれ設けられている。スペーサ４６は、図示例では８つである。スペーサ４６は、内径がボルト孔４０の内径と略同じ大きさとされた円筒形状の部材であり、ボルト孔４０に対応する位置にそれぞれ配置されている。

図５および図６に示されるように、一対の保持プレート３８は、ボルト孔４０およびスペーサ４６に挿通されてナット４８で固定された複数のボルト５０によって互いに接合される。このとき、第１流路部材１２および第２流路部材１４は、間に多孔質膜３０を挟んだ状態で一対の保持プレート３８によって圧縮されて保持される。

＜透明電極＞
本発明の流路デバイス１０において、第２流路２４に当接する保持プレート３８Ｂには、第２流路部材１４との当接面の全面を覆って、第２透明電極６２が配置される。上述のように、第２流路２４は、保持プレート３８Ｂが第２流路部材１４の下面に当接して、貫通孔２６の下面を閉塞することで形成される。従って、第２流路２４は、下面側が第２透明電極６２となり、すなわち、第２透明電極６２は、第２流路２４に接触している。
また、上述のように、第１流路部材１２は、下面に、第１流路１８を画成する凹部２０を有する。第１流路部材１２は、下面に、凹部２０を含む全面を覆って、第１透明電極６０を有する。すなわち、第１透明電極６０は、第１流路１８に接触している。
流路デバイス１０においては、第１流路１８に接触する第１透明電極６０と、第２流路２４に接触する第２透明電極６２とで、一対の透明電極（電極対）を構成している。

本発明の流路デバイス１０は、このような第１透明電極６０および第２透明電極６２を有することにより、光学的な測定と電気的な測定とを同時に行うことを可能にしている。

上述のように、人体は複雑であるため、流路デバイスを用いて細胞等の評価を正確に行うためには、一種の測定のみでは不十分であり、複数種の測定を同時に行う、いわゆるマルチバリデーションを行うのが好ましい。
流路デバイスを用いる測定としては、一例として、図７に概念的に示すように、蛍光標識をつけた大分子を第１流路１８または第２流路２４に流して、光源７０から励起光を照射して、光センサ７２で蛍光を測定する、膜の透過性の評価が例示される。
また、第１流路１８および／または第２流路２４に液体を流して、多孔質膜３０に形成した細胞層等を、透過型電子顕微鏡および蛍光顕微鏡などの撮像カメラ７４等で撮像（可視化）することで、細胞層等の構造を評価することも行われる。
さらに、第１透明電極６０および第２透明電極６２に電気センサ７６を接続して、電位差、抵抗および短絡回路電流等の電気特性を測定することで、膜を通した流体およびイオン等の輸送機能および障壁の形成等を評価することも行われる。

ところが、従来の流路デバイスでは、多孔質膜に形成した細胞層等の電気的特性を測定するために、第１流路および第２流路に対応して電極を形成すると、通常、電極は金属製であるため、電極が遮光部材として作用してしまい、蛍光の測定および細胞層の撮像などの光学的な測定および評価を適正に行うことができない。
そのため、従来の流路デバイスでは、電気的な測定と、光学的な測定とを、同時に行うことができない。

これに対し、本発明の流路デバイス１０では、第１流路１８と第２流路２４とを挟んで、一対の第１透明電極６０および第２透明電極６２を設ける。
本発明の流路デバイス１０は、第１流路１８と第２流路２４とを挟んで一対の電極を設けても、透明電極であるので、電極が蛍光および細胞層の撮像等の光学的な測定方法の妨害にならない。そのため、本発明の流路デバイス１０によれは、図７に示すような光源７０と光センサ７２とを用いる蛍光の測定、撮像カメラ７４等を用いる細胞層等の撮像、および、電気センサ７６を用いる抵抗の測定等、光学的な測定と、電気的な測定とを、同時に行うことが可能である。
また、透明電極を用いるため、電極を面状電極としても、光学的な測定の妨害をすることがない。そのため、十分な面積の電極によって、安定した電気的な測定を行うことができる。さらに、多孔質膜３０に形成した細胞層の面の電気的な性質を、電気信号として取り出すことも可能である。

