JP6868242B2 - 細胞培養モジュール - Google Patents
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Description
本発明は、再生医療等に用いられる細胞塊を培養する培養モジュールに関する。
従来から、細胞を連続的に培養する装置として潅流培養装置があり、この潅流培養装置として種々のものが知られている。
例えば、（１）微小なマイクロキャリアに細胞を２次元的に接着させ、マイクロキャリアを撹拌しながら培養を行う潅流培養装置、（２）浮遊状態の細胞塊の潅流培養を行うラジアルフローバイオリアクタ装置、（３）細胞シートを積層させ、３次元化し、専用モジュールで潅流培養を行う潅流培養装置が知られている。また、（４）培養液が浸透する基材に細胞を２次元的に接着させ、潅流培養を行う潅流培養装置等が知られている。
例えば、（１）微小なマイクロキャリアに細胞を２次元的に接着させ、マイクロキャリアを撹拌しながら培養を行う潅流培養装置、（２）浮遊状態の細胞塊の潅流培養を行うラジアルフローバイオリアクタ装置、（３）細胞シートを積層させ、３次元化し、専用モジュールで潅流培養を行う潅流培養装置が知られている。また、（４）培養液が浸透する基材に細胞を２次元的に接着させ、潅流培養を行う潅流培養装置等が知られている。
本出願人の一の出願人は、前記（４）の潅流培養装置の一つとして、（５）多孔質セラミックス培養基材（多孔質セラミックス細胞培養担体）と、それを組みこんだモジュールに培養液供給装置を接続した潅流培養装置を、特許文献１において提案している。
また、前記（３）の潅流培養装置にあっては、特許文献２に示すように、酸素濃度を制御して、短時間で細胞シートを製造する技術が知られている。具体的には、培養容器に接続されたＣＯ２・Ｏ２センサーで二酸化炭素・酸素濃度を検出し、ガス供給部から培養容器内への酸素供給、あるいは二酸化炭素供給を制御することが示されている。
ところで、前記（１）のマイクロキャリアを撹拌しながら培養を行う潅流培養装置、前記（２）のラジアルフローバイオリアクタ装置は、マイクロキャリアや細胞塊を浮遊させ、撹拌しながら培養するため、培養液中の成分を均一に保つことができるという利点がある。
しかしながら、マイクロキャリア同士や細胞塊同士の衝突が起き易いこと、また細胞が培養液の流れの刺激を受けやすいこと、細胞塊の大きさや形状を制御するのが困難なこと、細胞のロスが多くなりやすいことなどの問題がある。
しかしながら、マイクロキャリア同士や細胞塊同士の衝突が起き易いこと、また細胞が培養液の流れの刺激を受けやすいこと、細胞塊の大きさや形状を制御するのが困難なこと、細胞のロスが多くなりやすいことなどの問題がある。
また、前記（３）の細胞シートを積層させ、３次元化し、専用モジュールで潅流培養を行う潅流培養装置は、細胞シートの作製に技術と労力が必要な点や、重ねる細胞シートの枚数限界、一度に作れる細胞シートの大きさなどに制限があり、大量の細胞が必要となる再生医療に応用するには作製効率の問題がある。
更に、前記（４）の培養液が浸透する基材に細胞を２次元的に接着させ、潅流培養を行う潅流培養装置、また（５）の多孔質セラミックス培養基材（多孔質セラミックス細胞培養担体）と、それを組みこんだモジュールに培養液供給装置を接続した潅流培養装置にあっては、前記した浮遊培養のように、細胞塊同士の衝突はなく、細胞塊の大きさや形状を制御しやすいことや、かつ細胞数を用意できれば比較的少ない工程で細胞塊を形成できるという利点がある。
しかし、この潅流培養装置にあっては、細胞密度が高く、潅流速度が遅く、撹拌が起こらないため、溶存酸素の自然拡散速度より、細胞の酸素消費速度が速く、培養空間内で酸素濃度の濃度勾配が発生し、細胞近傍の酸素が不足する虞があった。
しかし、この潅流培養装置にあっては、細胞密度が高く、潅流速度が遅く、撹拌が起こらないため、溶存酸素の自然拡散速度より、細胞の酸素消費速度が速く、培養空間内で酸素濃度の濃度勾配が発生し、細胞近傍の酸素が不足する虞があった。
本発明者らは、所定の大きさの細胞塊を、比較的容易に形成できる、少なくとも凹部底面が多孔体の細胞培養担体と、それを組みこんだモジュールに培養液供給装置を接続した潅流培養装置を前提に、細胞近傍の酸素濃度を制御するという課題を解決するために鋭意研究を重ね、本発明を想到するに至った。
尚、特許文献２においては、ＣＯ２・Ｏ２センサーを培養容器に接続する旨の技術的開示はあるものの、培養空間内で酸素濃度の濃度勾配が発生するという課題及びこれを検知することの技術的開示はない。
