JP6889363B2 - Method and apparatus for preparing a cell aggregate structure - Google Patents
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Description
本発明は細胞の集合構造体の作製方法および作製装置に関し、詳しくは培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製方法および作製装置に関する。 The present invention relates to a method and an apparatus for producing an aggregate structure of cells. Specifically, a plurality of cell aggregates are arranged inside a culture vessel containing a culture solution, and the plurality of cell aggregates are cultured and fused with each other. The present invention relates to a method and an apparatus for producing a cell aggregate structure for producing a cell aggregate structure.
損傷を受けた生体機能を幹細胞などを用いて復元させる再生医療においては、細胞を高密度に培養した細胞シートが使用されている。この細胞シートは極めて薄いため、何枚かの細胞シートを重ね合わせる積層化培養細胞シートの製造方法が知られている(特許文献1)。
またこのような細胞シートを重ね合わせる積層化培養細胞シートの製造方法において、積層する細胞シートと細胞シートとの間にハイドロゲル粒子を配置して、積層された部分の細胞に酸素や栄養等を行き渡らせ、より確実に細胞シートを製造する方法も知られている(特許文献2)。
一方、予め細胞を略球状に培養した細胞凝集塊(スフェロイド)を相互に接触した状態に並べて浮遊培養を行い、細胞凝集塊同士が融合した50〜300μmの厚みを有するシート状細胞凝集塊の作製方法も知られている(特許文献3)。
In regenerative medicine in which damaged biological functions are restored using stem cells or the like, cell sheets in which cells are cultured at high density are used. Since this cell sheet is extremely thin, a method for producing a laminated cultured cell sheet in which several cell sheets are laminated is known (Patent Document 1).
Further, in the method for producing a laminated cultured cell sheet in which such cell sheets are laminated, hydrogel particles are arranged between the stacked cell sheets and oxygen, nutrients, etc. are applied to the cells in the laminated portion. A method of spreading and more reliably producing a cell sheet is also known (Patent Document 2).
On the other hand, cell aggregates (spheroids) in which cells are cultured in a substantially spherical shape in advance are arranged in a state of mutual contact and suspension culture is performed to prepare a sheet-like cell aggregate having a thickness of 50 to 300 μm in which the cell aggregates are fused with each other. The method is also known (Patent Document 3).
しかしながら、特許文献1、2のように細胞シートを積層化する場合、細胞シートは極めて薄いことから、取り扱いが難しく自動化することが困難であり、また特許文献3のように細胞凝集塊を浮遊培養してシート状細胞凝集塊を得ようとした場合、整列させた細胞凝集塊に粗密が生じて細胞凝集塊同士が不規則に融合するため、得られるシート状細胞凝集塊の形状が定まらず、厚さも不均一になるという問題があった。
このような問題に鑑み、本発明は所要の形状および寸法を得ることが可能で、かつ機能性を付加することが可能であり、また自動化に対応した細胞の集合構造体の作製方法および作製装置を提供するものである。
However, when cell sheets are laminated as in
In view of such a problem, the present invention can obtain a required shape and dimensions, can add functionality, and can prepare a method and an apparatus for producing an aggregated cell structure corresponding to automation. Is to provide.
すなわち請求項1の発明にかかる細胞の集合構造体の作製方法は、培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製方法において、
上記培養容器の内部に立設された複数のピンとピンとの間に形成される保持部に細胞凝集塊を挟持または収容させる供給工程と、上記保持部に保持された細胞凝集塊を培養して上記集合構造体を形成する培養工程と、当該培養工程で形成された集合構造体を上記保持部から取り出す離脱工程と、当該離脱工程で取り出された集合構造体に開口する上記ピンによる貫通孔に注入物を注入する注入工程とを有することを特徴としている。
That is, in the method for producing a cell aggregate structure according to the invention of
The cultured supply step of clamping or accommodating the cell clumps to the holding portion that will be formed between the plurality of pins and a pin erected on the inside of the culture vessel, the cell aggregate held in the holding portion A culture step of forming an aggregate structure, a detachment step of taking out the aggregate structure formed in the culture step from the holding portion, and an injection into a through hole by the pin opened in the aggregate structure taken out in the detachment step. It is characterized by having an injection step of injecting an object.
また請求項3の発明にかかる細胞の集合構造体の作製装置は、培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置において、
上記培養容器の内部に設けられ複数のピンを立設させた培養保持具と、上記培養保持具のピンとピンとの間に形成される複数の保持部に細胞凝集塊を挟持または収容させる供給手段と、上記培養保持具に保持された細胞凝集塊が培養されて形成された集合構造体を上記培養保持具の上記保持部から取り出す離脱手段と、当該取り出された集合構造体に開口する上記ピンによる貫通孔に注入物を注入する注入手段とを備えることを特徴としている。
Further, in the apparatus for producing a cell aggregate structure according to the invention of
A culture holder was erected a plurality of pins provided in the interior of the culture vessel, and supply means for clamping or accommodating the cell clumps into a plurality of holding portions that will be formed between the pin and the pin of the culture holder With the detaching means for taking out the aggregate structure formed by culturing the cell aggregates held in the culture retainer from the holding portion of the culture holder, and the pin opening in the taken out aggregate structure. It is characterized by being provided with an injection means for injecting an injection into the through hole.
上記請求項1および請求項3の発明によれば、上記培養保持具に設けた複数のピンとピンとの間を保持部として、複数の隣接する保持部で細胞凝集塊を保持するため、各細胞凝集塊は当該保持部で培養されることにより相互に融合し、所要の形状および寸法の細胞の集合構造体を作製することができ、これを自動化することができる。
さらに、このようにして培養された細胞の集合構造体には、上記保持部を構成するピンによって貫通孔が形成されるため、当該貫通孔に注入物を注入することで、機能性を付加した細胞の集合構造体を作製することができる。
According to the first and third aspects of the invention, each cell aggregate is held in a plurality of adjacent holding portions by using a holding portion between the plurality of pins provided in the culture holder and the plurality of adjacent holding portions. By culturing in the holding part, the masses can be fused with each other to form an aggregate structure of cells having a desired shape and size, which can be automated.