本発明の流路デバイス１０において、第１透明電極６０および第２透明電極６２は、導電性を有し、かつ、透明な電極である。
本発明において、導電性を有するとは、シート抵抗値が０．１〜１０，０００Ω／□（Ω/sq（Ohms per Square））であり、一般的には電気抵抗層と呼ばれるものも含む。汎用の電源を用いる場合は、シート抵抗値が低いほうが好ましく、具体的には、３００Ω／□以下が好ましく、２００Ω／□以下がより好ましく、１００Ω／□以下がさらに好ましい。なお、本発明において、シート抵抗値（表面抵抗率）は、ＪＩＳ（Japanese Industrial Standards） Ｋ ７１９４に準拠して測定すればよい。
また、本発明において、透明であるとは、透過率が６０〜９９．９９％であることを意味する。透明電極の透過率は、７５％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましい。なお、本発明において、透過率は、ＪＩＳ Ｋ ７３６１−１に準拠して全光線透過率［％］を測定すればよい。

本発明の流路デバイス１０において、第１透明電極６０および第２透明電極６２の材料には制限はなく、各種の電子デバイス（電子装置、電子素子）において、透明電極として利用されている材料が、各種、利用可能である。
具体的には、第１透明電極６０および第２透明電極６２に含まれる材料としては、金属酸化物、カーボンナノチューブ、グラフェン、高分子導電体、金属ナノワイヤー、および、金属メッシュなどが挙げられる。金属酸化物としては、ＩＴＯ（Indium Tin Oxide）等が例示される。カーボンナノチューブとしては、ＣＮＴ（Carbon Nanotube）およびＣＮＢ（Carbon Nanobud）等が例示される。高分子導電体としては、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリフェノール、ポリアニリンおよびＰＥＤＯＴ／ＰＳＳ（ポリエチレンジオキシチオフェン／ポリスチレンスルホン酸）等が例示される。金属ナノワイヤーとしては、銀ナノワイヤーおよび銅ナノワイヤー等が例示される。金属メッシュとしては、銀メッシュおよび銅メッシュ等が例示される。
金属メッシュの透明電極は、金属のみで形成されたものよりも、銀および銅などの導電性微粒子がマトリクスに分散されて形成されたものが、熱収縮率の観点から好ましい。

これらの材料からなる透明電極は、材料に応じた公知の方法で形成すればよい。
例えば、カーボンナノチューブを含む透明電極であれば、カーボンナノチューブを分散してなる塗料を調製して、第１流路部材１２の下面等、透明電極を形成する部分に調製した塗料を塗布して乾燥し、さらに必要に応じて熱処理を行う、塗布法によって、透明電極を形成すればよい。
カーボンナノバッドを含む透明電極であれば、同じく第１流路部材１２の下面等、透明電極を形成する部分に、ＳＩＤ（Society for Information Display） ２０１５ ＤＩＧＥＳＴ １０１２ページに記載されるダイレクト・ドライ・プリンティング（ＤＤＰ）法によって、透明電極を形成すればよい。
さらに、銀ナノワイヤーを含む透明電極であれば、同じく第１流路部材１２の下面等、透明電極を形成する部分に、米国特許出願公開第２０１３／０３４１０７４号明細書の実施例１に記載される方法によって、透明電極を形成すればよい。

ここで、本発明の流路デバイス１０では、第１透明電極６０が形成される第１流路部材１２および第２透明電極６２が形成される保持プレート３８Ｂは、共に、高分子材料によって構成されるのが好ましい。
この点を考慮すると、第１透明電極６０および第２透明電極６２を構成する材料としては、プラズマＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）、スパッタリングおよび真空蒸着等の気相成膜法（気相堆積法）ではなく、塗布法によって形成可能である材料が好ましく、中でも、カーボンナノチューブは好適に例示される。また、本発明の流路デバイス１０では、上述のように、蛍光の観察等も利用可能であるが、金属酸化物等の金属材料の中には、励起光および／または蛍光を吸収して発光する材料もある。この点でも、励起光および／または蛍光を吸収しないカーボンナノチューブは、透明電極の材料として好ましい。

