CN109996881B - 使用声穿孔的生物细胞高效转染 - Google Patents

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Abstract

提供了一种使用声穿孔实现宿主细胞转染的方法。将声辐射发生器定位为相对于包含要被转染的宿主细胞的储存器、要被加入到宿主细胞中的外源物质和细胞相容性流体介质成声耦合关系。将声辐射发生器激活以产生声辐射，并以有效方式将声辐射导引入储存器中以使得能够用外源物质转染宿主细胞。

Description

使用声穿孔的生物细胞高效转染
技术领域
本发明大体上涉及生物技术，更具体而言涉及生物细胞的有效转染。本发明可用于生物化学和医药学，包括细胞研究和药物开发。
背景技术
转染是指外来物质进入宿主细胞，包括细菌细胞、哺乳动物细胞和其它细胞类型。在生物技术领域，转染已成为用于将外来DNA或RNA引入细胞以生产转基因细胞的非常重要的工具。转染可以是稳定的或瞬时性的。在稳定转染中，引入的遗传物质通过穿越细胞膜和核膜而被递送到宿主细胞核并整合到宿主基因组中；每个子细胞均具有加入的物质。相反，在瞬时转染(也称为"转化")中，核酸被插入到宿主细胞中，但不会整合到其基因组中。结果，外来遗传物质暂时性表达但不会传到转染细胞的后代。因此，应理解稳定转染对大规模蛋白质生产、基因疗法、药物开发、化合物筛选以及深入研究来说是必要的。然而，稳定细胞系的开发是复杂、耗时耗力和昂贵的。
存在多种将外来遗传物质引入真核宿主细胞的方法，包括生物、化学和物理介导的方法。研究中最常用的转染方法是生物法，涉及使用病毒作为载体。腺病毒、慢病毒和致癌逆转录病毒载体已被广泛用于哺乳动物细胞培养物和体内的基因递送。病毒介导的转染或病毒"转化"是有效和使用相对简单的，即使对难以转染的细胞类型也是如此。然而，也存在显著的缺点，包括选定病毒的免疫原性和细胞毒性以及生产病毒载体所涉及的困难性和时间。例如，慢病毒载体对于使用者来说也是有生物危害性的，需要二级生物安全(Biosafety Level 2，BSL-2，由美国疾病控制及预防中心确立)或增强BSL-2(BSL-2+)工作条件。
广泛使用化学转染方法，其是最初用于将外来基因引入哺乳动物宿主细胞的方法。常用的化学方法包括但不限于以下：与盐水/磷酸缓冲溶液组合的磷酸钙；阳离子聚合物，诸如二乙醇胺和葡聚糖的缀合物(或“DEAE-葡聚糖”)或聚乙撑亚胺；阳离子脂质制剂，诸如商品名为的市售产品(其它阳离子脂质制剂在相关文本和文献中描述，例如，Felgner等人(1994)J.Biol.Chem.269(4):2550-61)；和活化的树状聚合物，诸如聚酰胺-胺树状聚合物(参见Hudde等人(1999)Gene Therapy 6(5):939-943)。化学转染效率取决于细胞类型、遗传物质/化学转染剂比、溶液pH以及其它条件而变。尽管化学转染方法不涉及病毒转染剂的潜在免疫原性和细胞毒性，其通常显示转染效率差。此外，许多上述化学转染试剂仅可用于那些强健而不特别敏感的极少数细胞系，例如，HeLa或HEK-293细胞。
物理转染方法相比于病毒或化学转染是较新的，包括诸如以下的技术：电穿孔、基于激光的转染、显微注射和基因枪(biolistic particle delivery)、细胞挤压和直接微注射。尽管已确立了这些方法来实现转染，但仍存在许多相关问题，包括样品大面积物理损坏的可能性。
为克服上述方法遇到的一些问题，已对使用“声穿孔”技术实现转染投入了一些努力。声穿孔涉及使用超声或声能诱导细胞膜通透性发生足以允许宿主细胞摄入大分子的瞬时变化，否则那些大分子将不能穿过细胞膜。时至今日该领域中已做的工作集中于使用超声造影剂(UCA)。大部分UCA是充有浮力气体(buoyant gas)的微泡，其涉及用于医学超声检测以通过反向散射提高声反射。已提出通过在宿主细胞附近经历空化而使UCA用于声穿孔中，使得UCA首先膨胀，但是随后快速收缩或塌陷，产生微流或冲击波，其对细胞膜施加剪切应力，使那些膜暂时或永久性地破裂。最近，有人提出，使用具有低于将引发空化者的声能的UCA可发生声穿孔。参见，例如，Forbes等人(2008)Ultrasound in Med.&Biol.34(12):2009-2018。然而，出于多种原因，该方法尚未以较大规模实施，所述原因包括以下事实：在流体介质中，UCA将上升至液体表面，而宿主细胞将因重力下沉。这是有问题的，因为经由声穿孔转染需要在施加声能时浮力微泡和宿主细胞接近。另一个问题是效率：迄今为止，没有报告过其中成功转染的宿主细胞的数量最大化且细胞死亡最小化的基于声穿孔的转染方法。此外，像其他转染技术一样，迄今为止声穿孔对于难以转染的细胞(例如，出生细胞，特别是干细胞)的转染无效。
理想的转染方法将做到以下这些：
最大化被转染的宿主细胞分数，同时最小化细胞死亡；
允许成功转染多种细胞类型，包括通常对转染有抗性的细胞；
能够转染非哺乳动物细胞以及哺乳动物细胞；
能够转染融合以及非融合细胞；
允许用核酸转染细胞，诸如DNA、RNA、小干扰RNA(siRNA/RNAi)、微小RNA(miRNA)和DNA质粒；
允许用其它类型的外源物质转染细胞，包括蛋白质和小分子；
使用选择用于修饰靶细胞功能的核酸序列和相关蛋白质以及用于执行基因表达的机构进行，包括(a)由Cas9蛋白和向导RNA组成的核糖核蛋白(RNP)和(b)具有相关启动子的CRISPR质粒；
涉及简单实施而不需要过多时间或人力；和
由于实施速度和容易性，适合用于高通量转染中。
发明内容
因此，本发明解决了上面讨论的本领域中的需要并提供了一种用于转染宿主细胞的基于声穿孔的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：
(a)提供包括以下的系统：(i)至少两个储存器，各自包含宿主细胞和待引入到宿主细胞中的外源物质，和(ii)产生和导引声辐射的声辐射发生器；
(b)将声辐射发生器声耦合至第一个储存器，同时不将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；
(c)以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将其导引至第一个储存器内，从而促进将外源物质引入到声穿孔的宿主细胞中；
(d)将声辐射发生器与第一个储存器声学地分离；
(e)将声辐射发生器声耦合至第二个储存器，同时不将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；和
(f)对第二个储存器重复步骤(c)。
在该实施方式的一个方面，所述至少两个储存器被包含在多个储存器中，所述方法进一步包括(g)将声辐射发生器与第二个储存器声学地分离，随后对其它储存器重复步骤(b)至(g)。储存器可被包含在集成式多储存器单元中，诸如微孔板，诸如96-孔板，384-孔板，1536-孔板等。在该实施方式的一个方面，被导引入储存器中的声辐射是聚焦声辐射。
在该实施方式的另一方面，所述方法在高通量转染系统背景下实施，其中多个多储存器中每个中的宿主细胞被连续地快速声穿孔。这可意味着储存器至储存器转换时间为至多约0.5秒、0.1秒或0.001秒。在相关方面，每个储存器中流体介质的体积可在约0.5μL至约500μL范围内。
在该实施方式的另一方面，诱导声穿孔的方式包括将产生的声辐射传递到宿主细胞的手段(means)，其通常为包含在流体介质中的多个声学可激活的部分(诸如，声学可激活的局部流体体积)的转染激发物质。局部流体体积(localized fluid volume)可以为充气微泡，其可被缀合至宿主细胞以促进声能从被辐射的微泡传递到宿主细胞。
在另一个实施方式中，提供了一种用于转染宿主细胞的方法，包括：
(a)通过将多个用第一结合部分进行表面功能化的充气微泡悬浮在于宿主细胞相容的流体介质中制备微泡组合物；
(b)通过将微泡与对宿主细胞类型具有特异性并且用连接到第一结合部分的第二结合部分功能化的抗体在流体介质中混合将微泡缀合至该抗体，从而产生微泡-抗体缀合物；
(c)通过将微泡-抗体缀合物与要被转染到宿主细胞中的外源物质混合制备加载的微泡-抗体缀合物；
(d)任选地用与宿主细胞相容的流体介质稀释加载的微泡-抗体缀合物，这提供了具有有效优化转染效率的加载的微泡-抗体缀合物浓度的稀释液；
(e)将储存器中的宿主细胞接触稀释液；和
(f)通过如下方式将(e)中提供的宿主细胞-稀释液混合物声穿孔：用声辐射在导致微泡以其平均共振频率的约15％内或其平均共振频率谐波的约15％内的频率共振的条件下辐射储存器。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至包含宿主细胞、要被转染到宿主细胞中的外源物质和流体介质的储存器；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，而不会导致流体介质中的温度升高多于约10℃。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至被包含在包括至少1536个储存器的集成式多储存器单元中的选定储存器，所述选定储存器包含宿主细胞、要被转染到宿主细胞中的外源物质和流体介质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，从而促进外源物质进入声穿孔的宿主细胞中。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，由此使其以局部流体体积平均共振频率的约15％内或局部流体体积平均共振频率谐波的约15％内的频率振动，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个具有一定尺寸分布的声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入尺寸为选定尺寸±15％的储存器中，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞。
在相关实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：(a)将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由具有多模态尺寸分布的多个声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；(b)以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入尺寸为第一模态峰值的约15％内的储存器中，由此使得声激活的局部流体体积传递声能到附近的宿主细胞；(c)重复步骤(b)以声激活尺寸为第二模态峰值的约15％内的局部流体体积；和(d)任选地重复步骤(b)以声激活尺寸为一个或多个其它模态峰值的约15％内的局部流体体积。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个具有一定尺寸分布的声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生具有选定频率含量的声辐射并将产生的声辐射导引入储存器中，其中选择产生的声辐射的频率含量选择为相关于声学可激活的局部流体体积的尺寸分布.
