JP7041346B2

JP7041346B2 - Cell culture method using gelatin support

Info

Publication number: JP7041346B2
Application number: JP2018034216A
Authority: JP
Inventors: 宗隆本多; 建樹 ▲高▼桑; 徹也東
Original assignee: Shibuya Corp
Current assignee: Shibuya Corp
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2022-03-24
Anticipated expiration: 2038-02-28
Also published as: JP2019146534A

Description

本発明はゼラチン支持体を用いた細胞培養方法に関し、詳しくは複数の細胞凝集塊をゼラチン支持体によって支持しながら培養して、これらが相互に融合した細胞の集合構造体を作成するゼラチン支持体を用いた細胞培養方法に関する。 The present invention relates to a cell culture method using a gelatin support. Specifically, the present invention is a gelatin support that cultures a plurality of cell aggregates while supporting them with the gelatin support to create an aggregate structure of cells in which these are fused with each other. The present invention relates to a cell culture method using.

従来、予め細胞を略球状に培養した細胞凝集塊（スフェロイド）を相互に接触させて培養を行い、細胞凝集塊同士を融合させることで所要の形状を有した細胞の立体構造体を作成させる方法が知られている（特許文献１、２）。
特許文献１では立設させた多数のピンに細胞凝集塊を貫通させ、特許文献２では立設させた多数のピンの間に細胞塊を挿入することで、それぞれ細胞凝集塊を所要の形状に整列させ、その状態で培養を行うことにより細胞凝集塊同士を融合させるようになっている。 Conventionally, a method in which cell aggregates (spheroids) in which cells are cultured in a substantially spherical shape are contacted with each other and cultured, and the cell aggregates are fused to create a three-dimensional structure of cells having a required shape. Is known (Patent Documents 1 and 2).
In Patent Document 1, the cell aggregate is penetrated through a large number of erected pins, and in Patent Document 2, the cell aggregate is inserted between the large number of erected pins to form the cell aggregate into a required shape. By arranging them and culturing them in that state, the cell aggregates are fused with each other.

特許第４５１７１２５号公報Japanese Patent No. 4517125 特開２０１７－７９７１９号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2017-79719

しかしながら、上記特許文献１、２において、上記ピンに細胞凝集塊を貫通させる作業や、ピンとピンとの間に細胞凝集塊を挿入する作業には、高い精度が必要であり、多大な時間を要するという問題があった。
また上記方法では、細胞凝集塊を保持するピンが密集しているため、ピンとピンとの間での培養液の流通が滞り、整列した細胞凝集塊のうち、中央部分に配置された細胞凝集塊の培養不良が生じやすいという問題があった。
さらに、上記方法によって得られた細胞の立体構造体には、上記細胞凝集塊を保持していたピンによる貫通穴が形成されるため、この貫通穴を処理する作業が別途必要になるという問題もあった。
このような問題に鑑み、上記ピンによって保持することなく容易に細胞凝集塊の融合を行うことが可能なゼラチン支持体を用いた細胞培養方法を提供するものである。 However, in Patent Documents 1 and 2, the work of penetrating the cell aggregate through the pin and the work of inserting the cell aggregate between the pins require high accuracy and require a large amount of time. There was a problem.
Further, in the above method, since the pins that hold the cell aggregates are densely packed, the flow of the culture solution between the pins is delayed, and among the aligned cell aggregates, the cell aggregates arranged in the central portion There was a problem that poor culture was likely to occur.
Further, since the three-dimensional structure of the cell obtained by the above method has a through hole formed by the pin holding the cell aggregate, there is also a problem that a work for processing the through hole is required separately. there were.
In view of such a problem, the present invention provides a cell culture method using a gelatin support capable of easily fusing cell aggregates without being held by the above pins.

すなわち請求項１の発明にかかるゼラチン支持体を用いた細胞培養方法は、細胞凝集塊を保持する保持部が形成されるとともに架橋されたゼラチン支持体に、複数の細胞凝集塊を整列させた状態で支持させ、さらに当該ゼラチン支持体ごと上記細胞凝集塊を培養液に浸漬して、ゼラチン支持体を溶解させながら細胞凝集塊を培養することにより、隣接する細胞凝集塊を融合させることを特徴とするものである。 That is, in the cell culture method using the gelatin support according to the invention of claim 1 , a state in which a plurality of cell aggregates are aligned on the gelatin support which is cross-linked while a holding portion for holding the cell aggregates is formed . It is characterized in that adjacent cell aggregates are fused by culturing the cell aggregates while dissolving the gelatin support by immersing the cell aggregates together with the gelatin support in the culture solution. It is something to do.

上記発明によれば、細胞凝集塊をピンによって保持せず、ゼラチン支持体によって支持させればよいため、高精度な作業が不要となり、より迅速に細胞凝集塊を整列させることができる。また得られる細胞の立体構造体に貫通穴が形成されることもない。
さらに、架橋されたゼラチン支持体には空間が形成され、当該空間に培養液を取り込むことが可能であることから、ゼラチン支持体に支持された細胞凝集塊に対して上記空間を介して培養液を供給することができ、支持されたすべての細胞凝集塊に対して良好に培養液を供給することが可能となっている。 According to the above invention, since the cell aggregates may not be held by the pins but supported by the gelatin support, high-precision work is not required, and the cell aggregates can be aligned more quickly. Further, no through hole is formed in the three-dimensional structure of the obtained cell.
Further, since a space is formed in the crosslinked gelatin support and the culture solution can be taken into the space, the culture solution is passed through the space for the cell aggregates supported by the gelatin support. It is possible to supply the culture solution satisfactorily to all the supported cell aggregates.

本実施例における作成装置の構成図Configuration diagram of the creation device in this embodiment アイソレータの内部を示した図Diagram showing the inside of the isolator 収容容器についての拡大図Enlarged view of the containment container 培養容器の内部を説明する図The figure explaining the inside of the culture vessel ゼラチンシートおよび細胞凝集塊についての斜視図Perspective view of gelatin sheet and cell agglomerates ゼラチンシートを作成するための型の断面図Cross section of mold for making gelatin sheet インキュベータの内部を示した図Diagram showing the inside of the incubator 第２実施例における供給工程を説明する図The figure explaining the supply process in 2nd Example 第３実施例における供給工程を説明する図The figure explaining the supply process in 3rd Example

以下、図示実施例について説明すると、図１～図７は第１実施例にかかるゼラチン支持体を用いた細胞培養方法に使用する作成装置１を説明するものであって、複数の細胞凝集塊２（スフェロイド：図３参照）を培養容器３の内部で整列させ、上記細胞凝集塊２が培養されて相互に接合した細胞の集合構造体としての癒合パッド４（図７参照）を作成するものとなっている。
上記細胞凝集塊２は、例えば特許第４５１７１２５号に開示される方法で作成することができる。すなわち、内面が非接着性の容器に細胞を播種して培養すると、細胞は足場を求めて互いに接着し合うことで凝集して細胞凝集塊２が形成され、これらがさらに融合することで略球状の細胞凝集塊２が形成される。
より効率的には、ウエルプレートの非接着性のウエル（略半球状の収容部）で培養することにより容易に細胞凝集塊２を得ることができる。なお、細胞凝集塊２の作成方法はこれに限らず、旋回している培養液中に細胞懸濁液を入れる旋回培養法、試験管に細胞懸濁液を入れて遠心分離器で沈殿させる方法、あるいはアルギン酸ビーズを用いて培養する方法など公知の様々な方法で作製することができる。
このように、細胞凝集塊２は、細胞同士が集合し凝集化した１００～５００μｍ程度の外径寸法を有した略球状の細胞集合体となり、これらの細胞凝集塊２を平面的または立体的に接触または接近させて配置すると、各細胞凝集塊２の細胞が増殖または結合して隣接する細胞凝集塊２と融合し、平面的または立体的な細胞の集合構造体が得られるようになっている。
本実施例で作製する癒合パッド４は、複数の細胞凝集塊２を平面的に配置して融合させたものとなっている。厚さは用いる細胞凝集塊２の寸法に応じて１００～５００μｍ程度のものを作製することが可能で、平面的なサイズは整列させる細胞凝集塊２の個数によって調節可能となっている。
このように作製される上記癒合パッド４は、細胞懸濁液を平面的に培養することで細胞単体をシート状に培養して得られる細胞シートとは異なるものである。 Hereinafter, the illustrated examples will be described. FIGS. 1 to 7 show the production device 1 used in the cell culture method using the gelatin support according to the first embodiment, and a plurality of cell aggregates 2 are described. (Spheroids: see FIG. 3) are aligned inside the culture vessel 3 to create a fusion pad 4 (see FIG. 7) as an aggregate structure of cells in which the cell aggregates 2 are cultured and joined to each other. It has become.
The cell aggregate 2 can be produced, for example, by the method disclosed in Japanese Patent No. 4517125. That is, when cells are seeded and cultured in a container whose inner surface is non-adhesive, the cells adhere to each other in search of a scaffold to aggregate to form a cell agglutination mass 2, and these are further fused to form a substantially spherical shape. Cell agglomerates 2 are formed.
More efficiently, the cell aggregate 2 can be easily obtained by culturing in a non-adhesive well (a substantially hemispherical container) of the well plate. The method for producing the cell aggregate 2 is not limited to this, and a swirling culture method in which the cell suspension is placed in a swirling culture solution, or a method in which the cell suspension is placed in a test tube and precipitated by a centrifuge. Alternatively, it can be produced by various known methods such as a method of culturing using alginate beads.
In this way, the cell aggregate 2 becomes a substantially spherical cell aggregate having an outer diameter of about 100 to 500 μm in which cells are aggregated and aggregated, and these cell aggregates 2 are planarized or sterically formed. When placed in contact or close proximity, the cells of each cell aggregate 2 proliferate or bind and fuse with the adjacent cell aggregate 2 to give a planar or steric cell aggregate structure. ..
The fusion pad 4 produced in this example is formed by arranging and fusing a plurality of cell aggregates 2 in a plane. The thickness can be about 100 to 500 μm depending on the size of the cell aggregate 2 to be used, and the planar size can be adjusted by the number of the cell aggregates 2 to be aligned.
The fusion pad 4 thus produced is different from the cell sheet obtained by culturing a single cell in a sheet shape by culturing the cell suspension in a plane.