Further, since a through hole is formed in the aggregate structure of the cells cultured in this way by the pins constituting the holding portion, the functionality was added by injecting an injection into the through hole. An aggregate structure of cells can be prepared.
以下、図示実施例について説明すると、図1〜図6は第1実施例にかかる細胞の集合構造体の作製装置1を説明するものであって、複数の細胞凝集塊2(スフェロイド:図3参照)を培養容器3の内部で配置し、上記細胞凝集塊2が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体としての癒合パッド4(図4参照)を作製するものとなっている。
上記細胞凝集塊2は、例えば特許第4517125号に開示される方法で作製することができる。すなわち、内面が非接着性の容器に細胞を播種して培養すると、細胞は足場を求めて互いに接着し合うことで凝集して細胞凝集塊2が形成され、これらがさらに融合することで外径寸法が500μm程度の略球状の細胞凝集塊2が形成される。
より効率的には、ウエルプレートの非接着性のウエル(略半球状の収容部)で培養することにより容易に細胞凝集塊2を得ることができる。なお、細胞凝集塊2の作製方法はこれに限らず、旋回している培養液中に細胞懸濁液を入れる旋回培養法、試験管に細胞懸濁液を入れて遠心分離器で沈殿させる方法、あるいはアルギン酸ビーズを用いて培養する方法など公知の様々な方法で作製することができる。
このように、細胞凝集塊2とは、細胞同士が集合し凝集化した100〜700μm程度の外径寸法を有した略球状の細胞集合体を指し、これらの細胞凝集塊2を平面的または立体的に接触または接近させて配置すると、各細胞凝集塊2の細胞が増殖して隣接する細胞凝集塊2と融合し、平面的または立体的な細胞の集合構造体が得られるようになっている。
本実施例で作製する癒合パッド4は、例えば骨、筋肉、内蔵、血管、皮膚などの組織や、臓器、器官を構成する体細胞やその前駆細胞、幹細胞などから作成され、骨や軟骨の欠損部を埋めたり、臓器や器官の表面に貼り付けて使用するものとなっている。
また上記癒合パッド4は、複数の細胞凝集塊2を平面的に配置して融合させたものとなっており、厚さは用いる細胞凝集塊2の寸法に応じて100〜700μm程度のものを作製することが可能で、平面的なサイズは整列させる細胞凝集塊2の個数によって調節可能となっている。
このように作製される上記癒合パッド4は、細胞懸濁液を平面的に培養することで細胞単体をシート状に培養して得られる細胞シートとは異なるものである。
Hereinafter, the illustrated examples will be described. FIGS. 1 to 6 show the
The
More efficiently,
As described above, the
The fusion pad 4 produced in this embodiment is created from, for example, tissues such as bone, muscle, internal organs, blood vessels, and skin, somatic cells constituting the organ, organs, precursor cells thereof, stem cells, and the like, and is defective in bone and cartilage. It is intended to be used by burying a part or pasting it on an organ or the surface of an organ.
Further, the fusion pad 4 is formed by arranging and fusing a plurality of
The fusion pad 4 thus produced is different from the cell sheet obtained by culturing a single cell in a sheet shape by culturing the cell suspension in a plane.
本実施例の細胞の集合構造体の作製装置1は、図1に示す内部が無菌状態に維持されたアイソレータ5と、当該アイソレータ5に接続可能に設けられたインキュベータ6との内部に設けられている。また、アイソレータ5には、搬入物を除染するためのパスボックス5aが設けられている。
図2は上記アイソレータ5の内部に設けられた構成を示し、細胞凝集塊2を収容する収容容器7を支持する収容容器支持部8と、癒合パッド4の培養される培養容器3を支持する培養容器支持部9と、上記細胞凝集塊2を保持する複数の吸引ノズル10と、上記吸引ノズル10を上記収容容器7および培養容器3に対して相対的に移動させる吸引ノズル移動手段11と、培養された癒合パッド4に注入物を注入する注入手段としての注入ノズル12と、上記注入ノズル12を上記培養容器3に対して相対的に移動させる注入ノズル移動手段13とを備えている。
なお、以下の説明において、図2における図示左右方向をX方向、前後方向をY方向、上下方向をZ方向とし、図5では図示左右方向をX方向、上下方向をY方向とする。
The
FIG. 2 shows a configuration provided inside the isolator 5, which supports a storage
In the following description, the left-right direction shown in FIG. 2 is the X direction, the front-back direction is the Y direction, the up-down direction is the Z direction, and in FIG. 5, the left-right direction shown is the X direction and the up-down direction is the Y direction.
上記アイソレータ5は内部が無菌環境に維持され、また無菌エア供給手段によって上方から下方へと向かう無菌エアによる一方向流が形成されるようになっている。
またアイソレータ5の正面には作業者が装着可能なグローブ5bが設けられており、各種の作業を行うことが可能となっている。なお、アイソレータ5の内部にロボットや所要の構成を有した移送手段を設けて、これらの作業を自動的に行うようにすることもできる。
次に、上記インキュベータ6は、内部が無菌環境に維持されるとともに、癒合パッド4の培養に適した所定の温度および湿度に維持され、細胞凝集塊2が融合して癒合パッド4へと形成される間、上記インキュベータ6を上記アイソレータ5より分離して、当該アイソレータ5より離れた場所に載置することが可能となっている。
そのため、上記アイソレータ5とインキュベータ6とは接続手段5cによって接続されており、例えば特許第4656485号公報に記載されるような、インキュベータ6とアイソレータ5とを無菌状態を維持したまま接離させる接続手段を使用することができる。
The inside of the isolator 5 is maintained in a sterile environment, and a unidirectional flow of sterile air is formed from above to below by a sterile air supply means.
