JP6861803B2 - ソノポレーションを使用した生物学的細胞の高効率トランスフェクション - Google Patents
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Description
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
(a)(i)宿主細胞および前記宿主細胞内に導入しようとする外因性物質を各々が含む少なくとも2つのレザバー、および(ii)音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
(b)前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第1のレザバーと音響的に接続するステップ、
(c)前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記第1のレザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進するステップ、
(d)前記音響放射発生器を前記第1のレザバーから音響的に分離するステップ、
(e)前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第2のレザバーと音響的に接続するステップ、ならびに
(f)前記第2のレザバーにつき、ステップ(c)を繰り返すステップ
を含む、方法。
(項目2)
前記少なくとも2つのレザバーが、複数のレザバー内に含まれており、前記方法が、(g)前記音響放射発生器を前記第2のレザバーから音響的に分離し、その後、前記複数のレザバーの追加のレザバーにつき、ステップ(b)〜(g)を繰り返すステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記複数のレザバーが、96個のレザバー、384個のレザバー、1536個のレザバー、3456個のレザバー、または3456個よりも多くのレザバーを含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記レザバーが、アレイで配置されている、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記レザバーが、一体型多重レザバーユニットを含む担体内に含まれている、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記一体型多重レザバーユニットが、ウェルプレートを含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
ステップ(c)〜(e)が、最大で約0.5秒のレザバー間移行時間で実施される、項目1に記載の方法。
(項目8)
ステップ(b)〜(g)の反復が、最大で約0.5秒のレザバー間移行時間で実施される、項目2に記載の方法。
(項目9)
前記レザバー間移行時間が、最大で約0.1秒である、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記レザバー間移行時間が、最大で約0.001秒である、項目8に記載の方法。
(項目11)
各レザバー間移行が、前記レザバーを前記音響放射発生器に対して移動させることにより実施される、項目8に記載の方法。
(項目12)
各レザバー間移行が、前記音響放射発生器を前記レザバーに対して移動させることにより実施される、項目8に記載の方法。
(項目13)
前記音響放射発生器が、集束素子を含み、ステップ(c)が、前記レザバー内へと指向させた音響放射が集束音響放射になるように、ステップ(c)で発生させた音響放射を集束させることをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記宿主細胞および前記外因性物質が、流体媒体内に含まれている、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記宿主細胞のソノポレーションを誘導するための様式が、発生させた前記音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段を含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段が、トランスフェクション刺激物質を含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記トランスフェクション刺激物質が、前記流体媒体内に複数の音響活性化可能な部分を含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記音響活性化可能な部分が、局所化流体容積を含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記局所化流体容積が、取り囲まれた流体容積である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記取り囲まれた容積が、気体充填マイクロバブルを含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
ステップ(c)で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から約15%以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から約15%以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、項目16に記載の方法。
(項目22)
ステップ(c)で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から約5%以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から約5%以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、項目19に記載の方法。