本実施例の細胞の集合構造体の作成装置１は、図１に示す内部が無菌状態に維持されたアイソレータ５と、当該アイソレータ５に接続可能に設けられたインキュベータ６との内部に設けられている。また、アイソレータ５には、搬入物を除染するためのパスボックス５ａが設けられている。
図２は上記アイソレータ５の内部に設けられた構成を示し、細胞凝集塊２を収容する収容容器７を支持する収容容器支持部８と、癒合パッド４の培養される培養容器３を支持する培養容器支持部９と、上記細胞凝集塊２を保持する複数の吸引ノズル１０と、上記吸引ノズル１０を上記収容容器７および培養容器３に対して相対的に移動させるノズル移動手段１１とを備えている。
一方、図７は上記インキュベータ６の内部に設けられた構成を示し、培養容器３の細胞凝集塊２もしくは癒合パッド４に培養液を供給する培養液供給手段１２を備えている。
なお、以下の説明において、図２における図示左右方向をＸ方向、前後方向をＹ方向、上下方向をＺ方向とする。 The apparatus 1 for creating an aggregate structure of cells of this embodiment is provided inside an isolator 5 whose inside is maintained in an aseptic state as shown in FIG. 1 and an incubator 6 provided so as to be connectable to the isolator 5. There is. Further, the isolator 5 is provided with a pass box 5a for decontaminating the carried-in material.
FIG. 2 shows a configuration provided inside the isolator 5, which supports a storage container support portion 8 that supports a storage container 7 that stores a cell aggregate 2 and a culture that supports the culture container 3 in which the fusion pad 4 is cultured. A container support portion 9, a plurality of suction nozzles 10 for holding the cell aggregate 2, and a nozzle moving means 11 for moving the suction nozzle 10 relative to the storage container 7 and the culture container 3 are provided. There is.
On the other hand, FIG. 7 shows a configuration provided inside the incubator 6, and includes a culture solution supply means 12 for supplying the culture solution to the cell aggregate 2 or the fusion pad 4 of the culture vessel 3.
In the following description, the left-right direction shown in FIG. 2 is the X direction, the front-back direction is the Y direction, and the up-down direction is the Z direction.

上記アイソレータ５は内部が無菌環境に維持され、また無菌エア供給手段によって上方から下方へと向かう無菌エアによる一方向流が形成されるようになっている。
またアイソレータ５の正面には作業者が装着可能なグローブ５ｂが設けられており、各種の作業を行うことが可能となっている。なお、アイソレータ５の内部にロボットや所要の構成を有した移送手段を設けて、これらの作業を自動的に行うようにすることもできる。
次に、上記インキュベータ６は、内部が無菌環境に維持されるとともに、癒合パッド４の培養に適した所定の温度および湿度に維持され、細胞凝集塊２が融合して癒合パッド４へと形成される間、上記インキュベータ６を上記アイソレータ５より分離して、当該アイソレータ５より離れた場所に載置することが可能となっている。
そのため、上記アイソレータ５とインキュベータ６とは接続手段１３によって接続されており、例えば特許第４６５６４８５号公報に記載されるような、インキュベータ６とアイソレータ５とを無菌状態を維持したまま接離させる接続手段１３を使用することができる。 The inside of the isolator 5 is maintained in a sterile environment, and a one-way flow of sterile air from above to below is formed by the sterile air supply means.
Further, a glove 5b that can be worn by an operator is provided on the front surface of the isolator 5, so that various operations can be performed. It is also possible to provide a robot or a transfer means having a required configuration inside the isolator 5 so that these operations can be performed automatically.
Next, the inside of the incubator 6 is maintained in a sterile environment, and is maintained at a predetermined temperature and humidity suitable for culturing the healing pad 4, and the cell aggregates 2 are fused to form the healing pad 4. During this period, the incubator 6 can be separated from the isolator 5 and placed in a place away from the isolator 5.
Therefore, the isolator 5 and the isolator 6 are connected by the connecting means 13, and for example, as described in Japanese Patent No. 4656485, the connecting means for connecting the incubator 6 and the isolator 5 while maintaining an aseptic state. 13 can be used.

図３は上記収容容器７の断面図を示し、上述したウエルプレートを使用することができる。収容容器７は平面視において縦横に複数の収容凹部７ａを備え、各収容凹部７ａの内部には培養液とともに略球状の細胞凝集塊２が一個ずつ収容されている。
上記収容容器７の収容凹部７ａは、平面視におけるＸ方向およびＹ方向にそれぞれ所定個数ずつ整列しており、本実施例では培養容器３において作製する癒合パッド４を構成する細胞凝集塊２のＸ方向およびＹ方向の個数と同数、すなわちＸ方向に５個、Ｙ方向に５個それぞれ設けられている。 FIG. 3 shows a cross-sectional view of the storage container 7, and the well plate described above can be used. The storage container 7 is provided with a plurality of storage recesses 7a in the vertical and horizontal directions in a plan view, and one substantially spherical cell aggregate 2 is housed inside each storage recess 7a together with the culture solution.
The storage recesses 7a of the storage container 7 are aligned in predetermined numbers in the X direction and the Y direction in a plan view, respectively. In this embodiment, X of the cell aggregate 2 constituting the fusion pad 4 produced in the culture container 3 The same number as the number in the direction and the Y direction, that is, 5 in the X direction and 5 in the Y direction are provided.

上記収容容器７を支持する収容容器支持部８は、位置決め片８ｂによってその上面で上記収容容器７を位置決めするとともに、上記ノズル移動手段１１を構成するＹ方向テーブル８ａによって構成されている。
後述するように、本実施例の吸引ノズル１０はＸ方向に５個設けられ、またＸ方向およびＺ方向にのみ移動可能となっていることから、上記Ｙ方向テーブル８ａが収容容器７をＹ方向に移動させることで、吸引ノズル１０と収容容器７とをＸＹＺの各方向で相対的に移動させることができる。
具体的に説明すると、最初に上記Ｙ方向テーブル８ａが収容容器７の１列目の収容凹部７ａを吸引ノズル１０の下方に位置させて、当該一列目の収容凹部７ａから吸引ノズル１０が細胞凝集塊２を吸着保持すると、Ｙ方向テーブル８ａが１列分だけＹ方向に収容容器７を移動させて、２列目の収容凹部７ａを吸引ノズル１０の下方に位置させるようになっている。 The storage container support portion 8 that supports the storage container 7 is configured by a Y-direction table 8a constituting the nozzle moving means 11 while positioning the storage container 7 on the upper surface thereof by the positioning piece 8b.
As will be described later, since five suction nozzles 10 of this embodiment are provided in the X direction and can be moved only in the X direction and the Z direction, the Y direction table 8a moves the storage container 7 in the Y direction. By moving the suction nozzle 10 and the storage container 7 to XYZ, the suction nozzle 10 and the storage container 7 can be relatively moved in each direction of XYZ.
Specifically, first, the Y-direction table 8a positions the storage recess 7a in the first row of the storage container 7 below the suction nozzle 10, and the suction nozzle 10 aggregates cells from the storage recess 7a in the first row. When the lump 2 is sucked and held, the Y-direction table 8a moves the storage container 7 in the Y direction by one row, and the storage recess 7a in the second row is positioned below the suction nozzle 10.