Further, a
Next, the inside of the
Therefore, the isolator 5 and the
図3は上記収容容器7の断面図を示し、上述したウエルプレートを使用することができる。収容容器7は平面視において縦横に複数の収容凹部7aを備え、各収容凹部7aの内部には培養液とともに略球状の細胞凝集塊2が一個ずつ収容されている。
上記収容容器7の収容凹部7aは、平面視におけるX方向およびY方向にそれぞれ所定個数ずつ整列しており、本実施例では培養容器3において作製する癒合パッド4を構成する細胞凝集塊2のX方向およびY方向の個数と同数、すなわちX方向に5個、Y方向に5個それぞれ設けられている。
FIG. 3 shows a cross-sectional view of the
The
上記収容容器7を支持する収容容器支持部8は、位置決め片8bによってその上面で上記収容容器7を位置決めするとともに、上記吸引ノズル移動手段11を構成するY方向テーブル8aによって構成されている。
後述するように、本実施例の吸引ノズル10はX方向に5個設けられ、またX方向およびZ方向にのみ移動可能となっていることから、上記Y方向テーブル8aが収容容器7をY方向に移動させることで、吸引ノズル10と収容容器7とをXYZの各方向で相対的に移動させることができる。
具体的に説明すると、最初に上記Y方向テーブル8aが収容容器7の1列目の収容凹部7aを吸引ノズル10の下方に位置させて、当該一列目の収容凹部7aから吸引ノズル10が細胞凝集塊2を吸着保持すると、Y方向テーブル8aが1列分だけY方向に収容容器7を移動させて、2列目の収容凹部7aを吸引ノズル10の下方に位置させるようになっている。
The storage
As will be described later, since five
Specifically, the Y-direction table 8a first positions the
図4に示すように、培養容器3は有底箱状を有しており、内部には所定の深さで培養液が収容されるとともに、底面に設置された底面プレート14と、当該底面プレート14に設置された台座15および当該台座15に立設された複数のピン16から構成される培養保持具と、上記ピン16に沿って上下に移動する支持部材としての支持プレート17とが設けられている。
上記底面プレート14は培養容器3の底面と略同形を有しており、底面プレート14が培養容器3の内部で移動しないように位置決めされている。また上記台座15は直方体形状を有しており、底面プレート14の上面に形成された凹部14aに嵌合して位置決めされるようになっている。
As shown in FIG. 4, the
The
上記ピン16は上記台座15の上面に形成された設置面15aにそれぞれZ方向を向くように規則的に立設されている。
図5は上記台座15に設けられたピン16と、当該ピン16によって保持される細胞凝集塊2についての平面図を示し、本実施例ではX方向およびY方向にそれぞれ5個の細胞凝集塊2を相互に接触した状態で平面的に整列させるようになっている。
上記ピン16は、各細胞凝集塊2の周囲に位置するように設けられており、本実施例では4本のピン16によって細胞凝集塊2を保持する保持部Hを構成している。より具体的には、平面視において4本のピン16が四隅に位置する略正方形の区画を上記保持部Hとしている。
本実施例では、上記保持部Hを構成する4本のピン16のうち、各対角位置の2本のピン16の間隔は、保持する細胞凝集塊2の直径よりも短くなるように配置されている。換言すると、細胞凝集塊2を作製する際に、各対角位置の2本のピン16の間隔よりも直径が大きくなるようにしている。
このように構成された保持部Hに細胞凝集塊2を保持すると、複数のピン16とピン16との間で細胞凝集塊2を挟持することができ、図4(a)のように細胞凝集塊2を上記ピン16の先端と根元との間の上下中間部分に位置させることが可能となる。
換言すると、上記保持部Hを上記複数のピン16を立設した設置面15aから離隔した位置に設定することができ、当該保持部Hに保持された細胞凝集塊2と設置面15aとの間に、培養液が流通可能な隙間gを形成することができる。
またピン16の直径にもよるが、各対角位置の2本のピン16の間隔を細胞凝集塊2の直径よりも短くすることで、各保持部Hの細胞凝集塊2同士を相互に接触させた状態で培養することができるようになっている。
The
FIG. 5 shows a plan view of the
The
In this embodiment, of the four
When the
In other words, the holding portion H can be set at a position separated from the
Further, although it depends on the diameter of the
上記底面プレート14には、上記台座15を挟んで対向した位置に設けられるとともに、Z方向に向けて立設されて上記支持プレート17を上下に貫通する2本の棒状のガイド部材18が設けられ、上記支持プレート17には上記ピン16が貫通する貫通孔17aが穿設されている。
上記構成により、上記支持プレート17は上記ピン16およびガイド部材18に沿ってZ方向に昇降可能に設けられるとともに、通常は自重により上記台座15の設置面15aに載置されるピン16の基端側となる下降位置に位置している。
図4(a)に示す支持プレート17が下降位置に位置した際、上記ピン16の上下中間部分に保持された細胞凝集塊2と上記台座15の設置面15aとの間には、培養液が流通可能な隙間gが形成されるようになっている。
一方、図4(b)に示すように、支持プレート17を上昇させると、支持プレート17は上記ピン16とピン16との間に保持された細胞凝集塊2を下方から支持することができ、上記支持プレート17がピン16の先端側となる上昇位置まで位置することで、細胞凝集塊2が培養された癒合パッド4を上記ピン16の間の保持部Hから取り出すことができるようになっている。
上記支持プレート17の上昇は、グローブ5bを装着した作業者によって行える他、ロボット等によって行うことも可能である。その際、図示しないが上記支持プレート17の上面に上記培養液の液面より上方に突出する把持部材を設けることで、培養液に触れずに支持プレート17を上昇させることが可能となる。
The
With the above configuration, the
When the
On the other hand, as shown in FIG. 4B, when the
The
図2に示すように、培養容器支持部9は上記吸引ノズル移動手段11を構成するY方向テーブル9aによって構成され、上記収容容器支持部8を構成するY方向テーブル8aと同様、吸引ノズル10に吸着保持された細胞凝集塊2が上記ピン16によって構成された保持部Hに供給されるたびに、培養容器3ごとピン16間に設定された保持部Hを上記Y方向に一列ずつ移動させるものとなっている。
As shown in FIG. 2, the culture
次に、上記吸引ノズル10について説明すると、図3に示すように図示しない負圧発生手段に接続された本体部10aと、当該本体部10aの下端部に設けられた管状の吸着部10bとを備えている。
上記吸着部10bの内径は上記細胞凝集塊2より小径となっており、上記収容容器7の収容凹部7aにおいて吸着部10bの先端に細胞凝集塊2を吸着保持した際に、細胞凝集塊2が当該吸着部10bの内部に吸い込まれないようになっている。