在相关实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由具有在储存器中的空间分布的多个声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生具有选定频率含量的声辐射并将产生的声辐射导引入储存器中，从而促进外源物质进入声穿孔的宿主细胞中，其中选择产生的声辐射的频率含量以使其关联于声学可激活的局部流体体积的空间分布。
在另一个实施方式中，使用协同(优选但不必须同时)但以不同频率操作的两个转换器来进行声穿孔，其中一个转换器是环形转换器被可操作地安装在标准转换器周围并密封该标准转换器。在该实施方式中，环形转换器和标准转换器通常以不同频率操作。在该实施方式的一个方面，环形转换器可以选择为在引起声穿孔的频率下操作，而标准转换器可以在有效导致声穿孔细胞的声喷射的频率下操作，例如，声喷射到储存器中、到基板上或到分析用分析仪器。在该实施方式的另一方面，两个转换器之一主要用于供应用于声穿孔的声能，另一个转换器传递声能以改变在不使用微泡-细胞缀合时微泡对于宿主细胞的相对位置。
在另一个实施方式中，通过以下方式进行声穿孔：用连续的多个声短纯音辐射，每个声短纯音均具有有效地将不同尺寸的微泡声穿孔的不同声频。多个声短纯音中每个的声频通常在约1.5MHz至约5.0MHz范围内，更通常在约2.0MHz至约2.5MHz范围内。
在进一步的实施方式中，提供了一种转染细胞的声学方法，其包括：将声辐射发生器声耦合至选定储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和包括多个声学可激活的局部流体体积的转染激发物质；和以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞，其中产生的声辐射处于选择为确保在辐射后至少50％的局部流体体积保持完整的声穿孔压力。在该实施方式的一个方面，声穿孔处于将导致局部流体体积空化的最小声压的约50％至约90％范围内。
附图说明
图1提供了实施例4中所述的FACS分析中正向散射高度与侧向散射高度之间的关系图。
图2也源自实施例4中所述的FACS分析，其表明在FL1通道中检测到成功转染，同时在FL3通道中检测到死细胞。
图3也源自实施例4中所述的FACS分析，其独立地说明了对于阳性对照物获得的结果。
图4提供了逐个孔的结果(well-by-well results)，说明了实施例4中转染细胞的比例随声功率和微泡浓度二者的增加而增加。
图5提供了图表形式的结果。
图6逐个孔地显示了实施例14中声穿孔之后保留的活细胞的百分比接近100％，甚至在所用的较高电压(1.5V)下也是如此。
图7说明了实施例4中对于转染细胞和阴性对照物(即，仅有DPBS，不存在微泡)获得的结果。
图8显示了实施例5中所述的CRISPR转染实验中对于四种质粒浓度中的每种获得的GFP-阳性细胞的百分比。
图9显示了在四种质粒浓度中的每种下的GFP-阳性细胞的平均百分比，并显示了标准误差线。
图10显示了实施例5中所述的对于四种质粒浓度中每种的死细胞百分比。
图11说明了实施例6第1次运行的CRISPR转染实验的错配切割实验和分析的结果。
图12说明了实施例6第2次运行的CRISPR转染实验的错配切割实验和分析的结果。
图13是表明实施例6第1次和第2次运行所得的切割百分比结果的柱形图。
图14提供了在实施例6第2次运行中转染宿主细胞所得的荧光图像，使用具有RFP发光立方体的EVOS荧光显微镜检测标记的tracrRNA。
具体实施方式
除非另外定义，本文中所用的所有技术和科学术语均具有本发明所述领域一般技术人员普遍理解的含义。下文中定义了对于本发明说明书具有特别重要性的特定术语。
在本说明书和所附权利要求中，单数形式“一/一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文中另有明确规定。因此，例如，"一个/一种组分"不仅是指单一组分，而且指两个(种)或更多个(种)组分的组合，以及类似情况。
术语"声辐射"和"声能"在本文中可互换使用，并且指代声波形式的能量的发射和传播。如下文中所讨论地，与其他波形一样，可使用聚焦装置来聚焦声辐射。
术语"聚焦装置"和"声聚焦装置"是指通过以下方式使声波汇聚在焦点处的装置：通过独立于声能来源的作用类似透镜的器件，或者通过声能来源的空间布置，经由相长干涉和相消干涉实现声能在焦点处的汇聚。聚焦装置可简单地为具有弯曲表面的实体构件，或者其可包括诸如在菲涅耳透镜(Fresnel lenses)中可见的那些复杂结构(其采用衍射来引导声辐射)。合适的聚焦装置还包括相控阵法，如本领域中已知和在以下文献中描述的：例如，Nakayasu等人的美国专利第5,798,779号，以及和Amemiya等人(1997)Proceedingsof the 1997IS&T NIP13 International Conference on Digital PrintingTechnologies,pp.698-702。
本文所用的术语"声耦合"和"声耦合的"是指如下状态：其中将物体放置为与另一个物体直接或间接接触以允许声辐射在两个物体之间传递而没有显著的声能损失。当两个物品间接声耦合时，需要"声耦合介质"以提供可通过其传输声辐射的媒介物。因此，可通过以下方式将发射器声耦合至储存器中的流体：例如，在发射器与流体之间插入声耦合介质以将发射器产生的声辐射通过声耦合介质传递至流体中。
"声学可激活"的部分是当用特定波长的声能辐射时能引起其以超声频率振动的部分。
本文所用的术语"储存器"是指用于保持或包含流体的容器或室。在其最简单的形式之一中，储存器由如下的固体表面组成，该固体表面具有足够的湿润性质以使得仅因流体与表面之间的接触即可保持流体。储存器还可为孔板中的孔、试管或试管架中的其他这种容器等。
本文所用的术语"阵列"是指特征的二维排列，诸如储存器(例如，孔板中的孔)的排列。阵列通常包括有规律地排列的特征，例如，直线网格、平行条纹、螺旋线等，但也可有利地使用不规则阵列。阵列与图形的区别在于，图形不必包含规则有序的特征。阵列通常，但非必要地，包括至少约4个至约10,000,000个特征，通常在约4个至约1,000,000个特征范围内。
本文所用的术语"流体"，如在“流体介质"中，是指非固体和至少部分由液体组成的物质。流体可包含最低限度、部分或完全溶剂化、分散或悬浮的固体。流体的实例包括但不限于水性液体(包括水本身和盐水)和非水液体诸如有机溶剂等。流体还可为包含细胞、生物分子等的生物流体。
术语"核酸"是指核苷、核苷酸或多核苷酸，包括寡核苷酸，无论其是自然产生的还是在实验室中合成的，因此涵盖诸如质粒的非天然构建体。除非另有明确说明或者上下文有不同解释，这些术语在本文中可互换使用。核酸包括包含2-脱氧-D-核糖以及D-核糖的那些，因此分别包含多脱氧核糖核苷酸和多核糖核苷酸，并且可包含任何常规的嘌呤和嘧啶碱基，即，腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)以及它们的受保护形式(例如，其中碱基用以下保护基保护：诸如乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基，异丁酰基或苯甲酰基)，以及本领域技术人员已知和在相关文本和文献中描述的嘌呤和嘧啶类似物。常见的类似物包括，但不限于，1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基-腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊基腺嘌呤、N,N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、5-氟-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-(甲基-氨基甲基)尿嘧啶、5-(羧基甲基氨基甲基)-尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、queosine、肌苷、1-甲基肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。本文的核酸还可具有其他类型的修饰，包括但不限于：糖部分上的修饰，例如，其中一个或多个羟基被路原子或脂族基团替换或被官能化为醚、胺等；非天然核苷酸间键，诸如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基膦酸酯、氨基甲酸酯、硫代磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯和氨基烷基磷酸三酯；用侧链部分进行官能化；加入嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)；加入螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属)；等等。
术语"多肽"意图包括由两个或更多个氨基酸组成的任何结构，因此包括二肽、寡肽和蛋白质，除非文本或上下文另有说明，这些术语在本文中可互换使用。形成肽的全部或一部分的氨基酸可以为以下中的任何种类：20种天然常规氨基酸，即，丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)；非常规氨基酸，诸如常规氨基酸的异构体和修饰，例如，D-氨基酸、非-蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶修饰的氨基酸、β-氨基酸、设计为模拟氨基酸的构建体或结构(例如，α,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、β-丙氨酸、萘丙氨酸、3-吡啶丙氨酸、4-羟基脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和正亮氨酸)；以及如例如Rosenberg等人的美国专利第5,679,782号中所述的其它非常规氨基酸。肽还可包含非肽骨架键(nonpeptidicbackbone linkages)，其中天然酰胺-CONH-键在肽骨架内的一个或多个位点处被替换为非常规键，诸如N-取代的酰胺键、酯键、硫代酰胺键、反向肽(retropeptide，-NHCO-)、反向硫代酰胺(-NHCS-)、磺酰胺(-SO2NH-)和/或类肽(N-取代甘氨酸)键。因此，肽可包括伪肽和模拟肽。肽可以是：(a)天然的，(b)通过化学合成制成，(c)通过重组DNA技术制成，(d)通过较大分子的生物化学或酶促分裂制成，(e)通过上述方法(a)至(d)的组合方法制成，或(f)通过制备肽的任何其他方式。