尚、特許文献２においては、ＣＯ２・Ｏ２センサーを培養容器に接続する旨の技術的開示はあるものの、培養空間内で酸素濃度の濃度勾配が発生するという課題及びこれを検知することの技術的開示はない。
本発明は、上記状況のもとなされたものであり、細胞近傍の培養液の溶存酸素濃度を検知し、培養細胞近傍の溶存酸素濃度を制御できる細胞培養モジュールを提供することを目的とする。
上記目的を達成するためになされた、本発明にかかる細胞培養モジュールは、表面に細胞を培養する凹部を有し、少なくとも前記凹部の底面が平均気孔径０．０５μｍ以上１０μｍ以下であり気孔率が２５％以上５０％以下のセラミックス多孔質焼結体からなる細胞培養担体と、前記細胞培養担体が収容され、前記細胞培養担体によって内部空間が第１空間及び第２空間に仕切られる保持部材と、前記保持部材の第１空間側に設けられた、第１空間内に新規な培養液を供給する供給口と、前記保持部材の第１空間側に設けられた、第１空間内の培養液を循環させるための導出口及び導入口と、前記保持部材の上部に形成された第１空間から外部に連通する空気孔と、前記保持部材の第２空間側に設けられた、前記細胞培養担体を介して、第１空間内の培養液を排出する排出口と、前記第１空間内部で前記細胞培養担体の上面から非接触で５ｍｍ以下の位置に設けられた、第１空間内の培養液の溶存酸素濃度を測定する酸素センサーと、前記培養液を排出する排出口に接続される液路と、前記酸素センサーの測定値に応じて、前記保持部材の第２空間内部に負圧を作用させることにより、前記細胞培養担体を介して、第１空間内部の培養液に負圧を作用させ、前記細胞培養担体の凹部内の培養液を排出する、前記液路に接続された吸引部と、を備えたことを特徴としている。
このように、本発明にかかる細胞培養モジュールにあっては、保持部材の第１空間内部に、第１空間内の培養液の溶存酸素濃度を測定する酸素センサーが設けられている。
この酸素センサーの測定値に応じて、培養液を排出する排出口から負圧を作用させ、（吸引し）、細胞培養担体を介して、第１の空間内の培養液を吸引することができる。この吸引によって、溶存酸素濃度の低い培養細胞近傍の培養液は、細胞培養担体の凹部内から排出され、溶存酸素濃度の高い表層の培養液と置換され、培養細胞の酸素不足が解消される。
この酸素センサーの測定値に応じて、培養液を排出する排出口から負圧を作用させ、（吸引し）、細胞培養担体を介して、第１の空間内の培養液を吸引することができる。この吸引によって、溶存酸素濃度の低い培養細胞近傍の培養液は、細胞培養担体の凹部内から排出され、溶存酸素濃度の高い表層の培養液と置換され、培養細胞の酸素不足が解消される。
また、排出口からの培養液を排出し、供給口から所定の溶存酸素を含有する新規な培養液を供給し、第１空間内部の培養液の溶存酸素濃度を所定の濃度となすこともできる。
尚、この細胞培養モジュールに、培養液の排出速度、供給速度を制御する制御部を設け、酸素センサーの測定値に合わせて、排出口からの培養液の排出速度、供給口からの供給速度を自動制御し、第１空間内部の培養液の溶存酸素濃度を所定の濃度になすように構成しても良い。
尚、この細胞培養モジュールに、培養液の排出速度、供給速度を制御する制御部を設け、酸素センサーの測定値に合わせて、排出口からの培養液の排出速度、供給口からの供給速度を自動制御し、第１空間内部の培養液の溶存酸素濃度を所定の濃度になすように構成しても良い。
更に、この酸素センサーの測定値に応じて、導出口から培養液を導出し、導入口から再び第１空間内へ導入し、培養液を循環させても良い。このように、循環させることにより、第１空間内部の培養液の溶存酸素の濃度勾配を制御することができる。
特に、前記酸素センサーが前記細胞培養担体の上面から非接触で５ｍｍ以下に位置している。
前記酸素センサーが上記範囲内に位置している場合には、細胞近傍の培養液の溶存酸素濃度を検知することができる。
この酸素センサーは、前記細胞培養担体の上面に限りなく近接していることが好ましい（前記上面と接触する場合は、接触の際の衝撃でセンサーが破損する虞もあり、あまり好ましくない）が、前記上面から５ｍｍを越えると、培養空間内で酸素濃度の濃度勾配の影響を受けて、細胞近傍の培養液の溶存酸素濃度を正確に測定できないため、好ましくない。
したがって、酸素センサーは細胞培養担体の上面から非接触で５ｍｍ以下に位置しているのが好ましい。
前記酸素センサーが上記範囲内に位置している場合には、細胞近傍の培養液の溶存酸素濃度を検知することができる。
