JP6855382B2 - 細胞の統合された機能性および分子のプロファイリング - Google Patents

細胞の統合された機能性および分子のプロファイリング Download PDF

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Description

関連出願
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、下記の出願に基づく優先権を主張し、それぞれの全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
・米国仮特許出願第６２/１３８,８１３号（２０１５年３月２６日付けで出願）
・米国仮特許出願第６２/１５７,１７４号（２０１５年５月５日付けで出願）
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する陳述
[0002]本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって付与されたＲＯ１認可番号ＣＡ１７４３８５；およびテキサスがん予防研究所（Cancer Prevention and Research Institute of Texas；ＣＰＲＩＴ）によって付与された認可番号ＲＰ１３０５７０に基づく政府支援を用いてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
[0003]細胞活性を研究する現行方法は、単一細胞レベルで動的な細胞挙動を分子の挙動と統合する能力を欠いている。本発明の開示は、上述した当業界における不備に取り組む。
[0004]一部の実施態様において、本発明の開示は、（ａ）領域上に細胞集団を設置する工程；（ｂ）細胞集団の動的な挙動を、時間の関数としてアッセイする工程；（ｃ）動的な挙動に基づいて、１つまたはそれより多くの目的の細胞を同定する工程；（ｄ）１つまたはそれより多くの同定された細胞の分子プロファイルを特徴付ける工程；および（ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）から得られた情報を相関させる工程によって、細胞活性を評価する方法に関する。一部の実施態様において、本発明の開示の方法はまた、組織または血液サンプルなどの源から細胞集団を得る工程も包含する。
[0005]一部の実施態様において、細胞集団は、免疫細胞を包含する。一部の実施態様において、細胞集団としては、これらに限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、腫瘍細胞、腫瘍幹細胞、腫瘍浸潤リンパ球、およびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施態様において、細胞集団は、Ｔ細胞を包含する。
[0006]一部の実施態様において、細胞集団は、個々の細胞として領域上に設置される。一部の実施態様において、領域は、複数の容器を包含する。一部の実施態様において、容器は、ウェル、チャネル、区画、およびそれらの組合せの少なくとも１つの形態である。一部の実施態様において、容器は、ナノウェルのアレイの形態である。
[0007]一部の実施態様において、アッセイしようとする動的な挙動としては、これらに限定されないが、細胞の活性化、細胞の阻害、細胞の相互作用、タンパク質発現、タンパク質分泌、代謝産物分泌、脂質プロファイルの変化、微小胞分泌、エキソゾーム分泌、微粒子分泌、細胞質量の変化、細胞増殖、細胞形態の変化、運動性、細胞死、細胞の細胞傷害性、細胞溶解、細胞膜の分極、シナプスの確立、タンパク質の動的なトラフィッキング、顆粒の分極、カルシウム活性化、代謝変化、小分子分泌、プロトン分泌、およびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施態様において、アッセイは、微速度撮影画像化顕微鏡法などの様々な方法によって動的な挙動を可視化することによって行われる。
[0008]例えば、一部の実施態様において、細胞集団の運動性が、細胞の配置、細胞の動き、細胞の転移、細胞の速度、領域上での細胞の動きの経路、細胞の浸潤、細胞のトラフィッキング、およびそれらの組合せの少なくとも１つを評価することによってアッセイされる。一部の実施態様において、細胞集団の細胞の細胞傷害性は、細胞集団からの細胞傷害性分子の放出を評価することによってアッセイされる。一部の実施態様において、細胞集団の細胞の相互作用は、細胞の相互作用の持続時間、細胞の相互作用の数、カルシウム活性化、顆粒の分極、タンパク質局在化、細胞の相互作用中の運動性、細胞の相互作用の終結、およびそれらの組合せを評価することによってアッセイされる。
[0009]一部の実施態様において、アッセイは、領域と連携するセンサーの使用を包含する。追加の実施態様において、本発明の開示は、（ａ）センサーと連携する領域上に細胞集団を設置する工程；および（ｂ）細胞集団の動的な挙動を、時間の関数としてアッセイする工程によって細胞活性を評価する方法に関する。
[0010]一部の実施態様において、センサーは、ビーズの形態である。一部の実施態様において、ビーズは、約３μｍから約５μｍの範囲の直径を包含する。一部の実施態様において、センサーは、目的の分析物（例えば、分泌されたタンパク質、細胞溶解産物の要素、細胞受容体、およびそれらの組合せ）に対する分析物結合剤を包含する。
[0011]一部の実施態様において、センサーは、細胞集団中の単一細胞の動的な挙動をリアルタイムでアッセイするのに利用される。例えば、一部の実施態様において、タンパク質発現は、本発明の開示のセンサーによって、細胞溶解産物の要素の捕獲を介してアッセイされる。一部の実施態様において、タンパク質分泌は、本発明の開示のセンサーによって、分泌されたタンパク質の捕獲を介してアッセイされる。一部の実施態様において、本発明の開示のセンサーは、アッセイ中の細胞集団のオートフォーカシングを可能にするための基準マーカーとして利用される。一部の実施態様において、細胞集団は、センサーとのインキュベーションの前に溶解される。
[0012]またアッセイされた動的な細胞挙動に基づき１つまたはそれより多くの目的の細胞を同定するのに、様々な方法を利用することもできる。例えば、一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの細胞は、アルゴリズムの使用を介して自動的に同定される。その後、同定された細胞の様々な分子プロファイルを特徴付けることができる。
[0013]一部の実施態様において、特徴付けられた分子プロファイルとしては、これらに限定されないが、転写活性、トランスクリプトームのプロファイル、遺伝子発現活性、ゲノムプロファイル、タンパク質発現活性、プロテオームのプロファイル、タンパク質の相互作用活性、細胞受容体の発現活性、脂質プロファイル、脂質活性、炭水化物プロファイル、微小胞活性、グルコース活性、代謝プロファイル、およびそれらの組合せを挙げることができる。一部の実施態様において、特徴付けは、これらに限定されないが、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、タンパク質分析、脂質分析、代謝産物分析、質量分析、およびそれらの組合せなどの方法によって行われる。
[0014]また様々な方法が、得られた情報を相関させることにも利用され得る。例えば、一部の実施態様において、相関させる工程は、アッセイされた動的な挙動および特徴付けられた分子プロファイルを統合することを包含する。一部の実施態様において、相関させる工程は、１つまたはそれより多くの同定された細胞の運動性を、１つまたはそれより多くの同定された細胞の遺伝子発現または転写活性に相関させることを包含する。一部の実施態様において、相関させる工程は、１つまたはそれより多くの同定された細胞の運動性を、１つまたはそれより多くの同定された細胞のタンパク質の相互作用活性に相関させることを包含する。一部の実施態様において、相関させる工程は、１つまたはそれより多くの同定された細胞の細胞の相互作用活性を、１つまたはそれより多くの同定された細胞のタンパク質発現活性に相関させることを包含する。
[0015]相関させた情報は、様々な目的に利用され得る。例えば、一部の実施態様において、相関させた情報は、処置（例えば、免疫療法）の臨床転帰を予測すること、細胞をスクリーニングすること（例えば、マルチキラーＴ細胞）、さらなる評価（例えば、さらなる研究または拡大）のために細胞を回収すること（例えば、顕微操作によって）、処置を容易にすること、疾患を診断すること、細胞活性をモニタリングすること、およびそれらの組合せの少なくとも１つのために利用することができる。
[0016]図１は、細胞活性を評価する方法スキームを例示する。 [0017]図２は、ナノウェルのグリッド（ＴＩＭＩＮＧ）アッセイにおける微速度撮影画像化顕微鏡法に基づく小さいデータセットを例示する。図２Ａは、７×７個のブロック（５×５個の使用に適した内部のナノウェル／ブロックを含む）で並べられた１６８×７０個のナノウェルを有するアレイを示す。図２Ｂは、パネルＡにおいて赤色の囲みでハイライトされた５個のブロックの拡大図を示す。図２Ｃは、パネルＢにおいて赤色の囲みでハイライトされたナノウェルに関する５分のインターバルでの時系列データを示す。図２Ｄは、パネルＣに示されるナノウェルに関する一連の微速度撮影像の単一フレームの拡大図を示し、これは、３つのＮＡＬＭ−６標的細胞（緑色）、標的細胞と接触している１つのＣＤ１９特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞（赤色、右下）（接触区域は黄色に見える）、および分析中に却下される赤色蛍光の死細胞片粒子を示す（左端）。 [0018]図３は、自動化画像分析のチャレンジを例示する。図３Ａ〜Ｈは、サンプル画像のフレームを示す。赤色の矢印は、隣接する細胞間の不明瞭な境界を表示する。黄色の矢印は、検出が難しい低強度の細胞をハイライトする。緑色の矢印は、均質ではない蛍光のためにセグメント化が難しい細胞をハイライトする。図３Ａ、３Ｂ、３Ｄ、３Ｅ、および３Ｆは、低いコントラストおよびＳＮＲを有するフレームを例示する。図３Ｉは、図３Ａ〜Ｈにおける画像のバックグラウンド強度（暗い灰色）およびフォアグラウンド強度（明るい灰色）の平均ならびに標準偏差（誤差バー）を示す。図３Ｊは、１つの細胞に関連する画素と複数の細胞の両方にわたる蛍光分布の変動を示す。赤色および青色のヒストグラムは、図３Ｈにおいてそれぞれ赤色および青色のドットによって表示された細胞に対応する。 [0019]図４は、ナノウェルの自動化された局在化を例示する。図４Ａは、アーチファクトを示すナノウェルの例を示す。図４Ｂは、最もよく適合したテンプレートの正規化相互相関（ＮＣＣ）を示す。図４Ｃは、推測のナノウェルのクロッピング区域を示す。 [0020]図５は、サンプルの５×５個のナノウェルブロックに関する前処理（均一化、平滑化、アンミキシング、照度補正）を例示する。図５Ａは、標的（ＮＡＬＭ−６細胞）のチャネル中のウェルの外形の存在を示す。パネルＡ１およびＡ２は、２つの選択されたナノウェルのクローズアップ図を示す。図５Ｂは、対応するエフェクター（ＣＡＲ＋Ｔ細胞）のチャネルを示す。パネルＢ１およびＢ２は、それぞれＡ１およびＡ２でハイライトされた同じナノウェルに対応する。パネルＣおよびＤは、前処理後の標的およびエフェクターのチャネルを示す。画像の上のヒストグラムは、前処理後に補正される未加工画像における一様でない照度を例示する。 [0021]図６は、閉じ込めにより拘束された細胞のセグメンテーション方法の、従来の方法ではセグメント化できないナノウェルのムービーを集める能力を例示する。図６Ａは、４つのエフェクター（ＮＫ）細胞を含有する単一のナノウェルのサンプル画像のフレームを示す。赤色の矢印は、従来のアルゴリズムでは見逃される極めて低いコントラストを有する細胞を指し示す。黄色の矢印は、均質ではない蛍光のために分離が難しい２つの細胞を指し示す。図６Ｂは、提唱された正規化多重閾値距離マップ（ＮＭＴＤＭ）が、図６Ｃにおけるガウス（Ｌｏｇ）応答のラプラシアンを改善することを示す。図６Ｃは、ガウス（Ｌｏｇ）応答のラプラシアンを示す図である。図６Ｄは、細胞の変数を示す細胞数のヒストグラムを提供し、このナノウェルは、誤差なく自動的にセグメント化できないことを示す。閉じ込めにより拘束されたアルゴリズムは、ムービー全体を正確に再セグメント化するためにこのヒストグラムのピーク（正確には４における）を使用する。図６ＤにおけるパネルＥ、Ｆ、およびＧは、過小、補正、および過剰セグメンテーションシナリオの再セグメンテーション結果の例を提供する。 [0022]図７は、閉じ込めにより拘束された細胞の追跡を例示する。図７Ａは、ナノウェル中におけるＮＫ細胞のサンプルの追跡を示す。細胞の外形は、細胞の同一性により着色される。図７Ｂ〜Ｅは、多様な動きのパターンを有するエフェクターおよび標的細胞を追跡する能力を例示する、色分けされたサンプル細胞の動きの経路を示す。 [0023]図８は、細胞相互作用分析を示す。図８Ａは、標的細胞（Ｋ５６２細胞、緑色）およびエフェクター（ＮＫ細胞、赤色）ごとのＣＩを計算するのに使用される空間的な区域を示す。 図８Ｂは、ＣＩ＝０．３の場合の接触事象を示す。 図８Ｃは、ＣＩ＝０．０２の場合の非接触を示す。 図８Ｄは、１０時間にわたる３０分ごとのサンプルのフレームを示す。図８Ｄにおいて、赤色の点線はサンプリング時間に対応する。 図８Ｅは、標的細胞Ｔ１およびＴ２の経時的な接触の尺度ＣＩを示す。 [0024]図９は、全ての試行で同一なパラメーター設定を用いた１２回のＴＩＭＩＮＧ実験からの、様々な標的細胞（ＮＡＬＭ６、Ｋ５６２、およびＥＬ４）およびエフェクター細胞（ＮＫ細胞またはＣＡＲ＋Ｔ細胞）を含むセグメンテーションおよび追跡結果の視覚的な要約を示す（表４、実施例１）。上の列は、サンプルのフレームを示す。中央の列は、セグメンテーションを示す。下の列は、細胞の追跡を示す。 [0025]図１０は、ＴＩＭＩＮＧのフィーチャの分析を例示する。図１０Ａは、細胞死の前および後におけるエフェクター細胞と標的細胞との接触における累積時間の分布を示す。図１０Ｂは、それらの標的との接触の前（遊離）またはその間のＮＫ細胞の転移の分布を示す。バーは、それらの有意性と共に比較を表示する（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。 [0026]図１１は、ビーズアッセイ（タンパク質分泌）、ＴＩＭＩＮＧ（細胞間相互作用の分析論）およびマイクロ流体ｑＰＣＲ（単一細胞の遺伝子発現）の組合せを介して達成されるような単一細胞のハイスループットの多重化された機能性および分子のプロファイリングのためのモジュールの略図を提供する。 [0027]図１２は、ナノウェルアレイ内の機能化したマイクロビーズによって列挙されたＩＦＮγを分泌するＴ細胞の頻度は、ＥＬＩＳｐｏｔを使用して決定された同じ応答に相関することを例示する。図１２Ａは、単一細胞から分泌されたサイトカインを検出するためのビーズアッセイおよび抗体サンドイッチの略図を提供する。エフェクター細胞および標的細胞を、それぞれＰＫＨ６７およびＰＫＨ２６（シグマ（Sigma））で標識したところ、サイトカイン陽性ビーズが赤色の蛍光を発した（ストレプトアビジン−ＰＥ）。図１２Ｂは、ＩＦＮγ分析物濃度の関数としての、最小の３０個のＩＦＮγ陽性ビーズから検出されたバックグラウンド補正した平均蛍光強度（ＭＦＩ）を提供する。図１２Ｃは、様々なレベルの抗原性刺激（ウイルスペプチドプールおよびＰＭＡ／イオノマイシン）における異なるエフェクター細胞（ＰＢＭＣおよびＴＩＬ）の単一細胞のＩＦＮγ分泌を検出するためのＥＬＩＳｐｏｔを用いたビーズアッセイの比較を提供する。線形回帰から、どちらのアプローチも有意に相関することが示される（ｒ２＝０．８７、ｐ値＝０．０００８）。 [0028]図１３は、オープンウェルシステムにおける単一細胞から分泌された分析物の捕獲効率をモデル化するための有限要素分析を提供する。図１３Ａは、４０μｍのナノウェルにおける分泌から５時間後のウェル全体（右）およびビーズ表面上（左）の液相中の分析物濃度を示すヒートマップのスナップショットを提供する。表の右側にシミュレーションパラメーターを示した。図１３Ｂは、インキュベーション時間の関数としての異なるサイズを有するビーズの部分占有率およびそれらの単一細胞から分泌された分析物を捕獲する能力を提供する。図１３Ｃは、結合部位密度が３桁にわたり変更された場合のインキュベーション時間の関数としての３μｍビーズの部分占有率を提供する。一定速度での単一細胞の分泌の場合、結合部位密度が最も低いビーズは、最大の部分占有率を有する。 [0029]図１４は、ＣＤ３ζおよびＣＤ２８エンドドメインを介して活性化する第２代キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて腫瘍細胞（赤色）上のＣＤ１９抗原を認識するエフェクター細胞（青色）の略図を提供する。 [0030]図１５は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の表現型および機能のフローサイトメトリーによる特徴付けを提供する。図１５Ａは、フローサイトメトリーを用いたＣＡＲ＋Ｔ細胞の表現型の特徴付けを提供し、細胞は優勢にＣＤ８＋であり、ＣＡＲ発現が９０％を超えることが示される。図１５Ｂは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡで染色することにより得られたドットプロットを示し、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の優勢なサブセット（６０．７３％）がナイーブ様であったことが示される。図１５Ｃは、同種抗原を発現する標的細胞を認識するときにＩＦＮγ発現を特異的に上方調節するＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力を確認する細胞内染色分析を提供する。エフェクター：標的の比率は１：５であった。 [0031]図１６は、単一細胞レベルでのＣＡＲ＋Ｔ細胞の多機能性を照合するためにＴＩＭＩＮＧをビーズベースのアッセイと組み合わせることに関するデータを提供する。図１６Ａは、どのようにＴＩＭＩＮＧを利用して、運動性のようなＴ細胞に固有の挙動と腫瘍細胞内でアポトーシスの誘導を引き起こすそれらの相互作用の性質とを定量するかを実証する。エフェクター（青色）および標的（赤色）細胞を標識し、アポトーシスをアネキシンＶ（緑色から黄色）によって検出した。図１６Ｂは、ＴＩＭＩＮＧアッセイの終わりに、ＴＩＭＩＮＧ中にビーズ上に捕獲されたＩＦＮγ分子が、適切な蛍光標識した抗体を使用することによって明らかになったことを示す。 [0032]図１７は、一機能性および多機能性ＣＡＲ＋Ｔ細胞の固有なおよび相互作用の挙動の定量的な比較を提供する。図１７Ａは、正確に１つのエフェクターおよび複数の（２〜５の）腫瘍細胞の相互作用（Ｎ＝１１７８）を有するナノウェルごとの、殺滅（殺滅なし、１つを殺滅する、および複数を殺滅する）および／またはＩＦＮγ分泌に基づくＣＤ８＋Ｔ細胞の機能性の破壊を示すベン図を提供する。 図１７Ｂは、異なる機能転帰を生じるエフェクターと標的との累積的な接触の持続時間（分）を提供する。ＩＦＮγ（一機能性）のみを分泌するエフェクター細胞が、ＩＦＮγを分泌するかどうかに関わりなく１つまたは一連のものを殺滅する細胞と比較して、より長い接触の持続時間を示した。 ｔＣｏｎｔａｃｔ（図１７Ｃ）およびｔＤｅａｔｈ（図１７Ｄ）に基づく殺滅の速度論はさらに、殺滅および／またはＩＦＮγ分泌に参加するエフェクターのサブセットに対してモノキラーおよびマルチキラー細胞（それぞれ第１、第２、および第３の標的を殺滅する）に関しても示される。 ｔＣｏｎｔａｃｔ（図１７Ｃ）およびｔＤｅａｔｈ（図１７Ｄ）に基づく殺滅の速度論はさらに、殺滅および／またはＩＦＮγ分泌に参加するエフェクターのサブセットに対してモノキラーおよびマルチキラー細胞（それぞれ第１、第２、および第３の標的を殺滅する）に関しても示される。 図１７Ｅは、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の殺滅の機能性およびＩＦＮγ分泌の異なる組合せごとに計算した平均の転移、ｄＷｅｌｌ（μｍ）に関するデータを提供する。全ての多重比較に対する全てのｐ値を、パラメトリックな一元配置ＡＮＯＶＡを使用してコンピューターで計算した。各ドットは、単一のエフェクター細胞を表す。ｐ値の指定は、以下の通りである：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、および＊＊＊＊＜０．０００１。 [0033]図１８は、それらと単一のＮＡＬＭ−６腫瘍細胞との相互作用を説明するのに使用されるエフェクターのパラメーターを描写する略図を提供する。赤色のバーは、コンジュゲーションの期間を表示し、青色の矢印は、最初にコンジュゲーションが観察されたタイムポイントを表示し、緑色のラインは、最初のコンジュゲーションから標的の死までの時間を表示する。 [0034]図１９は、Ｔ細胞の運動性に関する追加のデータを提供する。図１９Ａは、マルチキラー細胞およびモノキラーＴ細胞に関するｔＣｏｎｔａｃｔ／ｔＤｅａｔｈの比較を提供する。ｔＣｏｎｔａｃｔはｔＤｅａｔｈより有意に低かったことが観察され、これは、Ｔ細胞の脱離が腫瘍細胞のアネキシンＶ染色より前に起こることを実証する。パラメトリックな一元配置ＡＮＯＶＡを使用してｐ値を決定した。図１９Ｂは、キラーおよび非キラーＴ細胞（ＩＦＮγ分泌に関わりなく）のコンジュゲーションの持続時間の比較を示す。ｔ検定を使用してｐ値を決定した。ここで、非キラーＴ細胞は、観察の全持続時間にわたり腫瘍細胞にコンジュゲートした緑色の矢印によって表示される細胞の集団を有し、したがってその値は、コンジュゲーションの本当の持続時間の過小評価を表すことに留意されたい。 [0035]図２０は、１：２〜５のＥ：Ｔ比率におけるフレームインターバル（５分）ごとのエフェクターと標的細胞とのコンジュゲーション中におけるエフェクター細胞の平均の転移を示す。複数の標的を殺滅するエフェクター細胞は、それらがＩＦＮγを分泌するかどうかに関わりなく、殺滅しないかまたはＩＦＮγを分泌しない非機能的エフェクターと比較してより有意に高い運動性を有する。各マーカーは単一細胞を表し、赤色のバーは、集団の平均を表す。一元配置ＡＮＯＶＡを使用してｐ値を決定した。 [0036]図２１は、実施例２におけるＤＥＬＴＡジーン定量ＰＣＴ（ｑＰＣＲ）アッセイに関する標的化された遺伝子およびプライマー設計の列挙を提供する。 [0036]図２１は、実施例２におけるＤＥＬＴＡジーン定量ＰＣＴ（ｑＰＣＲ）アッセイに関する標的化された遺伝子およびプライマー設計の列挙を提供する。 [0036]図２１は、実施例２におけるＤＥＬＴＡジーン定量ＰＣＴ（ｑＰＣＲ）アッセイに関する標的化された遺伝子およびプライマー設計の列挙を提供する。 [0036]図２１は、実施例２におけるＤＥＬＴＡジーン定量ＰＣＴ（ｑＰＣＲ）アッセイに関する標的化された遺伝子およびプライマー設計の列挙を提供する。 [0036]図２１は、実施例２におけるＤＥＬＴＡジーン定量ＰＣＴ（ｑＰＣＲ）アッセイに関する標的化された遺伝子およびプライマー設計の列挙を提供する。 [0037]図２２は、運動性ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞は活性化された転写プロファイルを表すことを表示するデータを提供する。図２２Ａは、３時間のＴＩＭＩＮＧ実験中における高いおよび低い運動性の細胞の追跡の代表的な例を提供する。Ｘ、Ｙ座標は、起点に対して設定された最初の細胞位置に対するマイクロメートルで示される。カラーマップは、細胞分極のアスペクト比を表し、赤色は、円形の細胞を意味し、緑色および青色の色調の増加は、細長い細胞を意味する。Ｍ２およびＭ３は、対応する補足のムービーが示される細胞を意味する。 図２２Ｂは、高いおよび低い運動性のＣＤ８＋Ｔ細胞を比較した有意性（ｔ検定）および倍率変化の規模を実証するボルケーノプロットを示す。 図２２Ｃは、有意差を有すると同定された（ｐ値＜０．０５）サンプルおよび遺伝子の教師なし階層的バイクラスタリングおよび＞１．５の正味の倍率変化を示す。＊および＋は、パネルＡで追跡が示される個々の運動性および非運動性細胞を意味する。 図２２Ｄは、ＳＴｒｅｎＤを用いた傾向の発見が、細胞間の進行性の状況を説明するために最も重要な遺伝子を選択することを可能にすることを示す。 図２２Ｅは、どのように各遺伝子が差次的に局在するかを高いまたは低い運動性の細胞と共に例示するツリー型の構造における連続的な状況の可視化を示す。 図２２Ｆは、差次的に発現される遺伝子のジーンマニア（Genemania）を使用したタンパク質の相互作用ネットワーク分析を示し、これは、それらのＴ細胞の活性化および細胞移動経路への分離を実証する。 [0038]図２３は、３時間のＴＩＭＩＮＧ実験中における高いおよび低い運動性のＣＤ８＋Ｔ細胞の位置の追跡を示す。高い運動性の細胞の、低い運動性の細胞と比較してより大きいスキャニング領域およびより低い円形度が示される。細胞位置を自動化画像分析によって追跡し、Ｍａｔｌａｂの表面機能を使用してグラフ化した。Ｘ、Ｙ座標は、細胞の最初の位置に対するマイクロメートルで列挙される。カラーマップは、アスペクト比（円形度）の値を表す。赤色は、円形の細胞を意味し、緑色および青色の色調の増加は、細長い細胞を表示する。 [0039]図２４は、サンプルおよび遺伝子のヒートマップとして表された教師なし階層的バイクラスタリングを、個々のＴ細胞の平均速度および平均アスペクト比（最小（Ｍｉｎ）／最大（Ｍａｘ））と共に提供する。有意差を有すると同定された（ｐ値＜０．０５）遺伝子およびフィーチャならびに＞１．５の正味の倍率変化のみがクラスタリングに使用される。速度および形状のフィーチャなしのクラスタリングと比較して（図２２Ｃ）、サンプルおよび遺伝子は、これらのフィーチャ：サンプルの分離および遺伝子の順序付けにおける類似の正確性を使用した場合、類似の方式でクラスタリングされる。 [0040]図２５は、高いおよび低い運動性のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるグランザイムＢおよびパーフォリン転写物の相対数の比較を提供する。ｑＰＣＲアッセイの効力が最大と仮定した理想的な方式で、転写数を２（Ｌｏｇ２Ｅｘ）として計算した。グランザイムＢは差次的に発現されないが、それに対してパーフォリンは、２つのグループ間で有意差を示した（ｐ値＝０．０３）。 [0041]図２６は、免疫蛍光染色によって決定した場合のＮＡＬＭ−６腫瘍細胞におけるＣＤ１９発現を示す。ＥＬ４細胞株（ＣＤ１９陰性）を、陰性対照（黒線）として使用した。 [0042]図２７は、理想的な数の転写物と細胞の平均速度（ｄＷｅｌｌ）との相関を示す。ＣＸＣＲ３（図２７Ａ）およびＣＤ２（図２７Ｂ）発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の運動性に伴い増加することが示される。 [0042]図２７は、理想的な数の転写物と細胞の平均速度（ｄＷｅｌｌ）との相関を示す。ＣＸＣＲ３（図２７Ａ）およびＣＤ２（図２７Ｂ）発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の運動性に伴い増加することが示される。 図２７Ｃは、ＣＤ２およびＣＤ５８発現は、単一細胞レベルで直線的に相関することを示す。 図２７Ｄは、ＬＡＧ３、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＧＡＴＡ３およびＩＬ１８Ｒ１転写物が、高い運動性において、低い運動性の細胞と比較してより高度に発現されることを示す。 [0043]図２８は、統合されたＴ細胞の機能性をまとめた略図を提供する。多機能性ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞のサブセットが、腫瘍細胞の連続殺滅およびＩＦＮγ分泌の両方に参加した。殺滅および連続殺滅に参加するＴ細胞は、それらの標的からより速く脱離し、それらの局在的な微環境をサンプリングすることを可能にする接触なしのより高い運動性を有していた。それに対して、付着した標的細胞を殺滅できなかったＴ細胞は、接触なしの低い運動性を示し、脱離を開始させなかったが、それでもなおＩＦＮγの分泌が可能であった。遺伝子発現プロファイリングから、高い運動性のＴ細胞は、低い運動性のＴ細胞と比較して、パーフォリンの、さらに細胞の活性化とケモカイン移動に関与する分子の多数の転写物を有していたことが示された。 [0044]図２９は、ナノウェルのグリッドにおけるＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞溶解機能性のハイスループット単一細胞分析を提供する。図２９Ａは、キメラＣＤ２８／ＣＤ３−ζを介してシグナル伝達する第２代ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９ＲＣＤ２８）の略図を提供する。 図２９Ｂは、ナノウェル内に閉じ込められた腫瘍細胞と共にインキュベートした場合、殺滅およびアポトーシスを受ける単一ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力を例示する代表的な複合顕微鏡写真を提供する。スケールバーは５０μｍである。 図２９Ｃは、２つの別々のドナーからのＣＡＲ＋Ｔ細胞の表現型の特徴付けを提供する。総ＣＤ３＋ＣＡＲ＋集団をゲーティングして、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の頻度を解明した。 図２９Ｄは、単一細胞のアッセイおよび１：１のＥ：Ｔ比率における集団レベルの５１Ｃｒ放出アッセイによって測定された細胞溶解応答の比較を提供する。単一細胞のアッセイごとの括弧内の数字は、観察された事象の総数を報告する。 図２９Ｅは、これらの２つのドナーから誘導されたＣＡＲ＋Ｔ細胞とＣＤ１９＋ＥＬ４標的細胞との相互作用の殺滅転帰の頻度をまとめたドーナツプロットを示す。図３１に、これらの相互作用のそれぞれを例示する代表的な顕微鏡写真を示す。 [0045]図３０は、ナノウェルのグリッドでＴ細胞標的細胞相互作用をモニタリングするためのハイスループット細胞傷害アッセイを例示する。標識されたエフェクターおよび標的細胞は、単一細胞レベルでＴ細胞の機能をモニタリングできるようにナノウェルアレイ上にローディングされる（約８５，０００の個々のウェル、各ウェルは１２５ｐＬ）。ローディングおよび洗浄工程に続いて、チップ全体をアネキシンＶを含有する細胞培養培地に浸す。顕微鏡で事前の画像を捕捉して、単一のナノウェルごとの占有を決定し、アッセイ開始時に死んでいる細胞を排除する。次いでアレイを、細胞間相互作用が可能なように６時間でインキュベーターに移し、第２の事後の画像を捕捉する。社内の画像セグメンテーションプログラムを使用して、画像を自動処理し、データベースの一致を採用して、殺滅を決定する。平行して、別々のナノウェルアレイに標的のみをローディングして、同じ期間にわたるエフェクターの非存在下における死亡率を決定する。殺滅アッセイ結果を、標的のみのアレイによって決定されたバックグラウンドの殺滅速度に対して補正する。 [0046]図３１は、単一ＣＡＲ＋Ｔ細胞（Ｅ）と１つまたはそれより多くのＮＡＬＭ−６腫瘍（Ｔ）細胞との相互作用の代表的な例を例示する複合顕微鏡写真を提供する。腫瘍細胞は赤色に着色され、ＣＡＲ＋Ｔ細胞は青色に標識され、外部を人工的に白色にする。死滅は、赤色の標的細胞におけるアネキシンＶ染色（緑色）の共局在によって決定される。スケールバーは５０μｍである。 [0047]図３２は、個々のＣＡＲ８細胞と１〜３個のＣＤ１９＋-ＮＡＬＭ−６腫瘍細胞との相互作用の転帰をまとめたドーナツプロットを示す。 [0048]図３３は、ＴＩＭＩＮＧアッセイのスキームを示す。ＰＤＭＳナノウェルアレイ（６４ｐＬの各ナノウェル）を、６０ｍｍのペトリ皿に接着されるように製作した。標識されたエフェクターおよび標的をナノウェルアレイ上にローディングし、チップ全体を蛍光性のアネキシンＶを含有する細胞培養培地に浸した。少なくとも６，０００個のナノウェルを、合計１２〜１６時間にわたり７〜１０分ごとに顕微鏡上で画像化する。その後、ウェル検出、画像の前処理および細胞のセグメンテーション、追跡およびフィーチャの計算結果が自動的になされるように、ファーサイト（ＦＡＲＳＩＧＨＴ）内の統合されたパイプラインを提供する。各ナノウェルが単一の時系列ファイルを提示するように、画像を断片化する。時系列データを分析した際、タイムポイントの＞９５％で正確に同じ数のエフェクターおよび標的を生じたナノウェルのみを分析のために繰り越した。最終的に、データは、各ウェルの時系列プロットとして、関連する細胞フィーチャのグラフと共に提示される。 [0049]図３４は、ＣＡＲ８細胞が、運動性およびＮＡＬＭ−６腫瘍細胞とのコンジュゲーション期間（Ｅ：Ｔは１：１）に基づいて異なるサブグループに分類できることを示す。それらと単一のＮＡＬＭ−６腫瘍細胞との相互作用を説明するのに使用されるエフェクターのパラメーターを描写する略図が示される。図３４Ａは、タイムラインを示し、ここで赤色のバーは、コンジュゲーションの期間を表示し、青色の矢印は、最初にコンジュゲーションが観察されたタイムポイントを表示し、緑色のラインは、最初のコンジュゲーションから標的の死までの時間を表示する。 図３４Ｂは、楕円に適合させた長軸と短軸の比率を説明する分極のアスペクト比を示す。 図３４Ｃは、連続した７分のタイムポイント間のエフェクター細胞の重心転移の平均を表す、Ｔ細胞の重心の正味の転移（ｄＷｅｌｌ）の例示を示す。また、３つの異なるサブグループのそれぞれにおける、単一ＣＡＲ８細胞の平均運動性（図３４Ｄ）、最初のコンジュゲーションまでの時間（図３４Ｅ）、および殺滅効率（図３４Ｆ）も示される。各丸は、単一細胞を表す。多重比較のｐ値を、パラメトリックな一元配置ＡＮＯＶＡを使用してコンピューターで計算した。 図３４Ｃは、連続した７分のタイムポイント間のエフェクター細胞の重心転移の平均を表す、Ｔ細胞の重心の正味の転移（ｄＷｅｌｌ）の例示を示す。また、３つの異なるサブグループのそれぞれにおける、単一ＣＡＲ８細胞の平均運動性（図３４Ｄ）、最初のコンジュゲーションまでの時間（図３４Ｅ）、および殺滅効率（図３４Ｆ）も示される。各丸は、単一細胞を表す。多重比較のｐ値を、パラメトリックな一元配置ＡＮＯＶＡを使用してコンピューターで計算した。 図３４Ｃは、連続した７分のタイムポイント間のエフェクター細胞の重心転移の平均を表す、Ｔ細胞の重心の正味の転移（ｄＷｅｌｌ）の例示を示す。また、３つの異なるサブグループのそれぞれにおける、単一ＣＡＲ８細胞の平均運動性（図３４Ｄ）、最初のコンジュゲーションまでの時間（図３４Ｅ）、および殺滅効率（図３４Ｆ）も示される。各丸は、単一細胞を表す。多重比較のｐ値を、パラメトリックな一元配置ＡＮＯＶＡを使用してコンピューターで計算した。 図３４Ｃは、連続した７分のタイムポイント間のエフェクター細胞の重心転移の平均を表す、Ｔ細胞の重心の正味の転移（ｄＷｅｌｌ）の例示を示す。また、３つの異なるサブグループのそれぞれにおける、単一ＣＡＲ８細胞の平均運動性（図３４Ｄ）、最初のコンジュゲーションまでの時間（図３４Ｅ）、および殺滅効率（図３４Ｆ）も示される。各丸は、単一細胞を表す。多重比較のｐ値を、パラメトリックな一元配置ＡＮＯＶＡを使用してコンピューターで計算した。 [0050]図３５は、運動性および１：１のＥ：Ｔ比率における腫瘍細胞との接触挙動に基づくキラーＣＡＲ８細胞のサブグループの同定を示す。ＣＡＲ８細胞とＮＡＬＭ−６細胞との相互作用におけるＣＡＲ８細胞の接触パターンの時系列をＫ平均クラスタリング（ユークリッド距離、完全連結法）を使用してクラスタリングして、低いおよび高い接触の持続時間のサブセットを同定した。ＣＡＲ８細胞の転移（ｄＷｅｌｌ）を独立してクラスタリングして、Ｋ平均（ユークリッド距離、完全連結法）を使用して２つまたは３つのサブセットを得た。これらは同じ細胞のフィーチャであるため、カレイドを使用して、単一細胞の解像におけるクラスター間の連結（灰色のケーブル）を可視化した。３つのサブセット、Ｓ１〜Ｓ３それぞれの頻度は、オレンジ色でハイライトされる。 [0051]図３６は、マルチキラーＣＡＲ８細胞が、同時に起こるコンジュゲーション（Ｅ：Ｔは１：２〜５）に従事して、多重化殺滅をもたらすことを示す。図３６Ａは、ＮＡＬＭ−６腫瘍細胞数を増加させてインキュベートした場合における個々のＣＡＲ８細胞の同時に起こるコンジュゲーションの数の分布を示す。個々のマルチキラーＣＡＲ８細胞の、平均の運動性（図３６Ｂ）、最初のコンジュゲーションまでの時間（図３６Ｃ）、および殺滅効率（図３６Ｄ）も示される。多重比較のｐ値を、パラメトリックな一元配置ＡＮＯＶＡを使用してコンピューターで計算した。 [0052]図３７は、運動性に基づき同定されたＣＡＲ４細胞の部分集団、効率的な殺滅に従事できることを示す（Ｅ：Ｔは１：１）。図３７Ａは、優勢にＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞で構成される２つの別々のドナーからのＣＡＲ＋Ｔ細胞の表現型の特徴付けを示す。３つの異なるサブグループのそれぞれにおける単一ＣＡＲ４細胞の平均の運動性（図３７Ｂ）、死滅効率（図３７Ｃ）も示される。図３７Ｄは、Ｓ１サブグループ内における単一ＣＡＲ８とＣＡＲ４細胞との間の殺滅効率の平均の比較を提供する。各丸は、パネルＢ〜Ｄにおける単一細胞を表。ＣＡＲ４細胞は、灰色の丸を使用して表され、ＣＡＲ８細胞は、黒色の丸を使用して表される。図３７Ｅは、ＣＡＲ４細胞およびＣＡＲ８細胞の集団全体の殺滅効率における差を描写する、比較のためのカプラン−マイヤー推測量を提供する。多重比較のｐ値（Ｂ／Ｃ）をパラメトリックな一元配置ＡＮＯＶＡを使用してコンピューターで計算し、二重比較（Ｄ／Ｅ）を対応のない両側ｔ検定を使用してコンピューターで計算した。 [0053]図３８は、それらの運動性および１：１のＥ：Ｔ比率における腫瘍細胞との接触挙動に基づくキラーＣＡＲ４細胞のサブグループの同定を提供する。ＣＡＲ４細胞とＮＡＬＭ−６細胞との相互作用におけるＣＡＲ４細胞の接触パターンの時系列をＫ平均クラスタリング（ユークリッド距離、完全連結法）を使用してクラスタリングして、低いおよび高い接触の持続時間のサブセットを同定した。ＣＡＲ４細胞の転移（ｄＷｅｌｌ）を独立してクラスタリングして、Ｋ平均（ユークリッド距離、完全連結法）を使用して２つまたは３つのサブセットを得た。これらは同じ細胞のフィーチャであるため、カレイド（Caleydo）を使用して、単一細胞の解像におけるクラスター間の連結（灰色のケーブル）を可視化した。３つのサブセット、Ｓ１〜Ｓ３それぞれの頻度は、オレンジ色でハイライトされる。 [0054]図３９は、マルチキラーＣＡＲ４細胞が、ＣＡＲ８細胞と比較して遅い殺滅の速度論を実証したこと（Ｅ：Ｔは１：２〜５）を示す。平均の運動性（図３９Ａ）と殺滅効率（図３９Ｂ）との比較も示される。 [0054]図３９は、マルチキラーＣＡＲ４細胞が、ＣＡＲ８細胞と比較して遅い殺滅の速度論を実証したこと（Ｅ：Ｔは１：２〜５）を示す。平均の運動性（図３９Ａ）と殺滅効率（図３９Ｂ）との比較も示される。 図３９Ｃは、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーによって同定されたグランザイムＢの細胞内発現を表す箱型および箱ひげ図（先端は、９９％信頼区間を表示する）を提供する。ＣＡＲ４細胞（ドナーＰＢ５８５８およびＰＢ３３３０３８から）およびＣＡＲ８細胞（ドナーＰＢ２４３５６６およびＰＢ２８１８４８から）を、ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＡＲおよびＧｚＢに対するｍＡｂを使用してプロファイリングした。多重比較または二重比較のためのｔ検定に関して、ｐ値を、パラメトリックな一元配置ＡＮＯＶＡを使用してコンピューターで計算した。 図３９Ｄは、５ｍＭのＥＧＴＡ遮断の非存在または存在下で３つの別々の標的細胞株（Ｄａｕｄｉ−β２ｍ、ＮＡＬＭ−６およびＣＤ１９＋ＥＬ４）と共にインキュベートしたＣＡＲ４細胞のフローサイトメトリーの殺滅アッセイ（Ｅ：Ｔ＝５：１）を示す。 [0055]図４０は、キラー細胞のアポトーシスの頻度および速度論が、複数のＮＡＬＭ−６腫瘍細胞との機能的なコンジュゲーションに依存することを示す。図４０Ａは、個々のシングルキラーＣＡＲ＋Ｔ細胞のエフェクターアポトーシス（Ｅ：Ｔは１：１）の平均速度論の、マルチキラーＣＡＲ＋Ｔ細胞（Ｅ：Ｔは１：２〜５）との比較を提供する。各丸は、単一細胞を表す。ＣＡＲ４細胞は、灰色の丸を使用して表され、ＣＡＲ８細胞は、黒色の丸を使用して表される。図４０Ｂは、キラー細胞のアポトーシスの頻度を腫瘍細胞密度の関数として示す。 [0056]図４１は、ＴＩＭＩＮＧアッセイとそれに続く単一細胞の遺伝子発現プロファイリングのスキームを提供する。 [0057]図４２は、インビトロにおけるＣＡＲ＋Ｔ細胞コンストラクトの運動性データを提供する。 [0058]図４３は、インビトロにおけるＣＡＲ＋Ｔ細胞コンストラクトの細胞傷害性データを提供する。 [0059]図４４は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイルを提供する。 [0060]図４５は、３人のドナーから差次的に発現される遺伝子のベン図を提供する。 [0061]図４６は、ＣＤ１３７が、活性化されたＣＡＲ＋Ｔ細胞および脱顆粒ＣＡＲ＋Ｔ細胞においてより高いレベルで発現されることを表示するデータを提供する。 [0062]図４７は、ＣＤ１３７刺激が、枯渇マーカーを減少させるが、その一方でＴＩＭ３の標的化は、ＣＴＬＡ４を誘導することを表示するデータを提供する。 [0063]図４８は、ＣＤ１３７およびＴＩＭ３の標的化が、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害性を増加させることを表示するデータを提供する。 [0064]図４９は、ＣＤ１３７およびＴＩＭ３の標的化が、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害性を増加させることを表示するデータを提供する。
[0065]前述の一般的な説明と以下の詳細な説明はいずれも例示的および説明的なものであり、特許請求された主題を限定しないことが理解されるものとする。本出願において、単数形の使用は複数形を包含し、言葉「１つの（a）」または「１つの（an）」は「少なくとも１つの」を意味し、「または」の使用は、特に別段の規定がない限り「および／または」を意味する。さらに、用語「包含する（including）」、加えて「包含する（includes）」および「包含される（included）」などの他の形態の使用は、非限定的な意味である。また「エレメント」または「要素」などの用語も、特に別段の規定がない限り、１つの単位を含むエレメントまたは要素と、１つより多くの単位を含むエレメントまたは要素との両方を包含する。