术语"基本"，例如，在短语"基本相同的储存器"中，是指在声学特性上基本没有实质性偏差的储存器。例如，“基本相同的储存器”的声衰减彼此相差不多于10％，优选不多于5％，更优选不多于1％，最优选至多0.1％。术语“基本”的其他用途涉及类似定义。
本发明提供了一种使用声辐射以能够转染多种细胞类型(包括非哺乳动物细胞和哺乳动物细胞、融合细胞和非融合细胞)的方式转染细胞的方法。如本文所述地使用声穿孔，该方法能够将外源物质加入宿主细胞，包括但不限于，质粒、核糖核蛋白和其它物种。如下文中将要详细描述的，该方法适合用于高通量转染，这在很大程度上升是因为该方法可用大量包含细胞的储存器连续进行。
在一个实施方式中，转染细胞的方法包括：(a)提供包括(i)各自包含宿主细胞和要经由声穿孔诱导的转染而被引入到宿主细胞中的外源物质的至少两个储存器和(ii)产生和导引声辐射的声辐射发生器的系统；(b)将声辐射发生器声耦合至第一个储存器同时不将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；(c)以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将其导引至第一个储存器内，从而促进将外源物质引入到声穿孔的宿主细胞中；(d)将声辐射发生器与第一个储存器声学地分离；(e)将声辐射发生器声耦合至第二个储存器同时不将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；和(f)对第二个储存器重复步骤(c)。
通常，尽管非必要地，第一个和第二个储存器被包含在多个储存器中，并且对一些或全部储存器重复上述方法。在这种情况中，所述方法在(f)之后包括额外步骤，即，(g)将声辐射发生器与第二个储存器声学地分离，和对于其他储存器重复步骤(b)至(g)。为提供组件的模块性和可互换性，有时可优选器件与多个可移除储存器协同使用，例如，试管架中的试管等。储存器被排列为图形或阵列，通常为阵列，以便为每个储存器提供单独的系统可寻址性。尽管每个储存器可作为分立或单独的容器提供，在需要大量储存器的情况中，例如，在高通量转染方法中，优选储存器被包含在集成式多储存器单元中。多储存器单元可为孔板，其中各个孔用作储存器。适用于所述器件的许多孔板是市售的，并且每个孔板可包含例如96个、384个、1536个或3456个孔，并且具有全裙边、半裙边或无裙边。孔板或微量滴定板已广泛用于实验室项目。实验室自动化与筛选学会(the Society for LaboratoryAutomation and Screening，SLAS)已与美国国家标准协会联合建立和保持了微量滴定板的标准，包括封装尺寸标准(the footprint and dimension standards)ANSI/SLAS 1-2004。这种孔板的孔通常为直线阵列形式。
这样的市售孔板的可用性不排除生产和使用包含至少约10,000个孔或者多达100,000至500,000个孔或更多的其他几何结构的定制孔板。此外，用于构建储存器的材料必须是可相容并且与其中所含的流体样品相容的。对于水基流体，有多种材料适合用于构建储存器，包括，但不限于，陶瓷，诸如氧化硅和氧化铝，金属，诸如不锈钢和铂，以及聚合物，诸如聚酯、聚丙烯、环烯烃共聚物(例如，可得自Nippon Zeon的名为的那些市售产品可得自Ticona的名为/>的那些市售产品)、聚苯乙烯和聚四氟乙烯。
此外，为减少在多个储存器中的每一个中快速连续转染宿主细胞所需的运动量和时间，优选每个储存器中心位于距相邻储存器中心不多于约1厘米，例如，不多于约1.5厘米，不多于约1毫米，以及不多于约0.5毫米。这些尺寸旨在将储存器的尺寸限制到最大体积。储存器被构建为通常包含不多于约1mL，优选不多于约500μL，更优选不多于约250μL流体，在某些情况中不多于100μL、50μL、25μL、10μL、5μL、1μL或0.5μL流体。因此，在操作过程中，储存器中流体介质的体积在约0.5μL至约500μL范围内。为有利于一致性，还优选储存器是在声学上不可区分的。
包括超声转换器的声辐射发生器用于产生声辐射和将产生的声辐射导引入包含要被转染的宿主细胞的储存器中。超声转换器通常包括激发器和集中激发器所产生的声能的聚焦元件；激发器的实例包括压电和磁致伸缩(magnetorestrictive)元件，在本文中通常，尽管非必要地，优选压电转换器。在操作中，激发器由超声驱动频率的信号驱动，并且在有源物理元件中产生超声振动。这些振动被传输进入和通过声耦合介质并进入容纳流体样品的储存器中。可使用单一转换器，或者在某些情况中，可使用包括转换器组件的多元件声辐射发生器。例如，可有利地使用直线声学阵列、曲线声学阵列或相控声学阵列来产生同时传输到多个储存器的声辐射。在优选实施方式中，采用单一声辐射发生器。可有利地用于本文中的声辐射发生器的实例为可被加入到可得自Labcyte Inc.(San Jose,CA)的声液滴喷射(acoustic droplet ejection,ADE)系统中的那些，该系统在例如以下中描述：Stearns等人的美国专利6,416,164；Ellson等人的6,666,541；Ellson等人的6,603,118；Ellson等人的6,746,104；Ellson等人的6,802,593；Ellson等人的6,938,987；Mutz等人的7,270,986；Ellson等人的7,405,395；和Mutz等人的7,439,048。得自Labcyte的市售ADE系统包括500-系列液体处理器系统，包括/>525、/>550和/>555液体处理器。
如上文中所解释的，本文的声辐射发生器优选包括聚焦元件。本领域已知的包括弯曲表面或菲涅耳透镜的多种聚焦装置中的任一种可用于本发明。这样的聚焦装置在Lovelady等的美国专利4,308,547和Quate等人的美国专利5,041,849以及美国专利申请公开2002037579中描述。
当在多个储存器中(如在孔板或其它类型的阵列中)的每一个中转染宿主细胞时，使用用于以声耦合关系定位每个储存器与声辐射发生器的装置来实施该方法，这样在每个声穿孔事件之后，声辐射发生器与要被辐射的下一个储存器对齐。可向转让系统中加入定位装置以相对于声发射器移动包含储存器的基板(例如，其可被定位在可移动台上)，反之亦然。因此容易促进储存器的快速连续辐射。无论定位装置是哪一种类型，即，发射器定位装置或储存器或储存器基板定位装置，都可由例如发动机、杠杆、滑轮、齿轮其组合或者其他电机或机械装置构建。储存器至储存器转换时间优选为至多约0.5秒，优选至多约0.1秒，最好为至多约0.001秒。
应注意声辐射发生器必须相对于要被辐射的储存器为声耦合关系，因此也与储存器内容物成声耦合关系，当连续辐射多个储存器时，声辐射发生器在声穿孔之后与每个被辐射的储存器解耦，随后与下一个储存器声耦合以进行下一个声穿孔事件。因此，该方法涉及将声辐射发生器声耦合至要被辐射的第一个储存器，辐射第一个储存器，随后将声辐射发生器与第一个储存器声学地分离，随后将声辐射发生器声耦合至下一个储存器，辐射下一个储存器等，并且重复该过程知道已辐射了所需数量的储存器。尽管可以通过与储存器的直接接触实现声耦合，优选的方式是将声辐射发生器声耦合至储存器，因此声耦合至其内容物，但不允许声辐射发生器的任何其他部分(例如，驱动手段(forcing means))接触储存器的内容物。
声辐射发生器可与每个储存器的外表面直接或间接接触。对于直接接触，为声辐射发生器声耦合至储存器，优选直接接触完全适形以确保有效的声能传递。即，声辐射发生器与储存器应当具有适于配合接触的对应表面。因此，如果通过使用驱动手段在声辐射发生器与储存器之间实现声耦合，则对于储存器而言理想的是具有对应于驱动手段表面轮廓的外表面。如果不是适形接触，则声能传递的效率和准确性可能会受到损害。此外，由于许多聚焦装置具有弯曲表面，直接接触方式可能必须使用具有特别成形的相反表面的储存器。
最佳地，通过间接接触实现声辐射发生器与每个储存器之间的声耦合，如在以下中所述的：在上文中引用的Stearns等人的美国专利6,416,164；Ellson等人的6,666,541；Ellson等人的6,603,118；Ellson等人的6,746,104；Ellson等人的6,802,593；Ellson等人的6,938,987；Mutz等人的7,270,986；Ellson等人的7,405,395；和Mutz等人的7,439,048。通常，将声耦合介质放置在声辐射发生器和要被辐射的储存器的底座之间。声耦合介质可为声耦合流体，优选与声辐射发生器的上表面适形接触的声均匀材料，例如，与位于声辐射发生器上表面上和储存器下侧的声聚焦装置适形接触。此外，重要的是确保声耦合流体基本不含具有与要被辐射的储存器中的流体介质不同的声学性质的材料。在使用中，将第一个储存器声耦合至声辐射发生器，使得通过例如驱动手段将声辐射发生器所产生的声辐射导引到声耦合介质中，后者将声辐射传输至储存器中。系统可包含单一声发射器，或者，如前文所述，其可包含多发射器。单发射器设计通常优于多发射器设计，这是因为用单发射器更容易实现液滴放置的准确性以及液滴尺寸和速度的一致性。然而，本发明不限于单发射器设计。