この酸素センサーは、前記細胞培養担体の上面に限りなく近接していることが好ましい（前記上面と接触する場合は、接触の際の衝撃でセンサーが破損する虞もあり、あまり好ましくない）が、前記上面から５ｍｍを越えると、培養空間内で酸素濃度の濃度勾配の影響を受けて、細胞近傍の培養液の溶存酸素濃度を正確に測定できないため、好ましくない。
したがって、酸素センサーは細胞培養担体の上面から非接触で５ｍｍ以下に位置しているのが好ましい。
なお、酸素センサーの位置は、前記酸素センサーの下端部からの距離を示すものである。また、細胞培養担体と酸素センサーの配置は、細胞培養担体に対し垂直でもよく、斜めでもよい。細胞培養担体に対し垂直となる位置に酸素センサーが配置されるのが細胞近傍の溶存酸素濃度を正確に測定できるため、より好ましい。
更に、前記培養液を排出する排出口に接続される液路と、前記液路に接続された、前記保持部材の第２空間内部に負圧を作用させ、第１空間内部の培養液に負圧を作用させる、吸引部と、を備える。
このように第２空間内部に負圧を作用させる吸引部が構成されていることにより、第１空間内部（細胞培養担体上方）からの加圧による排出と比べ、細胞への圧力を低減させることができるため、細胞へのダメージを抑制することができる。
前記吸引部は特に限定されないが、例えば、シリンジポンプ、真空ポンプである。中でも、吸引部がシリンジポンプで構成されている場合には、緩やかに負圧を作用させることができ、培養細胞にかかる圧力を低減させ、細胞へのダメージを抑制しつつ、溶存酸素濃度の低い培養細胞近傍の培養液を、溶存酸素濃度の高い表層の培養液と置換することができる。その結果、培養細胞の酸素不足が解消されるため、より好ましい。
このように第２空間内部に負圧を作用させる吸引部が構成されていることにより、第１空間内部（細胞培養担体上方）からの加圧による排出と比べ、細胞への圧力を低減させることができるため、細胞へのダメージを抑制することができる。
前記吸引部は特に限定されないが、例えば、シリンジポンプ、真空ポンプである。中でも、吸引部がシリンジポンプで構成されている場合には、緩やかに負圧を作用させることができ、培養細胞にかかる圧力を低減させ、細胞へのダメージを抑制しつつ、溶存酸素濃度の低い培養細胞近傍の培養液を、溶存酸素濃度の高い表層の培養液と置換することができる。その結果、培養細胞の酸素不足が解消されるため、より好ましい。
本発明によれば、細胞近傍の培養液の溶存酸素濃度を検知し、培養細胞近傍の溶存酸素濃度を制御できる細胞培養モジュールを得ることができる。
本発明にかかる細胞培養モジュールの一実施形態について、図１乃至図５に基づいて説明する。
本発明にかかる細胞培養モジュール１は、図１に示すように、表面に細胞を培養する凹部（ウェル）２ａを有し、少なくとも凹部２ａの底面が多孔体からなる細胞培養担体２を備えている。
また、この細胞培養担体２を収容し、前記細胞培養担体２によって内部空間が第１の空間Ｓ１及び第２の空間Ｓ２に仕切られる保持部材３を備えている。
更に、前記第１の空間Ｓ１内部の培養液の溶存酸素濃度を測定するために、第１空間Ｓ１の内部には、培養液の溶存酸素濃度を測定する酸素センサー９が設けられている。
尚、培養液の溶存酸素濃度とは、培養液中に溶け込んだ酸素濃度であり、３７℃・１気圧大気中の蒸留水に溶け込む飽和酸素濃度（６．８６ｍｇ／Ｌ）を２０．９％とし、酸素が全く溶け込んでいない状態（０ｍｇ／Ｌ）を０％として、その他の値は比例計算で算出している。
本発明にかかる細胞培養モジュール１は、図１に示すように、表面に細胞を培養する凹部（ウェル）２ａを有し、少なくとも凹部２ａの底面が多孔体からなる細胞培養担体２を備えている。
また、この細胞培養担体２を収容し、前記細胞培養担体２によって内部空間が第１の空間Ｓ１及び第２の空間Ｓ２に仕切られる保持部材３を備えている。
更に、前記第１の空間Ｓ１内部の培養液の溶存酸素濃度を測定するために、第１空間Ｓ１の内部には、培養液の溶存酸素濃度を測定する酸素センサー９が設けられている。
尚、培養液の溶存酸素濃度とは、培養液中に溶け込んだ酸素濃度であり、３７℃・１気圧大気中の蒸留水に溶け込む飽和酸素濃度（６．８６ｍｇ／Ｌ）を２０．９％とし、酸素が全く溶け込んでいない状態（０ｍｇ／Ｌ）を０％として、その他の値は比例計算で算出している。
更に、この細胞培養担体２について、図２に基づいて説明する。
この細胞培養担体２は、例えば、その上面には複数の凹部（ウェル）２ａが形成され、複数の凹部（ウェル）２ａの底面は多孔体で形成されている。
このように、前記細胞培養担体２の少なくとも凹部底面が多孔体で形成されているため、細胞培養担体２の裏面側から吸引することにより、第１の空間Ｓ１内の培養液に負圧を作用させることができる。