また培養容器3においては、上記吸着部10bの中心位置をピン16とピン16との間に形成した保持部Hの略中央に位置させ、かつ細胞凝集塊2を上記ピン16の上下中間位置に位置した状態で上記負圧発生手段による負圧を解消する。
なお細胞凝集塊2を吸着保持する吸引ノズル10に代えて、グリッパなどによって細胞凝集塊2を保持する等の構成を有したものを用いて細胞凝集塊2を保持するようにしてもよい。
Next, the
The inner diameter of the
Further, in the
Instead of the
また上記吸引ノズル10を移動させる吸引ノズル移動手段11は、上記収容容器支持部8および培養容器支持部9にかけてX方向に設けられたX方向レール21と、当該X方向レール21に沿って吸引ノズル10をX方向に移動させるX方向移動手段22と、当該X方向移動手段22に設けられてZ方向に吸引ノズル10を昇降させるZ方向移動手段23と、上記収容容器支持部8および培養容器支持部9における上記Y方向テーブル8a、9aとによって構成されている。なお、吸引ノズル移動手段11としては、Y方向テーブル8a、9aに代えて、上記X方向レール21をY方向に移動させる構成を有したものであってもよい。このような構成とすることで、上記吸引ノズル10や注入ノズル12、後述するカメラ25をX−Y方向に移動させることができる。
Further, the suction nozzle moving means 11 for moving the
また本実施例の吸引ノズル10はX方向に5個整列して設けられ、これら吸引ノズル10は間隔変更手段24によってX方向にその間隔が変更されるようになっている。
具体的には、上記吸引ノズル10が収容容器支持部8の上方に位置した際には、間隔変更手段24は上記収容容器7におけるX方向に整列した収容凹部7aと同じ間隔に上記吸引ノズル10の間隔を変更する。
一方、吸引ノズル10が培養容器支持部9の上方に位置した際には、間隔変更手段24は上記培養容器3の内部のピン16とピン16との間に形成された保持部Hにおける、X方向の間隔と同じ間隔に吸引ノズル10の間隔を変更する。
なお、吸引ノズル10についてはY方向に複数列設けることも可能であり、また収容容器支持部8の収容凹部7aの間隔と、上記ピン16とピン16との間に形成された保持部Hの間隔とが同じ場合には、上記間隔変更手段24を省略することができる。
また例えば上記保持部Hの間隔が狭い場合には、上記吸引ノズル10によって一つおきの保持部Hに細胞凝集塊2を保持させることも可能であり、その場合、最初に奇数番目の保持部Hに細胞凝集塊2を保持させ、その後偶数番目の保持部Hに細胞凝集塊2を保持させるようにすればよい。
なお、吸引ノズル10は少なくとも1本備えられていれば良く、また、細胞凝集塊2の供給手段としては、本実施例のように細胞凝集塊2を移載する構成の他、多数の細胞凝集塊2を収容した容器から1個ずつ繰り出すような構成であっても良い。
Further, five
Specifically, when the
On the other hand, when the
It is possible to provide a plurality of rows of
Further, for example, when the interval between the holding portions H is narrow, it is possible to have every other holding portion H hold the cell aggregates 2 by the
It is sufficient that at least one
図6に示すように、上記注入ノズル12は、図示しない注入物供給手段に接続された本体部12aと、当該本体部12aの下端部に設けられた管状の注入部12bとを備え、後述するように培養された癒合パッド4に開口する貫通孔4aに注入物を注入するものとなっている。
上記注入物供給手段からは、注入物として細胞の培養を促進させる栄養成分や、癒合パッド4を患者に移植した後の生着や成長、周辺組織の再生を促す成長因子や増殖因子、血管の新生を促す細胞懸濁液、移植後の生体に作用する薬物等が、液体、ジェル、ゲル、粒子、顆粒等の状態で供給され、これらは上記注入部12bの先端から排出されて上記癒合パッド4の貫通孔4aに注入されるようになっている。なお、注入は貫通孔4aの上方で行ってもよいし、注入ノズル12を貫通孔4aに挿入して行うこともできる。
このように貫通孔4aに注入することで、注入物を癒合パッド4の内部に埋め込むことができ、注入物を単に癒合パッド4の表面に滴下する場合に比べて多量の注入物を当該癒合パッド4の内部に浸透させることができる。
そして上記注入物が注入された癒合パッド4については、引き続き培養して上記貫通孔4aを塞いでもよいし、そのまま回収して移植に用いることもできる。
As shown in FIG. 6, the
From the above-mentioned injectable supply means, a nutritional component that promotes cell culture as an injectable, growth factors and growth factors that promote engraftment and growth after transplantation of the fusion pad 4 into a patient, and regeneration of surrounding tissues, and blood vessels Cell suspensions that promote neoplasia, drugs that act on the living body after transplantation, etc. are supplied in the form of liquids, gels, gels, particles, granules, etc., and these are discharged from the tip of the
By injecting the injection into the through
Then, the healing pad 4 into which the injection is injected may be continuously cultured to close the through
図2に示すように、注入ノズル12はX方向に4個整列して設けられており、具体的には上記培養容器3の内部でX方向に整列したピン16の間隔と同じ間隔、すなわち癒合パッド4の貫通孔4aと同じ間隔となるように設けられている。
上記注入ノズル12を移動させる注入ノズル移動手段13は、上記吸引ノズル移動手段11と共通して用いられるX方向レール21と、当該X方向レール21に沿って移動する左右移動手段25と、当該左右移動手段25に設けられて注入ノズル12をZ方向に昇降させる上下移動手段26と、上記培養容器支持部9における上記Y方向テーブル9aとによって構成されている。
なお、注入ノズル12は少なくとも1本備えられていれば良く、また、注入ノズル移動手段13は、Y方向テーブル9aを備えず当該注入ノズル12をX方向およびY方向に移動させるよう構成することもできる。