(項目23)
前記システムが、前記マイクロバブルから前記細胞への音響放射の移転を可能にするように、前記マイクロバブルが前記宿主細胞と十分に接近することを確実にするための手段をさらに含む、項目20に記載の方法。
(項目24)
前記手段が、ステップ(b)の前に、前記マイクロバブルを前記宿主細胞にコンジュゲートすることを含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
ステップ(a)で提供された前記システム中の前記宿主細胞が、前記マイクロバブルにコンジュゲートされる、項目23に記載の方法。
(項目26)
各レザバー中の前記流体媒体の容積が、約0.5μL〜約500μLの範囲である、項目14に記載の方法。
(項目27)
前記流体媒体が、等張性緩衝液を含む、項目14に記載の方法。
(項目28)
前記細胞が、前記レザバーの表面で平板培養される、項目1に記載の方法。
(項目29)
前記細胞が、非接着性である、項目1に記載の方法。
(項目30)
前記外因性物質が、核酸、プラスミド、ペプチド、タンパク質、脂質、ポリサッカリド、小型分子、またはそれらの組み合わせを含む、項目1に記載の方法。
(項目31)
前記外因性物質が、DNAプラスミドを含む、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記外因性物質が、リボ核タンパク質を含む、項目30に記載の方法。
(項目33)
前記リボ核タンパク質が、宿主細胞核酸を変更することが可能である、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記リボ核タンパク質が、ガイドRNA、およびCRISPR関連RNA−プログラム可能な(programmable)DNAまたはRNAヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記リボ核タンパク質が、ガイドRNAおよびCas9タンパク質を含む、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記リボ核タンパク質が、ガイドRNA、および触媒的に不活性なCRISPR関連RNA−プログラム可能なDNAまたはRNAヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、項目35に記載の方法。
(項目37)
ステップ(c)では、ソノポレートすることが、前記レザバーを、約15秒間〜約40秒間にわたって毎秒約10〜約25トーンバーストの速度の音響トーンバーストで照射することを含む、項目1に記載の方法。
(項目38)
各周期的音響トーンバーストが、およそ5サイクル〜10サイクルのトーンバーストである、項目37に記載の方法。
(項目39)
宿主細胞をトランスフェクトするための方法であって、
(a)前記宿主細胞と適合する流体媒体に、第1の結合部分で表面機能化された複数の気体充填マイクロバブルを懸濁することにより、マイクロバブル組成物を調製するステップ、
(b)前記マイクロバブルを、前記宿主細胞のタイプに特異的であり、かつ前記第1の結合部分に連結する第2の結合部分で機能化されている抗体と、前記流体媒体中で前記マイクロバブルを前記抗体と混合することによりコンジュゲートし、それによりマイクロバブル−抗体コンジュゲートを生成するステップ、
(c)前記マイクロバブル−抗体コンジュゲートを、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質と混合することにより、負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲートを調製するステップ、
(d)任意選択で、前記負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲートを宿主細胞適合性流体媒体で希釈して、それによりトランスフェクション効率の最適化に有効な負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲート濃度を有する希釈物を提供するステップ、
(e)レザバー中の宿主細胞を前記希釈物と接触させるステップ、および
(f)前記マイクロバブルを、それらの平均共鳴周波数から約15%以内の、またはそれらの平均共鳴周波数の高調波から約15%以内の周波数で共鳴させる条件下で、音響放射を前記レザバーに照射することにより、(e)で提供した前記宿主細胞−希釈物混合物をソノポレートするステップ
を含む、方法。
(項目40)
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、および流体媒体を含むレザバーと音響的に接続するステップ;ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、約10℃よりも大きな前記流体媒体の温度上昇をもたらさずに、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させるステップ
を含む、方法。
(項目41)
前記宿主細胞のソノポレーションが、約5℃よりも大きな前記流体媒体の温度上昇をもたらさない、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記宿主細胞のソノポレーションが、約2℃よりも大きな前記流体媒体の温度上昇をもたらさない、項目41に記載の方法。
(項目43)
ソノポレーションが、前記流体媒体の温度を約40℃よりも高く上昇させない、項目40に記載の方法。
(項目44)
前記レザバー内へと指向される音響放射が、集束音響放射である、項目40に記載の方法。
(項目45)
