JP6871575B2 - 生体分子移動制御方法およびデバイス - Google Patents

Description

本発明は、生体分子移動制御方法およびデバイスに関する。

微量の分離対象物質を効率よく検出するためには、マイクロアレイが一般的に使われる。現在、ほとんどのマイクロアレイの作製には、固体基板表面に直接ＤＮＡ、酵素、可水溶性タンパク質などを共有結合で固定化するという手法がとられている。ＤＮＡチップを代表とする、現在までに成功を収めている素子は、共有結合による固定化に際して、上記ＤＮＡなどの機能を維持できるものに限られている。

近年、マイクロアレイの材料として、膜タンパク質を代表とする膜関連生体分子を用いる試みが、精力的に行われている。このようなマイクロアレイの作製に際し、従来法である共有結合による固定化を膜関連生体分子について行った場合、膜関連生体分子の機能が失われることが多い。そこで、これを回避する方法の開発が重要な課題となっている。解決法の一つとして、生体膜を含む支持膜をマイクロアレイの固体基板表面に配置する手法が注目されている。自然界において効率よく特異的反応場として用いられている生体膜を、支持膜としてマイクロアレイの固体基板上に配置することで、より自然に近い環境を素子上へ実現し、これまで機能を維持した状態での固定化が難しかった膜タンパク質に代表される膜関連生体分子を、その機能を維持した状態で固体基板表面に担持することが可能になると期待されている。

このような支持膜は、固体基板表面に吸着していると共に、生体膜が有する最も重要な性質である流動性を維持している。そのため、上記生体膜は、膜関連生体分子の機能する場として最適な環境を与える。非特許文献１には、支持膜を用いた生体分子検出チップが記載されている。非特許文献１に記載の生体分子検出チップは、プラスチック、ガラス、シリコンなどの材料からなる固体基板の表面に、脂質分子などからなる支持膜を配置し、これら支持膜を隔壁で分離したものである。支持膜の流動性は、基板表面の支持膜に平行な電場を印可することにより、ゲルに担持されたタンパク質の電気泳動と同様に、支持膜に担持した生体分子を動かすことで証明されている。

非特許文献２には、生体分子が支持膜内で定常状態に達し、支持膜内を一定速度で移動するとき、電気泳動の際に受けるクーロン力、それとは反対方向に作用する対イオンのクーロン力、支持膜から受ける摩擦力、および支持膜外の水相から受ける抵抗力という４つの力が相殺され、釣り合った状態になることが記載されている。このとき、膜内の生体分子の濃度勾配や分離能は、外力と膜の流動性との競合となる。現在実現されている多くの支持膜実験系では、支持膜の流動性が外力に勝っており、外力がなくなった場合には速やかに均一な平衡状態へ移行する。

一方、支持膜内の特定の分子を、外場を利用して支持膜内で分離・分取するといった技術の要請が高まっている。この場合には、分子を分離しようとする外力と、分子を均一に分散させようとする流動性の競合を制御しなければならない。外場によって支持膜内に形成した生体分子の濃度勾配を維持できるように、支持膜の流動性を制御する技術が特に重要である。これによって、形成した濃度勾配が短時間で平衡状態へ移行するのを防ぎ、膜内で分離した生体分子を分取することが可能になる。

J. T. Groves and S. G. Boxer, " Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes", Acc. Chem. Res., vol.35, pp. 149-157, 2002. M. Tanaka, J. Hermann, I. Haase, M. Fischer and S. G. Boxer, "Frictional Drag and Electrical Manipulation of Recombinant Proteins in Polymer-Supported Membrane", Langmuir, vol.23, pp.5638-5644, 2007. M. Tanaka, A. P. Wong, F. Rehfeldt, M. Tutus and S. Kaufmann, "Selective Deposition of Native Cell Membranes on Biocompatible Micropatterns", J. Am. Chem. Soc., vol.126, pp. 3257-3260, 2004.

従来、マイクロアレイの固体基板上に支持されている支持膜の流動性を制御するための手法として、例えば支持膜の成分を変える、固体基板を変える、電気泳動に用いる泳動槽の温度を変える、などの手法が提案・実証されている。

しかしながら、このような従来技術にもそれぞれ課題が指摘されている。例えば、生体膜の成分を変えると、担持する生体分子に最適な生体膜の構成成分を選択できない可能性がある。また、人工生体膜を利用する場合は、構成成分を変えることが困難であることが多い。一方、固体基板を変えた場合、支持膜内の膜関連生体分子との相互作用が生じ、膜関連生体分子の機能の維持を阻害する恐れがある。また、泳動槽の温度を変えた場合、生体膜の構成成分の相転移を促すことがあり、生体膜内の異なる成分の相分離を生じる可能性がある。また、膜タンパク質に代表される膜関連生体分子以外の、生体膜に担持される生体分子においても同様の課題が挙げられる。

本発明はこのような課題を解決するためのものであり、生体膜に担持される生体分子の機能を損なうことなく、当該生体分子の流動性を容易に制御できる生体分子移動制御方法およびデバイスを提供することを目的としている。

本発明の一態様は、固体基板と、固体基板の表面に支持された支持膜と、を有する生体分子移動制御基板を用い、支持膜は、脂質分子を構成材料とする生体膜と、生体膜に担持された生体分子と、を有し、生体分子移動制御基板を泳動液に浸漬させて、生体分子を電気泳動させるとき、生体分子の泳動液中での移動度と、泳動液の種類と濃度との少なくとも一方との関係に基づいて、泳動液の種類と濃度との少なくとも一方を制御し、前記泳動液として、第１泳動液と、前記第１泳動液よりも前記生体分子の移動度が高い第２泳動液とを用い、前記支持膜と接する前記泳動液の組成によって前記支持膜の流動性を変化させ、前記第１泳動液と前記第２泳動液とが境界面を形成するように前記第１泳動液と前記第２泳動液とを隣接させると共に、前記境界面と交差する方向に前記生体分子を電気泳動させる生体分子移動制御方法を提供する。