図４に示すように、培養容器３は有底箱状を有しており、内部には所定の深さで培養液が収容され、当該培養液中には細胞凝集塊２を支持するゼラチン支持体としてのゼラチンシート１４が収容され、当該ゼラチンシート１４は培養容器３の底面に設けられた支持部材１５に位置決めされた状態で支持されている。
また上記ゼラチンシート１４は、図５に示すように略正方形の板状に形成されており、後に詳述するように製造過程で架橋を行うことで乾燥状態では固化しており、また内部には微細な空間が多数形成されている。
上記ゼラチンシート１４には複数の保持部としての貫通穴１４ａが形成されており、当該貫通穴１４ａの位置に細胞凝集塊２を載置すると、当該細胞凝集塊２の下部が貫通穴１４ａに嵌合して移動が阻止されるようになっている。
上記貫通穴１４ａは作成する癒合パッド４の形状に合わせて配置され、隣接する貫通穴１４ａの間隔は、各貫通穴１４ａに載置された細胞凝集塊２同士が接触するか、もしくは極力接近するような間隔に設定されている。
上記貫通穴１４ａは任意の形状とすることが可能であり、円形であってもよいが四角形や三角形等の形状を採用することが望ましい。このような形状を採用することで、載置された細胞凝集塊２と貫通穴１４ａの開口縁との間に隙間が形成され、当該隙間を介して細胞凝集塊２に新鮮な培養液を供給することが可能となる。
また本実施例では、上記ゼラチンシート１４に載置されて整列した上記細胞凝集塊２のさらに上部に２枚目のゼラチンシート１４を載置して、細胞凝集塊２の移動を阻止するようになっており、当該２枚目のゼラチンシート１４にも細胞凝集塊２の位置に合わせて貫通穴１４ａが形成されている。
本実施例では、細胞凝集塊２の載置されるゼラチンシート１４と、細胞凝集塊２の上部に載置される２枚目のゼラチンシート１４とには同形状のものを使用しているが、上下で異なる形状を有したゼラチンシート１４を使用してもよい。 As shown in FIG. 4, the culture vessel 3 has a bottomed box shape, and the culture solution is contained therein at a predetermined depth, and the culture solution contains gelatin support that supports the cell aggregate 2. A gelatin sheet 14 as a body is housed, and the gelatin sheet 14 is supported in a positioned state by a support member 15 provided on the bottom surface of the culture vessel 3.
Further, the gelatin sheet 14 is formed in a substantially square plate shape as shown in FIG. 5, and is solidified in a dry state by cross-linking in the manufacturing process as described in detail later, and inside. Many fine spaces are formed.
A through hole 14a as a plurality of holding portions is formed in the gelatin sheet 14, and when the cell aggregate 2 is placed at the position of the through hole 14a, the lower portion of the cell aggregate 2 fits into the through hole 14a. In addition, movement is blocked.
The through holes 14a are arranged according to the shape of the fusion pad 4 to be created, and the distance between the adjacent through holes 14a is such that the cell aggregates 2 placed in the through holes 14a come into contact with each other or are as close as possible to each other. It is set to such an interval.
The through hole 14a can have any shape, and may be circular, but it is desirable to adopt a shape such as a quadrangle or a triangle. By adopting such a shape, a gap is formed between the placed cell aggregate 2 and the opening edge of the through hole 14a, and a fresh culture solution is supplied to the cell aggregate 2 through the gap. It becomes possible to do.
Further, in this embodiment, a second gelatin sheet 14 is placed on top of the cell aggregate 2 placed and aligned on the gelatin sheet 14 so as to prevent the movement of the cell aggregate 2. The second gelatin sheet 14 also has a through hole 14a formed in accordance with the position of the cell aggregate 2.
In this embodiment, the gelatin sheet 14 on which the cell aggregate 2 is placed and the second gelatin sheet 14 placed on the upper part of the cell aggregate 2 have the same shape. , Gelatin sheets 14 having different shapes on the top and bottom may be used.

上記ゼラチンシート１４の作成方法について説明すると、原料ゼラチンを液体に溶解してゼラチン溶解液とする溶解工程と、上記ゼラチン溶解液を所定形状のゼラチン形成物として形成する形成工程と、上記ゼラチン形成物を架橋してゼラチン架橋体を作製する架橋工程とを経て作成することができ、これらの工程は無菌環境下で行われるようになっている。
上記溶解工程では、原料ゼラチンとして、粉末、顆粒、粒子、固形、ゲル、ジェル等、液体に溶解可能な様々な態様のものを用いることができ、これを純水、生理食塩水、注射用水等の溶媒で溶解させる。
上記形成工程では、最初に上記ゼラチン溶解液を図６に示すような型１０１に注入し、このとき上記型１０１の内部に上記貫通穴１４ａに相当する保持部形成部１０１ａを形成しておくことで、得られるゼラチン形成物に上記貫通穴１４ａを形成することができる。
ここで、ゼラチンシート１４に上記貫通穴１４ａを形成するには、ゼラチン溶解液の液面を図６において点線で示す高さ、すなわち上記保持部形成部１０１ａが液面よりも上方に突出するようにすればよい。
また、保持部は貫通穴である必要はなく、細胞凝集塊２を保持して位置を規制することができれば、貫通しない窪みや凹部であってもよい。このような窪みや凹部からなる保持部を形成するには、ゼラチン溶解液の液面を上記保持部形成部１０１ａよりも高くすればよい。 The method for producing the gelatin sheet 14 will be described as a dissolution step of dissolving the raw material gelatin in a liquid to obtain a gelatin solution, a forming step of forming the gelatin solution as a gelatin-forming product having a predetermined shape, and a gelatin-forming product. It can be produced through a cross-linking step of cross-linking to produce a gelatin cross-linked product, and these steps are performed in a sterile environment.
In the above dissolution step, as the raw material gelatin, various forms such as powder, granules, particles, solids, gels, gels, etc. that can be dissolved in a liquid can be used, and these can be used as pure water, physiological saline, water for injection, etc. Dissolve in the solvent of.
In the formation step, the gelatin solution is first injected into a mold 101 as shown in FIG. 6, and at this time, a holding portion forming portion 101a corresponding to the through hole 14a is formed inside the mold 101. The through hole 14a can be formed in the obtained gelatin-forming product.
Here, in order to form the through hole 14a in the gelatin sheet 14, the liquid surface of the gelatin solution is at the height indicated by the dotted line in FIG. 6, that is, the holding portion forming portion 101a is projected above the liquid surface. It should be.
Further, the holding portion does not have to be a through hole, and may be a recess or a recess that does not penetrate as long as the cell aggregate 2 can be held and the position can be regulated. In order to form a holding portion having such a depression or a recess, the liquid level of the gelatin solution may be higher than that of the holding portion forming portion 101a.

続いて、ゼラチン溶解液が注入された型１０１を凍結乾燥機に投入し、冷却により上記ゼラチン溶解液をゲル化するとともに、さらに凍結乾燥機の内部を減圧しながら低温乾燥することで、型１０１の内部に上記貫通穴１４ａの形成された板状のゼラチン形成物を形成させる。
続いて上記架橋工程では、上記板状のゼラチン形成物を真空オーブンに収容し、これを減圧しながら加熱することで、上記ゼラチン形成物を熱によって架橋し、ゼラチン架橋体としてのゼラチンシート１４を得ることができる。
この架橋工程では、加熱温度や加熱時間を変更することで、ゼラチンシート１４が培養液中において溶解する速度を制御することができる。例えば、ゼラチンシート１４が溶解する速度を、隣接する細胞凝集塊２と細胞凝集塊２とが融合するタイミングに合わせて設定することができる。
なお上記架橋工程において、真空オーブンにおいて減圧下で加熱するのに代えて、不活性ガス中において加熱する方法を用いてもよく、その他にも、ガンマ線や電子線による放射線架橋や、薬剤を用いる化学架橋を採用してもよい。 Subsequently, the mold 101 in which the gelatin lysate is injected is put into a freeze-dryer, and the gelatin lysate is gelled by cooling, and the inside of the freeze-dryer is further dried at a low temperature while reducing the pressure to cause the mold 101. A plate-shaped gelatin-forming product having the through hole 14a formed therein is formed inside the above.
Subsequently, in the cross-linking step, the plate-shaped gelatin-forming product is housed in a vacuum oven and heated while reducing the pressure, thereby cross-linking the gelatin-forming product by heat to obtain a gelatin sheet 14 as a gelatin cross-linked product. Obtainable.
In this cross-linking step, the rate at which the gelatin sheet 14 dissolves in the culture solution can be controlled by changing the heating temperature and the heating time. For example, the rate at which the gelatin sheet 14 dissolves can be set according to the timing at which the adjacent cell aggregates 2 and the cell aggregates 2 fuse.
In the above-mentioned cross-linking step, instead of heating under reduced pressure in a vacuum oven, a method of heating in an inert gas may be used, and in addition, radiation cross-linking with gamma rays or electron beams, or chemistry using chemicals may be used. Cross-linking may be adopted.