この細胞培養担体２は、例えば、その上面には複数の凹部（ウェル）２ａが形成され、複数の凹部（ウェル）２ａの底面は多孔体で形成されている。
このように、前記細胞培養担体２の少なくとも凹部底面が多孔体で形成されているため、細胞培養担体２の裏面側から吸引することにより、第１の空間Ｓ１内の培養液に負圧を作用させることができる。
その結果、培養細胞近傍の培養液と、第１の空間Ｓ１内の溶存酸素濃度の高い表層の培養液とを置換することができる。その結果、培養細胞の酸素不足を解消することができる。
尚、前記細胞培養担体２は、少なくとも前記凹部の底面が多孔体で形成されているため、細胞培養担体２の裏面側から培養液を吸引する（負圧を作用させる）ことにより、第１の空間Ｓ１内の培養液を、第１の空間Ｓ１から第２の空間Ｓ２内に導出させることができる。
尚、前記細胞培養担体２は、少なくとも前記凹部の底面が多孔体で形成されているため、細胞培養担体２の裏面側から培養液を吸引する（負圧を作用させる）ことにより、第１の空間Ｓ１内の培養液を、第１の空間Ｓ１から第２の空間Ｓ２内に導出させることができる。
この細胞培養担体２は、凹部底面が多孔体であれば特に限定されるものではないが、前記多孔体の具体的な例としては、多孔質セラミックス、多孔性プラスチック、多孔有機膜等があげられ、中でも多孔質セラミックスが好ましい。例えば、平均細孔径が０．０５μｍ以上１０μｍ以下である細孔を有し、気孔率が２５％以上５０％以下のセラミックス多孔質焼成体で形成され、材質としては、生体安全性の高い、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、アルミナ−シリカ、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム等が挙げられるが、これらの中でも、生体安定性が確認されている、アルミナ、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、チタニアがより好ましい。特に、ジルコニアまたはアルミナが好ましい。
前記細胞培養担体２は、前記材料を用いて製作される多孔質焼成体であり、これにより培養担体に接着している細胞塊全体にも培養液を十分供給できる。
前記細胞培養担体２は、前記材料を用いて製作される多孔質焼成体であり、これにより培養担体に接着している細胞塊全体にも培養液を十分供給できる。
次に、保持部材及び酸素センサーについて、図１、図３〜図５に基づいて説明する。
図１は概略構成を示したもので、具体的な保持部材３の構成を図３〜図５に示す。
保持部材３は、図１に示すように、下面に凹部３ａが形成された、プラスチックで構成された上部部材３Ａと、上面に凹部３ｂが形成された、プラスチックで構成された下部部材３Ｂとを備えている。
そして、下部部材３Ｂの凹部３ｂによって形成される空間に、細胞培養担体２を収容して、下面に凹部３ａが形成された上部部材３Ａを当接させる。これにより、細胞培養担体２によって内部空間が第１の空間Ｓ１及び第２の空間Ｓ２に仕切られた保持部材３が形成される。
図１は概略構成を示したもので、具体的な保持部材３の構成を図３〜図５に示す。
保持部材３は、図１に示すように、下面に凹部３ａが形成された、プラスチックで構成された上部部材３Ａと、上面に凹部３ｂが形成された、プラスチックで構成された下部部材３Ｂとを備えている。
そして、下部部材３Ｂの凹部３ｂによって形成される空間に、細胞培養担体２を収容して、下面に凹部３ａが形成された上部部材３Ａを当接させる。これにより、細胞培養担体２によって内部空間が第１の空間Ｓ１及び第２の空間Ｓ２に仕切られた保持部材３が形成される。
尚、上部部材３Ａと下部部材３Ｂの嵌合部には、Ｏリング３Ｃ１が設けられ、気密性が保たれている。また、図４に示すように、上部部材３Ａと細胞培養担体２との間に、Ｏリング３Ｃ２が設けられ、気密性が保たれている。
また、図４、図５に示すように、第１空間Ｓ１を形成する上部部材３Ａには、第１空間Ｓ１内に培養液を供給する供給口４と、前記第１の空間Ｓ１内の培養液を循環させるための導出口５及び導入口６が設けられている。
そして、図１に示すように、この導出口５と導入口６は液路７により接続され、ポンプ８により第１空間Ｓ１内の培養液が循環するように構成されている。
そして、図１に示すように、この導出口５と導入口６は液路７により接続され、ポンプ８により第１空間Ｓ１内の培養液が循環するように構成されている。