本発明の一態様においては、泳動液がイオン液体を含む方法としてもよい。

本発明の一態様は、固体基板と、前記固体基板の表面に形成された流路と、前記流路の前記固体基板が露出した面に支持された支持膜と、を有する生体分子移動制御基板と、前記流路を流通する泳動液と、前記流路の内部に設けられた一対の電極と、を備え、前記支持膜は、脂質分子を構成材料とする生体膜と、前記生体膜に担持された生体分子と、を有し、前記流路は、第１流路と、第２流路と、前記第１流路および前記第２流路に接続される第３流路と、を有し、前記泳動液は、第１泳動液と、前記第１泳動液よりも前記生体分子の移動度が高い第２泳動液と、を含み、前記第１流路には前記第１泳動液が流通し、前記第２流路には前記第２泳動液が流通し、前記支持膜における前記第１泳動液と接する部分と前記支持膜における前記第２泳動液と接する部分の流動性が異なり、前記第３流路には、前記第３流路の延在方向と前記一対の電極の配列方向とが交差するように、前記一対の電極が設けられているデバイスを提供する。

本発明の生体分子移動制御方法およびデバイスによれば、生体膜に担持される生体分子の機能を損なうことなく、当該生体分子の流動性を容易に制御することが可能となる。

図１は、第１実施形態の生体分子移動制御方法を適用可能なデバイスの一例を示す模式断面図である。 図２は、生体分子検出チップＣＰ１における生体分子２１に対する力の作用を示す模式断面図である。 図３は、生体分子検出チップＣＰ２を示す模式斜視図である。 図４は、生体分子検出チップＣＰ２の製造方法における工程１を示す模式斜視図である。 図５は、生体分子検出チップＣＰ２の製造方法における工程２を示す模式斜視図である。 図６は、生体分子検出チップＣＰ２の製造方法における工程３を示す模式斜視図である。 図７は、第２実施形態の生体分子移動制御方法を適用可能なデバイスの一例を示す模式平面図である。 図８は、電気泳動装置１１０の動作原理を説明する模式平面図である。

＜第１実施形態＞
本発明の第１実施形態について図面を参照して説明する。

［生体分子移動制御方法］
まず、図１を参照して、本実施形態の生体分子移動制御方法について説明する。

本実施形態の生体分子移動制御方法は、固体基板と、固体基板の表面に支持された支持膜と、を有する生体分子移動制御基板を用いる。本実施形態の生体分子移動制御方法は、生体分子検出基板の支持膜上に生体分子を担持させ、前記生体分子を担持させた生体分子検出基板を泳動液に浸漬させて、生体分子を電気泳動させるとき、少なくとも一種の生体分子の移動度（流動性）と、泳動液の種類との関係に基づいて泳動液の種類を制御する。

［デバイス］
図１は、第１実施形態の生体分子移動制御方法を適用可能なデバイスの一例を示す模式断面図である。図１に示すように、デバイスの一例である電気泳動装置１０は、泳動槽１１、正電極１２、負電極１３、電源１４、泳動液１５、および生体分子検出チップＣＰ１を備えている。また、電気泳動装置１０は、電源１４のＯＮ、ＯＦＦを切り換えるスイッチや、ＯＮ、ＯＦＦの切り替えや印加電圧を制御する制御部も備えている（図示なし）。電気泳動装置１０は、検出分子２０を電気泳動させて分離する。

泳動槽１１は、上方が開口した収容部１１ａを有する容器である。収容部１１ａは、生体分子検出チップＣＰ１、正電極１２、負電極１３および泳動液１５を収容可能な容積を有する。泳動槽１１の材料は通常知られたものを使用することができる。

正電極１２および負電極１３は、泳動槽１１の収容部１１ａで泳動液１５に浸漬されている。図１に示す電気泳動装置１０においては、正電極１２と負電極１３とが泳動槽１１の一端側と他端側とにそれぞれ配置されている。また、正電極１２と負電極１３との間には生体分子検出チップＣＰ１が配置されている。

図１の電気泳動装置１０では、正電極１２および負電極１３が生体分子検出チップＣＰ１とは別体に設けられているが、これら電極を生体分子検出チップＣＰ１に形成してもよい。

電源１４は、正電極１２と負電極１３との間に電圧Ｅを印加する。電源１４は、通常のゲル電気泳動と同じものを用いることができる。

［生体分子検出チップ］
生体分子検出チップＣＰ１は、泳動槽１１の収容部１１ａで泳動液１５に浸漬されている。生体分子検出チップＣＰ１は、固体基板ＳＵＢ１および支持膜ＳＬＢ１を有する。生体分子検出チップＣＰ１は、検出分子２０を検出する。

本実施形態の生体分子検出チップＣＰ１は、特許請求の範囲における「生体分子移動制御基板」に相当する。

固体基板ＳＵＢ１は、隔壁ＢＡＲを有する。隔壁ＢＡＲは、金、ニッケル、クロムなどの金属材料から形成されている。通常、隔壁ＢＡＲは、加熱蒸着やスパッタ蒸着などの方法で固体基板ＳＵＢ１の表面に上記金属材料を蒸着することにより作製することができる。

固体基板ＳＵＢ１において、隔壁ＢＡＲが形成されている領域が疎水性表面として機能し、隔壁ＢＡＲの形成されていない領域が親水性表面として機能する。

固体基板ＳＵＢ１において、隣接する親水性表面は、疎水性表面を有する隔壁ＢＡＲでそれぞれ分離されている。

親水性表面は、シリコンウエハ、石英ウエハ、ガラスウエハ、サファイア、マイカなどから形成されている。

固体基板ＳＵＢ１の表面は高分子薄膜でコーティングされていてもよい。高分子薄膜材料として、再生セルロースのスピンコート膜、またはラングミュア−ブロジェット膜を用いることができる。一般に、固体基板ＳＵＢ１の表面を高分子薄膜でコーティングすることにより、固体基板ＳＵＢ１に人工生体膜だけでなく天然生体膜を配置できることが知られている（M. Tanaka, A. P. Wong, F. Rehfeldt, M. Tutus and S. Kaufmann, "Selective Deposition of Native Cell Membranes on Biocompatible Micropatterns", J. Am. Chem. Soc., vol.126, pp. 3257-3260, 2004.参照）。