また複数の注入ノズル12を備えて、それらを個別に移動させるよう構成することにより、異なる注入物を注入できるようにすることも可能である。
As shown in FIG. 2, four
The injection nozzle moving means 13 for moving the
It is sufficient that at least one
It is also possible to provide a plurality of
上記X方向レール21には、X方向に移動する横移動手段27にカメラ28が設けられており、当該カメラ28を培養容器支持部9の上方まで移動させて培養容器3の内部を撮影するようになっている。
上記吸引ノズル10によって細胞凝集塊2を保持部Hに保持させる際には、上記カメラ28が撮影した画像により、上記全ての保持部Hに細胞凝集塊2が保持されているか否かを確認し、必要に応じて細胞凝集塊2の保持されていない保持部Hに対して細胞凝集塊2を供給するように指示することができる。
さらに、上記注入ノズル12によって注入物を癒合パッド4に注入する際には、上記カメラ28が撮影した画像により、癒合パッド4の貫通孔4aの位置が認識されるようになっている。
またカメラ28は、上記吸引ノズル移動手段11が吸引ノズル10を培養容器支持部9の上方に位置させる際、ならびに注入ノズル移動手段13が注入ノズル12を培養容器支持部9の上方に位置させる際には、これらとの接触を避けるために培養容器支持部9の上方から退避するようになっている。
The
When the
Further, when the injection material is injected into the fusion pad 4 by the
Further, in the
以下において、上記構成を有する細胞の集合構造体の作製装置1を用いた癒合パッド4の作製方法を説明する。
最初に、上記パスボックス5aを介して上記細胞凝集塊2が収容された収容容器7や培養容器3を上記アイソレータ5内に搬入したり、培養容器3に所定量の培養液を供給する準備工程を行う。
また培養容器3には上記台座15および複数のピン16からなる培養保持具が設置され、また上記支持プレート17は自重により上記台座15の設置面15aに接触した下降位置に位置している。
さらに準備工程において、アイソレータ5の内部に上記収容容器7や培養容器3を複数搬入すれば、複数の培養容器3を用いて複数の癒合パッド4を連続して作製することが可能となる。
Hereinafter, a method for producing the fusion pad 4 using the
First, a preparatory step of carrying the
Further, a culture holder composed of the
Further, in the preparatory step, if a plurality of the
上記準備工程が完了したら、続いて上記吸引ノズル10により上記収容容器7から上記培養容器3へと細胞凝集塊2を移動させて、培養容器3の上記ピン16によって設定された保持部Hに細胞凝集塊2を供給する供給工程を行う。
上記吸引ノズル移動手段11が吸引ノズル10を移動させ、また間隔変更手段24が吸引ノズル10の間隔を変更して、上記収容容器支持部8において収容容器7の収容凹部7aから細胞凝集塊2を吸着保持する。
続いて、吸引ノズル移動手段11が吸引ノズル10を培養容器支持部9へと移動させ、また間隔変更手段24が上記ピン16とピン16との間に形成された保持部Hの間隔に合わせて吸引ノズル10の間隔を変更し、吸引ノズル10を下降させる。
すると、吸引ノズル10に保持された各細胞凝集塊2は4本のピン16の間に形成された保持部Hに挿入され、細胞凝集塊2の下方に隙間gが形成されるよう、上記ピン16の上下中間位置に細胞凝集塊2が保持される。
このようにして全ての保持部Hに細胞凝集塊2が保持されると、その後上記カメラ28が培養容器支持部9の上方に移動して培養容器3内の細胞凝集塊2を撮影し、細胞凝集塊2が所要の保持部Hに配置されているか否かを確認する。
When the preparation step is completed, the
The suction nozzle moving means 11 moves the
Subsequently, the suction nozzle moving means 11 moves the
Then, each
When the cell aggregates 2 are held in all the holding portions H in this way, the
このようにして培養容器3内に細胞凝集塊2が配置されると、ロボットもしくは作業者の手作業により、上記培養容器3はインキュベータ6に移送され、当該培養容器3内の細胞凝集塊2を培養する培養工程が行われる。
まず上記培養容器3をインキュベータ6に移送したら、インキュベータ6を上記アイソレータ5より分離して、アイソレータ5より離隔した位置に載置し、内部を所定の温度、湿度に維持するとともに、所定の炭酸ガスや酸素の濃度を維持する。
培養容器3内において、細胞凝集塊2が培養されると隣接する保持部Hの細胞凝集塊2が相互に融合し、これにより細胞凝集塊2が平面的に配置された形状を維持した細胞の集合構造体としての癒合パッド4を得ることができる。
つまり、各細胞凝集塊2は上記ピン16によって移動が規制されているため、形成される癒合パッド4の寸法を、はじめに細胞凝集塊2を配置した際の大きさと略同一にすることができ、細胞凝集塊2を配置した通りに任意の形状の癒合パッド4を作製することが可能となる。
これは、細胞凝集塊2が接触している上記ピン16の周囲に密着するように増殖または移動し、隣接する細胞凝集塊2同士の間に形成される間隙を埋めるためであり、ピン16を介さず細胞凝集塊2を平面的に配置して培養する場合のように、全体的な寸法はほとんど縮むことがない。
またその際、上記細胞凝集塊2の下方には上記隙間gが形成されていることから、癒合パッド4と台座15の設置面15aとの間に培養液が供給され、癒合パッド4の裏面側についても効率的に培養することができる。
つまり、細胞凝集塊2を上記設置面15aに載置させて癒合パッド4を作製する場合、中央に位置する細胞凝集塊2の下面側には十分に培養液が行き渡らないという問題があったが、細胞凝集塊2を下方に隙間gを形成した状態で保持することにより、当該部分に位置する細胞も良好に培養することが可能となった。
なお、培養中に上記支持プレート17を上下動させるようにすると、培養液の流動が促進されより効果的である。
When the
First, after the
When the
That is, since the movement of each
This is to proliferate or move so as to adhere to the periphery of the
At that time, since the gap g is formed below the
That is, when the
If the
このようにして上記培養工程において培養液を交換しながら培養を進めると、細胞凝集塊2同士が融合し必要な大きさの癒合パッド4が得られるが、癒合パッド4は保持部Hに保持された状態となっており、換言すると癒合パッド4には上記ピン16が貫通したままとなっている。