なお、後述するが、本発明の流路デバイスにおいては、透明電極は、本発明のように、第１流路部材１２の下面全面、および、保持プレート３８Ｂの全面に形成する構成に制限されない。

また、透明電極は、様々な形状およびサイズが利用可能である。従って、透明電極は、線状でも面状でもよいが、上述の理由によって、少なくとも一方の透明電極、好ましくは両方の透明電極が、面状電極であるのが好ましい。これにより、十分な面積の電極によって、安定した電気的な測定が可能になる。
なお、本発明において、面状電極とは、第１流路１８および第２流路２４が多孔質膜３０により隔てられている領域の面積よりも大きい面積である電極を示す。
より好ましくは、少なくとも一方の透明電極、好ましくは両方の透明電極が、第１流路部材１２の主面と直交する方向から見た際に、多孔質膜３０を内包する形状およびサイズであるのが好ましい。第１流路部材１２の主面と直交する方向から見た際とは、すなわち上述の平面視と同様である。特に、第１透明電極６０のように多孔質膜３０に当接する透明電極が、このような構成を有することで、多孔質膜３０に形成した細胞層等の面の電気的な性質を取り出すことができ、好ましい。

＜流路デバイスの作製方法＞
本発明の流路デバイス１０を作製する際には、まず、滅菌紙が主面に貼り付けられた多孔質膜３０を準備する。そして、多孔質膜３０の下面３０Ｂの滅菌紙をピンセットによって剥がし、図８に示すように、貫通孔２６が形成された第２流路部材１４の上に多孔質膜３０を載置し、多孔質膜３０と第２流路部材１４とを接合する。

次に、多孔質膜３０の上面３０Ａの滅菌紙をピンセットによって剥がし、顕微鏡で確認しながら、第１透明電極６０が形成された第１流路部材１２と、第２流路部材１４との位置を合わせ、図９に示すように、凹部２０が形成された第１流路部材１２を多孔質膜３０の上に積層する。これにより、第１流路部材１２の凹部２０と多孔質膜３０とによって第１流路１８を画成する。また、第１流路１８は、第１流路部材１２に形成された第１透明電極６０に接触する。

次に、図１０に示すように、互いの貫通孔２２Ａおよび２２Ｂと、４２Ａおよび４２Ｂとの位置を合わせながら、第１流路部材１２の上面に保持プレート３８Ａを載置する。
その後、流路ユニット１６を裏返し、第２流路部材１４の下面に、第２透明電極６２を形成した保持プレート３８Ｂを載置する。これにより、第２流路部材１４の貫通孔２６と、多孔質膜３０と、保持プレート３８Ａとによって第２流路２４を画成する。また、第２流路２４は、保持プレート３８Ｂに形成された第２透明電極６２に接触する。

最後に、図１１に示すように、流路ユニット１６の周囲にスペーサ４６を配置し、保持プレート３８Ａと保持プレート３８Ｂとを、ボルト５０とナット４８とで締め付けることにより、流路デバイス１０を作製する。
なお、上述の作製工程は一例であり、順序が前後してもよい。また、上述の工程に、その他の工程を追加してもよい。

＜その他の実施形態＞
以上、本発明の流路デバイスの一実施形態について説明したが、本発明は、この実施形態に制限されるものでなく、上述の構成以外にも、本発明の主旨を逸脱しない範囲内において、種々、変形して実施可能である。