固体基板ＳＵＢ１の親水性表面には、支持膜ＳＬＢ１が配置されている。支持膜ＳＬＢ１は、脂質分子を構成材料とする生体膜ＬＭと、生体膜ＬＭに担持された生体分子２１と、を有している。支持膜ＳＬＢ１は、流動性を有する。支持膜ＳＬＢ１の拡散は、隔壁ＢＡＲによって制限されている。本実施形態では、支持膜ＳＬＢ１の生体膜ＬＭとして脂質二分子膜を例示して説明する。

脂質二分子膜は、一般的に、極性頭部と疎水性炭化水素鎖を併せ持つ両親媒性の脂質分子からなる単一膜が、疎水性炭化水素鎖が内側となるよう形成される構造体である。本明細書では、生体膜ＬＭを固体基板ＳＵＢ１の表面に配置した状態において、生体膜ＬＭが泳動液と接する面を生体膜ＬＭの表面と呼び、生体膜ＬＭが存在する領域を生体膜ＬＭの内部と呼ぶこととする。

生体膜ＬＭの構成材料として、脂質分子の他に、脂質分子にスフィンゴミエリン、コレステロールなどを混合させた混合物を用いることができる。さらに、支持膜ＳＬＢ１の構成材料として、脂質分子にプロテオソームをベシクル融合させた分子を用いてもよい。なお、上記脂質分子は、単一種類であってもよいし、複数種類の混合物であってもよい。

また、生体膜ＬＭとしては、人工生体膜だけでなく小胞体や筋小胞体、単離した細胞膜などの生体由来の膜（天然生体膜）を直接利用することもできる。

生体分子２１は、検出分子２０と結合する部位を有している。そのため、電気泳動装置１０において、検出分子２０は生体分子２１と結合する。生体分子２１は、生体膜ＬＭの内部または生体膜ＬＭの表面に担持されている。脂質分子にプロテオソームをベシクル融合させる場合、生体分子２１として、膜タンパク質を用いることができる。生体分子２１としては、膜貫入型タンパク質（細胞接着レセプター、イオンチャネル）やグリセロフォスファチジルイノシトール脂質結合型タンパク質、またビオチンやヒスチジンオリゴマーでタグ付けされた人工再構成タンパク質なども挙げられる。

本実施形態の電気泳動装置１０においては、固体基板ＳＵＢ１が親水性表面および疎水性表面を有しているので、電気泳動法を用いて支持膜ＳＬＢ１で生体分子２１を濃縮したり、生体分子２１の濃度勾配を与えたりする際に有用である。

［泳動液］
泳動液１５としては、一般的な電気泳動法に用いられる無機塩水溶液の他に、イオン液体またはその水溶液が挙げられる。イオン液体は無機塩と同様に電解質であり、ある種のイオン液体は室温付近で液体として存在する。これらのイオン液体は水溶液とせずに泳動液として用いることができる。また、ある種のイオン液体は水と混じりやすく、得られたイオン液体水溶液を泳動液として用いることもできる。泳動液１５としてイオン液体水溶液を用いる場合、無機塩水溶液に比べ泳動液１５の濃度範囲を広く変えることが可能である。このため、泳動液１５としては、イオン液体またはその水溶液が好ましい。

イオン液体の具体例として、コリンリン酸、コリン二水素リン酸、コリンビストリフルオロメチルメチルスルフォニルイミド、１−ブチルイミダゾリウムジシアナイド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムトリフルオロメチルスルホン酸、１−ブチル−１−メチルピペリジニウムテトラフルオロボレートなどが挙げられる。なかでも、イオン液体としては、コリンリン酸、コリン二水素リン酸が好ましい。イオン液体としてコリンリン酸を用いる場合、支持膜ＳＬＢ１の流動を停止させることができる。具体的には、生体膜ＬＭおよび生体分子２１の流動を停止させることができる。

本実施形態の生体分子移動制御方法は、本発明の効果を損なわない範囲において、泳動液１５の種類を変更する。泳動液１５の種類は、生体分子２１や生体膜ＬＭ、泳動液１５以外の電気泳動条件などに応じて決定するとよい。泳動液１５以外の電気泳動条件が同じであるならば、泳動液１５の種類と、生体分子２１や生体膜ＬＭの種類との関係に応じて、支持膜ＳＬＢ１の流動性が定められる。なお、本実施形態では、泳動液１５の種類を変更する例を示しているが、泳動液１５の濃度を変更してもよいし、泳動液１５の種類と濃度との両方を変更してもよい。

図２は、生体分子検出チップＣＰ１における生体分子２１に作用する力を示す概略断面図である。支持膜ＳＬＢ１の生体膜ＬＭ内で生体分子２１の移動度が定常状態に達し、生体分子２１が一定速度ｖで移動するとき、下式（１）が成り立つと考えられる。
Ｆｅ＝Ｆｒ＋Ｆｆ＋Ｆｃ …（１）

Ｆｅは、生体分子２１が受けるクーロン力の大きさを表す。Ｆｒは、Ｆｅとは反対方向に作用する対イオンの力の大きさを表す。Ｆｆは、生体膜ＬＭ内から生体分子２１が受ける摩擦力の大きさを表す。Ｆｃは、生体膜ＬＭ内外の泳動液１５からなる相から生体分子２１が受ける抵抗力の大きさを表す。

このとき、支持膜ＳＬＢ１での生体分子２１の濃度勾配や分離能は、外力（Ｆｅ、Ｆｒ、Ｆｆ、Ｆｃ）と生体膜ＬＭの流動性とが競合した結果に基づいて定められる。現在実現されている多くの支持膜実験系では、生体膜の流動性が外力に勝っており、外力がなくなった場合には速やかに均一な平衡状態へ移行する。

発明者らは、Ｆｒ、ＦｆおよびＦｃに着目し、Ｆｒ、ＦｆおよびＦｃが泳動液の種類または濃度に基づいて制御可能であることを明らかにした。さらに、Ｆｒ、ＦｆおよびＦｃを制御することにより、生体膜ＬＭに担持された生体分子２１の移動度を制御可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