上記培養容器３に設けられた支持部材１５は、例えばゼラチンシート１４の四隅を下方から支持するとともに、上記吸引ノズル１０が細胞凝集塊２を上記貫通穴１４ａに載置できるよう、当該ゼラチンシート１４を所定の位置に保持するようになっている。
上記支持部材１５によってゼラチンシート１４を培養容器３の底面より上方となる位置で支持することで、ゼラチンシート１４の下方に培養液が流通する空間を確保するようになっている。
また支持部材１５については、ゼラチンシート１４の下面側が培養液に極力接触できるような構成であればよく、例えば四隅に設けた支持部材１５の上部に網目状のネットを設けて、当該ネット上にゼラチンシート１４を載置するようにしてもよい。 The support member 15 provided in the culture vessel 3 supports, for example, the four corners of the gelatin sheet 14 from below, and the gelatin sheet 14 allows the suction nozzle 10 to place the cell aggregate 2 in the through hole 14a. Is designed to be held in place.
By supporting the gelatin sheet 14 at a position above the bottom surface of the culture vessel 3 by the support member 15, a space for the culture solution to flow is secured below the gelatin sheet 14.
The support member 15 may be configured so that the lower surface side of the gelatin sheet 14 can come into contact with the culture solution as much as possible. For example, a mesh-like net is provided on the upper part of the support member 15 provided at the four corners, and the net is placed on the net. The gelatin sheet 14 may be placed on the surface.

図２に示すように、培養容器支持部９は上記ノズル移動手段１１を構成するＹ方向テーブル９ａによって構成され、上記収容容器支持部８を構成するＹ方向テーブル８ａと同様、吸引ノズル１０に吸着保持された細胞凝集塊２が上記ゼラチンシート１４の貫通穴１４ａに載置されるたびに、培養容器３ごと上記貫通穴１４ａをＹ方向に一列ずつ移動させるものとなっている。 As shown in FIG. 2, the culture container support portion 9 is composed of a Y-direction table 9a constituting the nozzle moving means 11, and is attracted to the suction nozzle 10 like the Y-direction table 8a constituting the storage container support portion 8. Each time the retained cell aggregate 2 is placed in the through hole 14a of the gelatin sheet 14, the through hole 14a is moved in a row in the Y direction together with the culture vessel 3.

次に、上記吸引ノズル１０について説明すると、図３に示すように図示しない負圧発生手段に接続された本体部１０ａと、当該本体部１０ａの下端部に設けられた管状の吸着部１０ｂとを備えている。
また本実施例の吸引ノズル１０は図２に示すようにＸ方向に５個整列して設けられ、これら吸引ノズル１０は間隔変更手段１６によってＸ方向にその間隔が変更することが可能となっている。
上記吸着部１０ｂの内径は上記細胞凝集塊２より小径となっており、上記収容容器７の収容凹部７ａにおいて吸着部１０ｂの先端に細胞凝集塊２を吸着保持した際に、細胞凝集塊２が当該吸着部１０ｂの内部に吸い込まれないようになっている。
また培養容器３においては、上記吸着部１０ｂの中心位置を上記ゼラチンシート１４の貫通穴１４ａに位置させ、上記負圧発生手段による負圧を解消することで、細胞凝集塊２をゼラチンシート１４に載置するようになっている。
上記間隔変更手段１６は、上記吸引ノズル１０を上記収容容器７の収容凹部７ａと同じ間隔か、もしくはゼラチンシート１４に形成された貫通穴１４ａと同じ間隔に変更するようになっている。
なお、吸引ノズル１０は少なくとも１本備えられていれば良く、また、細胞凝集塊２の供給手段としては、本実施例のように細胞凝集塊２を移載する構成の他、多数の細胞凝集塊２を収容した容器から１個ずつ繰り出すような構成であっても良い。
また細胞凝集塊２を吸着保持する吸引ノズル１０に代えて、グリッパなどによって細胞凝集塊２を保持する等の構成を有したものを用いて細胞凝集塊２を保持するようにしてもよい。 Next, the suction nozzle 10 will be described as follows: as shown in FIG. 3, a main body portion 10a connected to a negative pressure generating means (not shown) and a tubular suction portion 10b provided at the lower end portion of the main body portion 10a. I have.
Further, as shown in FIG. 2, five suction nozzles 10 of this embodiment are provided so as to be aligned in the X direction, and the intervals of these suction nozzles 10 can be changed in the X direction by the interval changing means 16. There is.
The inner diameter of the adsorption portion 10b is smaller than that of the cell aggregate 2, and when the cell aggregate 2 is adsorbed and held at the tip of the adsorption portion 10b in the accommodation recess 7a of the storage container 7, the cell aggregate 2 is formed. It is designed so that it is not sucked into the suction portion 10b.
Further, in the culture vessel 3, the center position of the adsorption portion 10b is positioned in the through hole 14a of the gelatin sheet 14, and the negative pressure generated by the negative pressure generating means is eliminated, so that the cell aggregate 2 is formed on the gelatin sheet 14. It is designed to be placed.
The interval changing means 16 is adapted to change the suction nozzle 10 to the same interval as the accommodating recess 7a of the accommodating container 7 or the same interval as the through hole 14a formed in the gelatin sheet 14.
It is sufficient that at least one suction nozzle 10 is provided, and as a means for supplying the cell aggregate 2, in addition to the configuration in which the cell aggregate 2 is transferred as in the present embodiment, a large number of cell aggregates are required. The configuration may be such that the lumps 2 are unwound one by one from the container containing the lumps 2.
Further, instead of the suction nozzle 10 that adsorbs and holds the cell aggregate 2, a device having a structure such as holding the cell aggregate 2 by a gripper or the like may be used to hold the cell aggregate 2.

そして上記吸引ノズル１０を移動させるノズル移動手段１１は、上記収容容器支持部８および培養容器支持部９にかけてＸ方向に設けられたＸ方向レール２１と、当該Ｘ方向レール２１に沿って吸引ノズル１０をＸ方向に移動させるＸ方向移動手段２２と、当該Ｘ方向移動手段２２に設けられてＺ方向に吸引ノズル１０を昇降させるＺ方向移動手段２３と、上記収容容器支持部８および培養容器支持部９における上記Ｙ方向テーブル８ａ、９ａとによって構成されている。
なお、ノズル移動手段１１としては、Ｙ方向テーブル８ａ、９ａに代えて、上記Ｘ方向レール２１をＹ方向に移動させる構成を有したものであってもよい。このような構成とすることで、上記吸引ノズル１０や後述するカメラ２４をＸ－Ｙ方向に移動させることができる。
また上記Ｘ方向レール２１にはＸ方向に移動するカメラ２４が設けられており、上記カメラ２４は上記吸引ノズル１０によって細胞凝集塊２がゼラチンシート１４に載置されると、培養容器支持部９の上方まで移動して培養容器３内のゼラチンシート１４を撮影するようになっている。
撮影された画像により、上記全ての貫通穴１４ａに細胞凝集塊２が載置されているか否かが確認され、必要に応じて細胞凝集塊２の載置されていない貫通穴１４ａに対して細胞凝集塊２を供給するよう、指示することができる。
またカメラ２４は、上記ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を培養容器支持部９の上方に位置させる際には、吸引ノズル１０との接触を避けるために培養容器支持部９の上方から退避するようになっている。 The nozzle moving means 11 for moving the suction nozzle 10 is an X-direction rail 21 provided in the X direction over the storage container support portion 8 and the culture container support portion 9, and a suction nozzle 10 along the X-direction rail 21. X-direction moving means 22 that moves the It is composed of the above-mentioned Y direction tables 8a and 9a in 9.
The nozzle moving means 11 may have a configuration in which the X-direction rail 21 is moved in the Y direction instead of the Y-direction tables 8a and 9a. With such a configuration, the suction nozzle 10 and the camera 24 described later can be moved in the XY directions.
Further, the X-direction rail 21 is provided with a camera 24 that moves in the X-direction. When the cell aggregate 2 is placed on the gelatin sheet 14 by the suction nozzle 10, the culture container support portion 9 is provided. The gelatin sheet 14 in the culture vessel 3 is photographed by moving to the upper part of the culture vessel 3.
From the captured image, it is confirmed whether or not the cell aggregate 2 is placed in all the through holes 14a, and if necessary, the cells are placed in the through hole 14a in which the cell aggregate 2 is not placed. You can instruct to supply the agglomerates 2.
Further, when the nozzle moving means 11 positions the suction nozzle 10 above the culture container support portion 9, the camera 24 retracts from above the culture container support portion 9 in order to avoid contact with the suction nozzle 10. It has become.