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、少なくとも1536個のレザバーを含む一体型多重レザバーユニット内に含まれる選択されたレザバーと音響的に接続するステップであって、前記選択されたレザバーが、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、および流体媒体を含む、ステップ;ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記音響放射を、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記レザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ
を含む、方法。
(項目46)
前記レザバー内へと指向される音響放射が、集束音響放射である、項目45に記載の方法。
(項目47)
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ;ならびに
前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、前記局所化流体容積が、前記局所化流体容積の平均共鳴周波数から約15%以内のまたは前記局所化流体容積の平均共鳴周波数の高調波から約15%以内の周波数で振動するように音響的に活性化される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ
を含む、方法。
(項目48)
音響的に活性化された前記局所化流体容積が、前記局所化流体容積の平均共鳴周波数から約5%以内であるかまたは前記局所化流体容積の平均共鳴周波数の高調波から約5%以内である周波数で振動される、項目47に記載の方法。
(項目49)
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびサイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ;ならびに
前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、選択されたサイズから約15%以内のサイズを有する前記局所化流体容積が音響的に活性化される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ
を含む、方法。
(項目50)
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
(a)音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および多峰形サイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ;
(b)前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、第1のモーダルピークから約15%以内であるサイズを有する局所化流体容積が音響的に活性化される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ;
(c)ステップ(b)を繰り返して、第2のモーダルピークから約15%以内であるサイズを有する局所化流体容積を音響的に活性化するステップ;ならびに
(d)任意選択で、ステップ(b)を繰り返して、1つまたは複数の追加のモーダルピークから約15%以内であるサイズを有する局所化流体容積を音響的に活性化するステップ
を含む、方法。
(項目51)
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびサイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ;ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、選択された周波数成分を有する音響放射を発生させ、発生させた前記音響放射を、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記レザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップであって、発生させた前記音響放射の周波数成分が、前記音響活性化可能な局所化流体容積のサイズ分布と関連するように選択される、ステップを含む、方法。
(項目52)
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップであって、前記トランスフェクション刺激物質は、前記レザバー内で空間分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されている、ステップ;ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、選択された周波数成分を有する音響放射を発生させ、発生させた前記音響放射を、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記レザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップであって、発生させた前記音響放射の周波数成分が、前記音響活性化可能な局所化流体容積の空間分布と関連するように選択される、ステップ
を含む、方法。
(項目53)
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および複数の音響活性化可能な局所化流体容積を含むトランスフェクション刺激物質を含む選択されたレザバーと音響的に接続するステップ;ならびに
前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、前記音響放射を、前記局所化流体容積が音響的に活性化される様式で前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップであって、発生させた前記音響放射が、前記局所化流体容積の少なくとも50%が照射後に依然としてインタクトのままであることを確実にするように選択された音響ソノポレーション圧力におけるものである、ステップ