如本文中先前所解释的，包含要经由声穿孔转染的宿主细胞的储存器含有宿主细胞以及要被引入到宿主细胞中的外源物质。宿主细胞和外源物质有利地被包含在流体介质中，即，宿主细胞相容性流体介质，诸如缓冲液，例如，等渗缓冲液，诸如杜氏磷酸缓冲液(DPBS)。“相容性”流体介质意指细胞可在其中存活至少5分钟的流体介质。
宿主细胞和宿主细胞类型：细胞应当在具有所有必要因子的合适培养基中生长，培养基必须不含污染。储存器内所含的流体介质中的细胞密度应当被优化，因为密度过低会因缺少细胞与细胞的接触而导致生长差，密度过高会导致接触抑制，使得细胞对核酸或其它大分子的摄入有抗性。宿主细胞通常来源于从受试者获取的细胞，诸如细胞系。可使用本发明的方法转染许多类型的哺乳动物细胞，不仅包括通常使用的那些哺乳动物细胞系，在某些情况中还包括通过目前已知的方法极难转染的细胞。通常使用的哺乳动物细胞系包括，例如，人细胞系HeLa、HepG2、HUVEC、MCF7、H1人胚胎、GM12878、K562和Jurkat E6.1；小鼠细胞系NIH-3T3和MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)；和其它细胞系诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和非洲绿猴肾(COS-7)细胞。通常极难转染但可使用本发明方法有效转染的细胞包括，例如：淋巴细胞，包括B-细胞和T-细胞二者；所有来源的初生细胞；神经元；所有类型的干细胞；以及卵母细胞。后面这组中的具体细胞系包括人淋巴母细胞系GM12878和Jurkat E6.1，以及H1人胚胎细胞。
能使用本发明方法转染的细胞系的具体实例包括但不限于C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLa-S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panc1、PC-3、TF1、CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1猴肾上皮细胞、BALB/3T3小鼠胚胎成纤维细胞、3T3 Swiss、3T3-L1、132-d5人胚成纤维细胞；10.1小鼠成纤维细胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A 172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1细胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293.BxPC3.C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr-/-、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY细胞、K562细胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCK II、MDCK 11、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT细胞系、Peer、PNT-1A/PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2细胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1细胞line、U373、U87、U937、VCaP、Vero细胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR以及它们的转基因变体。细胞系可得自本领域技术人员已知的多种来源(参见，例如，美国模式培养物集存库(the American Type Culture Collection，ATCC)(Manassas,VA)。
包含宿主细胞的流体介质中的外源物质，即，要经由转染加入宿主细胞中的外源物质，可以是能够被引入活细胞中以提供预期功能、结果或利益的任何物质。尽管转染通常被定义为将分子引入到受体细胞以加入、改变和/或调节(regular)细胞的DNA，该定义在本文发明的上下文中可扩展为本发明的方法有利于将多种分子部分加入到宿主细胞中，包括但不限于最终影响宿主细胞DNA的结构和功能的分子部分。当术语"外源物质"在本文中使用时，则包括但不限于：核酸，诸如DNA、RNA、mRNA、小干扰RNA(siRNA/RNAi)、micro RNA(miRNA)、编码将在宿主细胞中表达蛋白质的基因的DNA质粒、用作其它目的如产生增强子或RNA的DNA质粒、编码目标部分(如CRISPR的同源重组供体)的小线性DNA；蛋白质和多肽，包括激酶、细胞因子、染色质重塑酶、可视化的荧光蛋白质和正常蛋白的突变形式；以及小分子，特别是生物可用的低分子量(<约900道尔顿)的有机化合物(例如，其可帮助调节生物过程)，诸如特定途径(例如，药物或毒素路径)的抑制剂或激活剂、放射性标记的核苷酸或氨基酸、胆固醇、葡萄糖和其它糖类等(参见，例如，NCBI生物系统数据库，从“小分子(smallmolecules)”入口进入；脂质和糖类物质，诸如脂质、脂蛋白、脂多糖、脂多糖和多糖；以及核糖核蛋白，诸如CRISPR编辑中使用的Cas蛋白和蛋白质复合物。
在优选实施方式中，外源物质包括核酸，诸如DNA质粒或核糖核蛋白，诸如Cas:向导RNA核糖核蛋白。
核酸：可被引入至宿主细胞中的外源核酸可为基因、基因片段、寡核苷酸和多核苷酸或者反义寡核苷酸和多核苷酸的形式，或者可以是具有生物活性或其它利益的任何其他类型的核酸。使用本发明的方法引入到宿主细胞中的核酸通常为，尽管非必要地，在合适的调节区域的转录和翻译的控制下包括至少一个结构基因的构建体形式，例如，载体中的启动子序列，所述载体可以为质粒，进而能够表达上述结构基因编码的肽或蛋白质。这样的构建体通常包含一个或多个非启动子的调控元件，如本领域中所知的那样。更普遍地，使用本发明的方法通过DNA质粒的方式将外源核酸引入到宿主细胞使用。其它合适的载体是已知的，并且在相关文本和文献中描述。在某些情况中用核酸转染宿主细胞可能需要转染促进剂，诸如阳离子脂质制剂、阳离子聚合物(例如，DEAE-葡聚糖或聚乙撑亚胺)、树枝状聚合物等。如上所述的本发明的方法与CRISPR(规律间隔成簇短回文重复序列)质粒组合作用，如实施例5中所确立的。当用CRISPR质粒转染宿主细胞时，一些微小的修饰可能是必要或理想的；例如，由于CRISPR质粒相对较大，可将其经历上游处理以减少其整体尺寸。在替代方案中或此外，可使用转染助剂，诸如(Polyplus Transfection)。
CRISPR和RNP：应强调的是，本发明的方法可用于多种蛋白质，包括核糖核蛋白(RNP)。RNP是结合RNA的蛋白质，即，其是核糖核酸与RNA结合蛋白的复合物。这种复合物对于多种生物功能是重要的，包括DNA复制和基因表达调控。在本发明背景下特别重要的是利用CRISPR-Cas机制的工程化RNP，近年来其在基因组编辑领域具有重要意义；参见，例如，Donohoue等人，Trends Biotechnol.(2017年8月1日)。正如本领域中所知的那样，基于CRISPR的转染涉及使用由以下组成的RNP：CRISPR相关的蛋白质或"Cas"蛋白，以及RNA，即，"向导RNA"(gRNA)，其可以是crRNA(其定位宿主RNA的靶序列)与tracrRNA(其碱基与crRNA配对形成双链RNA)的组合或单一向导RNA(sgRNA)(其结合了crRNA和tracrRNA二者)。
Cas蛋白(通常为Cas9或其同系物)和向导RNA("单一向导"RNA(sgRNA)或crRNA与tracrRNA的组合)是CRISPR转染系统的主要成分。CRISPR组分的改变是可行的，并且在例如Zhang等人的美国专利8,771,945中描述。尽管Cas9，诸如来自酿脓链球菌或肺炎链球菌的Cas9，是最常用的CRISPR核酸酶，应理解也可使用其它Cas蛋白代替Cas9，特别是Cfp1，其中其他Cas蛋白包括但不限于Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2.Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物或其修饰形式。本文中用于CRISPR转染的Cas蛋白可以多种方式改变或修饰，例如，在许多情况中可使用缺乏切割靶多核苷酸的一条或两条链的能力的突变Cas核酸酶。例如，在来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中含有天冬氨酸-至-丙氨酸取代(D10A)的CRISPR-Cas9D10A切口酶切割双链多核苷酸的单个链而不是双链。作为另一个实例，包含上述突变以及HNH结构域中的H840A突变的"dCas9"缺乏切割多核苷酸的能力。参见，例如，Qi等人，(2013)Cell152:1173-1183。作为进一步的实例，Cas核酸酶是如下融合蛋白的一部分：在该融合蛋白中，融合蛋白结构域被选择为提供附加功能，例如，转录激活或抑制活性、核酸结合活性等。
通常，向导序列是如下的任何多核苷酸序列：该多核苷酸序列与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交，并且具有CRISPR复合物与靶序列的直接序列特异性结合。可选择向导序列以使其靶向任何靶序列。在一些实施方式中，靶序列是细胞基因组中的序列，特别是靶基因组中独有的序列。可选择向导序列以使宿主细胞中的多核苷酸靶向用于多种目的，通过删除、插入、移位、失活或激活靶向区域来修饰靶多核苷酸。因此，CRISPR复合物在许多领域中具有广泛应用，包括基因治疗、药物筛选、疾病诊断和预后。因此，CRISPR复合物的靶多核苷酸可包括多种疾病相关的基因和多核苷酸以及信号生物化学途径相关的基因和多核苷酸。许多疾病相关的基因和多核苷酸在本领域中是已知的，如信号生物化学途径相关的基因和多核苷酸；参见，例如，前文所述的Zhang等人的美国专利8,771,945。