そこで、保持部Hに保持されている癒合パッド4を保持部Hから取り出す離脱工程を行う。具体的には、インキュベータ6をアイソレータ5に接続して培養容器3をアイソレータ5内部の上記培養容器支持部9に載置し、作業者もしくはロボット等によって上記下降位置に位置した支持プレート17を上昇位置に位置させる。
これにより、癒合パッド4がピン16に沿って上昇され、図4(b)に示すように、上記支持プレート17が上方まで持ち上げられ、この状態で上記支持プレート17をクリップなどの固定具17bで固定するか、または支持プレート17を静かに下降位置へと移動させて、癒合パッド4を上記ピン16の先端部によって下方から支持させることにより、癒合パッド4を上記ピン16の上方に位置させる。
When the culture is advanced while exchanging the culture medium in the above culture step in this way, the cell aggregates 2 are fused to each other to obtain a fusion pad 4 having a required size, but the fusion pad 4 is held by the holding portion H. In other words, the
Therefore, a detaching step is performed in which the healing pad 4 held by the holding portion H is taken out from the holding portion H. Specifically, the
As a result, the healing pad 4 is raised along the
上記離脱工程により癒合パッド4をピン16の上方に位置させたら、続いて上記注入ノズル12によって癒合パッド4に開口している、上記ピン16による貫通孔4aに注入物を注入する注入工程を行う。
具体的には、最初に上記カメラ28が培養容器支持部9の上方に移動して培養容器3内の癒合パッド4を撮影し、当該癒合パッド4の貫通孔4aの位置を認識する。
続いて、上記注入ノズル移動手段13が培養容器支持部9の上方へと注入ノズル12を移動させ、さらに上記癒合パッド4の貫通孔4aの上方へ位置させた後、図6に示すように当該注入ノズル12の注入部12bを癒合パッド4に接近させる。
この状態で注入ノズル12の注入部12bから注入物を放出すると、当該注入物は貫通孔4aの内部に注入される。
このようにして、癒合パッド4の貫通孔4aに注入物が注入されると、そのまま癒合パッド4を使用するために、培養容器3から取り出して搬出用の容器に移して、アイソレータ5から搬出するようにしてもよいし、培養容器3を再びアイソレータ5からインキュベータ6へと移載して引き続き培養を継続して、上記貫通孔4aを完全に塞ぐようにしてもよい。
After the fusion pad 4 is positioned above the
Specifically, the
Subsequently, the injection nozzle moving means 13 moves the
When an injection is discharged from the
When the injection is injected into the through
図7、8は第2実施例としての細胞の集合構造体の作製方法を説明する図であり、本実施例で使用する培養容器3において、上記台座15に固定されるピン16は、癒合パッド4の中央部を保持する第1ピン群(16a)と、癒合パッド4の外周縁部を保持する黒色で示した第2ピン群(16b)とから構成されている。
具体的には、図7において、上記第2ピン群を構成するピン16bは、最外周およびこれよりも一列内側に配置された額縁状に配置されている。このため、供給工程において培養容器3に細胞凝集塊2を収容すると、その最外周に配置された細胞凝集塊2は上記第2ピン群のピン16bによって形成された保持部Hに保持されるようになっている。
また図8に示すように、上記第1ピン群を構成するピン16aは上記第2ピン群を構成するピン16bよりも短くなっており、上記細胞凝集塊2を保持する保持部Hの高さは上記第1ピン群のピン16aの先端部近傍の高さに設定されている。
7 and 8 are views for explaining a method for producing an aggregate structure of cells as a second embodiment, and in the
Specifically, in FIG. 7, the
Further, as shown in FIG. 8, the
上記培養容器3を用いた細胞の集合構造体の作製方法を説明すると、図8(a)に示すように、供給工程では上記第1実施例と同様、上記第1、第2ピン群のピン16a、16bによって形成された保持部Hに細胞凝集塊2を保持させる。
その後培養工程を行い、細胞凝集塊2がある程度融合して培養途中の癒合パッド4が形成されると、当該培養された癒合パッド4を収容した培養容器3をインキュベータ6からアイソレータ5へと移載する。
そして図8(b)に示すように、下降位置に位置した支持プレート17を上下動させて、培養された癒合パッド4を第2ピン群のピン16bの先端部近傍の高さまで移動させ、上記第1ピン群のピン16aの保持部Hから取り出す離脱工程を行う。
これにより、癒合パッド4は上記第2ピン群のピン16bによって支持された状態となり、当該癒合パッド4には第1ピン群のピン16aによる貫通孔4aが開口されている。
Explaining the method for producing the cell aggregate structure using the
After that, a culturing step is performed, and when the cell aggregates 2 are fused to some extent to form a fusion pad 4 in the middle of culturing, the
Then, as shown in FIG. 8B, the
As a result, the fusion pad 4 is in a state of being supported by the
この状態において、上記注入ノズル12により、癒合パッド4の第1ピン群のピン16aによる貫通孔4aに注入物を注入する注入工程を行う。
その後、上記癒合パッド4を再びアイソレータ5からインキュベータ6へと移動させて培養工程を再開し、引き続き培養を行うことで、上記貫通孔4aが培養された細胞によって埋められることとなる。
その際に、貫通孔4aの大きさにもよるが、貫通孔4aが塞がる過程において癒合パッド4が中央部に向けて収縮し、湾曲する場合がある。
これに対し、本実施例では、癒合パッド4の外周縁部を上記第2ピン群のピン16bによって保持しており、癒合パッド4の中央部の収縮が防止され、湾曲のない厚さが均一な癒合パッド4を得ることができる。
In this state, the injection step of injecting the injection into the through
After that, the fusion pad 4 is moved from the isolator 5 to the