を含む、方法。
(項目54)
前記音響ソノポレーション圧力が、前記局所化流体容積のキャビテーションをもたらすことになる最低音圧の約50%〜90%の範囲である、項目53に記載の方法。
(項目55)
宿主細胞をトランスフェクトするための方法であって、宿主細胞を、宿主細胞適合性流体媒体中にマイクロバブル−抗体コンジュゲートおよび前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質を含むレザバー中で接触させるステップ、ならびにこのようにして提供した宿主細胞−希釈物混合物を、協同して、ただし異なる周波数で作動する2つの変換器により発生された音響放射で前記レザバーを照射することによりソノポレートするステップを含み、前記変換器の一方が、環状変換器であり、周囲に作動可能に設置され、標準的変換器を封入する、方法。
(項目56)
前記環状変換器が、約1MHz〜約2.5MHzの範囲の周波数で作動する、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記標準的変換器が、約6MHz〜約20MHzの範囲の周波数で作動する、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記2つの変換器の一方が、主に、ソノポレーションのための音響エネルギーを供給するように機能し、他方の変換器が、ソノポレートされた細胞の前記流体媒体からの音響射出を可能にするように音響エネルギーを送達する、項目55に記載の方法。
(項目59)
前記2つの変換器の一方が、主に、ソノポレーションのための音響エネルギーを供給するように機能し、他方の変換器が、前記宿主細胞に対する前記マイクロバブルの相対的位置を変化させるための音響エネルギーを送達する、項目55に記載の方法。
(項目60)
前記宿主細胞に対する前記マイクロバブルの相対的位置を、前記マイクロバブルおよび前記宿主細胞が互いに接近してソノポレーションが促進されるように変化させる、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記マイクロバブルおよび前記宿主細胞が、ソノポレーションを引き起こすのに有効な音響強度の領域中で互いに接近して位置決めされる、項目58に記載の方法。
(項目62)
ソノポレーションを使用して宿主細胞をトランスフェクトするための方法において、以下:ソノポレーション事象後にトランスフェクション効率を評価すること、トランスフェクション効率を向上させるための候補解決策として少なくとも1つのソノポレーションパラメーターを調整すること、追加のソノポレーション事象を実施すること、および前記追加のソノポレーション事象のトランスフェクション効率を評価して、前記候補解決策の有効性を評価することを含む、向上。
(項目63)
前記追加のソノポレーション事象のトランスフェクション効率に基づき、ソノポレーションパラメーターを変化させるステップをさらに含む、項目61に記載の方法。
(項目64)
前記ソノポレーションパラメーターが、音響強度、変換器出力周波数、およびトーンバーストプロファイルの少なくとも1つから選択される、項目62に記載の方法。
以下のリストには、これらの実施例で使用される材料が、材料の供給源と共に示される。
上記のプロトコールを使用して、4枚のプレートのHEK−293細胞を試験した。DPBS単独対照ウェルを含む、4つすべてのプレートを同一にセットアップした。対照プレートは超音波処理しなかった。384ウェルプレートを、1ウェル当たり25,000個のHEK−293細胞で使用した。各プレートを、単一の電圧、0V(対照プレート)、0.5V(低出力)、1.0V(中出力)、または1.5V(高出力)のいずれかでパルス処理した。1.0Vは、焦点で約1.5MPaの音圧をもたらした。ソノポレーションの24時間後、細胞のGFP蛍光を検査した。ソノポレーションは、HEK−293細胞がGFPプラスミドを取り込み、発現することを可能にすることにおいて成功裏のものであり、そして取込みパーセントは、電圧およびプラスミド負荷マイクロバブルの濃度と共に増加したことが見出された。最も高い濃度のプラスミド負荷マイクロバブルおよび最も高い電圧で、蛍光が最高度であることが見出された。緑色(蛍光)細胞は、ウェルプレートを反転させた後のマイクロバブルの分布により、ウェルの周囲付近に濃縮されていた。対照プレートの一部の細胞が緑色になったが、極めてわずかだった。これは、数パーセントの細胞が、培地中のプラスミドを取り込んだことによるものだった。
1:200希釈の代わりに「プラスミドのみ」の対照を用いた、つまりプラスミドを1:4ウェルに見出されるものと同じ濃度で添加したこと以外は、一般的プロトコールおよび実施例1の手順に従った。得られた結果により、高媒体濃度のプラスミド単独では、細胞の形質転換に十分ではないことが確認された。
一般的プロトコール実施例1の手順を繰り返したが、各ウェルの中心に単一のパルスを適用するのではなく、各ウェルを異なる位置で数回パルス処理した。これは、各ウェルの全体にわたってGFP蛍光が存在することから推論することができるように、ウェルの周囲付近にトランスフェクトされた細胞が濃縮することを解消し、より均一な分布を提供したことが見出された。
実施例1の手順を以下のように改変して繰り返した。
この例には、ソノポレーションを使用したCRISPRプラスミドのトランスフェクションが記載されている。gWiz−GFPプラスミドの代わりに、Cas9およびGFPを発現するCRISPRプラスミドを用いたこと以外、一般的プロトコールおよび実施例1の手順に従った。1.5Vのソノポレーションパルスを使用した。マイクロバブル−抗体コンジュゲートの分散物を、DPBSで調製した(一般的プロトコールに記載されているように)。マイクロバブル−抗体コンジュゲートの濃度は、DPBS 1mL当たり5×108個だった。その後、この分散物を、分散物1μL当たりのμgプラスミドとして示されている、以下の比率でプラスミドと組み合わせた:1:1;2:1;4:1;および8:1。各比率で3回の反復を実施した。1つの「無プラスミド」陰性対照行および1つの「無ソノポレーション」陰性対照列が含まれていた。実施例4と同様に、IntelliCyt FACSを使用して結果をアッセイした。GFP陽性細胞は、CRISPRプラスミド取込みを示し、蛍光色素染色は死細胞を示した。