本发明的用于将宿主细胞声穿孔的方法包括将声辐射发生器产生的声辐射传递到宿主细胞的手段。通常，尽管非必要地，将声辐射传递至宿主细胞的手段包括转染激发物质，即在用声辐射发生器辐射时会被引发超声振动并且将超声振动传递到相邻的宿主细胞的材料。转染激发物质可包括颗粒、珠粒或局部流体体积形式的多个声学可激活的部分，其中"局部流体体积(localized fluid volume)"是指空间定位的流体体积，其可以被或不被划界特征(delineating feature)包围在内，并且其中局部流体体积通常将具有与周围流体不同的物理特性，尽管这不是必须的。没有包围的局部流体体积包括其中局部的脂质或疏水性区域被包含在亲水性(例如，水性)流体中或者其中局部的亲水性(例如，水性)区域被包含在脂质或疏水性流体中的流体组合物。有包围的局部流体体积包括含流体的微胶囊，例如，含液体和含凝胶的微胶囊，其中胶囊壁可允许或不允许胶囊内部与外部流体之间的一些物质交换，并且其中的流体可包含或不包含悬浮颗粒。仍然其他类型的包围体积由可能与其中所含的流体互不相溶或相溶的第一种流体组成，其中不相溶物质的分子层包围第一种流体从而在流体内部和流体外部之间提供屏障。参见，例如，Mutz等人的美国专利7,270,986。
在本发明的一个实施方式中，转染激发物质包括与宿主细胞和外源物质共同加入到流体介质中的充气微泡。
本文的优选实施方式中所用的微泡是在具有外表面的外壳内密封有气体内芯的小球，所述外表面可通过例如连接靶向配体来功能化。靶向配体在下文中有时也被称为“第一结合部分”，只要该靶向配体可与对宿主细胞具有特异性的抗体上存在的第二结合部分缔合，使得第一和第二结合部分的缔合得到微泡-宿主细胞复合物。微泡-宿主细胞复合物的形成是一项确保微泡接收到的使其振动的声辐射被传输到宿主细胞、促进声穿孔的技术。不希望受限于理论，相信将声辐射传输到宿主细胞通过干扰细胞膜或细胞壁，产生允许细胞摄入大分子(诸如DNA或RNP)的瞬时孔来促进声穿孔。
典型微泡材料(即，典型外壳材料)的实例包括但不限于脂质、聚合物、白蛋白和半乳糖，尽管最常用脂质材料。也可使用较持久的其他类型外壳材料，即，对降解(经由生物降解或其它过程)有耐受性的材料，例如，带涂层的玻璃珠或交联聚合物(参见Cohen等人的美国专利5,487,390)。合适的微泡包括用于医学造影(medical contrast imaging)(即，超声造影)、细胞离析和细胞分离中的微球形产品。因此，在Rychak等人的美国专利申请公开第2015/0219636 A1号(申请人为Targeson,Inc.,San Diego,CA)中描述的外壳材料可用于本发明的方法，所述外壳材料涉及在不同背景下使用微泡造影剂，并且公开了合适的微泡外壳材料和表面功能化技术。用于本发明的优选的微泡外壳材料是相对塑性的，以便在声穿孔过程中最小化空化的可能性。微泡的气体内芯可以是全氟化碳、空气或氮气，尽管最常用全氟化碳。正是微泡的气体内芯在超声频率场中振荡，这又使微泡在本发明的转染方法过程中共振。虽然尚未清楚确定潜在机制，但应强调的是，与本文所述的宿主细胞相连的微泡的声诱导共振是成功转染的原因。
可有利地用于本发明的市售超声造影剂包括，例如：和SA(可得自Targeson,San Diego,CA；参见Tlaxa等人(2010)UltrasoundMed.Biol.36(11):1907-18)；/>(GE Healthcare)，具有八氟丙烷气体内芯的白蛋白微泡；/>(Schering)，具有脂质/半乳糖外壳和空气内芯；/>脂质微球，全氟己烷内芯；/>脂质微球，带有八氟丙烷气体内芯；和/>六氟化硫脂质微泡(先前的/>)和MicroMarker微泡(Bracco Imaging S.p.A./FujifilmVisualsonics)。也可使用意图用于其它目的的微泡，诸如可得自Akadeum Life Sciences(Ann Arbor,MI)的涂有链霉亲和素的玻璃微泡。
在本发明的一个实施方式中，微泡被缀合至宿主细胞以促进声能从被辐射的微泡传递到细胞，从而允许将外源物质通过被激发的细胞膜或细胞壁转染到细胞中。微泡-抗体缀合物的制备通常涉及用第一结合部分功能化微泡，然后将功能化的微泡与对宿主细胞类型具有特异性的抗体结合，其中所述抗体用连接到存在于微泡上的第一结合部分的第二结合部分功能化。在宿主细胞相容性流体介质中进行混合。在制备微泡-抗体缀合物过程中，质量/体积比通常在0.5μg至5μg抗体/2x107微泡范围内，更通常在约0.5μg至3μg抗体/2x107微泡范围内，最通常在约0.5μg至1.5μg抗体/2x107微泡范围内。
第一结合部分和第二结合部分之间的连接，即，形成导致微泡-细胞复合物的连接的“结合对”，可以是共价或非共价的，尽管结合通常是非共价的。共价连接的实例包括在用作第一和第二结合部分之一的游离氨基与用作第一和第二结合部分中另一个的游离羧基之间形成的酰胺键。非共价的连接形式包括，例如，离子键、氢键、吸附或物理固定。示例性的结合对包括任何半抗原或抗原化合物与相应的抗体或其结合部分或片段的组合(例如，地高辛和抗地高辛；小鼠免疫球蛋白和山羊抗小鼠免疫球蛋白)和非免疫性结合对(例如，生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素、激素[例如，甲状腺素和皮质醇]-激素结合蛋白、受体-受体激动剂或拮抗剂(例如，乙酰胆碱受体-乙酰胆碱或其类似物)、IgG-蛋白A、凝集素-糖、酶-酶辅因子、酶-酶抑制剂和能够形成双链核酸的互补多核苷酸)等等。最常用生物素-链霉亲和素连接，通常使用市售的生物素化抗体和用链霉亲和素表面功能化的微泡。
随后可通过混合微泡-抗体缀合物与外源物质来制备"加载的(loaded)"微泡-抗体缀合物，其中外源物质如本文中先前所述，例如，DNA质粒或CRISPR RNP。加载微泡-抗体缀合物的优选的浓度/计数比在约1-10μM RNP/1.25x107缀合物(5x108/mL)之间，最好在约3-6μM RNP/1.25x107缀合物之间。这些仅是代表性的范围，并非意图限制，只要可经验地确定任何外源物质的合适的浓度/计数比即可。在这点上，可调整流体介质中加载的微泡-抗体缀合物的浓度，例如，通过用与宿主细胞相容的流体稀释，其中流体可与步骤(a)中所用的流体介质相同或不同。优化稀释程度以提供有利于细胞建行还有由此而来的更好转染效率的环境。在实施例中描述了对稀释程度的优化。应注意，通常悬浮液过稀将不能提供足够的转染程度，而类似地悬浮液过浓所提供的转染程度不足，尽管出于不同的原因，在后一情况中，声能可能无法到达宿主细胞，因为微泡-抗体缀合物将基本屏蔽其与短纯音。
声穿孔：随后通过如下方式辐射加载的微泡-抗体缀合物：如前所述地激活声辐射发生器以产生声辐射并将其导引入包含在流体介质中的加载的缀合物的储存器中，使用选择为引起转染的声穿孔参数。可通过相对于一种或多种声穿孔参数(诸如声强、转换器输出频率和短纯音曲线(例如，短纯音宽度))矫正观察到的转染效率来经验地选择合适的声穿孔参数。例如，如先前所解释的，用于辐射包含宿主细胞、微泡和选定外源物质的储存器的声压应当足以诱导微泡的共振，但是，在优选实施方式中，不会高到引发声焦斑(其通常位于储存器底部的内表面上)附近流体区域中的微泡空化。焦斑处的典型声压在约1MPa至约2MPa范围内。本领域技术人员使用常规实验可确定最佳的声穿孔参数，其通常将随细胞类型而变。然而，通常通过用各自在10毫秒量级或更低并且以每秒约10至约25次进行约15-40秒的短脉冲周期声短纯音辐射储存器来进行声穿孔，例如，以少于1ms的持续时间和每秒10次(10Hz)来辐射约30秒。作为说明，实施例6描述了使用前述规则的声穿孔，以10Hz的脉冲重复率进行300个周期声短纯音的辐射(对应于约30秒的声穿孔时间段，如上所述)，每个短纯音由8个输出周期组成。在实施例6中，短纯音持续时间为约3.5μs(8周期除以标称输出频率2.25MHz)。可在任何一个储存器中重复辐射，根据需要改变焦点位置或声束宽度，以便最大化声穿孔微泡的数量和面积，进而最大化转染效率。
通常，优选产生的声辐射具有选定的频率和强度以确保被辐射的微泡接收波长为储存器中微泡平均共振频率的约15％内(优选储存器中微泡平均共振频率±约5％)或储存器中微泡平均共振频率谐波的约15％内(优选储存器中微泡平均共振频率谐波±约5％)的激发辐射。在相关实施方式中，产生的声辐射可具有选定的频率和强度以确保特定尺寸或特定尺寸范围内的被辐射的微泡接收波长为储存器中微泡平均共振频率的约15％内(优选储存器中微泡平均共振频率±约5％)或储存器中微泡平均共振频率谐波的约15％内(优选储存器中微泡平均共振频率谐波±约5％)的激发辐射。如果微泡在具有多模态尺寸分布的组合物中，则可用靶向具有或接近每个模态峰的每个辐射事件辐射微泡一次以上。
此外，尽管一些微泡可能会因辐射经历空化，通常仍优选避免空化。因此，通常通过调节声辐射发生器以使用将导致微泡空化的最小声压的约50％至90％范围内的声穿孔压力来辐射微泡。例如，声穿孔压力可在约0.2MPa至约2MPa范围内，通常小于约1.5MPa。尽管对于许多细胞系而言声功率水平低于空化限制将会提供良好的声穿孔转染结果，但在空化限制下操作还有其他利益，即，微泡随后可重新使用。即，当用亚空化声能辐射时，在辐射后保持完整的微泡数量通常为声穿孔之前初始微泡数量的约50％、80％、90％或99％。声穿孔后完整的微泡可重新用于相同的宿主细胞，后者可在或不在相同储存器中作为初始声穿孔的宿主细胞。或者可选地，如果声穿孔后完整的微泡自然地或因处理而与缀合抗体分离，则其可被用于不同的宿主细胞类型。在亚空化声水平下操作还允许在同一储存器中重复辐射，其中，例如，在初始声穿孔事件之后，声辐射发生器产生的声束用于将完整的已被辐射的微泡与储存器中不同空间位置的宿主细胞接触。