[0066]本明細書で使用される章の見出しは、系統化する目的のためであり、記載される主題を限定すると解釈されないものとする。これらに限定されないが、特許、特許出願、論文、書籍、および専門書などの本出願で引用された全ての文書または文書の一部は、それによりそれらの全体があらゆる目的で参照により明示的に本明細書に組み入れられる。組み入れられた文献および類似の資料の１つまたはそれより多くが、本出願における用語の定義と矛盾する方式でその用語を定義する場合、本出願が優先される。
[0067]単一細胞の動的機能的な挙動とその機能に関与する基礎となるメカニズムの統合的な定量化は、細胞挙動の包括的理解を発展させるために重要である。例えば、ゲノムおよびトランスクリプトームから、細胞内および細胞外シグナル伝達へ、さらには他種の細胞との相互作用への複数の生物学的特徴にわたり、ハイスループットで単一細胞レベルでの不均質性を定量することは、生物工学における治療上の発見、疾患の診断の改善、および免疫療法の促進において直接的な影響を与えることができる。
[0068]フローサイトメトリーは、細胞の表現型のスナップショットの提供にとって最適なツールであるが、これは、連続する動的な細胞挙動を研究するのにあまり適していない。個々の単一細胞の十分な同一性を特徴付けるために、運動性、他の細胞との相互作用、およびタンパク質分泌などの細胞の機能性を定量化して、それらに関してスクリーニングすることができるモジュラー式の方法；およびこれらのパラメーターを単一細胞の多重化分子プラットフォームと統合する能力を有することが望ましい。
[0069]このような細胞挙動の研究は、免疫学、がん生物学、および幹細胞工学などの多くの分野において極めて関心が高い。例えば、Ｔ細胞は、病原体および腫瘍に対する適応免疫応答の必須の要素である。病原体および腫瘍に対するロバストな適応免疫応答の重要な特徴は、複数の機能に参加する個々のＴ細胞の能力（多機能性）である。
[0070]Ｔ細胞は、抗腫瘍免疫の媒介において重要な役割を果たす。さらに、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在は、特定の腫瘍にとって陽性の臨床予後マーカーである。Ｔ細胞の抗腫瘍効能の最もよく説明されている機能的な属性としては、なかでも、運動性（腫瘍のトラフィッキングおよび浸潤）、直接的な細胞傷害性（細胞傷害性分子の放出）およびＩＦＮ−γのような炎症促進性サイトカインの分泌が挙げられる。
[0071]Ｔ細胞に直接コンジュゲートする標的細胞にのみ影響を与える細胞傷害性とは異なり、ＩＦＮ−γの分泌は、ＨＬＡ−クラスＩ分子発現の上昇、免疫細胞浸潤を促進するケモカインの誘導、血管新生制御（angiostasis）の媒介、および抗原欠損バリアント伸長の予防などの複数のメカニズムによって、微環境内の全ての細胞により重度の影響を与える。加えて、ＩＦＮ−γの分泌は、腫瘍において、Ｔ細胞抑制分子の発現の誘導および腫瘍抗原発現の下方調節により適応耐性メカニズムを誘導することができる。
[0072]上述した単一細胞レベルでのＴ細胞の機能の全てを直接測定することは、細胞間相互作用、細胞移動、遺伝子発現などの複数のパラメーターの同時のモニタリング、分泌されたタンパク質を検出する能力、およびエフェクター細胞の生存を必要とする。これらの課題は、これらのエフェクター機能の該当するサブセットを測定して、細胞の機能性との関連を確立するための相関的な研究に頼ることにより取り組まれてきた。
[0073]実際に、インサイチュまたはインビボでＴ細胞の運動性および細胞傷害性を研究するには多光子顕微鏡法が有用であるが、同時に追跡できるＴ細胞の数は少なく、視野に限定され、サンプリングバイアスを引き起こす可能性がある。インビトロでの動的な画像化システムは、規定の環境およびハイスループットでの単一細胞の解像におけるＴ細胞と標的細胞との長期的な相互作用を研究するのにより適している可能性がある。
[0074]同様に、運動性と細胞間の相互作用の両方を追跡するには、微細加工されたナノウェルアレイが理想的である。単一細胞によって分泌されたサイトカインの分析のためのマイクロエングレービングおよび単一細胞のバーコードチップ（ＳＣＢＣ）のような洗練された方法がすでに報告されているが、これらの方法は、封入を介した別々のガラス基板上での分泌されたサイトカインの捕獲を必要とする。重要なことに、同じ時間枠内で定量される、運動性、殺滅の速度論などのＴ細胞と標的細胞との相互作用パラメーター、およびサイトカイン分泌の同時測定を文書で示した報告はまだない。
[0075]インビトロにおける生細胞の自動的な微速度撮影の顕微鏡法は、細胞および生体分子の時空的な記録、および多細胞性の相互作用の追跡に関して十分確立された方法である。残念なことに、ほとんどの従来の方法は、限られた数の（例えば、１０〜１００個の）手作業でサンプリングした「代表的な」細胞対しか評価しないため、主観的なバイアスが生じる。それゆえに、このような方法は、統計学的に過小表示された細胞挙動を確実に定量する能力を欠いている。上述した限定は、多くの生物学的に関連した細胞の部分集団（例えば、腫瘍幹細胞、マルチキラー免疫細胞、および生物工学的に関連するタンパク質を分泌する細胞）は希少であるため、重大である。
[0076]そのようなものとして、動的な細胞挙動を単一細胞レベルでの分子挙動と統合する細胞活性を研究する改善されたリアルタイムの方法への必要性がある。本発明の開示は上述の必要性に取り組む。
[0077]一部の実施態様において、本発明の開示は、細胞活性を評価する方法に関する。図１で例示される一部の実施態様において、本発明の開示の方法は、以下の工程：細胞集団を得る工程（工程１０）；領域上に細胞集団を設置する工程（工程１２）；細胞集団の動的な挙動を、時間の関数としてアッセイする工程（工程１４）；動的な挙動に基づいて、１つまたはそれより多くの目的の細胞を同定する工程（工程１６）；１つまたはそれより多くの同定された細胞の分子プロファイルを特徴付ける工程（工程１８）；得られた情報を相関させる工程（工程２０）；および相関させた情報を利用する工程（工程２２）の１つまたはそれより多くを包含する。
[0078]一部の実施態様において、本発明の開示の方法は、センサーを利用してもよい。追加の実施態様において、本発明の開示は、センサーと連携する領域上に細胞集団を設置する工程、および細胞集団の動的な挙動を、時間の関数としてアッセイする工程によって細胞活性を評価する方法に関する。本明細書でより詳細に記載されるように、本発明の開示の方法は、多数の実施態様を有し得る。
[0079]細胞集団を得る工程
[0080]本発明の開示の方法は、様々な源から細胞集団を得ることができる。例えば、一部の実施態様において、細胞集団は、組織から得られる。一部の実施態様において、細胞集団は、血液サンプルから得られる。一部の実施態様において、細胞集団は、インビトロで拡大した血液細胞集団から得られる。一部の実施態様において、細胞集団は、処置の前または後に患者の血液から直接得られる。
[0081]本発明の開示の方法は、細胞集団を得るために様々な方法を利用することもできる。例えば、一部の実施態様において、細胞集団は、これらに限定されないが、フローサイトメトリー、陽性フローソーティング、陰性フローソーティング、磁気によるソーティング、およびそれらの組合せなどの方法によって得られる。一部の実施態様において、細胞集団は、マイクロマニピュレータ（例えば、自動化または手作業のマイクロマニピュレータ）を使用することによって得られる。一部の実施態様において、細胞集団は、細胞を特定の細胞集団の表現型に特異的な磁気粒子とインキュベートした後に磁気ヘッドを使用することによって得られる。
[0082]細胞集団
[0083]本発明の開示の方法は、様々な細胞集団を得て、利用することができる。例えば、一部の実施態様において、細胞集団としては、これらに限定されないが、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、原核細胞、真核細胞、単細胞の細胞、多細胞の細胞、免疫細胞、およびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施態様において、細胞集団は、免疫細胞を包含する。一部の実施態様において、免疫細胞は、処置の前または後に患者の血液から得られる。一部の実施態様において、免疫細胞は、インビトロで拡大される。
[0084]一部の実施態様において、細胞集団としては、これらに限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、腫瘍細胞、腫瘍幹細胞、腫瘍浸潤リンパ球、およびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施態様において、細胞集団は、Ｔ細胞を包含する。一部の実施態様において、Ｔ細胞としては、これらに限定されないが、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、遺伝子改変されたＴ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞、およびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施態様において、Ｔ細胞としては、これらに限定されないが、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞（Ｖγ９＋、Ｖγ２＋）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＣＤ１ｄ＋、Ｖα２４＋）、およびそれらの組合せが挙げられる。
[0085]一部の実施態様において、細胞集団は、ナチュラルキラー細胞を包含する。一部の実施態様において、ナチュラルキラー細胞としては、これらに限定されないが、ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ１ｄ＋／Ｖα２４＋ナチュラルキラーＴ細胞、およびそれらの組合せが挙げられる。
[0086]一部の実施態様において、細胞集団は、腫瘍細胞を包含する。腫瘍細胞は、様々な源に由来するものでもよい。例えば、一部の実施態様において、腫瘍細胞は、がん幹細胞、黒色腫、膵臓がん、卵巣がん、白血病、リンパ腫、乳がん、膠芽腫、神経芽細胞腫、前立腺がん、肺がん、およびそれらの組合せの少なくとも１つに由来する。一部の実施態様において、腫瘍細胞は、ＮＡＬＭ細胞を包含する。
[0087]本発明の開示の細胞集団は、同種細胞集団または異種細胞集団であってもよい。例えば、一部の実施態様において、細胞集団は、同種細胞集団である。一部の実施態様において、細胞集団は、異種細胞集団である。一部の実施態様において、異種細胞集団は、腫瘍細胞および免疫細胞を包含する。一部の実施態様において、異種細胞集団は、腫瘍細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を包含する。
[0088]領域上への細胞集団の設置
[0089]本発明の開示の細胞集団は、動的な挙動分析のために様々な領域上に設置することができる。例えば、一部の実施態様において、領域は、封入されていない。一部の実施態様において、領域は、オープンなシステムである。
[0090]一部の実施態様において、領域は、体積が制限された（volume bounded）容器を包含する。一部の実施態様において、領域は、複数の容器を包含する。一部の実施態様において、容器は、ウェル、チャネル、区画、およびそれらの組合せの少なくとも１つの形態である。一部の実施態様において、容器は、ナノウェルを包含する。一部の実施態様において、容器は、アレイの形態である。
[0091]一部の実施態様において、領域は、約１ｎＬから約１００ｎＬの体積容量を有する容器を包含し得る。一部の実施態様において、容器は、約１ｎＬ未満の体積容量を有する。一部の実施態様において、領域は、マイクロまたはナノウェルのパターン化したアレイの形態である。一部の実施態様において、領域は、流体フローと連通して、ガスおよび栄養素の交換を許容する。
[0092]一部の実施態様において、領域は、複数の個々の容器（例えば、約１０個の容器から約１，０００，０００個の容器）を有するマイクロ流体チップ上に多数の個々のアレイを包含する。一部の実施態様において、本発明の開示の領域は、体積容量が約１ｎＬ／ウェル未満のナノウェルのアレイを含有するマイクロ流体チップを包含する。
[0093]本発明の開示の領域は、様々な材料から製作することができる。例えば、一部の実施態様において、本発明の開示の領域としては、これらに限定されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＭＤＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ケイ素、ガラス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの組合せが挙げられる。
[0094]細胞集団は、様々な方式で本発明の開示の領域上に設置することができる。例えば、一部の実施態様において、細胞集団は、個々の細胞として領域上に設置される。一部の実施態様において、細胞集団は、細胞の集合体として領域上に設置される。一部の実施態様において、細胞集団は、少数の細胞（例えば、容器１つ当たり２〜６個の細胞）として領域上に設置される。一部の実施態様において、細胞集団は、液滴の形態で領域上に設置される。
[0095]一部の実施態様において、細胞集団は、手作業で領域上に設置される。一部の実施態様において、細胞集団は、自動化された方式で領域上に設置される。一部の実施態様において、細胞集団は、半自動化された細胞回収方法によって領域上に設置される。一部の実施態様において、細胞集団は、特異的な細胞の液滴をソーティングすることによって領域上に設置される。
[0096]動的な挙動
[0097]本発明の開示の方法は、領域上で細胞集団の様々な動的な挙動をアッセイするのに利用され得る。例えば、一部の実施態様において、アッセイされる動的な挙動としては、これらに限定されないが、細胞の活性化、細胞の阻害、細胞の相互作用、タンパク質発現、タンパク質分泌、代謝産物分泌、脂質プロファイルの変化、微小胞分泌、エキソゾーム分泌、微粒子分泌、細胞質量の変化、細胞増殖、細胞形態の変化、運動性、細胞死、細胞の細胞傷害性、細胞溶解、細胞膜の分極、シナプスの確立、タンパク質の動的なトラフィッキング、顆粒の分極、カルシウム活性化、代謝変化、およびそれらの組合せが挙げられる。