例えば、第１流路１８に対応する透明電極は、凹部２０を含む第１流路部材１２の下面全面ではなく、第１流路１８（凹部２０）の壁面全面のみに配置してもよく、あるいは、第１流路１８の上面のみに配置してもよく、あるいは、第１流路１８の側面のみに配置してもよい。
同様に、第２流路２４に対応する透明電極は、保持プレート３８Ｂの全面ではなく、保持プレート３８Ｂの第２流路２４に対応する部分のみに配置してもよく、あるいは、第２流路２４（貫通孔２６）の側面のみに配置してもよい。

また、本発明においては、透明電極は、第１流路１８および第２流路２４に接触していなくてもよい。
例えば、第１流路１８に対応する透明電極を第１流路部材１２の上面すなわち多孔質膜３０と逆側の面に配置し、第２流路２４に対応する透明電極を保持プレート３８Ｂの下面すなわち多孔質膜３０と逆側の面に配置する等、第１流路１８に対応する透明電極および第２流路２４に対応する透明電極の少なくとも一方を、流路とは離間して配置してもよい。
透明電極を、第１流路１８および／または第２流路２４と離間して設けることにより、インピーダンスおよび誘電率の測定が可能になる。

すなわち、本発明の流路デバイスにおいては、１対の透明電極は、第１流路１８および第２流路２４（その少なくとも一部）を挟んで設けられれば、様々な位置に、様々な形状で配置可能である。

さらに、本発明の流路デバイス１０は、第１流路部材１２と第２流路部材１４との間に多孔質膜３０を配置し、この積層体を保持プレート３８Ａと保持プレート３８Ｂとで挟持した構成を有するが本発明は、この構成に制限されない。
例えば、保持プレートを用いず、かつ、第２流路２４を画成する貫通孔２６の代わりに、底を有する凹部を有する第２流路部材を用いて、特許文献１に記載される流路デバイス（マイクロチャネルを有する臓器模倣装置）のように、第１流路部材と、多孔質膜と、第２流路部材とで、流路デバイスを構成してもよい。
また、第１流路部材として、第１流路を画成する凹部の代わりに、第１流路を画成する貫通孔を有する第１流路部材を用いて、保持プレートで貫通孔を閉塞する構成であってもよい。この際においては、第１流路に対応する透明電極は、第１流路部材の下面（多孔質膜側の面）に設けてよく、あるいは、保持プレートの主面に設けてもよい。

以上、本発明の流路デバイスについて詳細に説明したが、本発明は上述の例に限定はされず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良や変更を行ってもよいのは、もちろんである。

以下に実施例を挙げて本発明の特徴をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の範囲は、以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。

＜流路デバイスの作製＞
上述した方法で、図１に示すような流路デバイス１０を作製した。
第１流路部材１２および第２流路部材１４はＰＤＭＳ製、保持プレート３８Ａおよび保持プレート３８Ｂはシクロオレフィンポリマー製とした。第１流路１８（凹部２０）および第２流路２４（貫通孔２６）は、共に、幅３００μｍ、深さ３００μｍとした。
また、第１流路部材１２の下面（凹部２０の形成面）および保持プレート３８Ｂの上面（第１流路部材１２側となる面）には、塗布法によって、カーボンナノチューブを含む、厚さ０．５μｍの第１透明電極６０および第２透明電極６２を形成した。同様の透明電極を作製して、上述の方法で確認したところ、第１透明電極６０および第２透明電極６２は、共に、シート抵抗値は３００Ω／□以下、透過率は８０％以上であった。

多孔質膜３０として、ハニカム状に貫通孔３２孔の並んだポリカーボネートのフィルムを準備した。この多孔質膜３０の表面をコラーゲンで被覆した。その後、多孔質膜３０を滅菌紙に挟みこんだ。

多孔質膜３０の一方の面の滅菌紙をピンセットによって剥がした。次いで、滅菌紙を剥がした面を下にして、多孔質膜３０を第２流路部材１４上にセットした（図８参照）。
さらに、綿棒を用いて多孔質膜３０にエタノールを浸し、多孔質膜３０と第２流路部材１４とを接合した。