更に、保持部材３の上部部材３Ａの上部中央部には前記凹部３ａに連通する貫通孔３Ｄが形成され、酸素センサー９が取り付けられるように構成されている。
この酸素センサー９は、第１の空間Ｓ１内部の培養液の溶存酸素濃度を測定するものであって、酸素センサー９下面と細胞培養担体２の上面との間の距離寸法ｔが０ｍｍ以上５ｍｍ以下となるように配置される。
このように前記細胞培養担体２に近接して配置されるため、細胞近傍の培養液の溶存酸素濃度を測定することができる。
この酸素センサー９は、第１の空間Ｓ１内部の培養液の溶存酸素濃度を測定するものであって、酸素センサー９下面と細胞培養担体２の上面との間の距離寸法ｔが０ｍｍ以上５ｍｍ以下となるように配置される。
このように前記細胞培養担体２に近接して配置されるため、細胞近傍の培養液の溶存酸素濃度を測定することができる。
また、前記酸素センサー９は、前記細胞培養担体２の上面に限りなく近接していることが好ましい。尚、酸素センサー９を前記上面と接触させる場合には、センサー破損の虞があることから、緩やかに接触させることが好ましい。
一方、前記距離寸法ｔが細胞培養担体２の上面から５ｍｍを越えると、培養空間内で酸素濃度の濃度勾配の影響を受けて、細胞近傍の培養液の溶存酸素濃度を正確に測定することができない虞がある。
したがって、酸素センサーは細胞培養担体の上面から０ｍｍ以上５ｍｍ以下に位置させるのが良い。
一方、前記距離寸法ｔが細胞培養担体２の上面から５ｍｍを越えると、培養空間内で酸素濃度の濃度勾配の影響を受けて、細胞近傍の培養液の溶存酸素濃度を正確に測定することができない虞がある。
したがって、酸素センサーは細胞培養担体の上面から０ｍｍ以上５ｍｍ以下に位置させるのが良い。
また、保持部材３の上部部材３Ａの上部には、第１空間Ｓ１に連通する空気孔３Ｅが形成されている。この空気孔３Ｅを介して、第１の空間Ｓ１内に空気が供給されるように構成されている。
またこの空気孔３Ｅにはフィルター１５が設けられ、空気孔３Ｅから流入する空気内に細菌、ウィルス等の混入を防止するようになされている。なお、この空気孔３Ｅは、図示した場合を記載したが、その他の構成（液路等）により第１の空間Ｓ１内に空気が供給される場合には設けなくてもよい。
またこの空気孔３Ｅにはフィルター１５が設けられ、空気孔３Ｅから流入する空気内に細菌、ウィルス等の混入を防止するようになされている。なお、この空気孔３Ｅは、図示した場合を記載したが、その他の構成（液路等）により第１の空間Ｓ１内に空気が供給される場合には設けなくてもよい。
更に、前記保持部材３の第２空間Ｓ２を形成する下部部材３Ｂには、培養液を排出する排出口１０が設けられ、この排出口１０には液路１１が接続されている。また液路１１には、保持部材３の第１空間Ｓ１内部の培養液を吸引する（負圧を作用させる）、吸引部１２が設けられている。
また、図１中の符号１３，１４は切換えバルブである。図１には示していないが、切換えバルブ１４の後段に排出ポンプが設けられ、吸引部１２と、排出ポンプの切換えが可能に構成されている。
続いて、前記実施形態にかかる細胞培養モジュールの動作、作用について、図１に基づいて説明する。
細胞培養中、酸素センサー９で第１の空間Ｓ１内の培養液の溶存酸素濃度を測定する。その結果、溶存酸素が所定濃度の範囲内である場合には、その状態が維持される。
その後、酸素センサー９による測定の結果、所定濃度以下であった場合には、吸引部１２を動作させ、第２の空間Ｓ２に負圧を作用させ、細胞培養担体２を介して、第１の空間内の培養液を吸引する。
この吸引によって、溶存酸素濃度の低い培養細胞近傍の培養液は、細胞培養担体２の凹部内から排出され、溶存酸素濃度のより高い表層の培養液と置換され、培養細胞の酸素不足が解消される。
細胞培養中、酸素センサー９で第１の空間Ｓ１内の培養液の溶存酸素濃度を測定する。その結果、溶存酸素が所定濃度の範囲内である場合には、その状態が維持される。
その後、酸素センサー９による測定の結果、所定濃度以下であった場合には、吸引部１２を動作させ、第２の空間Ｓ２に負圧を作用させ、細胞培養担体２を介して、第１の空間内の培養液を吸引する。
この吸引によって、溶存酸素濃度の低い培養細胞近傍の培養液は、細胞培養担体２の凹部内から排出され、溶存酸素濃度のより高い表層の培養液と置換され、培養細胞の酸素不足が解消される。
また、前記したように、第２空間内部に負圧を作用させる吸引部１２が構成されていることにより、第１空間内部（細胞培養担体上方）からの加圧による排出と比べ、細胞への圧力を低減させることができるため、細胞へのダメージを抑制することができる。