この例には、Integrated Technologies,Inc.(IDT、Coralsville、Iowa)から得たAlt−R(商標)S.p.Cas9ヌクレアーゼ3NLS、ならびにHPRT遺伝子を標的とするAlt−R(商標)CRISPR−Cas9HPRT陽性対照crRNA、Alt−R(商標)CRISPR−Cas9陰性対照crRNA、および無ヌクレアーゼ緩衝液を含むAlt−R(商標)CRISPR−Cas9キット(これもIDTから得た)を使用した、CRISPR Cas9/ガイドRNAリボヌクレオチド(RNP)によるHEK−293細胞のトランスフェクションが記載されている。crRNAと複合体形成するための蛍光標識tracrRNAを、別々に得た(ATTO(商標)550にコンジュゲートされたAlt−R(商標)CRISPR−Cas9 tracrRNA、これもIDTから得た)。
Claims (36)
- 細胞に外因性物質をトランスフェクトするための音響的方法であって、
(a)(i)アレイで配置されている複数のレザバ―であって、各々のレザバ―が宿主細胞および前記宿主細胞内に導入しようとする前記外因性物質を含む、レザバー、および(ii)音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
(b)前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第1のレザバーと音響的に接続するステップ、
(c)前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記第1のレザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進するステップ、
(d)前記音響放射発生器を前記第1のレザバーから音響的に分離するステップ、
(e)前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第2のレザバーと音響的に接続するステップ、
(f)前記第2のレザバーにつき、ステップ(c)を繰り返すステップ、ならびに
(g)前記音響放射発生器を前記第2のレザバーから音響的に分離し、その後、前記複数のレザバーの追加のレザバーにつき、ステップ(b)〜(f)を繰り返すステップ
を含む、方法。 - 前記複数のレザバーが、96個のレザバー、384個のレザバー、1536個のレザバー、3456個のレザバー、または3456個よりも多くのレザバーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記レザバーが、一体型多重レザバーユニットを含む担体内に含まれている、請求項1に記載の方法。
- 前記一体型多重レザバーユニットが、ウェルプレートを含む、請求項3に記載の方法。
- ステップ(g)が、最大で0.5秒のレザバー間移行時間で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記レザバー間移行時間が、最大で0.1秒である、請求項5に記載の方法。
- 前記レザバー間移行時間が、最大で0.001秒である、請求項5に記載の方法。
- 各レザバー間移行が、前記レザバーを前記音響放射発生器に対して移動させることにより実施される、請求項5に記載の方法。
- 各レザバー間移行が、前記音響放射発生器を前記レザバーに対して移動させることにより実施される、請求項5に記載の方法。
- 前記音響放射発生器が、集束素子を含み、ステップ(c)が、前記レザバー内へと指向させた音響放射が集束音響放射になるように、ステップ(c)で発生させた音響放射を集束させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞および前記外因性物質が、流体媒体内に含まれている、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞のソノポレーションを誘導するための様式が、発生させた前記音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段を含む、請求項11に記載の方法。
- 音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段が、トランスフェクション刺激物質を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記トランスフェクション刺激物質が、前記流体媒体内に複数の音響活性化可能な部分を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記音響活性化可能な部分が、局所化流体容積を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記局所化流体容積が、取り囲まれた流体容積である、請求項15に記載の方法。
- 前記取り囲まれた容積が、気体充填マイクロバブルを含む、請求項16に記載の方法。
- ステップ(c)で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から15%以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から15%以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、請求項17に記載の方法。
- ステップ(c)で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から5%以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から5%以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、請求項17に記載の方法。