At that time, although it depends on the size of the through
On the other hand, in this embodiment, the outer peripheral edge portion of the fusion pad 4 is held by the
上記培養工程が終了し、上記癒合パッド4の中央部に形成された貫通孔4aが塞がると、上記培養容器3をインキュベータ6からアイソレータ5へと移動させて離脱工程を行う。
具体的には、上記支持プレート17を再び下降位置から上昇位置まで上昇させて、癒合パッド4を上記第2ピン群の保持部Hより取り出す。
このようにして得られた癒合パッド4の外周縁部には、それまで貫通していた上記第2ピン群のピン16bによる貫通孔4aが形成されているため、必要に応じて癒合パッド4の外周縁部を切断して除去し、中央部のみを回収するようにしてもよいし、さらに注入工程を実行して第1ピン群のピン16aによる貫通孔4aとは異なる注入物を注入するようにしてもよい。
また、第1ピン群のピン16aによる貫通孔4aには注入物を注入をせずに塞いでしまい、第2ピン群のピン16bによる貫通孔4aに注入するようにすることも可能で、第1ピン群、第2ピン群を選択的に配置して、注入物の注入位置をデザインすることもできる。
When the culture step is completed and the through
Specifically, the
Since the through
Further, it is also possible to block the injection material into the through
図9は第3実施例としての細胞の集合構造体の作製方法を説明する図であり、細胞凝集塊2の直径が保持部Hの各対角位置のピン16の間隔よりも小径であり、当該細胞凝集塊2をピン16とピン16との間で保持できない場合に対応するものとなっている。
具体的には、図10に示すように、作製される癒合パッド4を薄くするために、極力小さな細胞凝集塊2を用いる場合や、作製された細胞凝集塊2の大きさにばらつきがあって、ピン16とピン16とでは保持できずに落下してしまう細胞凝集塊2を含んでいる場合が想定される。
そこで本実施例の供給工程では、図9(a)に示すように、ピン16の間を保持部Hとして細胞凝集塊2を収容させ、上記台座15の設置面15a上の下降位置に位置させた支持プレート17の上面に載置させて、個々の細胞凝集塊2を保持するようになっている。
そして、上記細胞凝集塊2が支持プレート17に載置された状態のままで、当該培養容器3をインキュベータ6に移送して上記培養工程を開始し、図9(b)に示すように細胞凝集塊2が融合するまで培養を行う。
細胞凝集塊2がある程度融合したら、上記支持プレート17を上記ピン16の基端側と先端側との間の中間位置まで上昇させて、上記複数のピン16を立設した設置面15aから離隔した位置を保持部Hとして細胞凝集塊2を保持させるようになっている。
そして本実施例においても、所定の大きさの癒合パッド4が得られたら、培養工程から離脱工程および注入工程に移行する。
FIG. 9 is a diagram illustrating a method of producing a cell aggregate structure as a third embodiment, in which the diameter of the
Specifically, as shown in FIG. 10, there are cases where as small a
Therefore, in the supply step of this embodiment, as shown in FIG. 9A, the
Then, with the
When the cell aggregates 2 were fused to some extent, the
Then, also in this embodiment, when the healing pad 4 having a predetermined size is obtained, the process proceeds from the culture step to the withdrawal step and the injection step.
図11は第4実施例にかかる細胞の集合構造体の作製方法を説明する図となっており、上記第1〜第3実施例において作製した細胞の集合構造体としての平面的な癒合パッド4に対し、本実施例ではZ方向に細胞凝集塊2を整列させた立体的な細胞の集合構造体を作製する方法を説明するものである。
ただし、当該立体的な細胞の集合構造体を作製する場合であっても、上記第1実施例で使用した細胞の集合構造体の作製装置1と同様の構成を有した装置を使用することが可能であり、また略同様の工程を用いて作製することができるため、詳細な説明については省略する。
図11に示す本実施例で使用する培養容器3において、上記ピン16の長さは所望される立体的な細胞の集合構造体の高さに応じて設定され、4本のピン16によって形成された保持部Hには細胞凝集塊2をZ方向に複数保持することが可能となっている。
そして上記供給工程では、上記吸引ノズル10は予め設定された細胞凝集塊2の立体的な配置に基づいて、上記細胞凝集塊2を上記ピン16によって形成された保持部Hに供給する。
具体的には、最初に培養容器支持部9が培養容器3をY方向に順次移動させて、最下段に配置すべき細胞凝集塊2を供給し、その後保持部Hに保持させた細胞凝集塊2の上部に順次細胞凝集塊2を供給するようにすればよい。
この時も、上記各実施例と同様、最下段に位置する細胞凝集塊2の下方に隙間gを形成するようになっており、これにより立体的な細胞の集合構造体の下面への培養液の供給が行われるようにする。また、上記ピン16に支持された立体的な細胞の集合構造体の側面部分と培養容器3の側面部分との間にも隙間が形成されることから、細胞の集合構造体の側面部分にも培養液の供給が行われるようになっており、培養工程において立体的な集合構造体を形成することができる。
そして本実施例においても、上記離脱工程および上記注入工程を行うことにより、保持部Hから取り出した集合構造体の貫通孔に上記注入ノズル12より注入物を注入することができる。この場合、上記注入ノズル12を集合構造体の貫通孔に挿入して、当該貫通孔4aの上下方向の所要の位置に上記注入物を注入するようにしても良い。
FIG. 11 is a diagram illustrating a method for producing a cell aggregate structure according to the fourth embodiment , and is a planar fusion pad 4 as the cell aggregate structure prepared in the first to third examples. On the other hand, in this embodiment, a method for producing a three-dimensional cell aggregate structure in which cell aggregates 2 are arranged in the Z direction will be described.