本実施形態の生体分子移動制御方法は、生体分子２１の移動度と泳動液１５の種類との関係に基づいて、泳動液１５の種類との関係を制御する。本実施形態の生体分子移動制御方法によれば、生体分子２１の流動性を制御することができる。また、本実施形態の生体分子移動制御方法は、生体分子２１を担持する生体膜ＬＭの流動性も同様に制御することができる。生体分子２１および生体膜ＬＭの流動性を制御できるので、支持膜ＳＬＢ１の流動性をより制御しやすい。以上をふまえると、本実施形態の生体分子移動制御方法は、検出分子２０を電気泳動法により分離する技術に貢献できる。具体的には、生体分子２１の移動度を制御することにより、生体分子検出チップＣＰ１の支持膜ＳＬＢ１で生体分子２１を濃縮したり、生体分子２１の濃度勾配を与えたりすることができる。この方法を適用すれば、電気泳動装置１０を用い、生体分子検出チップＣＰ１の支持膜ＳＬＢ１で検出分子２０を濃縮したり、検出分子２０の濃度勾配を与えたりすることができる。

なお、本発明を支持膜という観点から見れば、本発明にかかる支持膜は、泳動液に浸漬された固体基板の表面に配置されるものであって、脂質分子を構成材料とする生体膜と、生体膜に担持された生体分子と、を有し、生体分子の移動度は、生体分子の移動度と、泳動液の種類との関係に基づいて、泳動液の種類を制御することにより、制御可能である。

また、本発明を生体分子検出チップという観点から見れば、本発明にかかる生体分子検出チップは、固体基板と、固体基板の表面に支持された支持膜と、を有し、生体分子の移動度と、泳動液の種類との関係に基づいて泳動液の種類を制御するものであり、生体分子の移動度を制御可能である。

＜変形例＞
［生体分子検出チップ］
上述した本実施形態の生体分子検出チップＣＰ１に代わって、以下の生体分子検出チップＣＰ２を用いることができる。本変形例の生体分子検出チップＣＰ２は、特許請求の範囲における「生体分子移動制御基板」に相当する。

図３は、生体分子検出チップＣＰ２を示す模式斜視図である。図３に示すように、生体分子検出チップＣＰ２は、固体基板ＳＵＢ２、支持膜ＳＬＢ２１および支持膜ＳＬＢ２２を有する。

支持膜ＳＬＢ２１および支持膜ＳＬＢ２２は、互いに異なる流動性を有する。支持膜ＳＬＢ２１および支持膜ＳＬＢ２２は、例えば生体膜の種類が異なっていてもよいし、生体膜に担持される生体分子の種類が異なっていてもよいし、生体膜および生体分子の両方の種類が異なっていてもよい。支持膜ＳＬＢ２１および支持膜ＳＬＢ２２は、固体基板ＳＵＢ２の表面に配置されている。支持膜ＳＬＢ２１および支持膜ＳＬＢ２２は、後述する方法を用いて特定の形状に形成されている。

［生体分子検出チップの製造方法］
生体分子検出チップＣＰ２の製造方法における工程１〜３をそれぞれ図４〜６に示す。

支持膜ＳＬＢ２１および支持膜ＳＬＢ２２の構成材料としては、上述の支持膜ＳＬＢ１と同様の材料を用いることができる。また、固体基板ＳＵＢ２の材質としては、上述の固体基板ＳＵＢ１と同様の材料を用いることができる。

まず、工程１では、図４に示すように、固体基板ＳＵＢ２の上面に薄膜層Ｌを形成し、フォトリソグラフィを用いて切削加工を施し、任意の形状のキャビティ構造を作製する。薄膜層Ｌは、ピンセットなどで固体基板ＳＵＢ２から剥離することができるものである。また、薄膜層Ｌは、対応するエッチャントにより除去できるものである。さらに、薄膜層Ｌは、展開する生体分子に対して反応したり、混合したりしない薄膜材料で形成されている。例えば、高分子薄膜材料としては、透明性の高い剛直な高分子であるポリパラキシレンやポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などが挙げられる。

次に、工程２では、図５に示すように、特定の形状を有する支持膜ＳＬＢ２１を与える混合分子Ｍ１と、特定の形状を有する支持膜ＳＬＢ２２を与える混合分子Ｍ２とをパターニングされた薄膜層Ｌの表面に展開する。混合分子Ｍ１または混合分子Ｍ２は、上述した脂質分子および生体分子を含む。

次に、工程３では、図６に示すように、薄膜層Ｌをピンセットなどで固体基板ＳＵＢ２から剥離する。このようにして、固体基板ＳＵＢ２の表面に特定の形状を有する支持膜ＳＬＢ２１および支持膜ＳＬＢ２２を形成し、生体分子検出チップＣＰ２を得る。

このような薄膜層Ｌを用いた手法は、細胞パターニングに際し、接着タンパク質の位置制御などに用いられている。しかし、本実施形態の支持膜ＳＬＢ２１および支持膜ＳＬＢ２２を構成する生体分子のパターニングに応用された例は少なく、有用である。

一般に、マイクロアレイは、複数の異なる条件を同一基板上に集積可能であることがメリットとなる。支持膜内で分離した複数の検出分子のパターンを同一基板上で維持するため、異なる流動性パターンを有する支持膜を同一基板上に形成するには、従来型の手法では困難である。例えば、同一基板上に成分（脂質分子）が異なる支持膜を隣接させた場合、支持膜の持つ流動性に起因して、異なる脂質分子が混在して上記パターンを消失するか、形状の制御不能な相分離構造を形成してしまう恐れがある。一方で、同一基板上で場所により基板の温度を変える場合、マイクロスケールで異なる温度パターンを形成することは、支持膜の流動や泳動液の対流による熱拡散が起こるため、長時間の維持は困難である。

これに対し、本実施形態の生体分子移動制御方法は、支持膜ＳＬＢ２１および支持膜ＳＬＢ２２の流動性を制御することができる。そのため、支持膜ＳＬＢ２１および支持膜ＳＬＢ２２が特定の形状を保った状態で維持されやすい。支持膜ＳＬＢ２１および支持膜ＳＬＢ２２によって運ばれる検出分子も同様に特定の形状に維持されると考えられる。