図７はインキュベータ６の内部に設けられた、培養途中の癒合パッド４に培養液を供給する培養液供給手段１２を示し、インキュベータ６の内部に複数の培養容器３を収容する場合には、各培養容器３のそれぞれについて上記培養液供給手段１２を設けることができる。
上記培養液供給手段１２は、培養液を送液する送液ポンプ３１と、当該送液ポンプ３１に接続された配管３１ａ、３１ｂとから構成されている。
上記送液ポンプ３１は、配管３１ａにより培養容器３における上方側から培養液を吸引するとともに、当該培養液を配管３１ｂにより培養容器３へと流入させ、培養容器３内において培養液を循環させるようになっている。
また、これら培養液の供給動作の前処理として、必要に応じて培養液の栄養分の補給や、酸素や炭酸ガスの供給、およびｐＨの調整を行うようにしてもよい。 FIG. 7 shows a culture solution supply means 12 provided inside the incubator 6 for supplying the culture solution to the fusion pad 4 in the middle of culture, and when a plurality of culture containers 3 are housed inside the incubator 6, each of them is shown. The culture solution supply means 12 can be provided for each of the culture containers 3.
The culture solution supply means 12 is composed of a liquid feed pump 31 for feeding the culture liquid and pipes 31a and 31b connected to the liquid feed pump 31.
The liquid feed pump 31 sucks the culture solution from the upper side of the culture vessel 3 by the pipe 31a, and causes the culture solution to flow into the culture vessel 3 by the pipe 31b, so that the culture solution is circulated in the culture vessel 3. It has become.
Further, as a pretreatment for the supply operation of these culture solutions, the nutrients of the culture solution may be replenished, oxygen or carbon dioxide gas may be supplied, and the pH may be adjusted, if necessary.

以下、上記構成を有する細胞の集合構造体の作成装置１を用いた癒合パッド４の作成方法を説明する。
最初に、上記パスボックス５ａを介して上記細胞凝集塊２が収容された収容容器７や培養容器３、上記ゼラチンシート１４を上記アイソレータ５内に搬入したり、その他の培養操作に必要な準備を行う準備工程を行う。
上記準備工程では、培養容器３に所定量の培養液を収容するとともに、上記支持部材１５に上記ゼラチンシート１４を設置する作業を行い、このとき培養容器３に収容する培養液は、当該培養液の液面からゼラチンシート１４の上面までの深さを極力浅く、例えば細胞凝集塊２約一個分の深さとなるようにすることが望ましい。
さらに準備工程において、アイソレータ５の内部に上記収容容器７や培養容器３を複数搬入すれば、複数の培養容器３を用いて複数の癒合パッド４を連続して作成することが可能となる。 Hereinafter, a method for creating a fusion pad 4 using the apparatus 1 for creating an aggregate structure of cells having the above configuration will be described.
First, the storage container 7 and the culture container 3 in which the cell aggregate 2 is housed, the gelatin sheet 14 are carried into the isolator 5 via the pass box 5a, and other preparations necessary for the culture operation are performed. Perform the preparatory process.
In the preparation step, a predetermined amount of the culture solution is contained in the culture container 3, and the gelatin sheet 14 is placed on the support member 15, and the culture solution contained in the culture container 3 at this time is the culture solution. It is desirable that the depth from the liquid surface to the upper surface of the gelatin sheet 14 is as shallow as possible, for example, the depth of about one cell agglomerate.
Further, in the preparation step, if a plurality of the storage containers 7 and the culture containers 3 are carried into the isolator 5, a plurality of fusion pads 4 can be continuously produced by using the plurality of culture containers 3.

上記準備工程が完了したら、続いて上記吸引ノズル１０を用いて、上記培養容器３に収容された上記ゼラチンシート１４に細胞凝集塊２を載置して整列させる供給工程を行う。
まず、上記ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を移動させ、また間隔変更手段１６が吸引ノズル１０の間隔を変更して、吸引ノズル１０が上記収容容器支持部８において収容容器７の収容凹部７ａから細胞凝集塊２を吸着保持する。
続いて、ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を培養容器支持部９へと移動させ、また間隔変更手段１６がゼラチンシート１４の貫通穴１４ａの間隔に合わせて吸引ノズル１０の間隔を変更し、吸引ノズル１０を下降させる。
すると、吸引ノズル１０に保持された各細胞凝集塊２はゼラチンシート１４の貫通穴１４ａに載置され、細胞凝集塊２は上記貫通穴１４ａによって移動が規制されることから、細胞凝集塊２が所要の形状に整列されることとなる。
なお、図面では説明のため細胞凝集塊２を縦横に５個ずつ正方形に整列させているが、例えば縦横２ｃｍ四方の寸法からなるゼラチンシート１４を用いた場合、細胞凝集塊２を縦横に数十～百数十個ずつ整列させることが可能である。 After the preparation step is completed, the suction nozzle 10 is used to perform a supply step of placing and aligning the cell aggregate 2 on the gelatin sheet 14 housed in the culture vessel 3.
First, the nozzle moving means 11 moves the suction nozzle 10, and the interval changing means 16 changes the interval between the suction nozzles 10, so that the suction nozzle 10 moves from the storage recess 7a of the storage container 7 in the storage container support portion 8. Adsorbs and retains cell aggregate 2.
Subsequently, the nozzle moving means 11 moves the suction nozzle 10 to the culture vessel support portion 9, and the spacing changing means 16 changes the spacing of the suction nozzles 10 according to the spacing of the through holes 14a of the gelatin sheet 14, and sucks. Lower the nozzle 10.
Then, each cell aggregate 2 held by the suction nozzle 10 is placed in the through hole 14a of the gelatin sheet 14, and the movement of the cell aggregate 2 is restricted by the through hole 14a. It will be aligned to the required shape.
In the drawing, the cell aggregates 2 are arranged in a square shape by 5 in each of the vertical and horizontal directions for the sake of explanation. It is possible to arrange up to a hundred and several tens of pieces at a time.

ここで、図４に示すように培養液の液面からゼラチンシート１４の上面までの深さを細胞凝集塊２約一個分となるようにしたことで、ゼラチンシート１４に載置された細胞凝集塊２の全体が直ちに培養液中に浸漬されて、細胞凝集塊２の乾燥が防止されるようになっている。
また液面までの深さを極力浅くしたことで、ゼラチンシート１４の上面に細胞凝集塊２を載置する際に、既にゼラチンシート１４に載置されている細胞凝集塊２の移動を極力防止することができる。
このようにして全ての貫通穴１４ａに細胞凝集塊２が載置されると、その後上記カメラ２４が培養容器支持部９の上方に移動して培養容器３内の細胞凝集塊２を撮影し、細胞凝集塊２が全ての貫通穴１４ａに収容されているか否かを確認する。 Here, as shown in FIG. 4, the depth from the liquid surface of the culture solution to the upper surface of the gelatin sheet 14 is set to be about one cell aggregate mass, so that the cell aggregation placed on the gelatin sheet 14 is formed. The entire mass 2 is immediately immersed in the culture solution to prevent the cell aggregate 2 from drying out.
In addition, by making the depth to the liquid surface as shallow as possible, when the cell aggregate 2 is placed on the upper surface of the gelatin sheet 14, the movement of the cell aggregate 2 already placed on the gelatin sheet 14 is prevented as much as possible. can do.
When the cell aggregates 2 are placed in all the through holes 14a in this way, the camera 24 then moves above the culture vessel support portion 9 to photograph the cell aggregates 2 in the culture vessel 3. It is confirmed whether or not the cell aggregate 2 is contained in all the through holes 14a.

さらに上記供給工程では、上記ゼラチンシート１４に細胞凝集塊２を整列させた後に、整列した細胞凝集塊２の上部に２枚目のゼラチンシート１４を載置し、細胞凝集塊２の移動を防止するようになっている。
このゼラチンシート１４にも細胞凝集塊２の位置に合わせて貫通穴１４ａが穿設されていることから、当該ゼラチンシート１４を整列した細胞凝集塊２の上部に載置することで、上記貫通穴１４ａが細胞凝集塊２の上部に嵌合し、細胞凝集塊２の移動が阻止されるようになっている。
細胞凝集塊２の上部にゼラチンシート１４を載置したら、続いて上記培養容器３に培養液を追加投入し、これにより整列した細胞凝集塊２の上方に培養液が満たされ、培養容器３内に十分な量の培養液が収容されることとなる。 Further, in the supply step, after the cell aggregates 2 are aligned on the gelatin sheet 14, a second gelatin sheet 14 is placed on the aligned cell aggregates 2 to prevent the cell aggregates 2 from moving. It is designed to do.
Since the gelatin sheet 14 is also provided with a through hole 14a in accordance with the position of the cell aggregate 2, the through hole can be placed on the upper part of the aligned cell aggregate 2 by placing the gelatin sheet 14 on the aligned cell aggregate 2. 14a is fitted on the upper part of the cell aggregate 2 to prevent the movement of the cell aggregate 2.
After the gelatin sheet 14 is placed on the cell aggregate 2, the culture solution is additionally added to the culture vessel 3, and the culture solution is filled above the aligned cell aggregates 2 in the culture vessel 3. Will contain a sufficient amount of culture medium.