[0098]一部の実施態様において、アッセイされる動的な挙動は、タンパク質分泌を包含する。一部の実施態様において、アッセイされる動的な挙動は、運動性を包含する。一部の実施態様において、アッセイされる動的な挙動は、細胞死、例えば活性化誘導性細胞死を包含する。
[0099]一部の実施態様において、アッセイされる動的な挙動は、細胞の相互作用を包含する。一部の実施態様において、細胞の相互作用としては、これらに限定されないが、異種細胞の相互作用、同種細胞の相互作用、およびそれらの組合せが挙げられる。
[00100]一部の実施態様において、アッセイされる動的な挙動は、細胞死と細胞の相互作用との組合せを包含する。一部の実施態様において、アッセイされる動的な挙動としては、これらに限定されないが、運動性、細胞の細胞傷害性、細胞死、タンパク質分泌、細胞の相互作用、およびそれらの組合せが挙げられる。例えば、一部の実施態様において、アッセイしようとする動的な挙動としては、Ｔ細胞からのサイトカイン（例えば、炎症促進性サイトカイン、例えばＩＦＮ−γ）分泌、Ｔ細胞の運動性、およびＴ細胞と標的細胞との相互作用、Ｔ細胞／標的細胞死の動的なモニタリング、およびそれらの組合せが挙げられる。
[00101]一部の実施態様において、アッセイされる動的な挙動は、細胞形態の変化を包含する。一部の実施態様において、細胞形態の変化としては、これらに限定されないが、細胞の形状の変化、細胞体積の変化、細胞質量の変化、細胞サイズの変化、細胞の分極の変化、およびそれらの組合せが挙げられる。
[00102]動的な挙動をアッセイする工程
[00103]様々な方法は、細胞の動的な挙動をアッセイするのに利用され得る。一部の実施態様において、アッセイする工程は、単一細胞レベルで行われる。一部の実施態様において、アッセイする工程は、動的な挙動を可視化することによって行われる。一部の実施態様において、可視化することは、これらに限定されないが、顕微鏡法、微速度撮影画像化顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、多光子顕微鏡法、定量位相差顕微鏡法、表面増強ラマン分光法、ビデオ撮影術、手作業の視覚分析、自動化された視覚分析、およびそれらの組合せなどの方法によって行われる。
[00104]一部の実施態様において、動的な挙動の可視化は、微速度撮影画像化顕微鏡法によって行われる。一部の実施態様において、可視化することは、マルチチャネルのムービーのアレイとして記録される。一部の実施態様において、可視化することは、ナノウェルのグリッドにおけるハイスループットの微速度撮影画像化顕微鏡法を介して行われる。一部の実施態様において、可視化することは、明視野顕微鏡法、位相差顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、定量位相差顕微鏡法、表面増強ラマン分光法、およびそれらの組合せの少なくとも１つを介した微速度撮影の顕微鏡法を利用することによって行われる。
[00105]一部の実施態様において、動的な挙動をアッセイする工程は、動的な挙動の定量化を包含する。一部の実施態様において、アッセイする工程は、手作業で行われる。一部の実施態様において、アッセイする工程は、自動的に行われる。一部の実施態様において、アッセイする工程は、アルゴリズムの使用を介して自動的に行われる。例えば、一部の実施態様において、アッセイする工程は、動的な挙動の開始時間、持続時間、頻度、および程度を測定する自動化アルゴリズムを介した動的な挙動の自動化された定量化の使用を介して行われる。
[00106]細胞の動的な挙動のアッセイは、様々な実施態様を有し得る。例えば、一部の実施態様において、細胞集団の細胞形態が、最もよく適合する楕円の離心率を測定することによってアッセイされる。
[00107]一部の実施態様において、細胞集団の運動性が、細胞の配置、細胞の動き、細胞の転移、細胞の速度、領域上での細胞の動きの経路、細胞の浸潤、細胞のトラフィッキング、およびそれらの組合せの少なくとも１つを評価することによってアッセイされる。一部の実施態様において、細胞位置は、自動化画像分析によって追跡し、Ｍａｔｌａｂの表面機能を使用してグラフ化することができる。
[00108]一部の実施態様において、細胞死は、アポトーシスマーカーを検出することによってアッセイされる。一部の実施態様において、細胞毒性は、細胞集団からの細胞傷害性分子の放出を測定することによってアッセイされる。
[00109]一部の実施態様において、細胞集団の細胞の相互作用は、細胞の相互作用の持続時間、細胞の相互作用の数、カルシウム活性化、顆粒の分極、タンパク質局在化、細胞の相互作用中の運動性、細胞の相互作用の終結、およびそれらの組合せを測定することによってアッセイされる。一部の実施態様において、細胞の相互作用のアッセイはまた、細胞間接触の検出および定量化も包含する。
[00110]一部の実施態様において、細胞死と細胞の相互作用との組合せは、様々なパラメーターを評価することによってアッセイされる。このようなパラメーターとしては、これらに限定されないが、第１の細胞の接触から死までの時間、細胞死の前の細胞接触の数、第１の細胞の接触から標的細胞死までの細胞の相互作用の累積的な持続時間（ｔＣｏｎｔａｃｔ）、第１の細胞の接触から標的細胞死までの時間（ｔＤｅａｔｈ）、細胞接触の終結から標的細胞死までの時間、個々の細胞によって引き起こされる細胞死の数、およびそれらの組合せを挙げることができる。
[00111]本発明の開示のアッセイ方法はまた、追加の工程を包含していてもよい。例えば、一部の実施態様において、アッセイする工程は、細胞集団を標識することを包含する。一部の実施態様において、細胞集団は、蛍光ベースの検出試薬で細胞を染色することによって標識される。一部の実施態様において、標識することは、細胞死、運動性、またはタンパク質分泌などの様々な動的な挙動に関する情報を提供することができる。例えば、一部の実施態様において、細胞内染色分析は、タンパク質発現（例えば、抗体などの蛍光免疫親和性試薬を使用するＩＦＮγ発現の上方調節）をアッセイするのに利用することができる。一部の実施態様において、蛍光色素での細胞の標識は、細胞の生存を表示するのに利用することができる。
[00112]一部の実施態様において、アッセイする工程は、細胞集団を活性薬剤で前処置することを包含する。一部の実施態様において、活性薬剤としては、これらに限定されないが、小分子、薬物、抗体、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、およびそれらの組合せが挙げられる。
[00113]一部の実施態様において、アッセイする工程は、細胞集団を他の細胞で前処置することを包含する。一部の実施態様において、他の細胞は、同じ種、病原体または共生体の細胞を包含していてもよい。一部の実施態様において、他の細胞としては、これらに限定されないが、ウイルス、細菌、寄生虫、およびそれらの組合せを挙げることができる。
[00114]本発明の開示のアッセイ方法は、様々な条件下で行うことができる。例えば、一部の実施態様において、細胞の動的な挙動をアッセイする工程は、３７℃および５％ＣＯ２で実行される。一部の実施態様において、細胞の動的な挙動をアッセイする工程は、様々な分子酸素濃度（例えば、０〜５％）で実行される。一部の実施態様において、細胞の動的な挙動をアッセイする工程は、様々な代謝産物濃度で実行される。一部の実施態様において、代謝産物としては、これらに限定されないが、グルコース、グルタミン、乳酸塩、分岐鎖アミノ酸およびピルビン酸塩が挙げられる。追加の条件も想定することができる。
[00115]動的な挙動を、時間の関数としてアッセイする工程
[00116]細胞の動的な挙動は、様々な期間にわたりアッセイすることができる。例えば、一部の実施態様において、アッセイする工程は、所定期間にわたり連続的なインターバルで行われる。一部の実施態様において、所定期間は、約１分から約９６時間の範囲である。一部の実施態様において、所定期間は、約１分から約２４時間の範囲である。一部の実施態様において、所定期間は、約１時間から約２４時間の範囲である。一部の実施態様において、所定期間は、約５時間から約２４時間の範囲である。一部の実施態様において、所定期間は、約１２時間から約１４時間の範囲である。
[00117]一部の実施態様において、連続的なインターバルは、約１分から約６０分の範囲である。一部の実施態様において、連続的なインターバルは、約１分から約１０分の範囲である。一部の実施態様において、連続的なインターバルは、約５分から約１０分の範囲である。一部の実施態様において、連続的なインターバルは、約５分から約６分の範囲である。
[00118]一部の実施態様において、細胞の動的な挙動は、１２〜１３時間の期間にわたり、１インターバル当たり約５分〜約１０分続く連続的なインターバルでアッセイされる。一部の実施態様において、細胞の動的な挙動は、約８時間にわたり、１インターバル当たり約６分続く連続的なインターバルでアッセイされる。
[00119]センサー
[00120]一部の実施態様において、細胞集団の動的な挙動のアッセイは、センサーの使用によって行われる。一部の実施態様において、動的な挙動をアッセイするのに使用されるセンサーは、細胞集団を含有する領域と連携している。一部の実施態様において、センサーは、領域上に固定されている。
[00121]本発明の開示のセンサーは、様々な要素を包含していてもよい。例えば、一部の実施態様において、センサーは、分析物結合剤を包含する。一部の実施態様において、分析物結合剤は、センサーの表面上に１つまたはそれより多くの区域と連携している。一部の実施態様において、分析物結合剤としては、これらに限定されないが、遺伝子、ヌクレオチド配列、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、アンチセンスペプチド、アンチジーンペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、抗体、およびそれらの組合せが挙げられる。
[00122]一部の実施態様において、センサー上の分析物結合剤は、目的の分析物（すなわち、細胞の動的な挙動に関連する分析物）に対するものである。一部の実施態様において、目的の分析物としては、これらに限定されないが、分泌されたタンパク質、細胞溶解産物の要素、細胞受容体、代謝産物、脂質、微小胞、エキソゾーム（例えば、約２００ｎｍ未満の直径を有するエキソゾーム）、微粒子（例えば、約２００ｎｍから約５μｍの間の直径を有する微粒子）、小分子、プロトン、炭水化物、およびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施態様において、目的の分析物は、サイトカインである。
[00123]一部の実施態様において、目的の分析物は、本発明の開示のセンサーによって捕獲される。一部の実施態様において、捕獲された目的の分析物は、続いて特徴付けられる。捕獲された目的の分析物は、様々な方法によって特徴付けることができる。一部の実施態様において、このような方法としては、これらに限定されないが、質量分析、シーケンシング、顕微鏡法、核酸ハイブリダイゼーション、イムノアッセイベースの検出（例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ））、およびそれらの組合せを挙げることができる。
[00124]本発明の開示のセンサーは、様々な形態であってもよい。例えば、一部の実施態様において、センサーは、ビーズの形態である。一部の実施態様において、ビーズは、分析物に対して向けられた抗体でコーティングされる（例えば、蛍光標識した二次抗体で検出されるようなサイトカイン分泌をプロファイリングするために抗体でコーティングしたビーズ）。
[00125]本発明の開示のビーズは、様々な直径を有し得る。例えば、一部の実施態様において、ビーズは、約１００ｎｍから約１００μｍの範囲の直径を包含する。一部の実施態様において、ビーズは、約５００ｎｍから約１０μｍの範囲の直径を包含する。一部の実施態様において、ビーズは、約１μｍから約１０μｍの範囲の直径を包含する。一部の実施態様において、ビーズは、約５００ｎｍから約５μｍの範囲の直径を包含する。一部の実施態様において、ビーズは、約１μｍから約６μｍの範囲の直径を包含する。一部の実施態様において、ビーズは、約３μｍから約５μｍの範囲の直径を包含する。一部の実施態様において、ビーズは、約１μｍから約３μｍの範囲の直径を包含する。一部の実施態様において、ビーズは、約３μｍの直径を包含する。
[00126]本発明の開示のビーズは、様々な分析物結合密度を包含していてもよい。例えば、一部の実施態様において、ビーズは、約１０−１０ｍｏｌ／ｍ２から約１０ｍｏｌ／ｍ２の範囲の結合部位密度を包含する。一部の実施態様において、ビーズは、約１０−９ｍｏｌ／ｍ２から約１０−１ｍｏｌ／ｍ２の範囲の結合部位密度を包含する。追加の結合部位密度も想定することができる。
[00127]本発明の開示のビーズはまた、様々な組成物を包含していてもよい。例えば、一部の実施態様において、ビーズは、ポリマー性ビーズ、ケイ素ビーズ、ガラスビーズ、およびそれらの組合せを包含していてもよい。
[00128]本発明の開示のビーズは、様々な方法を介して、分析物結合剤で改変されてもよい。例えば、一部の実施態様において、ビーズは、目的の分析物に対する抗体と共にインキュベートされてもよい。次いでこれは、ビーズ表面への抗体の接着を起こすことができる。次いでビーズは、細胞集団の動的な挙動をアッセイするのに使用することができる。
[00129]動的な挙動をアッセイするためのセンサーの使用
[00130]本発明の開示のセンサーは、様々な方式で細胞の動的な挙動をアッセイするのに利用することができる。例えば、一部の実施態様において、本発明の開示のセンサーは、細胞集団の動的な挙動をリアルタイムでアッセイするのに利用される。一部の実施態様において、本発明の開示のセンサーは、細胞集団中の単一細胞の動的な挙動をリアルタイムでアッセイするのに利用される。