また、この細胞培養モジュール１にあっては、前記第１の空間Ｓ１内の培養液を循環させるための導出口５、導入口６が設けられているため、酸素センサー９による測定の結果に応じて、ポンプ８を動作させ、第１の空間Ｓ１内の培養液を循環させても良い。
更に、酸素センサー９による測定の結果に応じて、切換えバルブ１３，１４によって、吸引部１２から排出ポンプに切り換え、排出口１０からの培養液を排出しても良い。
このとき、培養液供給装置（図示せず）に接続された供給口４から所定の溶存酸素濃度の新規な培養液を第１の空間Ｓ１内に供給することによって、培養液の溶存酸素濃度が所定の濃度範囲に維持される。
このとき、培養液供給装置（図示せず）に接続された供給口４から所定の溶存酸素濃度の新規な培養液を第１の空間Ｓ１内に供給することによって、培養液の溶存酸素濃度が所定の濃度範囲に維持される。
また、この細胞培養モジュール１に、培養液の排出速度、供給速度を制御する制御部を設け、酸素センサーの測定値に合わせて、排出口からの培養液の排出速度、供給口からの供給速度を自動制御し、第１空間内部の培養液の溶存酸素濃度を所定の濃度になすように構成しても良い。
また、上記実施形態の変形例として、保持部材の第２空間側に供給口を設け、前記細胞培養担体を介して、第１空間内に培養液を供給し、また保持部材の第１空間側に排出口を設け、第１空間内の培養液を排出しても良い。尚、上記実施形態と同様に、前記第１空間内部には、第１空間内の培養液の溶存酸素濃度を測定する酸素センサーが設けられている。
この変形例にあっても、酸素センサーの測定値に応じて、第１空間内の培養液を排出口から排出すると共に、第２空間側から前記細胞培養担体を介して、第１空間内に培養液を供給することにより、溶存酸素濃度の低い培養細胞近傍の培養液は、細胞培養担体の凹部内から排出され、溶存酸素濃度の高い培養液と置換され、培養細胞の酸素不足が解消される。
この変形例にあっても、酸素センサーの測定値に応じて、第１空間内の培養液を排出口から排出すると共に、第２空間側から前記細胞培養担体を介して、第１空間内に培養液を供給することにより、溶存酸素濃度の低い培養細胞近傍の培養液は、細胞培養担体の凹部内から排出され、溶存酸素濃度の高い培養液と置換され、培養細胞の酸素不足が解消される。
また、この変形例においても、上記実施形態と同様に、培養液の排出速度、供給速度を制御する制御部を設け、酸素センサーの測定値に合わせて、排出口からの培養液の排出速度、供給口からの供給速度を自動制御し、第１空間内部の培養液の溶存酸素濃度を所定の濃度になすように構成しても良い。また、この酸素センサーの測定値に応じて、導出口から培養液を導出し、導入口から再び第１空間内へ導入し、培養液を循環させても良い。このように、循環させることにより、第１空間内部の培養液の溶存酸素の濃度勾配を制御することができる。
尚、上記変形例では、保持部材の第２空間側に供給口を設け、前記細胞培養担体を介して、第１空間内に培養液を供給し、また保持部材の第１空間側に排出口を設け、第１空間内の培養液を排出したが、更に上記実施形態と同様に、保持部材の第２空間側に排出口と吸引部を設けても良い。
以上説明したように、本発明にかかる細胞培養モジュールは、少なくとも凹部の底面が多孔体からなる細胞培養担体を収容した細胞培養モジュールであって、この細胞培養モジュールに培養液供給装置等が接続され、潅流培養を行う培養装置における細胞近傍の培養液の溶存酸素不足を解消するものである。しかも、本発明にかかる細胞培養モジュールには、酸素センサーが設けられているため、センサーの測定値に合わせ、培養液の排出・供給速度を制御し、細胞近傍の溶存酸素濃度を一定に維持することもできる。
更に言えば、本発明にかかる細胞培養モジュールの酸素センサーが前記細胞培養担体の上面から０ｍｍ以上５ｍｍ以下に位置しているため、細胞近傍の培養液の溶存酸素濃度を正確に測定することができる。
また、第２空間内部に負圧を作用させる吸引部が設けられている場合には、第１空間内部（細胞培養担体上方）からの加圧による排出と比べ、細胞への圧力を低減させることができるため、細胞へのダメージを抑制しつつ、溶存酸素濃度の低い培養細胞近傍の培養液を、溶存酸素濃度のより高い表層の培養液と置換することができる。
また、第２空間内部に負圧を作用させる吸引部が設けられている場合には、第１空間内部（細胞培養担体上方）からの加圧による排出と比べ、細胞への圧力を低減させることができるため、細胞へのダメージを抑制しつつ、溶存酸素濃度の低い培養細胞近傍の培養液を、溶存酸素濃度のより高い表層の培養液と置換することができる。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により限定解釈されるものではない。