生体分子検出チップＣＰ２は、支持膜ＳＬＢ２１または支持膜ＳＬＢ２２を構成する生体分子の挙動や展開速度などを同時に観察することができる。

第１実施形態の生体分子移動制御方法によれば、生体膜に担持される生体分子の機能を損なうことなく、当該生体分子の流動性を容易に制御できる。

＜第２実施形態＞
本発明の第２実施形態について図面を参照して説明する。

［デバイス］
図７は、第２実施形態の生体分子移動制御方法を適用可能なデバイスの一例を示す概略図である。

図７に示すように、電気泳動装置１１０は、正電極１１２、負電極１１３、電源１４、泳動液１５および生体分子検出チップＣＰ３を備えている。また、電気泳動装置１１０は、電源１４のＯＮ、ＯＦＦを切り換えるスイッチや、ＯＮ、ＯＦＦの切り替えや印加電圧を制御する制御部も備えている（図示なし）。電気泳動装置１１０は、検出分子２０を電気泳動させて分離する。したがって、本実施形態において第１実施形態と共通する構成要素については同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。なお、図７の矢印は、泳動液１５の流動方向を表している。

正電極１１２および負電極１１３は、第３流路１１１Ｃの幅方向の両端に設けられている。正電極１１２および負電極１１３は、金属薄膜から構成される。
本実施形態の正電極１１２および負電極１１３は、特許請求の範囲における「一対の電極」に相当する。

泳動液１５は、第１泳動液１５Ａおよび第２泳動液１５Ｂを含む。第２泳動液１５Ｂは、第１泳動液１５Ａと種類が異なる。本実施形態では、支持膜ＳＬＢ１を第１泳動液１５Ａまたは第２泳動液１５Ｂに接触させたときに、支持膜ＳＬＢ１の流動性が相対的に低い方を第１泳動液１５Ａとし、支持膜ＳＬＢ１の流動性が相対的に高い方を第２泳動液１５Ｂとする。例えば、第１泳動液１５Ａとしてコリンリン酸を用いる場合、第２泳動液１５ＢとしてＮａＣｌ水溶液を用いる。なお、第１泳動液１５Ａの種類と第２泳動液１５Ｂの種類とが異なればよく、無機塩水溶液同士やイオン液体同士またはイオン液体水溶液同士であってもよい。

［生体分子検出チップ］
生体分子検出チップＣＰ３は、固体基板ＳＵＢ１、流路１１１および支持膜ＳＬＢ１を有する。生体分子検出チップＣＰ３は、検出分子２０を検出する。

本実施形態の生体分子検出チップＣＰ３は、特許請求の範囲における「生体分子検出基板」に相当する。

流路１１１には、泳動液１５が流通する。流路１１１は、固体基板ＳＵＢ１の表面に形成されている。流路１１１の固体基板ＳＵＢ１が露出した面には、支持膜ＳＬＢ１が配置されている。

図７に示す流路１１１は、第１流路１１１Ａ、第２流路１１１Ｂ、第３流路１１１Ｃ、第４流路１１１Ｄおよび第５流路１１１Ｅからなる。これらの流路は、数μｍ〜数１００μｍ程度の幅および深さを有する。

第１流路１１１Ａおよび第２流路１１１Ｂはそれぞれ第３流路１１１Ｃの一端側（上流側）に接続する。また、第４流路１１１Ｄおよび第５流路１１１Ｅはそれぞれ第３流路１１１Ｃの他端側（下流側）に接続する。図７に示す流路１１１の平面視形状は、Ｘ型を呈する。

第１流路１１１Ａは第１泳動液１５Ａが流通する。一方、第２流路１１１Ｂは第２泳動液１５Ｂが流通する。

第４流路１１１Ｄは第１泳動液１５Ａが流通する。一方、第５流路１１１Ｅは第２泳動液１５Ｂが流通する。

第３流路１１１Ｃには、第３流路１１１Ｃの延在方向と、正電極１１２および負電極１１３の配列方向とが交差するように、正電極１１２および負電極１１３が設けられている。

第３流路１１１Ｃでは、第１泳動液１５Ａの層流と第２泳動液１５Ｂの層流とが互いに交わることなく境界面を形成する。その結果、第１泳動液１５Ａの層流と第２泳動液１５Ｂの層流とが隣接したバンド構造が形成される。一般に、このような現象はシアバンディング現象と呼ばれる。シアバンディング現象は、流路壁面での流体の流速がゼロに近似され、かつ流体の粘性（動粘度）、流路幅、流速の三要素で規定されるレイノルズ数が１０以下であると見積もられるために起こる現象である。例えば常温でＮａＣｌ溶液を１０μＬ／ｈで流した際、近似矩形断面半径が１００μｍの流路ではレイノルズ数はおよそ１．０と見積もられる。ここで、「近似矩形断面半径」とは、「水力直径」とも呼ばれ、断面積Ａ、断面周長Ｂの矩形管内の圧力損失を計算する場合、４Ａ×Ｂ^−１で近似される値に相当する。このバンドの幅は流束や溶液の粘性によって調節可能なので、目的に応じて第１泳動液１５Ａと第２泳動液１５Ｂとの組み合わせを変更することにより、バンドの幅を変更することができる。

上述したように、支持膜ＳＬＢ１を第１泳動液１５Ａまたは第２泳動液１５Ｂに接触させたときに、支持膜ＳＬＢ１の流動性が相対的に低い方を第１泳動液１５Ａとし、支持膜ＳＬＢ１の流動性が相対的に高い方を第２泳動液１５Ｂとする。第１泳動液１５Ａの層流と第２泳動液１５Ｂの層流との境界面を境に、第３流路１１１Ｃに存在する支持膜ＳＬＢ１の流動性は、第２流路１１１Ｂ側から第１流路１１１Ａ側に向かって低くなる。

流路１１１には、導入口１１６、導入口１１７、排出口１１８および排出口１１９が設けられている。

導入口１１６は、第１流路１１１Ａに第１泳動液１５Ａを導入する。導入口１１６は、第１流路１１１Ａの一部に設けられている。
導入口１１７は、第２流路１１１Ｂに第２泳動液１５Ｂを導入する。導入口１１７は、第２流路１１１Ｂの一部に設けられている。