[00131]本発明の開示のセンサーは、様々な細胞集団の動的な挙動をアッセイするのに利用することができる。このような動的な挙動およびアッセイ方法はこれまでに説明されている。例えば、一部の実施態様において、本発明の開示のセンサーによってアッセイしようとする動的な挙動としては、これらに限定されないが、細胞の活性化、細胞の阻害、タンパク質分泌、微小胞分泌、エキソゾーム分泌、微粒子分泌、代謝産物分泌、小分子分泌、プロトン分泌、タンパク質発現、およびそれらの組合せを挙げることができる。
[00132]一部の実施態様において、タンパク質発現は、本発明の開示のセンサーによって、細胞溶解産物の要素の捕獲を介してアッセイされる。一部の実施態様において、タンパク質分泌は、本発明の開示のセンサーによって、分泌されたタンパク質の捕獲を介してアッセイされる。次いで細胞溶解産物の要素または分泌されたタンパク質の捕獲は、蛍光性の二次抗体の使用などの様々な方法によって可視化することができる。
[00133]本発明の開示のセンサーはまた、動的な挙動をアッセイすることにおいて二次使用することもできる。例えば、一部の実施態様において、センサーは、画像化中の細胞集団のオートフォーカシングを可能にするための基準マーカーとして利用される。定量的な位相イメージングを利用する一部の実施態様において、不変のサイズのセンサービーズが、参照物体として使用される。
[00134]本発明の開示の細胞集団を、様々な方法によって本発明の開示のセンサーに曝露することができる。例えば、一部の実施態様において、細胞集団は、センサーと共にインキュベートされる。一部の実施態様において、細胞集団は、センサーとのインキュベーションの前に溶解される。
[00135]１つまたはそれより多くの目的の細胞を同定する工程
[00136]アッセイされた細胞集団の動的な挙動は、１つまたはそれより多くの目的の細胞を同定するのに利用することができる。例えば、一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの目的の細胞は、それらのアッセイされた運動性、細胞の細胞傷害性、細胞死、タンパク質分泌、細胞の相互作用、およびそれらの組合せに基づいて同定することができる。一部の実施態様において、アッセイされた動的な挙動に基づいて、単一細胞が同定される。一部の実施態様において、アッセイされた動的な挙動に基づいて、複数の細胞が同定される。
[00137]細胞同定は、様々な方法によって行うことができる。例えば、一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの細胞は、手作業で同定される。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの細胞は、自動的に同定される。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの細胞は、アルゴリズムの使用を介して自動的に同定される。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの細胞は、自動化セグメンテーションおよび追跡アルゴリズムの使用を介して同定される。
[00138]一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの同定された細胞は、単離されてもよい。追加の実施態様において、本発明の開示の方法は、１つまたはそれより多くの同定された細胞を単離する工程を包含し得る。１つまたはそれより多くの同定された細胞を単離するのに、様々な方法を使用することができる。例えば、一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの同定された細胞は、顕微操作（例えば、手作業のまたは自動化された顕微操作）、磁気回収、誘電泳動による回収、音波による回収、レーザーベースの回収、およびこのような工程の組合せによって単離される。
[00139]分子プロファイル分析
[00140]アッセイされた動的な挙動に基づいて１つまたはそれより多くの細胞が同定されたら（さらに任意選択で単離されたら）、それらの分子プロファイルを特徴付けることができる。１つまたはそれより多くの同定された細胞の様々な分子プロファイルを特徴付けることができる。例えば、一部の実施態様において、分子プロファイルとしては、これらに限定されないが、転写活性、トランスクリプトームのプロファイル、遺伝子発現活性、ゲノムプロファイル、タンパク質発現活性、プロテオームのプロファイル、タンパク質の相互作用活性、細胞受容体の発現活性、脂質プロファイル、脂質活性、炭水化物プロファイル、微小胞活性、グルコース活性、代謝プロファイル（例えば、質量分析または他の方法を使用することによって）、およびそれらの組合せを挙げることができる。
[00141]一部の実施態様において、特徴付けられる分子プロファイルとしては、細胞受容体の発現活性が挙げられる。一部の実施態様において、プロファイリングされる細胞受容体としては、これらに限定されないが、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン受容体、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ３）、転写因子受容体（例えば、ＧＡＴＡ３）、およびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施態様において、特徴付けられる分子プロファイルとしては、細胞の１つまたはそれより多くのアポトーシスマーカーが挙げられる。
[00142]様々な方法は、細胞の分子プロファイルを特徴付けるのに利用され得る。例えば、一部の実施態様において、分子プロファイルの特徴付けは、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、タンパク質分析、脂質分析、代謝産物分析（例えば、グルコース分析）、質量分析、およびそれらの組合せによって行われる。
[00143]一部の実施態様において、分子プロファイルの特徴付けは、ＤＮＡ分析によって行われる。一部の実施態様において、ＤＮＡ分析は、１つまたはそれより多くの同定された細胞からのＤＮＡ配列の増幅を包含する。一部の実施態様において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。
[00144]一部の実施態様において、分子プロファイルの特徴付けは、ＲＮＡ分析によって行われる。一部の実施態様において、ＲＮＡ分析は、ＲＮＡの定量化を包含する。一部の実施態様において、ＲＮＡの定量化は、逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、多重化ｑＲＴ−ＰＣＲ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、およびそれらの組合せによって行われる。
[00145]一部の実施態様において、分子プロファイルの特徴付けは、ＲＮＡまたはＤＮＡのシーケンシングによって行われる。一部の実施態様において、ＲＮＡまたはＤＮＡのシーケンシングは、これらに限定されないが、全トランスクリプトームの分析、全ゲノム分析、ゲノムの全区域または標的化された区域のバーコード化されたシーケンシング、およびそれらの組合せなどの方法によって行われる。一部の実施態様において、個々の細胞または集合体によって分泌された微小胞、エキソソームまたは微粒子は、ＲＮＡ−シーケンシングまたは抗体ベースの方法によって検出される。
[00146]一部の実施態様において、分子プロファイルの特徴付けは、タンパク質分析によって行われる。一部の実施態様において、タンパク質分析は、プロテオームレベルで行われる。一部の実施態様において、タンパク質分析は、多重化された蛍光染色によって行われる。一部の実施態様において、単一細胞の包括的な代謝プロファイルは、質量分析を使用することによって達成される。
[00147]得られた情報の相関
[00148]本発明の開示の方法を介して得られた情報を相関させるために、様々な手順が利用され得る。例えば、一部の実施態様において、相関させる工程は、アッセイされた動的な挙動と、１つまたはそれより多くの同定された細胞の特徴付けられた分子プロファイルとを統合することを包含する。
[00149]一部の実施態様において、相関させる工程は、１つまたはそれより多くの同定された細胞の運動性を、１つまたはそれより多くの同定された細胞の遺伝子発現または転写活性に相関させることを包含する。一部の実施態様において、遺伝子分析アルゴリズム（例えばＳＴｒｅｎＤを用いた傾向の発見）は、高いまたは低い運動性の細胞と相関する遺伝子を選択するのに利用することができる。同様に、一部の実施態様において、バイクラスタリングアルゴリズムは、高いまたは低い運動性の細胞に関連する過剰発現された遺伝子を同定するのに利用され得る。
[00150]一部の実施態様において、相関させる工程は、１つまたはそれより多くの同定された細胞の細胞の相互作用活性を、１つまたはそれより多くの同定された細胞のタンパク質発現活性に相関させることを包含する。一部の実施態様において、相関させる工程は、１つまたはそれより多くの同定された細胞の運動性を、１つまたはそれより多くの同定された細胞のタンパク質の相互作用活性に相関させることを包含する。例えば、一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの同定された細胞のタンパク質相互作用ネットワークの分析は、１つまたはそれより多くの同定された細胞のタンパク質の相互作用活性を、１つまたはそれより多くの同定された細胞の運動性に相関させるジーンマニアアルゴリズムを使用することによって実行することができる。一部の実施態様において、相関させる工程は、単一細胞のＲＮＡ−ｓｅｑまたはｑＰＣＲプロファイリングを使用して、殺滅または連続殺滅に参加する免疫細胞の能力を、これらの細胞に関連する遺伝子と結び付けることを含む。
[00151]得られた情報の適用
[00152]本発明の開示の方法から得られた相関させた情報は、様々な目的に利用することができる。例えば、一部の実施態様において、相関させた情報は、処置の臨床転帰を予測すること、細胞をスクリーニングすること、さらなる評価のために細胞を回収すること、処置を容易にすること、疾患を診断すること、細胞活性をモニタリングすること、およびそれらの組合せの少なくとも１つのために利用することができる。
[00153]一部の実施態様において、相関させた情報は、処置を容易にするのに利用することができる。一部の実施態様において、処置は、免疫療法を包含する。例えば、一部の実施態様において、免疫細胞と腫瘍細胞との相互作用を動的にプロファイルリングして、それに続き免疫細胞におけるプロテオーム／トランスクリプトームのプロファイリングを実行する能力は、より優れた免疫療法の操作を可能にする。
[00154]一部の実施態様において、相関させた情報は、細胞活性をモニタリングするのに利用することができる。一部の実施態様において、モニタリングされる細胞活性としては、免疫応答が挙げられる。
[00155]一部の実施態様において、相関させた情報は、細胞をスクリーニングする、例えば臨床効果に関して細胞をスクリーニングするのに利用することができる。例えば、一部の実施態様において、スクリーニングされる細胞としては、マルチキラーＴ細胞が挙げられる。一部の実施態様において、マルチキラーＴ細胞の機能的および分子的な特徴は、臨床前および臨床試験のためにサブセットを選択する前に評価される。
[00156]一部の実施態様において、相関させた情報は、免疫療法の転帰などの臨床転帰を予測するのに利用することができる。例えば、一部の実施態様において、腫瘍細胞の連続殺滅を持続するおよびそれに参加するＴ細胞の観察された能力は、がん治療における同定されたＴ細胞の治療成功の予測変数として利用することができる。同様に、同定されたＴ細胞の特徴付けられたタンパク質発現活性は、インビボにおける治療の成功を強化するために、Ｔ細胞上に様々なマーカー（例えば、免疫受容体）を導入するのに利用することができる。
[00157]一部の実施態様において、相関させた情報は、さらなる評価のために細胞を回収するのに利用することができる。一部の実施態様において、細胞は、顕微操作などの様々な方法によって回収される。その後、細胞は、様々な目的のために評価される。一部の実施態様において、細胞は、追加の研究で評価される。一部の実施態様において、細胞は、細胞の拡大を介して評価される。
[00158]追加の実施態様
[00159]ここで、本発明の開示のより具体的な実施態様およびこのような実施態様の裏付けを提供する実験結果について述べる。しかしながら、出願人は、以下の開示は単に例示の目的のためであり、特許請求された主題の範囲を限定することは決して意図していないことを指摘する。
[00160]実施例１．ナノウェルのグリッド（ＴＩＭＩＮＧ）におけるハイスループットの微速度撮影画像化顕微鏡法からの個々の細胞間相互作用の自動化されたプロファイリング
[00161]この実施例において、蛍光標識したヒトＴ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、および様々な標的細胞（ＮＡＬＭ６、Ｋ５６２、ＥＬ４）を、１ナノリットル未満のウェル（ナノウェル）のＰＤＭＳアレイ上で共にインキュベートし、マルチチャネルの微速度撮影の顕微鏡法を使用して画像化した。細胞の変動およびナノウェルの閉じ込め特性を説明する新規の細胞セグメンテーションおよび追跡アルゴリズムは、１つのエフェクターおよび単一の標的を含有するウェルにつき、正確に分析されたナノウェルの収量を４５％（既存のアルゴリズム）から９８％に増加させた。これは、細胞の配置、形態、動き、相互作用、および死の信頼できる自動化された定量化を可能にした。１２回の異なる実験からの記録の自動化された分析は、デフォルトパラメーターを用いたところ、照度、染色、画像化のノイズ、細胞形態、および細胞クラスタリングにおける変動にもかかわらず、９９％より高い自動化されたナノウェル設計の正確性、９５％より高い自動化された細胞セグメンテーションの正確性、および９０％の自動化された細胞の追跡の正確性を実証した。１０，０００個より多くのナノウェルを用いたデータセットの分析から、ＮＫ細胞は、コンジュゲーションの持続時間を変更することによって、生きた標的と死んだ標的とを効率的に識別することが解明された。データから、細胞傷害性細胞は、接触前と接触中の両方において、非キラーより高い運動性を表すことも実証された。