在本发明的其他实施方式中，如下文中所解释的，声穿孔不限于重复声耦合和声学地分离步骤。上文中关于宿主细胞、外源物质、流体介质、转染激发物质和其它要素以及转染方法的其他要素还适用于以下实施方式：
在本发明的其他实施方式中，随后提供了一种通过以下转染细胞的方法：将声辐射发生器声耦合至包含宿主细胞、要被转染到宿主细胞中的外源物质和流体介质的储存器；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，而不会导致流体介质中的温度升高多于约10℃。例如，该方法可诱导声穿孔而不会导致温度升高大于约5℃、2℃或1℃。在相关实施方式中，发生声穿孔而不会使流体介质的温度升高至大于约40℃。优选使用驱动手段(forcing means)将产生的声辐射导引入储存器中，从而使用聚焦声辐射进行声穿孔。还优选流体介质包含如本文先前所解释的转染激发物质。
在另一个实施方式中，提供了一种通过如下方式转染细胞的声学方法：将声辐射发生器声耦合至包括至少1536个储存器的集成式多储存器单元中所含的选定储存器，所述选定储存器包含宿主细胞、要被转染到宿主细胞中的外源物质和流体介质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，从而促进外源物质进入声穿孔的宿主细胞中。因此，集成式多储存器单元可以是具有1536个孔或具有3456个孔等的微孔板。如同前面的实施方式中一样，优选使用驱动手段将产生的声辐射导引入储存器，以及流体介质包含转染激发物质。
在另一个实施方式中，提供了一种通过以下方式转染细胞的声学方法：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，由此使其以局部流体体积平均共振频率的约15％内或局部流体体积平均共振频率谐波的约15％内的频率振动，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞。例如，声学可激活局部流体体积以使其以局部流体体积平均共振频率±约5％或局部流体体积平均共振频率谐波±约5％的频率振动。另外，在优选实施方式中，被导引入储存器的声辐射是聚焦声辐射。
在另一个实施方式中，提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个具有一定尺寸分布的声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入尺寸为选定尺寸的约15％内的储存器中，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞。
在相关实施方式中，提供了一种转染细胞的声学方法，包括：(a)将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个具有多模态尺寸分布的声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；(b)以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入尺寸为第一模态峰的约15％内的储存器中，由此声激活的局部流体体积传递声能至邻近的宿主细胞；(c)重复步骤(b)以声激活尺寸为第二模态峰值的约15％内的局部流体体积；和(d)任选地重复步骤(b)以声激活尺寸为一个或多个其它模态峰值的约15％内的局部流体体积。
在另一个实施方式中，提供了一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个具有一定尺寸分布的声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生具有选定频率含量的声辐射并将产生的声辐射导引入储存器中，其中产生的声辐射的频率含量被调节为与声学可激活的局部流体体积的尺寸分布相关。“相关”表示调节声辐射中的各个频率以靶向和声激活局部体积分布中的各个尺寸和尺寸范围。
在相关实施方式中，提供了一种通过如下方式转染细胞的声学方法：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个具有储存器中空间分布的声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生具有选定频率含量的声辐射并将产生的声辐射导引入储存器中，从而促进外源物质进入声穿孔的宿主细胞中，其中选择产生的声辐射的频率含量以使其关联于声学可激活的局部流体体积的空间分布。在这种情况中，"关联"表示调节声辐射中的各个频率以靶向和声激活位于储存器内不同位置处的局部体积。
在另一个实施方式中，使用协同(但优选不必同时)但以不同频率操作的两个转换器进行声穿孔，其中转换器之一是可操作地安装在标准转换器周围并密封该标准转换器的环形转换器。在该实施方式中，环形转换器和标准转换器通常将以不同频率操作。例如，当声穿孔的细胞从流体介质中声喷射出来时，环形转换器可以在选择为引起声穿孔的频率下操作，同时标准转换器可在有效导致声穿孔的细胞的声喷射(例如，进入储存器、到基板上或输送到分析仪器进行分析)的频率下操作。在这种情况中，环形转换器可以约1MHz至约2.5MHz范围内的频率操作，标准转换器可以约6MHz至约20MHz范围内的频率操作，优选在约9MHz至约14MHz范围内，最好为约11.5MHz。
在该实施方式的一个方面，当不使用微泡-细胞缀合时，两个转换器之一主要用于供应用于声穿孔的声能，且另一个转换器传递声能以改变微泡对于宿主细胞的相对位置。理想地，当微泡和宿主细胞的位置彼此邻近时，其应当在有效导致声穿孔的声强区域内。
在另一个实施方式中，声穿孔涉及用多个声短纯音连续辐射，所述多个声短纯音每个均具有有效地使不同尺寸的微泡声穿孔的不同声频。多个声短纯音中每个的声频通常在约1.5MHz至约5.0MHz范围内，更通常在约2.0MHz至约2.5MHz范围内。分布窄的微泡尺寸通常需要较小的声频范围以实现与分布宽的微泡尺寸相同水平的激发，其中必须改变声频以实现相同效果。最佳地，调节声频含量以响应微泡的共振频率分布，从而改进声穿孔的均匀性和总递送声能的最小量。多个声短纯音通常为5-周期至10-周期短纯音，并且可以相同或不同。
在进一步的实施方式中，提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至选定储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和包括多个声学可激活的局部流体体积的转染激发物质；和以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞，其中选择产生的声辐射所处的声穿孔压力以确保至少50％的局部流体体积在辐射后保持完整。在该实施方式的一个方面，声穿孔处于将导致局部流体体积空化的最小声压的约50％至约90％范围内。
本公开还意图包含多种优化声转染方法的方式。例如，如以下中所述的：Ellson等人的美国专利6,932,097，Ellson等人的6,938,995，Ellson等人的7,354,141，Qureshi等人的7,899,645，Ellson等人的7,900,505，Stearns等人的8,107,319，Ellson等人的8,453,507，和Stearns等人的8,503,266，本文所述的声辐射发生器可用于表征储存器中的流体以测量流体弯月面高度以及其它特性，诸如流体体积、粘度、密度、表面张力、组成、声阻抗、声衰减、流体中的声速等，其中的任何或全部随后可用于确定最佳声穿孔参数，包括声功率、声频、短纯音持续时间和/或驱动透镜(forcing lens)的F-数。作为另一个实例，Stearns等人的美国专利7,717,544和8,770,691描述了一种通过分析从储存器内的表面反射的声辐射的波形来优化用于声液体喷射或其他过程的声辐射幅度的方法。此外，Mutz等人的美国专利7,481,511和Ellson等人的7,784,331提供了控制声学过程参数以解决储存器特性变化的方法。
实验
材料：
以下列表说明了这些实验中所用的材料以及材料来源：
SA：用链霉亲和素功能化的微泡的阳离子分散液(Targeson)
抗-CD51：生物素化抗人CD51抗体，0.5μg/μL，在包含0.09％叠氮化钠的DPBS中(Biolegend#327906)
HEK-293细胞：人胚胎肾细胞，细胞系293，在含有高糖培养基的标准细胞培养物缓冲液DMEM中，添加4mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清(FBS)和100U/μL青霉素-链霉素(ATCC#CRL-1773)
DPBS：杜氏磷酸盐缓冲盐水，含钙和镁(ThermoFisher Scientific#14040182)
GFP：绿色荧光蛋白质(在整个过程中使用eGFP或增强GFP)
gWiz-GFP：eGFP-编码质粒(Aldevron)
CRISPR质粒：pCas-Guide-EF1a-eGFP(Origene#GE100018)
3000(ThermoFisher Scientific)
实施例1-5的一般方案：
(1)制备微泡/DPBS分散液：轻柔地摇晃含有Targesphere SA微泡分散液的小瓶，并上下倒置10秒，直到混合物看起来均匀地不透明。提取100μL Targesphere SA分散液并将其加入新的1.5mL试管。加入900μL DPBS，轻柔地混合分散液。随后将混合物于室温直立温育2分钟，然后在中旋转2分钟以从悬浮液分离微泡。使用注射器针头，缓慢去除白色的微泡饼下的清液，随后将微泡再悬浮于100μL DPBS中。(从Targesphere SA微泡分散液中去除原来的介质并用DPBS代替，以减少表面张力问题和在原来的微泡介质中看到的泡对孔表面的粘附。)在实施例6中使用了该规则的修改形式，如该实施例中所解释的。