排出口１１８は、第４流路１１１Ｄから第１泳動液１５Ａを排出する。排出口１１８は、第４流路１１１Ｄの一部に設けられている。
排出口１１９は、第５流路１１１Ｅから第２泳動液１５Ｂを排出する。排出口１１９は、第５流路１１１Ｅの一部に設けられている。

電気泳動装置１１０は、以下の手順で作製することができる。まず、固体基板ＳＵＢ１の表面に流路１１１、正電極１１２、負電極１１３および電源１４を形成する。流路１１１は、例えばポリジメチルシロキサンなどの高分子樹脂をフォトリソグラフィで作製した鋳型を用いて成形することができる。

次に、導入口１１６および導入口１１７に面した流路１１１の底面（露出した固体基板ＳＵＢ１の表面）に、ガラスキャピラリーを用いて支持膜ＳＬＢ１の原料を付着させた後、導入口１１６および導入口１１７から流路１１１に第２泳動液１５Ｂを導入して静置し、流路１１１の底面に支持膜ＳＬＢ１を形成する。このようにして、電気泳動装置１１０を作製することができる。

［デバイスの動作原理］
図８を参照しながら、電気泳動装置１１０の動作原理について説明する。図８は、電気泳動装置１１０の動作原理を説明する平面図である。

図８に示すように、電気泳動装置１１０において、まず、導入口１１６および導入口１１７から流路１１１に、検出分子２０を添加した第２泳動液１５Ｂを導入し、支持膜ＳＬＢ１に検出分子２０を担持させる。このとき、検出分子２０は支持膜ＳＬＢ１中の生体分子２１と結合する。次に、導入口１１６から第１流路１１１Ａに第１泳動液１５Ａを導入する。一方、導入口１１７から第２流路１１１Ｂに第２泳動液１５Ｂを導入する。

第１泳動液１５Ａおよび第２泳動液１５Ｂの導入方法は特に限定されないが、生体分子２１や生体膜ＬＭ（図２参照）の支持膜ＳＬＢ１の条件や、電気泳動条件などに応じて第１泳動液１５Ａの流量および第２泳動液１５Ｂの流量を制御しながら導入できる方法が好ましい。

第１流路１１１Ａを通過した第１泳動液１５Ａは、第３流路１１１Ｃ、第４流路１１１Ｄの順で通過する。一方、第２流路１１１Ｂを通過した第２泳動液１５Ｂは、第３流路１１１Ｃ、第５流路１１１Ｅの順で通過する。このとき、第３流路１１１Ｃ内部では、第１泳動液１５Ａの層流と第２泳動液１５Ｂの層流とが互いに交わることなく第１泳動液１５Ａおよび第２泳動液１５Ｂからなるバンド構造が形成される。

第１泳動液１５Ａ中では支持膜ＳＬＢ１の流動性が低くなっている。そのため、生体分子２１は第１泳動液１５Ａの流れに取り残される。一方、第２泳動液１５Ｂ中では、支持膜ＳＬＢ１の流動性が高くなっている。そのため、第２泳動液１５Ｂの流れに乗って生体分子２１が流動する。

このような生体分子検出チップＣＰ３に対し、正電極１１２と負電極１１３との間に電源１４から電圧を印加すると、生体分子検出チップＣＰ３の支持膜ＳＬＢ１中の生体分子２１が電気泳動する。上述したように、支持膜ＳＬＢ１の流動性が相対的に低い方を第１泳動液１５Ａとし、支持膜ＳＬＢ１の流動性が相対的に高い方を第２泳動液１５Ｂとする。第１泳動液１５Ａの層流と第２泳動液１５Ｂの層流との境界面を境に、境界面の第２流路１１１Ｂ側から第１流路１１１Ａ側に向かって、支持膜ＳＬＢ１の流動性が低くなる。第３流路１１１Ｃに位置する支持膜ＳＬＢ１中の生体分子２１は、正電極１１２側から負電極１１３側に移動するが、支持膜ＳＬＢ１の流動性が高い方から低い方に変化する境界面を越えて移動することは難しいと考えられる。また、第３流路１１１Ｃの延在方向と、正電極１１２および負電極１１３の配列方向とが交差するので、この境界面と支持膜ＳＬＢ１や生体分子２１の移動方向とが交差する。その結果、この境界面で目的の生体分子２１を濃縮することができる。

なお、本実施形態では、第１泳動液１５Ａの種類と第２泳動液１５Ｂの種類とが異なる例を示したが、これに限定されない。例えば、第１泳動液１５Ａの濃度と第２泳動液１５Ｂの濃度とが異なっていてもよい。また、別の例として、第１泳動液１５Ａの種類および濃度と第２泳動液１５Ｂの種類および濃度とが異なっていてもよい。

なお、本実施形態では、流路１１１を１つ設ける例を示したが、固体基板ＳＵＢ１上に流路１１１を複数設けてもよい。固体基板ＳＵＢ１上に流路１１１を複数設ける場合、本実施形態の電気泳動装置１１０はマイクロアレイとして用いることができる。

上述したように、マイクロアレイは、複数の異なる条件を同一基板上に集積可能であることがメリットとなる。支持膜内で分離した複数の生体分子のパターンを同一基板上で維持するため、異なる流動性パターンを有する支持膜を同一基板上に形成するには、従来型の手法では困難である。例えば、同一基板上に成分（脂質分子）が異なる支持膜を隣接させた場合、支持膜の持つ流動性に起因して、異なる脂質分子が混在して上記パターンを消失するか、形状の制御不能な相分離構造を形成してしまう恐れがある。一方で、同一基板上で場所により基板の温度を変える場合、マイクロスケールで異なる温度パターンを形成することは、支持膜の流動や泳動液の対流による熱拡散が起こるため、長時間の維持は困難である。

一方、本実施形態では、用いる泳動液の種類や濃度と流路１１１と組み合わせることにより、同一基板上において、微小領域ごとに生体分子２１の流動性を制御できる技術が提供可能となる。