（実験１）
図１に示した細胞培養モジュールを用いて、培養空間内で溶存酸素濃度の濃度勾配について、実験を行った。
細胞培養担体として、平均細孔径が０．１４μｍである細孔を有し、気孔率が４８％の多孔質セラミックス焼成体であって、厚さ３ｍｍ、直径３４ｍｍ、深さ０．５ｍｍ、直径０．５ｍｍの凹部（ウェル）が３０００個形成されている細胞培養担体を用いた。
図１に示した細胞培養モジュールを用いて、培養空間内で溶存酸素濃度の濃度勾配について、実験を行った。
細胞培養担体として、平均細孔径が０．１４μｍである細孔を有し、気孔率が４８％の多孔質セラミックス焼成体であって、厚さ３ｍｍ、直径３４ｍｍ、深さ０．５ｍｍ、直径０．５ｍｍの凹部（ウェル）が３０００個形成されている細胞培養担体を用いた。
この細胞培養担体に、ヒトｉＰＳ細胞５×１０６個を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地２．５ｍｌに懸濁させた懸濁液（２×１０６個／ｍｌ）を播種した。
また、培養液を細胞培養担体の上面から１５ｍｍの深さとなるように供給した。そして、酸素センサーを細胞培養担体の上面から０ｍｍ、１ｍｍ、２．５ｍｍ、５ｍｍ、７．５ｍｍ、１０ｍｍと変化させ、夫々の位置における培養液の酸素濃度を測定した。
また、培養液を細胞培養担体の上面から１５ｍｍの深さとなるように供給した。そして、酸素センサーを細胞培養担体の上面から０ｍｍ、１ｍｍ、２．５ｍｍ、５ｍｍ、７．５ｍｍ、１０ｍｍと変化させ、夫々の位置における培養液の酸素濃度を測定した。
その結果を図６に示す。尚、図６（ａ）は、縦軸に溶存酸素濃度（％）、横軸に細胞培養担体から酸素センサーまでの距離をとった箱ひげ図であって、図６（ｂ）は前記距離が５ｍｍ、７．５ｍｍ、１０ｍｍの部分の拡大図である。
図６（ａ）に示すように、前記酸素センサーが前記細胞培養担体の上面から５ｍｍの距離（第１の空間の培養液の深さの３５％の領域内）以下になると、急激に溶存酸素濃度が低下することが確認された。また、図６（ｂ）に示すように、前記酸素センサーが前記細胞培養担体の上面から５ｍｍの距離（培養液の深さの３５％の領域内）を超えると、測定結果にばらつきが大きく、正確に酸素濃度を測定できなかった。
したがって、前記酸素センサーは、前記細胞培養担体の上面から０ｍｍ以上５ｍｍ以下に位置している（配置されている）ことが好ましい。
図６（ａ）に示すように、前記酸素センサーが前記細胞培養担体の上面から５ｍｍの距離（第１の空間の培養液の深さの３５％の領域内）以下になると、急激に溶存酸素濃度が低下することが確認された。また、図６（ｂ）に示すように、前記酸素センサーが前記細胞培養担体の上面から５ｍｍの距離（培養液の深さの３５％の領域内）を超えると、測定結果にばらつきが大きく、正確に酸素濃度を測定できなかった。
したがって、前記酸素センサーは、前記細胞培養担体の上面から０ｍｍ以上５ｍｍ以下に位置している（配置されている）ことが好ましい。
（実験２）
実験１と同じ条件下で、酸素センサーを前記細胞培養担体の上面から１ｍｍに位置させ、酸素濃度が１０％になるように制御させた。具体的には、細胞の酸素消費によって酸素濃度が１０％以下になった時に、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで培養液の循環を行い、酸素濃度を１０％に維持した。その結果を図７に示す。
実験１と同じ条件下で、酸素センサーを前記細胞培養担体の上面から１ｍｍに位置させ、酸素濃度が１０％になるように制御させた。具体的には、細胞の酸素消費によって酸素濃度が１０％以下になった時に、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで培養液の循環を行い、酸素濃度を１０％に維持した。その結果を図７に示す。
図７に示すとおり、細胞近傍の溶存酸素濃度を１０％程度に維持していることがわかる。即ち、培養液を循環させることにより、細胞近傍の溶存酸素濃度を制御するできることを確認した。
（実験３）
図８に示すように、インキュベータ内に細胞培養モジュールと酸素センサーを配置し、細胞培養モジュール内で細胞の培養を行いつつ、インキュベータ内の酸素濃度を測定した。