多孔質膜３０の他方の面の滅菌紙をピンセットによって剥がした。次いで、第１流路部材１２と第２流路部材１４とを位置合わせして、第１流路部材１２を多孔質膜３０の上に積層した（図９参照）。

次いで、互いの貫通孔２２Ａおよび貫通孔２２Ｂと、貫通孔４２Ａおよび貫通孔４２Ｂとを位置合わせして、第１流路部材１２の上面に保持プレート３８Ａを載置した。さらに、積層体を裏返して、第２流路部材１４の下面に保持プレート３８Ｂを配置した（図１０参照）。
さらに、流路ユニット１６の周囲にスペーサ４６を配置し、保持プレート３８Ａと保持プレート３８Ｂとをボルト５０とナット４８とで締め付けて、流路デバイス１０を作製した（図１１参照）。

＜流路デバイス内での細胞培養＞
骨髄由来間葉系幹細胞（Lonza社製）の懸濁液（３×１０^-6ｃｅｌｌｓ/ｍＬ（リットル））を調製した。調製した懸濁液２００μＬを、流路デバイス１０の第２流路２４に注入した。

流路デバイス１０を反転し、ＣＯ₂インキュベーター内に３７℃で３時間静置した後、毎分０．７μＬの速度で培地を流し、一晩、培養した。

次に、CellTracker Orange（Thermo Fischer社製）で染色した、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞（ＣＤＩ社製、ｉＣｅｌｌ ＥＣ）の懸濁液（１×１０^-6ｃｅｌｌｓ/ｍＬ）を調製した。
調製した懸濁液２００μＬを、流路デバイス１の第１流路１８に注入した。

＜細胞の測定＞
倒立蛍光顕微鏡（Olympus社製、ＩＸ８３）を用いて、第１流路１８に注入したｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞の分布を観察した。
次に、蛍光標識デキストラン（Thermo Fischer社製、Ｄ１８３０）を第１流路１８に注入し、倒立蛍光顕微鏡を用いて、第１流路１８に注入した蛍光標識デキストランの分布を観察し、蛍光標識デキストランの第２流路２４への漏れを評価した。
同時に、光検出器（浜松ホトニクス社製、光電子増倍管Ｈ１１９０２−２０）を用いて、第２流路２４を透過してくる光量を検出し、第２流路２４に漏れる蛍光標識デキストランの量を測定した。

次に、第１流路１８にPhenol Red（東京化成工業社製）を注入し、光検出器（ソーラボ社製、差分増幅フォトディテクタＰＤＢ２１０Ａ／Ｍ）を用いて、第２流路２４を透過してくる光量を検出し、第２流路２４に漏れるPhenol Redの量を測定した。この時、蛍光標識デキストランとPhenol Redとでは分子量が異なるため、細胞構造に欠陥があった場合、それぞれの漏れ量を比較することで、欠陥の大きさを定量評価することができる。

ＯＣＴ（Optical Coherence Tomography、特許第６１８４９０５号公報参照）を用い、第１流路１８および第２流路２４内の細胞の立体構造、細胞層の構成、および、細胞層の厚さを測定した。
同時に、第１流路１８に形成した第１透明電極６０および保持プレート３８Ｂに形成した第２透明電極６２に、配線を取り付けて、第１流路１８および第２流路２４内部の電気抵抗を測定する（ＨＩＯＫＩ社製、デジタルマルチメータＤＴ４２８２）ことにより、内部構造の状態を監視した。この電気抵抗値が高いことは、細胞が緻密に配置されていることを示し、低いことは細胞間にすき間が生じていることを表しており、電気抵抗値により細胞構造の状態を定量評価することができる。

以上のように、本発明の流路デバイスを用いて、倒立蛍光顕微鏡による光学的な観察と、複数のトレーサーの光検出と、ＯＣＴと、電気測定とを組み合わせるマルチバリデーションを行うにより、細胞の構造および欠陥サイズを、非破壊および非浸襲で評価することが可能となる。
これに対して、これらの測定の内の、いずれか１つの単独の測定では、欠陥の構造の本来の“すきま”と“欠陥”を区別し、それぞれの大きさを定量することまでは難しい。なお、欠陥とは、細胞が適正に存在できていない異常部分である。
すなわち、本発明の流路デバイスは、マルチバリデーションによる臓器モデル（生体チップ）の解析に、非常に有効である。