- 前記システムが、前記マイクロバブルから前記細胞への音響放射の移転を可能にするように、前記マイクロバブルが前記宿主細胞と十分に接近することを確実にするための手段をさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記手段が、ステップ(b)の前に、前記マイクロバブルを前記宿主細胞にコンジュゲートすることを含む、請求項20に記載の方法。
- 細胞に外因性物質をトランスフェクトするための音響的方法であって、
(a)(i)各々のレザバ―が音響活性化可能な気体充填マイクロバブルにコンジュゲートされた宿主細胞、および前記宿主細胞内に導入しようとする前記外因性物質を含む少なくとも2つのレザバーであって、前記宿主細胞および前記外因性物質が流体媒体内に包まれている、レザバー、および(ii)音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
(b)前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第1のレザバーと音響的に接続するステップ、
(c)前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記マイクロバブルを音響的に活性化させる様式で前記第1のレザバー内へと指向させ、ここで、音響放射が前記マイクロバブルから前記宿主細胞へと移転されて、ソニポレートされた宿主細胞を提供し、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進するステップ、
(d)前記音響放射発生器を前記第1のレザバーから音響的に分離するステップ、
(e)前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第2のレザバーと音響的に接続するステップ、
(f)前記第2のレザバーにつき、ステップ(c)を繰り返すステップ
を含む、方法。 - 各レザバー中の前記流体媒体の容積が、0.5μL〜500μLの範囲である、請求項11に記載の方法。
- 前記流体媒体が、等張性緩衝液を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞が、前記レザバーの表面で平板培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、非接着性である、請求項1に記載の方法。
- 前記外因性物質が、核酸、プラスミド、ペプチド、タンパク質、脂質、ポリサッカリド、小型分子、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記外因性物質が、DNAプラスミドを含む、請求項27に記載の方法。
- 前記外因性物質が、リボ核タンパク質を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記リボ核タンパク質が、宿主細胞核酸を変更することが可能である、請求項29に記載の方法。
- 前記リボ核タンパク質が、ガイドRNA、およびCRISPR関連RNA−プログラム可能な(programmable)DNAまたはRNAヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記リボ核タンパク質が、ガイドRNAおよびCas9タンパク質を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記リボ核タンパク質が、ガイドRNA、および触媒的に不活性なCRISPR関連RNA−プログラム可能なDNAまたはRNAヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、請求項32に記載の方法。
- ステップ(c)では、ソノポレートすることが、前記レザバーを、15秒間〜40秒間にわたって毎秒10〜25トーンバーストの速度の音響トーンバーストで照射することを含む、請求項1に記載の方法。
- 各周期的音響トーンバーストが、およそ5サイクル〜10サイクルのトーンバーストである、請求項34に記載の方法。
- 細胞に外因性物質をトランスフェクトするための音響的方法であって、
(a)(i)宿主細胞および前記宿主細胞内に導入しようとする前記外因性物質を各々が含む少なくとも2つのレザバーであって、前記宿主細胞および前記外因性物質が流体媒体内に包まれている、レザバー、および(ii)音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
(a’)音響的に活性化可能な気体充填マイクロバブルを前記流体媒体に添加し、前記マイクロバブルを前記宿主細胞にコンジュゲートさせるステップ、
(b)前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第1のレザバーと音響的に接続するステップ、
(c)前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記マイクロバブルを音響的に活性化させる様式で前記第1のレザバー内へと指向させ、ここで、音響放射が前記マイクロバブルから前記宿主細胞へと移転されて、ソニポレートされた宿主細胞を提供し、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進する
ステップ、
(d)前記音響放射発生器を前記第1のレザバーから音響的に分離するステップ、
(e)前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続
せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第2のレザバーと音響的に接続するステップ、ならびに
(f)前記第2のレザバーにつき、ステップ(c)を繰り返すステップ
を含む、方法。
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