その応用として、タンパク質に代表される生体分子の移動速度を生体膜で制御し、検出分子のパターンを作製することができる。

第２実施形態の生体分子移動制御方法によれば、生体膜に担持される生体分子の機能を損なうことなく、当該生体分子の流動性を容易に制御できる。

次に、本発明の実施例について説明する。以下の実施例では、図７の例と同様の構成を有するデバイス（電気泳動装置）を作製した。

［支持膜の原料の調製］
それぞれのクロロホルム溶液を用いて、卵黄由来脂質分子L-α-PCと、１６：０biotinyl DPPEと、１６：０NBD-DPPEとを、９７：２：１のモル比の割合で含む混合物を、クロロホルム溶液として調製した。得られたクロロホルム溶液は、はじめに窒素気流下においてクロロホルムを蒸発させ、次に真空下に１晩おいてクロロホルムをさらに除去し、支持膜ＳＬＢ１の原料を得た。

［泳動液の調製］
コリンリン酸（分子量２０１．１６）２ｇを純水に溶解して１００ｍＬとし、１００ｍＭコリンリン酸水溶液を得、第１泳動液１５Ａとした。また、ＮａＣｌを純水に溶解して１００ｍＭＮａＣｌ水溶液を得、第２泳動液１５Ｂとした。

［検出分子］
実施例で用いる検出分子２０として、赤色蛍光色素であるTexas Redが結合したストレプトアビジン（ＴＲ−ｓＡＶ）を用いた。

［デバイスの作製］
以下の手順で、図７の例と同様の構成を有するデバイス（電気泳動装置）を作製した。なお、支持膜ＳＬＢ１および検出分子２０の確認には共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いた。具体的に、支持膜ＳＬＢ１の確認には、支持膜ＳＬＢ１の原料として用いたＮＢＤ由来の緑色蛍光（４８８ｎｍ励起、５０５−５２５ｎｍ発光）を用いた。一方、検出分子２０の確認には、Texas Red由来の赤色蛍光（５４３ｎｍ励起、＞５８０ｎｍ発光）を用いた。

まず、ＳｉＯ_２酸化膜（３００ｎｍ厚）を有するＳｉウエハ（以下、ＳｉＯ_２／Ｓｉ基板）を５ｍｍ×１５ｍｍに切断し固体基板ＳＵＢ１を作製した。得られた固体基板ＳＵＢ１に対して水洗（５分間）、濃硫酸（純度９６質量％）：過酸化水素水（濃度３０質量％）＝４：１（体積比）混酸（ピラニア）処理（５分間）、水洗（５分間）、フッ化アンモニウム水溶液（５分間）処理、水洗（５分間）の順で施して洗浄した。

洗浄後の固体基板ＳＵＢ１に、幅５００μｍ、深さ５０μｍの流路を形成したポリマーシートを密着させて搭載することで、固体基板ＳＵＢ１上に第１泳動液１５Ａを送液可能な流路１１１を形成した。流路１１１を形成したポリマーシートはポリジメチルシロキサンをフォトリソグラフィで作製した鋳型を用いて成形した。また、流路の一部には、２つの導入口（導入口１１６、導入口１１７）および２つの排出口（排出口１１８、排出口１１９）を設けた。

第３流路１１１Ｃ内部に、正電極１１２と負電極１１３を形成した。正電極１１２および負電極１１３には、金属薄膜を用いて形成した微小電極を用いた。なお、第３流路１１１Ｃの第１流路１１１Ａに近い側に負電極１１３、第３流路１１１Ｃの第２流路１１１Ｂに近い側に正電極１１２を配置した。

導入口１１６および導入口１１７に面する流路の底面（露出した固体基板の表面）に，ガラスキャピラリーを用いて支持膜の原料を付着させた後、導入口１１６および導入口１１７から１００ｍＭＮａＣｌ水溶液（第２泳動液１５Ｂ）を導入して静置し、流路１１１全体に脂質膜（支持膜）ＳＬＢ１を形成した。共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いて第３流路１１１Ｃ内部を観察すると、一様な緑色蛍光を確認した。この緑色蛍光により，第３流路１１１Ｃ内部に一様な支持膜が形成されていることを確認した。このとき赤色蛍光は確認されなかった。

［実施例１］
引き続き、共焦点レーザ走査型顕微鏡で観察しながら、導入口１１６および導入口１１７からＴＲ−ｓＡＶを添加した１００ｍＭＮａＣｌ水溶液（第２泳動液１５Ｂ）を導入した。ＴＲ−ｓＡＶ濃度は１００ｍＭＮａＣｌ水溶液１００μＬに対して２μｇとした。導入後、緑色蛍光は導入前と同様に確認された。また、支持膜部分は速やかに赤色発光を示すことを確認した。このことからＴＲ−ｓＡＶが支持膜中のビオチンと相互作用し、ＴＲ−ｓＡＶが支持膜に担持されたことを確認した。このようにして、図７の例と同様の構成を有するデバイスを作製した。

次に、導入口１１６から第１流路１１１Ａに１００ｍＭコリンリン酸水溶液（第１泳動液１５Ａ）を、導入口１１７から第２流路１１１Ｂに１００ｍＭＮａＣｌ水溶液（第２泳動液１５Ｂ）を導入した。このとき支持膜の内部および支持膜の表面に担持された検出分子２０（ＴＲ−ｓＡＶ）は、置換された泳動液に応じた移動特性（移動度、流動性）を示すと考えられる。検出分子２０の移動特性を以下の方法で確認した。

作製したデバイスについて、共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いて、ＦＲＡＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ａｆｔｅｒ Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）実験を行った。第３流路１１１Ｃ内部に、直径５０μｍの円領域にレーザを高強度で照射し、この領域の色素分子を退色させた。その前後で、２０秒毎に赤色蛍光および緑色蛍光を、共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いて観察した。ＦＲＡＰ実験では、脂質分子（支持膜ＳＬＢ１）の移動はNBD-DPPE由来の緑色蛍光から、生体分子２１であるストレプトアビジンの移動はＴＲ−ｓＡＶ由来の赤色蛍光から、それぞれ評価した。