生命科学の研究、創薬、薬物の開発および安全性試験、ならびに、化学および生物学的な検定等、各種の分野に好適に利用可能である。

１０ 流路デバイス
１２ 第１流路部材
１２Ａ、１４Ａ 対向面
１４ 第２流路部材
１６ 流路ユニット
１８ 第１流路
２０ 凹部
２０Ａ、２６Ａ 流入口
２０Ｂ、２６Ｂ 流出口
２０Ｃ、２６Ｃ 流路部
２２Ａ、２２Ｂ、２８Ａ、２８Ｂ 貫通孔
２４ 第２流路
２６ 貫通孔
２９ 凹部
３０ 多孔質膜
３０Ａ 上面
３０Ｂ 下面
３２ 貫通孔
３２Ａ 開口
３４ 平坦部
３６ 連通孔
３８Ａ、３８Ｂ 保持プレート
４０ ボルト孔
４２Ａ、４２Ｂ、４４Ａ、４４Ｂ 貫通孔
４６ スペーサ
４８ ナット
５０ ボルト
６０ 第１透明電極
６２ 第２透明電極
７０ 光源
７２ 光センサ
７４ 撮像カメラ
７６ 電気センサ

Claims (12)

1. 第１流路を有する第１流路部材と、
   第２流路を有する第２流路部材と、
   前記第１流路部材と前記第２流路部材との間に設けられ、前記第１流路と前記第２流路とを覆うと共に、隔てている多孔質膜と、
   前記第１流路に接触して前記多孔質膜と対向して設けられる第１透明電極と、
   前記第２流路に接触して前記多孔質膜と対向して設けられる第２透明電極と、を有し、
   前記第１流路は、前記第１流路部材と前記多孔質膜との間に形成され、
   前記第２流路は、前記第２透明電極と前記第２流路部材と前記多孔質膜との間に形成されることを特徴とする流路デバイス。
2. 前記第１流路部材が、前記第１流路を形成する凹部を有する板材である、請求項１に記載の流路デバイス。
3. 前記第１透明電極および前記第２透明電極の少なくとも一方が、面状電極である、請求項１または２に記載の流路デバイス。
4. 前記第１流路部材の主面と直交する方向から見た際に、前記第１透明電極および前記第２透明電極の少なくとも一方が、前記多孔質膜を内包する面状電極である、請求項３に記載の流路デバイス。
5. 前記第１流路部材の前記第１流路の形成面の全面に、前記第１透明電極が形成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の流路デバイス。
6. 前記第２流路部材が、前記第２流路となる貫通孔を有する板材であり、
   さらに、前記第２流路部材に当接して、前記第２流路となる貫通孔を閉塞する保持プレートを有し、
   前記第２透明電極が、前記保持プレートの前記第２流路部材の当接面の全面に形成される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の流路デバイス。
7. 前記第１流路部材、または、前記第１流路部材および前記第２流路部材が、高分子材料で構成され、
   前記第１透明電極および前記第２透明電極が、カーボンナノチューブを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の流路デバイス。
8. 前記保持プレートが高分子材料で構成され、
   前記保持プレートの前記第２流路部材の当接面の全面に形成される前記第２透明電極が、カーボンナノチューブを含む、請求項６に記載の流路デバイス。
9. 前記多孔質膜は、ハニカム状に配列された貫通孔を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の流路デバイス。
10. 前記多孔質膜が、高分子材料で構成される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の流路デバイス。
11. 前記多孔質膜に、細胞が固定されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の流路デバイス。
12. 前記多孔質膜に固定される細胞が、前記多孔質膜の一方の面と他方の面とで異なる細胞である、請求項１１に記載の流路デバイス。

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