上記供給工程によって培養容器３内に細胞凝集塊２が配置されると、ロボットもしくは作業者の手作業により、上記培養容器３をインキュベータ６に移送し、当該培養容器３内の細胞凝集塊２を培養する培養工程を行う。
まず上記培養容器３をインキュベータ６に移送すると、図７に示すように上記培養液供給手段１２の配管３１ａ、３１ｂをそれぞれ培養容器３の内部に設置し、培養液の循環を開始する。
その後、インキュベータ６を上記アイソレータ５より分離して、アイソレータ５より離隔した位置に載置し、内部を所定の温度、湿度に維持するとともに、所定の炭酸ガスや酸素の濃度を維持する。
これにより、培養容器３内では細胞凝集塊２が培養され、細胞凝集塊２が平面的に配置された形状を維持したまま相互に融合し、細胞の集合構造体としての癒合パッド４を得ることができる。
つまり、細胞凝集塊２を配置した通りに任意の形状の癒合パッド４を作成することが可能であり、また細胞凝集塊２は上記ゼラチンシート１４に形成した貫通穴１４ａによって隙間なく整列しているため、上記癒合パッド４の厚さは略均一となる。 When the cell aggregate 2 is arranged in the culture vessel 3 by the supply step, the culture vessel 3 is manually transferred to the incubator 6 by a robot or a worker, and the cell aggregate 2 in the culture vessel 3 is transferred. Perform the culture step of culturing.
First, when the culture container 3 is transferred to the incubator 6, the pipes 31a and 31b of the culture solution supply means 12 are installed inside the culture container 3, respectively, as shown in FIG. 7, and the circulation of the culture solution is started.
After that, the incubator 6 is separated from the isolator 5 and placed at a position separated from the isolator 5, the inside is maintained at a predetermined temperature and humidity, and the concentration of carbon dioxide gas or oxygen is maintained.
As a result, the cell aggregates 2 are cultured in the culture vessel 3, and the cell aggregates 2 are fused with each other while maintaining the shape arranged in a plane to obtain a fusion pad 4 as an aggregate structure of cells. Can be done.
That is, it is possible to create a healing pad 4 having an arbitrary shape as the cell aggregate 2 is arranged, and the cell aggregate 2 is aligned without a gap by the through hole 14a formed in the gelatin sheet 14. Therefore, the thickness of the healing pad 4 is substantially uniform.

この培養工程において、本実施例では上記細胞凝集塊２をゼラチンシート１４の上面に載置して整列させることで、細胞凝集塊２の培養を良好に行うことが可能となっている。
すなわち、形成した貫通穴１４ａの隙間を培養液が流通することに加え、上記ゼラチンシート１４は架橋により内部に微小な空間が形成されていることから、当該空間に培養液が流入し、当該空間を介してゼラチンシート１４に接触している細胞凝集塊２に培養液を供給することが可能となっている。
ここで、ゼラチンシート１４の厚さを薄くした場合には、上記培養液供給手段１２によって培養容器３を流通する培養液がゼラチンシート１４の上記空間を通過し、またゼラチンシート１４を厚くした場合には、ゼラチンシート１４に形成された空間に培養液を取り込むことにより、培養液を細胞凝集塊２に供給することができる。
このように、ゼラチンシート１４の空間に培養液を取り込むことで、整列した細胞凝集塊２のうち、特に中央部分に配置された細胞凝集塊２に対しても培養液を供給することができ、癒合パッド４を確実に得ることができる。
そして、上記培養工程を開始し、上記細胞凝集塊２が培養されると、図７に示すように上記ゼラチンシート１４は徐々に溶解するが、このとき上記ゼラチンシート１４を作成する際の架橋工程において架橋の度合いを調整しておくことで、隣接する細胞凝集塊２と細胞凝集塊２とが接合するタイミングに合わせてゼラチンシート１４を消滅させることができる。
また上記ゼラチンシート１４については、無菌状態下で製造しているため、仮に得られた癒合パッド４にゼラチンシート１４の成分が残存していても、安全に使用することができる。 In this culturing step, in this example, by placing and aligning the cell aggregate 2 on the upper surface of the gelatin sheet 14, it is possible to cultivate the cell aggregate 2 satisfactorily.
That is, in addition to the culture solution flowing through the gaps of the formed through holes 14a, the gelatin sheet 14 has a minute space formed inside by cross-linking, so that the culture solution flows into the space and the space is concerned. It is possible to supply the culture solution to the cell aggregate 2 in contact with the gelatin sheet 14 via the above.
Here, when the thickness of the gelatin sheet 14 is reduced, the culture solution flowing through the culture vessel 3 by the culture solution supply means 12 passes through the space of the gelatin sheet 14, and the gelatin sheet 14 is thickened. The culture solution can be supplied to the cell aggregate 2 by taking the culture solution into the space formed in the gelatin sheet 14.
In this way, by taking the culture solution into the space of the gelatin sheet 14, the culture solution can be supplied to the cell aggregates 2 arranged in the central portion among the aligned cell aggregates 2. The healing pad 4 can be surely obtained.
Then, when the culture step is started and the cell aggregate 2 is cultured, the gelatin sheet 14 gradually dissolves as shown in FIG. 7, but at this time, the cross-linking step when the gelatin sheet 14 is prepared. By adjusting the degree of cross-linking in the above, the gelatin sheet 14 can be extinguished at the timing when the adjacent cell agglomerates 2 and the cell agglomerates 2 are joined.
Further, since the gelatin sheet 14 is manufactured under aseptic conditions, it can be safely used even if the components of the gelatin sheet 14 remain on the obtained healing pad 4.

上記培養工程により細胞凝集塊２が培養されて癒合パッド４が作成されると、インキュベータ６をアイソレータ５に接続して、当該癒合パッド４を培養容器３から回収する回収工程を行う。
回収工程では、培養容器３中のゼラチンシート１４が溶解して消滅しているため、培養容器３から癒合パッド４のみを容易に取り出すことが可能となっており、ロボットや作業者によって所要の容器に移し替えて回収することができる。
なお、上記培養工程と回収工程との間に、所定期間ごとにインキュベータ６をアイソレータ５に接続して、培養途中の癒合パッド４の培養状態を検査する検査工程や、培地の交換を行う培地交換工程を行うようにしてもよい。 When the cell aggregate 2 is cultured and the fusion pad 4 is created by the above culture step, an incubator 6 is connected to the isolator 5 and a recovery step of recovering the fusion pad 4 from the culture vessel 3 is performed.
In the recovery step, since the gelatin sheet 14 in the culture container 3 is dissolved and disappears, it is possible to easily take out only the fusion pad 4 from the culture container 3, and the container required by the robot or the operator. Can be transferred to and collected.
In addition, between the above-mentioned culture step and the recovery step, an incubator 6 is connected to the isolator 5 at predetermined intervals to inspect the culture state of the fusion pad 4 during the culture, and a medium exchange for exchanging the medium. The process may be performed.

上記実施例によれば、培養容器３に細胞凝集塊２を収容する際に、上記ゼラチンシート１４で細胞凝集塊２を支持することで効率的に作業を行うことができる。
つまり、特許文献１、２のようにピンを用いずに培養を行うため、当該ピンに細胞凝集塊２を貫通させたり、ピンとピンとの間に細胞凝集塊２を挿入するといった、高精度な作業が不要となり、細胞凝集塊２を収容する動作を高速化することができる。
また培養工程においては、培養液が流通する貫通穴１４ａに加え、細胞凝集塊２に接触しているゼラチンシート１４に形成された空間から培養液を供給することができるため、整列した細胞凝集塊２の全体に対して良好に培養液を供給することができる。
さらに、特許文献１、２では得られた癒合パッド４に上記ピンによる貫通穴が形成されてしまい、当該貫通穴がふさがるまで再度培養を行う必要があるが、本実施例で得られる癒合パッド４にはこのような貫通穴は形成されることはなく、直ちに癒合パッド４を回収することができる。 According to the above embodiment, when the cell aggregate 2 is housed in the culture vessel 3, the work can be efficiently performed by supporting the cell aggregate 2 with the gelatin sheet 14.
That is, since the culture is performed without using a pin as in Patent Documents 1 and 2, highly accurate work such as penetrating the cell aggregate 2 through the pin or inserting the cell aggregate 2 between the pins is performed. Is unnecessary, and the operation of accommodating the cell aggregate 2 can be speeded up.
Further, in the culture step, in addition to the through hole 14a through which the culture solution flows, the culture solution can be supplied from the space formed in the gelatin sheet 14 in contact with the cell aggregate 2, so that the aligned cell aggregates can be supplied. The culture solution can be satisfactorily supplied to the whole of 2.
Further, in Patent Documents 1 and 2, a through hole is formed in the obtained fusion pad 4 by the above pin, and it is necessary to culture again until the through hole is closed. However, the fusion pad 4 obtained in this embodiment is required. No such through hole is formed in the body, and the healing pad 4 can be recovered immediately.