(2)微泡对生物素化抗体的缀合：将10μg抗CD51生物素化抗体(即，20μL0.5μg/μL溶液)加入到100μL微泡分散液中，使得抗CD51抗体与Targesphere SA分散液的质量/体积比为1:10。将小瓶在轻柔搅拌下于室温温育约20分钟。在实施例6中使用了该规则的修改形式，如该实施例中所解释的。
(3)制备质粒-加载的微泡(实施例1-5)：将包含生物素化抗体/Targesphere组合物的小瓶倒置数次以均匀混合，将24μL 5μg/μL gWiz-GFP质粒(对应于120μg gWiz-GFP)加入到120μL在(2)中制备的微泡-生物素化抗体缀合物中，使得质粒与Targesphere SA分散液的质量/体积比为1:1。将小瓶于室温在轻柔搅拌下再次温育约25分钟。
(4)温育细胞：制备如下的质粒-加载的微泡稀释液：
1:4vol/vol，100μL微泡分散液，含有300μL DPBS；
1:20vol/vol，20μL微泡分散液，含有380μL DPBS；
1:40vol/vol，10μL微泡分散液，含有390μL DPBS；和
1:200vol/vol，2μL微泡分散液，含有398μL DPBS。
不含微泡的400μL DPBS用作对照物。
用移液管移取20μL质粒-加载的微泡(或对照物)到铺展的HEK-293细胞上，后者已在384孔板中培养到80％融合度(假定约25,000细胞/孔，最大体积为约115μL/孔)，培养基已先经由移液管移取从细胞上去除。在下表中，处理浓度与微泡稀释度、加载体积/孔和微泡/细胞温育比相关：
表1
将孔板颠倒翻转以促进结合，并在37℃温育器中放置5分钟。最初，随后将板用50μL DPBS洗涤以去除未结合的微泡；发现洗涤步骤还去除了细胞，然而，洗涤步骤是不连续的(注：对于不同细胞类型可能是这样或不是这样)。
(5)声穿孔：将孔用80μL预温暖的DPBS再充填到总量为100μL，以125RCF旋转5分钟以去除大气泡(较高的旋转速度很可能会杀死许多(如果不是全部)的细胞)。随后使用声辐射发生器在改进版本的声学液体处理器(500系列液体处理器，Labcyte Inc.,SanJose CA)超声脉冲处理细胞，将孔板返回温育器过夜。1-2天后，检查细胞的GFP荧光、DNA摄入指标和存活率。
实施例1
使用上述规则，检测四个HEK-293细胞板。所有四个板均同等设定，包括仅有DPBS的对照孔。对照孔不进行声处理。使用384-孔板，采用25,000HEK-293细胞/孔。每块板用单一电压脉冲处理，电压为0V(对照板)、0.5V(低功率)、1.0V(中等功率)或1.5V(高功率)，其中1.0V使得焦斑处的声压为约1.5MPa。声穿孔24小时之后，检查细胞的GFP荧光。发现声穿孔成功地使得HEK-293细胞摄取和表达了GFP质粒，并且摄取百分比随电压和质粒-加载的微泡的浓度升高而升高。在最高浓度的质粒加载的微泡和最高电压下发现最高程度的荧光。在孔板翻转后，由于微泡的分布，绿色(荧光)细胞集中在孔周围。对照板中的一些细胞变绿，但是极少；这是因为少部分细胞社区了培养基中的质粒。
实施例2
遵循一般规则和实施例1中的程序，不同之处在于"仅质粒"的对照物更换为1:200稀释液，即，以1:4孔中的相同浓度加入质粒。所得结果证实了仅有高介质浓度的质粒不足以转化细胞。
实施例3
重复一般规则和实施例1的程序，但对每个孔的中心施加单一脉冲，每个孔在不同位置处进行数次脉冲处理。发现这消除了转染细胞在孔周围的集中，提供了更均匀的分布，正如从每个孔中均存在GFP荧光能看出来的。
实施例4
重复实施例1的程序，做以下修改：
包含两个阳性对照细胞群：(1)使用脂质体3000遵循生产商提供的转染规则转染的细胞；和(2)通过热冲击杀死的死细胞。
此外，在声穿孔1-2天之后，将细胞用阳性染色死细胞的细胞膜完整性染料染色，即，MultiCyt Cell Membrane Integrity Dye Panel FL3染料(IntelliCyt,Albuquerque,NM)。
使用荧光激活细胞分选(FACS)分析转染和存活率；结果在图1-7中提供。图1显示正向散射高度与侧向散射高度之间的关系图，能够区分HEK-293细胞与微泡和其它材料；死细胞在SSC-H轴上显示为较高的不同分组，高于密集的活细胞簇。在图2中，在FL1通道中检测用编码GFP的质粒转染的细胞，并且在FL3通道中检测用细胞膜完整性染料染色的细胞，即，死细胞。图上的"GFP+"和"死亡"标记手工设定；这些对照细胞群在图3中单独说明。正如可从图4和图5总结的，成功转染的宿主细胞分数随声功率和微泡浓度的提高而提高。同时，如图6中所示，转染后剩余的活细胞百分比接近100％，甚至在所用的最高电压1.5V下也是如此。图7说明了在不存在微泡条件下对阴性对照物(即，仅DPBS)获得的数据。
实施例5
本实施例描述了使用声穿孔转染CRISPR质粒。遵循一般规则和实施例1的程序，不同之处在于用表达Cas9和GFP的CRISPR质粒代替gWiz-GFP质粒。使用1.5V声穿孔脉冲。在DPBS中制备微泡-抗体缀合物分散液(如一般规则中所述)，浓度为5x108微泡-抗体缀合物/mL DPBS。随后将该分散液以如下比率与质粒结合，以μg质粒/μL分散液给出：1:1；2:1；4:1；和8:1。每个比率重复三次。包含一个"无质粒"阴性对照行和一个"无声穿孔"阴性对照列。与实施例4中一样，使用IntelliCyt FACS检测结果。GFP阳性细胞是CRISPR质粒摄取的制备，荧光染料染色表示死细胞。
结果在图8和9中显示。图8显示了对于四种质粒浓度中每一种获得的GFP-阳性细胞的百分比，图9显示了每个浓度的GFP-阳性细胞的平均百分比，显示了标准误差线。GFP-阳性细胞的百分比高于背景，表示细胞已摄取和表达了CRISPR质粒。所得的数据还总结在表2中。
表2
微泡/细胞温育比 重复1 重复2 重复3 无脉冲
0 0 0 0 0
0.5X 5 7 2 0
1X 5 21 9 3
2X 4 6 7 10
4X 16 7 24 6
所得的单线态细胞计数数据在表3中列出：
表3
微泡/细胞温育比 重复1 重复2 重复3 无脉冲
0 2363 4658 3407 4185
0.5X 3082 5199 3655 5770
1X 3640 3664 6106 6129
2X 3250 5022 6247 6175
4X 2451 2479 3523 6843
处理后细胞死亡率仍然很低。图10显示了四种质粒浓度中每一种的死细胞百分比。所得数据也总结在表4中：
表4
GFP-阳性细胞百分比随质粒浓度的增加而增加，并且高于背景阴性对照物，证实了可使用声穿孔转染CRISPR质粒。应当可以通过使用非基于质粒的方法来提高转染成功率，诸如，例如，涉及使用声穿孔将核糖核蛋白引入靶细胞的技术。
实施例6
本实施例描述了使用得自Integrated Technologies,Inc.(IDT,Coralsville,Iowa)的Alt-RTM S.p.Cas9核酸酶3NLS以及Alt-RTM CRISPR-Cas9试剂盒(也得自IDT)，用CRISPR Cas9/向导RNA核糖核苷酸(RNP)转染HEK-293细胞，所述试剂盒包括靶向HPRT基因的Alt-RTMCRISPR-Cas9 HPRT阳性对照物crRNA、Alt-RTMCRISPR-Cas9阴性对照物crRNA和不含核酸酶的缓冲液。独立地获得用于与crRNA复合的荧光标记的tracrRNA(缀合至ATTOTM550的Alt-RTMCRISPR-Cas9tracrRNA，也来自IDT)。
(a)制备微泡/DPBS分散液：这是制备微泡/DPBS分散液的一般规则中所述方法的修改形式。轻柔地摇晃包含Targesphere SA微泡分散液(浓度为2x109微泡/mL)的小瓶，并上下倒置翻转10秒，直到混合物显示均匀地不透明。提取50μL Targesphere SA分散液，并将其加入新的1.5mL试管中。加入950μL DPBS，轻柔地混合分散液。随后将混合物于室温直立温育2分钟，随后在中旋转2分钟以从分散液中分离微泡。使用注射器枕头，缓慢去除白色的微泡饼下的清液，直到体积达到50μL。
(b)将微泡缀合至生物素化抗体：这是将微泡缀合至生物素化抗体的一般规则中所述方法的修改形式。将5μg抗CD51生物素化抗体(即，10μL 0.5μg/μL溶液)加入50μL微泡/DPBS分散液中，使得抗CD51抗体与Targesphere SA微泡的质量/计数比为1:2x107。将小瓶在轻柔搅拌下于室温温育约20分钟。
(c)形成向导RNA：将crRNA和tracrRNA以200μM悬浮在IDT的无核酸酶双重缓冲液(duplex)中。crRNA以1:1等摩尔比结合，最终向导RNA浓度为100μM(表5)：
表5
混合物于95℃加热五分钟，随后移除热并使其冷却至室温。
(d)形成RNP复合物：如Alt-RTMCRISPR-Cas9用户指南中所述的，将Cas9与向导RNA结合以产生RNP。简言之，对于经历了声穿孔的每个孔，将向导RNA(即，在前述步骤中制成的crRNA:tracrRNA二重体)在DPBS中稀释，最后缓慢加入Cas9，使Cas9:gRNA摩尔比为约1:1.15。随后将混合物于室温温育20分钟。浓度如下：
表6
(e)制备加载的微泡：轻弹包含抗体-微球缀合物("aCD51 Targespheres")的小瓶以混合。随后将抗体-微球缀合物与前面步骤制成的RNP合并，温育20分钟，随后用DPBS稀释至最终浓度为4μM RNP和5x108微泡(mb)/mL：
表7
(f)用HEK-293细胞温育aCD51 Targespheres：通过用移液管移取从HEK-293细胞中去除生长培养基(参见一般规则)。上下吸取aCD51Targespheres(即，抗体-缀合的微泡)以良好混合。随后将25μL aCD51Targespheres用移液管移至涂有组织培养物涂层的384孔聚丙烯微孔板的每个孔中。将板颠倒翻转以促进aCD51 Targespheres与细胞的结合，并将其在37℃温育器中放置五分钟。