第３流路１１１Ｃ内部の第１流路１１１Ａに近い側では、退色後の緑色蛍光強度がほとんど回復しなかった．よって、１００ｍＭコリンリン酸水溶液（第１泳動液１５Ａ）に置換された部分では，脂質膜（支持膜）ＳＬＢ１の流動性は抑制されてほぼ停止していることが分かった．同様に，第３流路１１１Ｃ内部の第２流路１１１Ｂに近い側においては、緑色蛍光強度が一定時間経過後にほぼ初期値レベルまで回復していた。このことから、支持膜ＳＬＢ１の流動性が担保されていることが分かった。また、支持膜ＳＬＢ１の流動性が高い方から低い方へと変化する境界領域は、第３流路１１１Ｃ内部で流れ方向に平行に形成されており、第１泳動液１５Ａおよび第２泳動液１５Ｂの層流によってパターン（バンド）が形成されていることも示された。

同様に，赤色蛍光を用いて，ＴＲ−ｓＡＶと結合したビオチン脂質の移動を観察すると，第３流路１１１Ｃ内部の第１流路１１１Ａに近い側では、退色後の赤色蛍光強度がほとんど回復しなかった。一方、第３流路１１１Ｃ内部の第２流路１１１Ｂに近い側においては、赤色蛍光強度が一定時間経過後にほぼ初期値レベルまで回復していた。このことから、ＴＲ−ｓＡＶと結合したビオチン脂質についても流動性が担保されていることが分かった。ＴＲ−ｓＡＶと結合したビオチン脂質の流動性が高い方から低い方へと変化する境界領域は、緑色蛍光を用いた評価で観測されたパターンと一致していた。このことから、支持膜ＳＬＢ１に担持された生体分子２１（ＴＲ−ｓＡＶ）の移動抑制が，脂質膜（支持膜）ＳＬＢ１の流動性の抑制と関連していることが示された。

作製したデバイスを用い、正電極１１２および負電極１１３を電源１４と接続して電圧を印加して電気泳動を行った。そして、共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いて、赤色蛍光によりＴＲ−ｓＡＶと結合したビオチン脂質の移動を観察した。

第３流路１１１Ｃ内部の第１流路１１１Ａに近い側では、電圧印加の前後で赤色蛍光の分布の変化はほとんど観測されなかった。一方、第３流路１１１Ｃ内部の第２流路１１１Ｂに近い側においては、緑色蛍光で観測された流動性が異なる境界領域で赤色蛍光強度が強くなり、ＴＲ−ｓＡＶと結合したビオチン脂質が濃縮されていることが示された。これは、ＴＲ−ｓＡＶと結合したビオチン脂質は、電気泳動によって負電極１１３側に移動しようとするが、脂質膜（支持膜）ＳＬＢ１やビオチンの流動性が抑制されている境界を越えては移動できず、停止したためだと考えられる。

本発明によれば、生体膜に担持された生体分子の流動性を容易に制御することが可能となる。また、支持膜での検出分子の分離・分取が可能となることが示された。

［本実施の形態の効果］
このように、本実施の形態は、泳動液中にある固体基板の表面に配置される生体膜に対し、生体分子の移動度と、当該泳動液の種類と濃度との少なくとも一方との関係に基づいて当該泳動液の種類と濃度との少なくとも一方を制御することにより、当該生体膜に担持された生体分子の移動度を制御可能にしたものである。

これにより、生体膜に担持された生体分子の機能を損なうことなく、当該生体分子の流動性を容易に制御することが可能となる。その結果、このような支持膜での検出分子の分離・分取技術に貢献する。その応用として、例えば、定常状態のタンパク質の移動、すなわち濃度勾配のスロープやｐＨ勾配下での等電点電気泳動のバンド幅など、支持膜での生体分子のパターンを作製することができる。さらに本発明の技術は、これまで提案のあった手法と同時に適用可能な手法であることから、さらに広範囲な制御を可能とする。

［実施の形態の拡張］
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明の効果を損なわない範囲内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。また、各実施形態については、矛盾しない範囲で任意に組み合わせて実施することができる。

１５…泳動液、１５Ａ…第１泳動液、１５Ｂ…第２泳動液、２０…検出分子、２１…生体分子、１１１…流路、１１１Ａ…第１流路、１１１Ｂ…第２流路、１１１Ｃ…第３流路、ＬＭ…生体膜、ＳＬＢ１，ＳＬＢ２１，ＳＬＢ２２…支持膜、ＳＵＢ１，ＳＵＢ２…固体基板

Claims (3)

1. 固体基板と、
   前記固体基板の表面に支持された支持膜と、
   を有する生体分子移動制御基板を用い、
   前記支持膜は、脂質分子を構成材料とする生体膜と、前記生体膜に担持された生体分子と、を有し、
   前記生体分子移動制御基板を泳動液に浸漬させて、前記生体分子を電気泳動させるとき、
   前記生体分子の前記泳動液中での移動度と、前記泳動液の種類と濃度との少なくとも一方との関係に基づいて、前記泳動液の種類と濃度との少なくとも一方を制御し、
   前記泳動液として、第１泳動液と、前記第１泳動液よりも前記生体分子の移動度が高い第２泳動液とを用い、前記支持膜と接する前記泳動液の組成によって前記支持膜の流動性を変化させ、
   前記第１泳動液と前記第２泳動液とが境界面を形成するように前記第１泳動液と前記第２泳動液とを隣接させると共に、前記境界面と交差する方向に前記生体分子を電気泳動させる生体分子移動制御方法。
2. 前記泳動液がイオン液体を含む請求項１に記載の生体分子移動制御方法。
3. 固体基板と、前記固体基板の表面に形成された流路と、前記流路の前記固体基板が露出した面に支持された支持膜と、を有する生体分子移動制御基板と、
   前記流路を流通する泳動液と、
   前記流路の内部に設けられた一対の電極と、を備え、
   前記支持膜は、脂質分子を構成材料とする生体膜と、前記生体膜に担持された生体分子と、を有し、
   前記流路は、第１流路と、第２流路と、前記第１流路および前記第２流路に接続される第３流路と、を有し、
   前記泳動液は、第１泳動液と、前記第１泳動液よりも前記生体分子の移動度が高い第２泳動液と、を含み、
   前記第１流路には前記第１泳動液が流通し、前記第２流路には前記第２泳動液が流通し、前記支持膜における前記第１泳動液と接する部分と前記支持膜における前記第２泳動液と接する部分の流動性が異なり、
   前記第３流路には、前記第３流路の延在方向と前記一対の電極の配列方向とが交差するように、前記一対の電極が設けられているデバイス。

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