However, even in the case of producing the three-dimensional cell aggregate structure, it is possible to use an apparatus having the same configuration as the cell aggregate
In the
Then, in the supply step, the
Specifically, first, the culture
At this time as well, as in each of the above examples, a gap g is formed below the
Then, also in this embodiment, by performing the detachment step and the injection step, the injection material can be injected from the
なお、上記各実施例において、上記細胞凝集塊2を支持するピン16の配置としては、複数のピン16によって細胞凝集塊2を支持することが可能であれば、例えば6本のピン16で各細胞凝集塊2を囲繞するように配置してもよい。
その場合、上記保持部Hは千鳥状に配置されることとなり、またこの配置を用いて上記第4実施例のような立体的な細胞の集合構造体を作製することも可能である。
In each of the above examples, the arrangement of the
In that case, the holding portions H are arranged in a staggered pattern, and it is also possible to prepare a three-dimensional cell aggregate structure as in the fourth embodiment by using this arrangement.
さらに上記各実施例において、培養容器3に設けられるピン16の太さや、ピン16によって形成される保持部Hの大きさ、もしくは使用する細胞凝集塊2の直径に応じて、図12に示すようにさまざまな態様が考えられる。
図12に示すピン16の直径は、上記各実施例で示したピン16の直径よりも大径であり、対角位置の2本のピン16の間隔よりも細胞凝集塊2の直径が大きい場合であっても、上記保持部Hに保持された隣接する細胞凝集塊2同士が接触しない場合を示している。
このような場合であっても、上記培養工程において細胞凝集塊2が培養されて隣接する細胞凝集塊2が融合するため、上述したような癒合パッド4を得ることができ、またピン16が大径であるため、癒合パッド4に形成される貫通孔4aも大径となることから、当該貫通孔4aの内部に注入物を大量に注入することが可能となり、ピン16の太さによって注入量を規定することも可能である。
Further, in each of the above examples, as shown in FIG. 12 , depending on the thickness of the
The diameter of the
Even in such a case, since the
上記癒合パッド4に形成された貫通孔4aに注入物として栄養成分や成長因子、増殖因子または薬物等を注入する場合、これら注入物の作用に応じて、例えば一つおきの貫通孔4aに注入して、効果を分散させるようにすることもでき、また癒合パッド4における特定の位置に集中する貫通孔4aにのみ注入物を注入して、癒合パッド4の特定の位置に作用性を持たせることも考えられる。
また、癒合パッド4の所要の部分に血管が形成されるよう、注入物として血管を構成する細胞を含んだ細胞懸濁液を選択的に貫通孔4aに注入することも可能であり、癒合パッド4の用途に応じて、種類の異なる注入物を、貫通孔4aの位置を選択して注入することも可能である。
When a nutritional component, a growth factor, a growth factor, a drug, or the like is injected into the through
Further, it is also possible to selectively inject a cell suspension containing cells constituting the blood vessel as an injection into the through
1 細胞の集合構造体の作製装置 2 細胞凝集塊
3 培養容器 4 癒合パッド(細胞の集合構造体)
10 吸引ノズル 12 注入ノズル
16 ピン 17 支持プレート
H 保持部 g 隙間
1 Equipment for making a cell
10
Claims (4)
上記培養容器の内部に立設された複数のピンとピンとの間に形成される保持部に細胞凝集塊を挟持または収容させる供給工程と、上記保持部に保持された細胞凝集塊を培養して上記集合構造体を形成する培養工程と、当該培養工程で形成された集合構造体を上記保持部から取り出す離脱工程と、当該離脱工程で取り出された集合構造体に開口する上記ピンによる貫通孔に注入物を注入する注入工程とを有することを特徴とする細胞の集合構造体の作製方法。 In a method for producing an aggregate structure of cells, in which a plurality of cell aggregates are arranged inside a culture vessel containing a culture solution and the plurality of cell aggregates are cultured to produce an aggregate structure of cells fused with each other. ,
The cultured supply step of clamping or accommodating the cell clumps to the holding portion that will be formed between the plurality of pins and a pin erected on the inside of the culture vessel, the cell aggregate held in the holding portion A culture step of forming an aggregate structure, a detachment step of taking out the aggregate structure formed in the culture step from the holding portion, and an injection into a through hole by the pin opened in the aggregate structure taken out in the detachment step. A method for producing an aggregate structure of cells, which comprises an injection step of injecting a substance.
上記培養容器の内部に設けられ複数のピンを立設させた培養保持具と、上記培養保持具のピンとピンとの間に形成される複数の保持部に細胞凝集塊を挟持または収容させる供給手段と、上記培養保持具に保持された細胞凝集塊が培養されて形成された集合構造体を上記培養保持具の上記保持部から取り出す離脱手段と、当該取り出された集合構造体に開口する上記ピンによる貫通孔に注入物を注入する注入手段とを備えることを特徴とする細胞の集合構造体の作製装置。 In a cell assembly structure preparation device in which a plurality of cell aggregates are arranged inside a culture vessel containing a culture solution, and the plurality of cell aggregates are cultured to produce a cell aggregate structure fused with each other. ,
A culture holder was erected a plurality of pins provided in the interior of the culture vessel, and supply means for clamping or accommodating the cell clumps into a plurality of holding portions that will be formed between the pin and the pin of the culture holder With the detaching means for taking out the aggregate structure formed by culturing the cell aggregates held in the culture retainer from the holding portion of the culture holder, and the pin opening in the taken out aggregate structure. An apparatus for producing an aggregate structure of cells, which comprises an injection means for injecting an injection into a through hole.
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