(g)声穿孔：使用反向移液，将75μL预温暖的完全生长培养基加到每个孔中，使每个孔的总流体体积达到100μL，RNP浓度为1μM。使用2.25MHz转换器、0.5”孔径和1英寸焦距(F数为2)进行声穿孔。激活转换器以便用出发重复率为约10Hz(这表示短纯音相隔0.1秒)的300个短纯音辐射每个储存器。每个短纯音由8个输出周期组成，对应于约(8/2.25)3.5μs的短纯音持续时间。在整个突发输出过程中RF频率恒定。
(h)分析：通过测量被引入到HPRT基因的插入缺失(indels)数量来评价CRISPR编辑成功率，其中"插入缺失"是因插入或缺失核苷酸所致的DNA序列变化。使用T7核酸内切酶I(T7E1)消化法将其量化，在螺旋的两个半部没有完美地彼此碱基配对(即，如果一个半部包含插入缺失)的情况下，所述方法切割双链DNA。在用T7E1消化之后，DNA或者保持完整，或者被切割为两个较小片段。使用凝胶电泳色谱法分析消化的DNA以根据尺寸分离片段，并且分析切割片段比全长片段的量。
T7核酸内切酶I CRISPR插入缺失检测方法：用DPBS洗涤细胞并使用EpicentreQuickExtract DNA提取溶液溶解细胞。使用位于目标位点(即，HPRT基因座)侧翼的引物对所得的基因组DNA进行PCR扩增。将PCR产物加热至95℃以使其变性，随后将其缓慢冷却至室温，有利于形成错配对。随后加入T7核酸内切酶I并于37℃温育1小时，切割任何具有>1个碱基对错配的双链DNA。随后将消化的DNA稀释，并且在AATI片段分析仪上使用CRISPRDiscovery Gel Kit Discovery Gel Kit Discovery Gel Kit运行以测量切割百分比。
为测量切割百分比，AATI ProSize软件比较了存在的“全长”DNA的量相对于在较小的“片段1”和“片段2”带中发现的量。这种切割百分比是CRISPY在细胞群中进行的编辑的百分比的代表。然而，T7E1酶不能检测1个碱基对插入缺失，后者可占CRISPR编辑事件的高达30％。通过该方法测量的切割百分比显著低估了插入缺失形成的真实比率。
切割％＝(片段1和2中的平均nmol)/(全长中的nmol+(片段1和2中的平均nmol))
重复试验工作并产生第二组结果。这两个试验在下文中被称为第1次运行和第2次运行。
结果：图11显示了毛细管电泳凝胶，其显示了第1次运行的错配切割测定和分析的结果；图12是提供了第2次运行的结果的毛细管电泳凝胶。1,083bp片段是全长PCR产品，而"片段1"是827bp，"片段2"是256bp。这两幅图显示了实验样品中的切割和所有对照物中的无切割，表明成功进行了CRISPR转染和编辑。表8给出了每次运行的切割百分比：
表8:第1次运行 第2次运行
还在图13的柱形图中示出了切割百分比结果，其中较暗的柱表示第1次运行的结果，较亮的柱表示第2次运行的结果。
图14是第2次运行获得的荧光图像，使用具有RFP光立方体的EVOS荧光显微镜来检测标记的tracrRNA。在图像中可看出，在实验条件下将HPRT和非-靶向RNP成功转染到细胞中，而阴性对照物条件导致非常低的摄取。

Claims (36)

1.一种将外源物质转染至细胞的声学方法，所述方法包括：
(a)提供系统，其包含：(i)以阵列布置的多个储存器(reseroir)，每个储存器含有宿主细胞和待引入所述宿主细胞中的所述外源物质，和(ii)产生和导引声辐射的声辐射发生器；
(b)将声辐射发生器声耦合至第一个储存器，而不同时将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；
(c)激活声辐射发生器以产生声辐射并以诱导宿主细胞的声穿孔的方式将声辐射导引入第一个储存器中，从而促进外源物质引入声穿孔的宿主细胞；
(d)将声辐射发生器与第一个储存器声学地分离；
(e)将声辐射发生器声耦合至第二个储存器，而不同时将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；
(f)对于第二个储存器，重复步骤(c)；和
(g)将声辐射发生器与第二个储存器声学地分离，并随后对于多个储存器中的其他储存器重复步骤(b)至(f)。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多个储存器包括96个储存器、384个储存器、1536个储存器、3456个储存器或多于3456个的储存器。
3.如权利要求1所述的方法，其中储存器包含在包括集成式多储存器单元的基板中。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述集成式多储存器单元包括孔板。
5.如权利要求4所述的方法，其中以至多0.5秒的储存器至储存器转换时间进行步骤(g)。
6.如权利要求5所述的方法，其中储存器至储存器转换时间为至多0.1秒。
7.如权利要求5所述的方法，其中储存器至储存器转换时间为至多0.001秒。
8.如权利要求5所述的方法，其中通过相对于声辐射发生器移动储存器进行每次的储存器至储存器转换。
9.如权利要求5所述的方法，其中通过相对于储存器移动声辐射发生器进行每次的储存器至储存器转换。
10.如权利要求1所述的方法，其中声辐射发生器包括聚焦元件，并且步骤(c)进一步包括聚焦步骤(c)中产生的声辐射，使得被导引入储存器的声辐射为聚焦声辐射。
11.如权利要求1所述的方法，其中宿主细胞和外源物质被包含在流体介质中。
12.如权利要求11所述的方法，其中诱导宿主细胞的声穿孔的方式包括将产生的声辐射传给宿主细胞的手段(means)。
13.如权利要求12所述的方法，其中将声辐射传给宿主细胞的手段包括转染激发物质。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述转染激发物质包括流体介质中的多种声学可激活的部分。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述声学可激活的部分包括局部流体体积。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述局部流体体积是受限流体体积(circumscribed fluid volumes)。
17.如权利要求16所述的方法，其中受限流体体积包括充气微泡。
18.如权利要求17所述的方法，其中步骤(c)中产生和被导引入储存器的声辐射使得充气微泡接收波长为微泡平均共振频率的15％内或者微泡平均共振频率的谐波的15％内的激发辐射。
19.如权利要求18所述的方法，其中步骤(c)中产生和被导引入储存器的声辐射的声穿孔压力小于1.5MPa。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述系统还包括确保微泡足够接近宿主细胞以便能够将声辐射从微泡传递到细胞的手段。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述手段包括在步骤(b)之前将微泡缀合至所述宿主细胞。
22.一种将外源物质转染至细胞的声学方法，所述方法包括:
(a)提供系统，其包含：(i)至少两个储存器，每个储存器含有缀合至声学可激活的充气微泡的宿主细胞和待引入所述宿主细胞中的所述外源物质，所述宿主细胞和外源物质包含在流体介质中，和(ii)产生和导引声辐射的声辐射发生器；
(b)将声辐射发生器声耦合至第一个储存器，而不同时将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；
(c)激活声辐射发生器以在声学上激活所述微泡而最小化可能的微泡空化的方式产生声辐射并将声辐射导引入所述第一个储存器，其中声辐射从所述微泡转移到所述宿主细胞以提供声穿孔的宿主细胞，从而促进所述外源物质引入所述声穿孔的宿主细胞；
(d)将声辐射发生器与所述第一个储存器声学地分离；
(e)将声辐射发生器声耦合至第二个储存器，而不同时将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；和
(f)对于所述第二个储存器，重复步骤(c)。
23.如权利要求11所述的方法，其中每个储存器中流体介质的体积在0.5μL至500μL范围内。
24.如权利要求11所述的方法，其中流体介质包括等渗缓冲溶液。
25.如权利要求1所述的方法，其中将细胞铺在储存器表面上。
26.如权利要求1所述的方法，其中细胞是非贴壁的。
27.如权利要求1所述的方法，其中外源物质包括核酸、肽、蛋白质、脂质、多糖、小分子或其组合。
28.如权利要求27所述的方法，其中外源物质包括DNA质粒。
29.如权利要求27所述的方法，其中外源物质包括核糖核蛋白。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述核糖核蛋白能够改变宿主细胞核酸。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述核糖核蛋白包括向导RNA和CRISPR相关的RNA可编程的DNA或RNA核酸酶蛋白或蛋白质复合物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述核糖核蛋白包括向导RNA和Cas9蛋白。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述核糖核蛋白包括向导RNA和催化无活性的CRISPR相关的RNA可编程的DNA或RNA核酸酶蛋白或蛋白质复合物。
34.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中，声穿孔包括以每秒10至25个短纯音的速度用声短纯音(toneburst)辐射储存器15秒至40秒。
35.如权利要求34所述的方法，其中每个周期声短纯音为5周期至10周期短纯音。
36.如权利要求27所述的方法，其中所述核酸是质粒。
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