図８は第２実施例にかかる細胞培養方法について、培養容器３に細胞凝集塊３を供給する供給工程を説明する図であり、上記第１実施例ではシート状の癒合パッド４を作成するものであるのに対し、本実施例ではより厚みのある細胞の立体構造体を作成する方法を説明するものである。
なお、本実施例において使用する細胞凝集塊２やゼラチンシート１４には上記第１実施例と同様のものを用いることができるため、詳細な説明は省略する。
本実施例における上記収容工程においても、上記第１実施例と同様、最初にゼラチンシート１４に形成した貫通穴１４ａに細胞凝集塊２を載置し、その後当該整列した細胞凝集塊２の上部に２枚目のゼラチンシート１４を載置する。
そして本実施例では、載置されたゼラチンシート１４のさらに上部に、細胞凝集塊２を載置して整列させるようになっており、ここでも上記ゼラチンシート１４の貫通穴１４ａに細胞凝集塊２を載置することで、細胞凝集塊２を所要の配置に整列させることができる。
その後、載置した２段目の細胞凝集塊２の上部に、さらに３枚目のゼラチンシート１４を載置して、細胞凝集塊２の移動を防止するとともに、以後は所要の立体構造に合わせて、さらに多層の細胞凝集塊２およびゼラチンシート１４を交互に積層させてゆけばよい。 FIG. 8 is a diagram illustrating a supply step of supplying the cell aggregate 3 to the culture vessel 3 with respect to the cell culture method according to the second embodiment, and in the first embodiment, the sheet-shaped fusion pad 4 is created. On the other hand, in this embodiment, a method for creating a three-dimensional structure of thicker cells will be described.
Since the same cells as those in the first embodiment can be used for the cell aggregate 2 and the gelatin sheet 14 used in this example, detailed description thereof will be omitted.
Also in the storage step of the present embodiment, as in the first embodiment, the cell aggregate 2 is first placed in the through hole 14a formed in the gelatin sheet 14, and then the cell aggregate 2 is placed on the upper portion of the aligned cell aggregate 2. A second gelatin sheet 14 is placed.
Then, in this embodiment, the cell aggregate 2 is placed and aligned on the upper portion of the placed gelatin sheet 14, and again, the cell aggregate 2 is placed in the through hole 14a of the gelatin sheet 14. By placing the cell aggregate 2, the cell aggregate 2 can be arranged in a required arrangement.
After that, a third gelatin sheet 14 is placed on the upper part of the placed second-stage cell aggregate 2 to prevent the cell aggregate 2 from moving, and thereafter, according to the required three-dimensional structure. Then, the multi-layered cell aggregates 2 and the gelatin sheet 14 may be alternately laminated.

このようにして細胞凝集塊２が収容された培養容器３は、その後インキュベータ６に移送されて培養工程を行うと、ゼラチンシート１４が溶解して細胞凝集塊２と細胞凝集塊２との間に設けたゼラチンシート１４が消滅するため、上段と下段の細胞凝集塊２が接合して所望の形状を有した細胞の立体構造体を得ることができる。
この場合も、積層させる細胞凝集塊２の間に上記２枚目のゼラチンシート１４を介在させることで、各段における細胞凝集塊２の移動を防止し、またゼラチンシート１４に形成された空間により、上下に位置する細胞凝集塊２に培養液を供給することができ、上段と下段の細胞凝集塊２の接合を良好に行うことができる。
本実施例では、上段と下段の細胞凝集塊２の接合を良好に行うため、細胞凝集塊２と細胞凝集塊２との間に設けるゼラチンシート１４には、保持部として貫通穴１４ａを設け、またその厚さを薄めに設定することが望ましい。
このようにすることで、上記貫通穴１４ａを介して下段の細胞凝集塊２と上段の細胞凝集塊２とを接触または接近させることが可能となり、細胞凝集塊２同士の接合を容易に行うことが可能となる。 When the culture vessel 3 containing the cell aggregate 2 in this way is then transferred to the incubator 6 and the culture step is performed, the gelatin sheet 14 is dissolved and between the cell aggregate 2 and the cell aggregate 2. Since the provided gelatin sheet 14 disappears, the cell aggregates 2 in the upper and lower stages are joined to obtain a three-dimensional structure of cells having a desired shape.
Also in this case, by interposing the second gelatin sheet 14 between the cell aggregates 2 to be laminated, the movement of the cell aggregates 2 in each stage is prevented, and the space formed in the gelatin sheet 14 prevents the cell aggregates 2 from moving. The culture solution can be supplied to the cell aggregates 2 located above and below, and the upper and lower cell aggregates 2 can be satisfactorily joined.
In this embodiment, in order to satisfactorily join the cell aggregates 2 in the upper and lower stages, the gelatin sheet 14 provided between the cell aggregates 2 and the cell aggregates 2 is provided with a through hole 14a as a holding portion. It is also desirable to set the thickness thin.
By doing so, it becomes possible to bring the lower cell aggregate 2 and the upper cell aggregate 2 into contact with each other or bring them closer to each other through the through hole 14a, and the cell aggregate 2 can be easily joined to each other. Is possible.

図９は第３実施例にかかる細胞培養方法について、使用するゼラチン支持体としてのゼラチン収容体１１４と、当該ゼラチン収容体１１４を収容した培養容器３に細胞凝集塊３を供給する供給工程とを説明する図となっている。
本実施例においても、上記第１実施例と同様、アイソレータ５において培養容器３に収容されたゼラチン収容体１１４に細胞凝集塊２を載置する作業を行い、その後上記培養容器３ごと整列された細胞凝集塊２をインキュベータ６に移送して、培養工程を行うようになっている。
ただし、本実施例では、上記供給工程を上記第１実施例のような吸引ノズル１０や当該吸引ノズル１０を移動させるノズル移動手段１１を用いず、作業者の手作業によって行うものとなっている。
なお、以下に詳述する点を除き、上記第１実施例で使用した器具等を用いることが可能であり、また工程自体もほぼ同じであるため、詳細な説明については省略する。 FIG. 9 shows the cell culture method according to the third embodiment, the gelatin container 114 as the gelatin support to be used, and the supply step of supplying the cell aggregate 3 to the culture container 3 containing the gelatin container 114. It is a diagram to explain.
In this example as well, as in the first embodiment, the work of placing the cell aggregate 2 on the gelatin container 114 housed in the culture container 3 in the isolator 5 was performed, and then the cells were aligned together with the culture container 3. The cell aggregate 2 is transferred to the incubator 6 to carry out the culture step.
However, in this embodiment, the supply process is performed manually by the operator without using the suction nozzle 10 or the nozzle moving means 11 for moving the suction nozzle 10 as in the first embodiment. ..
Except for the points described in detail below, the instruments and the like used in the first embodiment can be used, and the process itself is almost the same, so detailed description thereof will be omitted.

本実施例で使用するゼラチン収容体１１４は、上記第１実施例で使用したゼラチンシート１４の外周に枠部１１４ｂを形成した構成を有しており、上記枠部１１４ｂによって保持部としての貫通穴１１４ａで保持した細胞凝集塊２の脱落を防止するようになっている。
具体的には、ゼラチン収容体１１４には細胞凝集塊２を保持する保持部としての貫通穴１１４ａが縦横に整列した状態で形成されており、これら貫通穴１１４ａを囲繞するように、上記細胞凝集塊２と略同じ高さで上記枠部１１４ｂを形成したものとなっている。
本実施例のゼラチン収容体１１４も、第１実施例で使用したゼラチンシートの製造方法で作成することが可能であり、上述した形成工程で使用する型１０１に、上記枠部１１４ｂに相当する形状を形成しておくことで、上記枠部１１４ｂと上記貫通穴１１４ａとを同時に形成することが可能となっている。 The gelatin container 114 used in the present embodiment has a structure in which a frame portion 114b is formed on the outer periphery of the gelatin sheet 14 used in the first embodiment, and the through hole as a holding portion is formed by the frame portion 114b. It is designed to prevent the cell aggregate 2 held by 114a from falling off.
Specifically, the gelatin container 114 is formed with through holes 114a as holding portions for holding the cell aggregates 2 in a vertically and horizontally aligned state, and the cell aggregation is such that the through holes 114a are surrounded by the through holes 114a. The frame portion 114b is formed at substantially the same height as the lump 2.
The gelatin container 114 of this embodiment can also be produced by the method for producing a gelatin sheet used in the first embodiment, and has a shape corresponding to the frame portion 114b in the mold 101 used in the above-mentioned forming step. By forming the above-mentioned frame portion 114b, the above-mentioned through hole 114a can be formed at the same time.