この実験では、平均細孔径が０．１４μｍである細孔を有し、気孔率が４８％の多孔質セラミックス焼成体であって、厚さ３ｍｍ、直径３４ｍｍの細胞培養担体であって、深さ０．５ｍｍ、直径０．５ｍｍの凹部（ウェル）が３０００個形成されている細胞培養担体を用いた。この細胞培養担体にヒト間葉系幹細胞５×１０６個を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地２．５ｍｌに懸濁させた懸濁液（２×１０６個／ｍｌ）を播種した。この測定結果を図９に示す。
図８に示すように、インキュベータ内に細胞培養モジュールと酸素センサーを配置し、細胞培養モジュール内で細胞の培養を行いつつ、インキュベータ内の酸素濃度を測定した。
この実験では、平均細孔径が０．１４μｍである細孔を有し、気孔率が４８％の多孔質セラミックス焼成体であって、厚さ３ｍｍ、直径３４ｍｍの細胞培養担体であって、深さ０．５ｍｍ、直径０．５ｍｍの凹部（ウェル）が３０００個形成されている細胞培養担体を用いた。この細胞培養担体にヒト間葉系幹細胞５×１０６個を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地２．５ｍｌに懸濁させた懸濁液（２×１０６個／ｍｌ）を播種した。この測定結果を図９に示す。
また、酸素センサーを前記細胞培養担体の上面から１ｍｍに位置させた以外、前記実験と同一の条件で実験を行った。即ち、同一の細胞培養担体を用い、同一の懸濁液（２×１０６個／ｍｌ）を播種し、細胞培養担体の上面から１ｍｍの酸素濃度を測定した。
その結果を図１０に示す。
その結果を図１０に示す。
この図９、図１０からわかるように、インキュベータ内とモジュール内との酸素濃度に乖離があることが判明した。
したがって、インキュベータ内に酸素センサーを配置し、インキュベータ内の酸素濃度の変化を測定しても培養細胞近傍の溶存酸素濃度と異なるため、培養細胞の酸素不足を検出することができないことが判明した。
したがって、インキュベータ内に酸素センサーを配置し、インキュベータ内の酸素濃度の変化を測定しても培養細胞近傍の溶存酸素濃度と異なるため、培養細胞の酸素不足を検出することができないことが判明した。
１ 細胞培養モジュール
２ 細胞培養担体
３ 保持部材
３Ａ 上部部材
３Ｂ 下部部材
３Ｄ 貫通孔
３Ｅ 空気孔
３ａ 上部部材の凹部
３ｂ 下部部材の凹部
４ 供給口
５ 導出口
６ 導入口
７ 液路
８ ポンプ
９ 酸素センサー
１０ 排出口
１１ 液路
１２ 吸引部
１３ 切換えバルブ
１４ 切換えバルブ
１５ フィルター
Ｓ１ 第１の空間
Ｓ２ 第２の空間
ｔ 酸素センサー（下面）と細胞培養担体上面との距離寸法
２ 細胞培養担体
３ 保持部材
３Ａ 上部部材
３Ｂ 下部部材
３Ｄ 貫通孔
３Ｅ 空気孔
３ａ 上部部材の凹部
３ｂ 下部部材の凹部
４ 供給口
５ 導出口
６ 導入口
７ 液路
８ ポンプ
９ 酸素センサー
１０ 排出口
１１ 液路
１２ 吸引部
１３ 切換えバルブ
１４ 切換えバルブ
１５ フィルター
Ｓ１ 第１の空間
Ｓ２ 第２の空間
ｔ 酸素センサー（下面）と細胞培養担体上面との距離寸法
Claims (2)
- 表面に細胞を培養する凹部を有し、少なくとも前記凹部の底面が平均気孔径０．０５μｍ以上１０μｍ以下であり気孔率が２５％以上５０％以下のセラミックス多孔質焼結体からなる細胞培養担体と、
前記細胞培養担体が収容され、前記細胞培養担体によって内部空間が第１空間及び第２空間に仕切られる保持部材と、
前記保持部材の第１空間側に設けられた、第１空間内に新規な培養液を供給する供給口と、
前記保持部材の第１空間側に設けられた、第１空間内の培養液を循環させるための導出口及び導入口と、
前記保持部材の上部に形成された第１空間から外部に連通する空気孔と、
前記保持部材の第２空間側に設けられた、前記細胞培養担体を介して、第１空間内の培養液を排出する排出口と、
前記第１空間内部で前記細胞培養担体の上面から非接触で５ｍｍ以下の位置に設けられた、第１空間内の培養液の溶存酸素濃度を測定する酸素センサーと、
前記培養液を排出する排出口に接続される液路と、
前記酸素センサーの測定値に応じて、前記保持部材の第２空間内部に負圧を作用させることにより、前記細胞培養担体を介して、第１空間内部の培養液に負圧を作用させ、前記細胞培養担体の凹部内の培養液を排出する、前記液路に接続された吸引部と、
を備えたことを特徴とする細胞培養モジュール。 - 前記酸素センサーが、前記第１空間内の培養液の深さ３５％の領域内に位置していることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養モジュール。
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