[00162]近年の進歩によって、透明な生体適合性ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）基板上にキャスティングされた１ナノリットル未満のウェル（ナノウェル）の大きいアレイの製作が可能になっている。臨床サンプルからの生細胞、および実験室で操作された細胞の小さいグループをナノウェルに閉じ込めて、マルチチャネルの微速度撮影の顕微鏡法によって延長された持続時間にわたり画像化することができ、それにより何千もの制御された細胞事象をマルチチャネルのムービーのアレイとして記録することが可能になる。出願人は、この方法を、ナノウェルのグリッド（ＴＩＭＩＮＧ）における微速度撮影画像化顕微鏡法と称する。空間的な閉じ込めは、関連する細胞内事象マーカーと共に、細胞の動き、細胞の変化、および細胞間相互作用パターンなどの局在化した細胞現象のリッチサンプリングを可能にする。
[00163]したがってＴＩＭＩＮＧは、短い距離での細胞の移動および相互作用を追跡することに理想的に適している。しかしながら、より大きい距離にわたる細胞移動のパターンが目的の場合、より大きいウェルを有するアレイを製作することができる。同様に、閉じ込められていない細胞の移動挙動が望ましい場合、他の方法が説明されている。ナノウェルアレイの展望と課題は、ハイスループット、使用者が目的の事象を選択する必要性の排除、および経時的に同じ細胞を繰り返して追尾する能力である。
[00164]例えば、図２は、ナノウェル１つ当たり１つの４チャネルのムービーのアレイを生じる、１３０タイムポイントにわたり５分のインターバルで微速度撮影の顕微鏡法によって画像化された、蛍光でタグ付けされたヒトＣＡＲ＋Ｔ細胞（赤色）およびＮＡＬＭ−６腫瘍細胞（緑色）を含有する１１，７６０個のナノウェルからなるＴＩＭＩＮＧのデータセットを例示する。各ブロックからの境界のナノウェルを廃棄して、ブロック１つ当たり２５個の使用に適したナノウェルを得る。ＴＩＭＩＮＧのデータセットは、アレイサイズ、およびタイムポイントの数に応じて２００ＧＢ〜１．５ＴＢの様々なサイズを有する。生産データセットは図２の実施例より低い品質を有することが多く（例えば、図３〜５）、天然の細胞のばらつき、シグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）の変動、染色の変動、フォーカスのドリフト、蛍光色素間のスペクトルのオーバーラップ、および光退色などの混乱を含有する。
[00165]この実施例において、出願人は、最小のパラメーターのチューニングで、ＴＩＭＩＮＧのデータセット中の細胞を確実にセグメント化して追跡することができ、手作業の校正を必要とすることなく統計的プロファイリングのための細胞規模での測定値の十分に大きくリッチなセットを生じる高度に自動化されたアルゴリズムの開発を実証する。多目的のセグメンテーションおよび追跡アルゴリズムの直接的な適用は、それらの収量（セグメンテーションおよび追跡において誤差ゼロで分析されたナノウェルの数）が低く、それらのパラメーターのチューニングの必要性が高いため、実行可能な戦略ではない。
[00166]例えば、オープンソースのファーサイト（FARSIGHT）ツールキット（farsight-toolkit.org）のコアである報告された正確性が９５％より大きい先行するセグメンテーションアルゴリズムを図２に記載のデータセットに直接適用すると、ナノウェルが１つのエフェクターおよび１つの標的を含有する基礎的なケースの場合、誤差なしの収量はナノウェルのわずか４３％である（表１）。
[00167]追跡アルゴリズムを用いる状況は似たようなものである。例えば、３６個のナノウェルを含有し、そのうち２１個が少なくとも１つの細胞含有する１つのサンプルブロックを分析することにおいて、最先端のアルゴリズムは、ｘｘナノウェルを誤差ゼロで正確に追跡した（２８％の収量）。収量が９０％を下回る場合、正確に追跡されたナノウェルを同定するには、負担のかかる手作業の校正が好ましい。一方で、自動化された正確性が少なくとも９０％である場合、使用者は単に、自動化された結果とそれらが必然的に伴う適度の誤差を受け入れるだけでよい。
[00168]そのようなものとして、多目的のセグメンテーションおよび追跡アルゴリズムは、ＴＩＭＩＮＧのデータセットに密接に関係する強い拘束、具体的には細胞の空間的な閉じ込め、および細胞分裂の希少性を利用しない。それらはまた、従来の文献で数多く研究されてきた細胞核と比較して、細胞本体のより形態学的な変動および均質ではない蛍光に対処するためのメカニズムも欠いている。
[00169]この実施例において、出願人は、閉じ込めおよび細胞周期による拘束を利用し、新規のセグメンテーションアプローチを利用することにより、上記の基礎的なケースに対して収量を９８％に増加し（表１と表２を比較して）、高い追跡正確性をもたらす（表３）アルゴリズムを提供する。この性能レベルで、自動化セグメンテーションおよび追跡から得られた定量的な測定値は、手作業の校正を必要とすることなく統計学的研究に直接利用することができる。
Figure 0006855382
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[00170]実施例１．１．試料の調製および画像化
[00171]ＴＩＭＩＮＧのデータセットを、ヒトＴ細胞（キメラ抗原受容体ＣＡＲを発現するように遺伝子操作した）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエフェクターとして使用した現行の研究から得た。適切なリガンドを発現するヒト白血病細胞株ＮＡＬＭ６、Ｋ５６２またはマウスＥＬ４細胞を標的（Ｔ）として使用した。
[00172]両方の細胞型を無血清培地中で１回洗浄し、約２００万個／ｍＬに懸濁して、それぞれＰＫＨ６７緑色およびＰＫＨ２６赤色色素で製造元（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich））によって指示されるように標識した。およそ１００，０００個のエフェクター（Ｅ）細胞、続いて約２００，０００個の標的細胞を、ナノウェルアレイ上にローディングした。細胞を５分かけてナノウェルに沈降させ、過量の細胞を洗浄して取り除いた。
[00173]次に、５０μＬのアネキシンＶ−アレクサフルオロ（Alexa Fluor）６４７（ＡｎｎＶ−ＡＦ６４７、ライフテクノロジーズ（Life Technologies））を３ｍＬの完全培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ、フェノールレッド非含有、セルグロ（Cellgro））中に混合し、ナノウェルアレイプレート上にピペットで載せて、栄養およびガス交換（３７℃、５％ＣＯ２）をしながら画像捕捉中ずっとアレイを培地中に浸漬した。ナノウェルアレイは、顕微鏡の視界よりかなり幅広い。それゆえに、コンピューター制御された顕微鏡のステージ（AxioObserver Z1、カールツァイス（Carl Zeiss））を使用して、アレイを空間的にスキャンした。画像を、１２〜１３時間の期間にわたり５〜１０分のインターバルで収集した。この時間的サンプリング速度は、以前のインビトロでの観察において第１の接触から殺滅までと説明された時間の範囲内である。１つのブロック次のブロックまでのステージの動きは約１００ｍｓを必要とし、これは、サンプリングインターバルと比較してごくわずかである。
[00174]出願人は、ＬＤプランネオフルアール（LD Plan Neofluar）２０×／０．４ＮＡのＫｏｒｒ Ｐｈ１ Ｐｈ２ Ｍ２７（カールツァイス）対物レンズとオプトバー（optovar）の１×チューブレンズとの組合せを使用して、２００×の合計倍率、および０．３２５μｍ／画素（画素サイズ）の解像度を得た。画像を記録するために、ペルチェ冷却（−１０℃）式のデジタル科学ＣＭＯＳカメラ（ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ ４．０Ｖ２ Ｃ１１４４０−２２ＣＵ）、または浜松（Hamamatsu）のＥＭ−ＣＣＤカメラを使用した。
[00175]実施例１．２．ナノウェルの自動局在化
[00176]ナノウェルの自動局在化は、細胞の閉じ込め区域を線引きし、ステージを再度位置決めする際の誤差に関して補正して、全体的なＴＩＭＩＮＧのデータセットを、ナノウェル１つ当たり１つの動き補正された多数のビデオシーケンスに分割することにとって好ましい。好ましくは、単一ウェルの検出誤差はナノウェルを分析に使用できなくして、実験収量を低下させる可能性があるため、この操作は信頼性を高める。好ましくは、操作はまた、フォーカスのドリフト（ポリマー基板の縮み／膨潤／不規則性の原因となる）、幾何学的配置が損なわれたウェル、照度の変動、リンギングアーチファクト、ならびに経時的に移動したり、突然カメラ視野から出現／消失したりする可能性がある死細胞片または気泡に対してもロバストでなければならない（図４Ａ）。
[00177]ＳＩＦＴマッチングのような内容と無関係の画像の登録方法は、ＴＩＭＩＮＧデータにとって十分に信頼できるものでも実用的でもない。それらは複数のパラメーターの調整を必要とし、アーチファクトの存在下で不成功であった。それゆえに、出願人は、照度の変動およびアーチファクトに対してロバストな正規化相互相関（ＮＣＣ）ベースのテンプレート適合方法を採用した。出願人は、ナノウェルの幾何学的配置は製作プロセスからわかっており、それら常に位相差チャネルで目に見えるという事実を活用した。
[00178]例えば、図２Ｂは、アレイ中の個々のウェルを固有に配置するように設計されたコード化戦略を実行するために、ナノウェルの一部を意図的に４５°回転させることを示す。それゆえに、出願人は、分析されているデータセットから２つの空のウェル（規則的な、４５°回転した）を選択して、画像データに適合させるテンプレートとしてそれらを使用する。ＮＣＣ応答は、（−１，＋１）の範囲内であり、ここで−１は不十分な一致を表示し、＋１は完全一致を表示する。
[00179]ＮＣＣの速度を上げるために、出願人は、フーリエの実行を使用し、空間領域における正規化を実行した。図４Ｂは、図４Ａにおける実施例のウェルの、図４Ａにおける最もよく適合した（２つの）テンプレートに対するＮＣＣ応答を示す。出願人は、ウェルの中心を検出するために最適ＮＣＣ応答に極大クラスタリングアルゴリズムを使用し、認識できない応答を除去するためにナノウェル間の公知の間隔を使用して、正確性が９９％より大きいウェルのロバストな局在化を得た。
[00180]アーチファクトに対処するために、出願人は、最大ＮＣＣ応答が所定の閾値（ｔｙｐ．０．７５）を下回るナノウェルのビデオを廃棄した。結果得られた厳密な空間変換の推測（図４Ｃ）を使用して、クロッピングされた動き補正されたナノウェルのビデオ記録を生成した。
[00181]実施例１．３．画像の前処理
[00182]ビデオシーケンスごとの各画像フレームを均一化して、ガウスカーネルをσ＝１５で使用して各画素で推測された局在的なバックグラウンドを差し引くことによって照度の変動を補正した（図５Ｃ）。次に、出願人は、使用されたＰＫＨ６７およびＰＫＨ２６色素の放出スペクトル間におけるスペクトルのオーバーラップを補正して、エフェクターおよび標的細胞を標識した。７×７個のブロックのナノウェルビデオの主成分分析（ＰＣＡ）を使用して混合行列の列をオフラインで推測し、次いでアレイの残りに再使用した。線形インバース法によってアンミキシングを実行した。
[00183]最終的に、出願人は、細胞の境界を保存しながら半径ｒｍ＝３で中間値フィルターを使用して画像を平滑化した。他の著者によって述べられているように、このような前処理は、ハイスループットの細胞セグメンテーションの誤差を低下させるために好ましい。
[00184]前処理の後でも、細胞は形状および細胞内蛍光における変動を示すが（図６Ａ）、これは、細胞の検出および付着／オーバーラップする細胞本体の分離にとって課題である。広く使用されるマルチスケールのガウス（ＬｏＧ）マップのラプラシアンは、赤色の矢印によって表示された目立たない細胞を見失い、黄色の矢印によって表示された丸くない形状と均質ではない強度を示す細胞の対を分離することができない（図６Ｃ）。さらに、勾配で重み付けされた流域アルゴリズムは、端部が弱い細胞を分離することが難しい。
[00185]上述の制限を克服するために、出願人は、以下のように機能する細胞本体を検出するように設計される正規化多重閾値距離マップ（ＮＭＴＤＭ）（図６Ｃ）を提唱する。出願人の前処理した画像の正規化した画素強度分布ｐ（ｉ）は、方程式１に従って３つのガウス分布の混合によってモデル化される。
Figure 0006855382
[00186]方程式１において、パラメーター（μｋ，σｋ）および重みｗｋ、ｋ＝１、２、３は、それぞれ目立たないバックグラウンド、中間のフォアグラウンド、および超蛍光性のフォアグラウンド画素を捕獲する。出願人は、混合重みを推測するために決定論的なシーディングと共にｋ平均アルゴリズムを使用したが、これはなぜなら、このアルゴリズムは、迅速であり、初期化パラメーターをほとんど必要とせず、確実に収束し、費用がかかる期待値の最大化アルゴリズムに匹敵する結果をもたらし、出願人のハイスループット分析にとって理想的にするためである。
[00187]クラスター２および３は、画像のフォアグラウンドを一緒に捕獲し、ここでＬｍｉｎおよびＬｍａｘは、このフォアグラウンドに関する最小および最大の画素強度値を意味する。出願人は、一連のＭ閾値（ｔｙｐ．２０）を定義し、これは、δ＝（Ｌｍａｘ−Ｌｍｉｎ）／Ｍによって分離されたＬｍｉｎからＬｍａｘの間のｌを意味し、ここでｌ＝Ｌｍｉｎ，Ｌｍｉｎ＋δ，Ｌｍｉｎ＋２δ，・・・，Ｌｍａｘである。これらの閾値のそれぞれを使用して、Ｂｌ（ｘ，ｙ）と対応するユークリッド距離マップＤｌ（ｘ，ｙ）を意味する対応するバイナリーマスクを生成する。これらのバイナリーマスクのそれぞれを連結成分分析に供して、Ｒｈ，ｈ＝１，・・・，Ｈを意味する連結成分のセットを得る。
[00188]次に、出願人は、各連結成分のユークリッド距離マップをＲｈ以内の対応する最大値によって正規化して、確実に異なるレベルでの距離マップが等しく最終応答に寄与するようにした。それにより、連結成分Ｒｈの正規化多重閾値距離マップ（ＮＭＴＤＭ）は、方程式２に従って記述することができる。
Figure 0006855382