本実施例において、アイソレータ５の内で培養容器３等の準備をする準備工程では、上記細胞凝集塊２を上記収容容器７に収容した状態でアイソレータ５に供給する必要はなく、図９に示すように複数の細胞凝集塊２を筒状の容器１１１に収容した状態で供給することができる。
上記容器１１１には細胞凝集塊２とともに培養液が収容され、図示しないが当該容器１１１に蓋部を装着した状態でアイソレータ５の内部に搬入するようになっており、その際には上記パスボックス５ａにおいて容器１１１の外部を滅菌するようになっている。
また準備工程では、上記ゼラチン収容体１１４を培養容器３に収容する際、培養容器３に培養液を供給する必要はない。なお、培養容器３に培養液を供給してもよいが、その場合には培養液の液面からゼラチン収容体１１４が露出するように液面を設定することが望ましい。 In the present embodiment, in the preparatory step of preparing the culture vessel 3 and the like in the isolator 5, it is not necessary to supply the cell aggregate 2 in the state of being contained in the accommodation container 7 to the isolator 5, and it is shown in FIG. As described above, a plurality of cell aggregates 2 can be supplied in a state of being contained in a tubular container 111.
The container 111 contains the culture solution together with the cell aggregate 2, and although not shown, the container 111 is carried into the isolator 5 with the lid attached to the container 111. In that case, the pass box is used. In 5a, the outside of the container 111 is sterilized.
Further, in the preparation step, when the gelatin container 114 is housed in the culture container 3, it is not necessary to supply the culture solution to the culture container 3. The culture solution may be supplied to the culture vessel 3, but in that case, it is desirable to set the liquid level so that the gelatin container 114 is exposed from the liquid level of the culture solution.

そして供給工程では、作業者が上記ゼラチン収容体１１４の上記枠部１１４ｂの内側に、上記容器１１１から培養液ごと細胞凝集塊２を供給し、その後ピンセット等の器具を利用して各貫通穴１１４ａの位置に細胞凝集塊２を移動させ、これによりゼラチン収容体１１４上に細胞凝集塊２を整列させる。
このとき、細胞凝集塊２とともに上記容器１１１に収容された培養液が培養容器３に供給され、これによりゼラチン収容体１１４ごと細胞凝集塊２を培養液中に浸漬させることができる。なお、培養液が足りない場合には適宜培養液を供給して細胞凝集塊２が完全に浸漬されるようにする。
続いて作業者は、上記ゼラチン収容体１１４に支持された細胞凝集塊２の上部に、第１実施例で用いたのと同じゼラチンシート１４を載置し、これにより細胞凝集塊２の移動を防止する。
なお、上記ゼラチン収容体１１４の枠部１１４ｂによって細胞凝集塊２の移動を防止することができるため、上記細胞凝集塊２の上部に載置するゼラチンシート１４についてはこれを省略してもよく、また所要の個数の細胞凝集塊２をゼラチン収容体１１４に供給すれば、上記枠部１１４ｂの内側で細胞凝集塊２が接近した状態である程度は整列するため、上記貫通穴１１４ａを省略するとともに当該細胞凝集塊を整列させる作業を簡略化することができる。
その後は、上記実施例同様、上記培養容器３をインキュベータ６に移送して当該培養容器３内の細胞凝集塊２を培養する培養工程を行い、細胞凝集塊２が平面的に配置された形状を維持したまま相互に融合し、細胞の集合構造体としての癒合パッド４を得ることができる。 Then, in the supply step, the worker supplies the cell aggregate 2 together with the culture solution from the container 111 to the inside of the frame portion 114b of the gelatin container 114, and then uses an instrument such as a tweezers to supply each through hole 114a. Move the cell agglomerates 2 to the position of, thereby aligning the cell agglomerates 2 on the gelatin container 114.
At this time, the culture solution contained in the container 111 is supplied to the culture container 3 together with the cell aggregate 2, whereby the cell aggregate 2 together with the gelatin container 114 can be immersed in the culture solution. If the culture solution is insufficient, the culture solution is appropriately supplied so that the cell aggregate 2 is completely immersed.
Subsequently, the operator placed the same gelatin sheet 14 used in the first embodiment on the cell aggregate 2 supported by the gelatin container 114, whereby the cell aggregate 2 was moved. To prevent.
Since the frame portion 114b of the gelatin container 114 can prevent the movement of the cell aggregate 2, the gelatin sheet 14 placed on the upper part of the cell aggregate 2 may be omitted. Further, if the required number of cell aggregates 2 are supplied to the gelatin container 114, the cell aggregates 2 are aligned to some extent in a state of being close to each other inside the frame portion 114b, so that the through holes 114a are omitted and the said. The task of aligning cell aggregates can be simplified.
After that, as in the above-mentioned Example, the culture step of transferring the culture vessel 3 to the incubator 6 and culturing the cell aggregate 2 in the culture vessel 3 is performed, and the shape in which the cell aggregate 2 is arranged in a plane is obtained. It is possible to obtain a fusion pad 4 as an aggregate structure of cells by fusing with each other while maintaining the structure.

なお、上記実施例の培養工程では、培養に伴ってゼラチンシート１４やゼラチン収容体１１４が溶解するようになっているが、ゼラチンシート１４やゼラチン収容体１１４を培養容器３中で消滅させないようにしてもよい。
この場合、培養された癒合パッドと共に上記ゼラチンも患者の体内に移植し、当該ゼラチンを体内で吸収させることができる。そして当該ゼラチンが体内に吸収されるまでの期間は、上記ゼラチン収容体１１４を製造する際の架橋の度合いによって調節することができる。
また上記実施例では、上記供給工程においてゼラチンシート１４またはゼラチン収容体１１４に細胞凝集塊２を載置し、さらに当該細胞凝集塊２の上部にゼラチンシート１４を載置したら、そのままの状態で培養容器３ごとインキュベータ６に移送し、細胞凝集塊２の培養を行うようになっているが、細胞凝集塊２を上記ゼラチンシート１４またはゼラチン収容体１１４によって挟持したまま、これを垂直方向に起立させたり、所要の角度に傾斜させた状態で培養してもよい。 In the culture step of the above example, the gelatin sheet 14 and the gelatin container 114 are dissolved with the culture, but the gelatin sheet 14 and the gelatin container 114 are not eliminated in the culture container 3. You may.
In this case, the gelatin can be transplanted into the patient's body together with the cultured fusion pad, and the gelatin can be absorbed in the body. The period until the gelatin is absorbed into the body can be adjusted by the degree of cross-linking in the production of the gelatin container 114.
Further, in the above embodiment, the cell aggregate 2 is placed on the gelatin sheet 14 or the gelatin container 114 in the supply step, and the gelatin sheet 14 is further placed on the gelatin sheet 14 and then cultured as it is. The whole container 3 is transferred to the incubator 6 to culture the cell aggregate 2, but the cell aggregate 2 is held by the gelatin sheet 14 or the gelatin container 114 and is erected in the vertical direction. Alternatively, the cells may be cultured in a state of being tilted at a required angle.

１作成装置２細胞凝集塊
３培養容器４癒合パッド
１４ゼラチンシート（ゼラチン支持体）１４ａ貫通穴（保持部） 1 Preparation device 2 Cell aggregate 3 Culture container 4 Healing pad 14 Gelatin sheet (gelatin support) 14a Through hole (holding part)

Claims

A holding portion for holding cell aggregates is formed , and a plurality of cell aggregates are supported in an aligned state on a crosslinked gelatin support, and the cell aggregates together with the gelatin support are immersed in a culture medium. A method for culturing cells using a gelatin support, which comprises fusing adjacent cell aggregates by culturing the cell aggregates while dissolving the gelatin support.

The cell culture method using the gelatin support according to claim 1, wherein the plurality of cell aggregates are supported by the plurality of gelatin supports in a sandwiched state.

The cell culture method using the gelatin support according to claim 2, wherein the plurality of gelatin supports and the plurality of cell aggregates are alternately laminated.