[00189]ＮＭＴＤＭは、マルチスケールＬｏＧとは異なり、細胞１つ当たり１つの明確なピークを示す（図６Ｃ対６Ｃ）。さらに、このマップにわたる局在的な最大クラスタリングは、マルチスケールＬｏＧフィルターより信頼できる細胞数の推測をもたらす。この工程は、２つのパラメーター設定：レベルＭの数およびピークを選択するためのクラスタリング半径ｒしか必要としない。これを使用して、出願人は、各フレームにつき独立して細胞数を推測し、時系列にわたりヒストグラムを計算する（図６Ｄ）。ナノウェル中の細胞数が一定のままであることが分かれば（細胞分裂は、観察期間内ではまれである）、このヒストグラムにおける１つより多くのゼロではない項目の存在は、従来のセグメンテーションおよび追跡結果が、このナノウェルに関して誤差を生じやすく、校正を必要とすると予想されることを意味する。しかしながら、ヒストグラムは、正しい細胞数でピークを示す。
[00190]出願人は、ヒストグラムのピークが、個々のフレームでは誤差があるにもかかわらず、微速度撮影シーケンスにわたる細胞数の信頼できる指標であることを見出した。さらに、正規化したヒストグラムのピークの高さは、細胞数における出願人の信頼性の信頼できる尺度である。この例示に関して、ピークは８２％に到達する。出願人は、ピークが７５％を下回るナノウェルを廃棄する。
[00191]実施例１．４．閉じ込めにより拘束された細胞の再セグメンテーション
[00192]上記で説明した方法は、細胞本体の正しい数を推測するには効果的であるが、細胞はそれらの中心に近づくにつれてより明るくなると想定されるため、正確な細胞配置の推測および細胞セグメンテーションを生じない。この制限を克服する出願人の戦略は、ヒストグラムベースの細胞数推測を使用して、画像画素の正規化したスペクトルのクラスタリングによってデノボで細胞を再セグメント化することである。この方法は、多様な形状の細胞を検出することができ、類似のサイズを有するクラスター（細胞）を推測するのに役立ち、これは、不明瞭な画像を取り扱う場合に合理的な仮説である。
[00193]Ｎフォアグラウンドの画素座標を｛ｘｉ｝ｉ＝１，…，Ｎと仮定して、出願人は、方程式３に従って相似行列Ｗ∈ＲＮ×Ｎを計算する。
Figure 0006855382
[00194]方程式３において、εは、ある画素とその近傍の画素との間の最大距離を表す使用者によって定義される定数であり、σは、近傍の幅を制御し、下記はユークリッドノルムである。
Figure 0006855382
次に出願人は、次数行列Ｄおよび非正規化グラフラプラシアン行列Ｌ＝Ｄ−Ｗを計算するが、Ｄは、方程式４で定義される対角行列である。
Figure 0006855382
[00195]方程式４において、出願人は、汎用の固有値問題Ｌｕ＝λＤｕの第１のＫ固有ベクトルｕ１，・・・，ｕＫをコンピューターで計算することによって行列Ｕ＝［ｕ１，・・・，ｕＫ］∈ＲＮ×Ｋを形成する。最終的に、出願人は、Ｕの列に対応するポイント｛ｙｉ｝ｉ＝１，・・・，ＮをクラスターＣｉ，ｉ＝１，・・・，Ｋにクラスタリングして、それに従いフォアグラウンド画素｛ｘｉ｝ｉ＝１，・・・，Ｎを再標識する。この方法（図６Ｅ〜Ｇ）は、個々のフレームに誤差があっても、ビデオシーケンス中の細胞を正確に再セグメント化することを可能にする。
[00196]出願人は、各ムービーにわたり固定数の細胞を確実に得ることになり、これは細胞の追跡を簡単にする。興味深いことに、閉じ込めにより拘束された細胞の再セグメンテーションアルゴリズムはまた、不正確なセグメンテーションおよび追跡結果の効率的な編集も可能にする。必要な場合、使用者は、補正された細胞数を用いたスペクトラルクラスタリングベースの再セグメンテーションを再試行することができ、これは、ほとんどの場合、正しい結果を生じる。
[00197]実施例１．５．閉じ込めにより拘束された細胞の追跡
[00198]信頼できる細胞の追跡は、細胞の複雑な運動挙動をハイスループットで定量するのに必要である。低い時間的サンプリング速度（５〜１０分／フレーム）は、細胞がフレーム間で顕著な転移および形状変化を受ける可能性があることを意味する。加えて、ナノウェルの壁の作用が、細胞の動きの予測を難しくしている。重要なことに、出願人は、手作業の校正への必要性を回避することを求めている。
[00199]これらの事柄を考慮に入れて、出願人は、迅速な、完全に自動化された、信頼できる閉じ込めにより拘束された追跡方法を提唱する。これは、連続したフレーム単位でというより、ムービー全体にわたり包括的に定式化される。これは初期化をまったく必要とせず、３つのみパラメーターを必要とする。ここで、出願人のアルゴリズムは、多目的の細胞の追跡問題を意図したものではないことに留意されたい。そうではなく、これは、特に閉じ込めにより拘束されたデータのために設計される。一般的な問題にとって、洗練された細胞追跡方法が文献に記載され、比較されている。このアプローチは、動きのモデルおよび観察モデルを必要とするが従来のセグメンテーションを必要としない、粒子フィルタリング、カルマンフィルタリングを包含する。高い時間的な分解データが利用可能な場合、コンターベースの平均シフト、およびレベル設定方法が好ましく、一部は、言うまでもないが細胞の併合および分割を取り扱うことができる。最適化ベースのアプローチは、先験的に検出／セグメント化される対象物を必要とし、低い時間的な分解データの場合に好ましい。対象物が視野に入る／視野から出る可能性がある場合、細胞は分割するかまたは死に、またはセグメンテーションが信頼できない場合、出現、消失、統合および分割、ならびにセグメンテーション誤差の自動補正を取り扱う精巧な方法が説明されている。ＴＩＭＩＮＧデータに関して、出願人は、ナノウェルの閉じ込め特性のために、このような複雑な要因を考慮に入れない。それゆえに、出願人の定式化は、能率的な定式化である。
[00200]出願人は、Ｔ個のフレームにわたるＫ個の細胞の追跡を、有向グラフにおける包括的に最適なエッジ選択問題として定式化した。グラフ中のノード
Figure 0006855382
は、フレームｔにおける細胞ｊを表し、下式の属性ベクトルによって記載される。
Figure 0006855382
下式のエッジ：
Figure 0006855382
は、フレームｔ−１における細胞ｉをフレームｔにおける細胞ｊに関連付け、出願人は、細胞区域ｉとｊとの間の相違点を測定する関連付けのコスト
Figure 0006855382
を計算する。
エッジ選択の変数
Figure 0006855382
は、最終的な解で所与のエッジが選択されるかどうかを表示する。整数計画法を使用して、出願人は、解γ∈｛０，１｝Ｎを求め、ここでＮ＝（Ｔ−１）×Ｋ×Ｋであり、各ナノウェルにわたり以下の関連付けコストの合計を最小化する。
Figure 0006855382
[00201]細胞の閉じ込めによる拘束は、方程式５に含まれる。不等式制約は、各ノード
Figure 0006855382
が、それぞれ前のフレームと次のフレームで最大１つのノードと関連付けられることを確実にする。
Figure 0006855382
をコンピューターで計算する際、細胞形態および強度プロファイルは経時的に変化するため、出願人は形状およびテクスチャー特徴を無視する。出願人は、方程式６に記載の２つの細胞に関して、細胞の重心間のユークリッド距離の重み付けされた合計ｇ（ｃｉ，ｃｊ）、細胞間の領域差ｇ（ａｉ，ａｊ）＝｜ａｉ−ａｊ｜、および画素間の集合論的な距離（ｒｉ，ｒｊ）を計算する。
Figure 0006855382
[00202]方程式６において、ａｏｖｅｒｌａｐは、オーバーラップ面積であり、ｍｉｎ（ｄｉｓｔ（ｒｉ，ｒｊ））は、細胞の画素間の最短距離である。全体コストは、φｉ，ｊ＝ｗ１×ｇ（ｃｉ，ｃｊ）＋ｗ２×ｇ（ａｉ，ａｊ）＋ｗ３×ｇ（ｒｉ，ｒｊ）と記述され、ここで重みｗ１、ｗ２、およびｗ３は、必要な場合に調整することができる。出願人は、デフォルト値ｗ１＝１、ｗ２＝１０、およびｗ３＝１００を使用した。高い時間的な分解データと優れたセグメンテーション結果が利用可能な場合、ｗ３を増加させることができる。出願人は、方程式５で分枝限定アルゴリズムを使用することによって整数計画を解く。理論上最悪のケースの走行時間が指数関数的に延びる可能性があるが、出願人は各ナノウェルで小さい細胞のコホートを処理するため、これは懸念に値しない。
[00203]図７Ａは、エフェクター細胞のみを含有するナノウェルの自動化された追跡の結果を例示し、大きいフレーム間の動きに対処する本発明者らの能力を示す。パネルＢ〜Ｅは、多様な動きのパターンを有するエフェクターおよび標的細胞のサンプルの細胞軌道を描写する。図９に、追加の実施例を提示する。
[00204]実施例１．６．細胞間接触の検出および定量化
[00205]エフェクターと標的との接触を検出すること、および接触パラメーター（例えば、開始時間、持続時間、頻度、程度）を測定することは、細胞挙動がどのように目的のその後の事象、特にエフェクターによる標的の殺滅を予測するかの理解に必要である。細胞セグメンテーションの空間的な近接を使用するアプローチは、かなり高い解像度の画像化を必要とし、セグメンテーション誤差に対して高感度であるため、それらはＴＩＭＩＮＧデータにとって信頼できないものである。これを念頭に置き、出願人は、細胞とその周囲の細胞との相互作用を定量するために、柔らかい細胞の相互作用の尺度ＣＩを以下のように定義する。
[00206]まず、出願人は、各ナノウェルｊで正規化したエフェクター蛍光シグナル
Figure 0006855382
を計算する。次に、出願人は、図８で例示されるように、セグメント化された標的細胞に対するユークリッド距離マップＤ（ｘ，ｙ）を使用して一連のリング様の区画を定義する。ｋおよびｋ＋１画素の間の距離を有する画素は、内部半径ｋ＝｛１，２，・・・，ｎ｝を有する区画ｂｋを形成し、ここでｎは、全ナノウェルをカバーするのに必要な最大距離である。出願人は、各区画にわたる蛍光強度を合計し、区画面積に比例するそれらの半径ｋによってそれらを正規化する。これにより、細胞の相互作用の尺度ＣＩ（ｔ）は、方程式７において、以下の重み付けされた強度の合計である。
Figure 0006855382
[00207]図８は、どのようにＣＩ（ｔ）が画像シーケンスにわたり段階的な方式で細胞接触を捕獲するかを示す。この尺度を二値化して、望ましい感度で細胞接触事象を検出することができる。閾値は、免疫学者によって、デフォルト値（ｔｙｐ．０．０１）から開始して各ＴＩＭＩＮＧのデータセットにつき少なくとも３０個のナノウェルの視覚検証に基づき手作業で設定され検証される。出願人は、この視覚検証を有用な適正評価とみなす。１５６個のナノウェルビデオにわたる５人の独立したオブザーバーによる接触の十分な手作業によるアノテーションから、デフォルトの閾値と９０．４％の一致が示された。接触を明確に割り当てるために、２つの連続したフレームで閾値の基準が満たされる場合に起こることが定義される。ＣＩ（ｔ）は、単一細胞とその近傍に関して上記で定義されている。ＣＩ（ｔ）は、セグメンテーションマスクを使用することによって複数の細胞を取り扱うために延長することができる。
[00208]実施例１．７．フィーチャの計算結果
[00209]各細胞につき、自動化セグメンテーションおよび追跡操作は、細胞の配置（ｘ，ｙ）、面積ａ（ｔ）、瞬時速度ｖ（ｔ）、最適楕円の離心率によって測定された場合の細胞の形状ｅ（ｔ）、および接触の尺度ＣＩ（ｔ）を包含する一次フィーチャの複数の時系列をもたらす。加えて、アネキシンＶを使用して標的細胞死事象（アポトーシス）を検出し、それを合計した蛍光強度ｉｄ（ｔ）を別の一次フィーチャとして測定する。次に、出願人は、各ナノウェルのスケールでの細胞のフィーチャ、具体的には、エフェクター細胞の数ｎｅ、標的細胞ｎｔ、死んだエフェクターｎｅｄ、接触した標的ｎｔｃ、および殺滅された標的ｎｔｋを計算する。これらの測定は、ナノウェルをプロファイリングするのに使用することができる。
[00210]初代細胞のフィーチャは、各ナノウェル内の細胞活性の重要な形態を捕獲するが、それらは２つの不利益を有する。第１に、それらは、ＴＩＭＩＮＧ実験全体でタイムポイントの数が変化するために可変次元を有することである。第２に、長い実験は、不必要に高次元のフィーチャデータを生じる可能性があることである。タイムポイントの数から独立した、有意義なより低次元の細胞事象の表示を導く意図で、出願人は、各細胞につき８つの二次フィーチャのセットを導く。
各細胞につき、出願人は、下記を計算する。
Figure 0006855382
[00211]実施例１．８．実験結果
[00212]提唱された方法を、標的細胞（ＮＡＬＭ６、Ｋ５６２、およびＥＬ４）およびエフェクター細胞（ＮＫ細胞またはＣＡＲ＋Ｔ細胞）の組合せを含む１２回のＴＩＭＩＮＧ実験で評価して、生物学的な変動および画像化の変動、異なる細胞型、実験の持続時間、ならびに機器の変化に対処するその能力を評価した。全てのデータセットを、表４に要約したパラメーター設定を使用して分析した。
Figure 0006855382
[00213]莫大な量のデータを仮定して、出願人は、図９におけるサンプルセグメンテーションおよび追跡結果の視覚的な要約を提示することから開始する。総合して、アルゴリズムおよびパラメーター設定が、自動化された分析にとって信頼できるものであることが証明された。詳細な例として、出願人は、１３０タイムポイントにわたり画像化されたＣＡＲ＋Ｔ細胞およびＮＡＬＭ６細胞を含有する２，０００個のナノウェルを有する小さいデータセットで、セグメンテーションおよび追跡を手作業で検証した結果を提示する。これらのなかでも、１５７個のナノウェルは、４を超えるエフェクターまたは標的を有していた。これらのより大きいコホートは、目的の現在の生物学的研究にとって関連性がないため、それらはさらなる分析から省略した。追加の３３ウェル（１．７％）は、細胞数における信頼性（ヒストグラムピーク）が７５％未満であったため、それらを廃棄した。残りの１，８０３個のナノウェルのうち、気泡のために正確に検出されなかったのは７個のみであったため、出願人の全体的なナノウェル検出の正確性は９９％を超えた。
[00214]実施例１．９．収量における改善
[00215]細胞検出誤差がゼロのウェルの画分を査定するために、出願人は、１，８０３個の残りのナノウェルにわたる結果を、提唱された方法および基準として従来のアルゴリズムを使用して手作業で検証した。表２に結果を要約する。
[00216]９０より多くのウェルを含む表の項目に関して、出願人は、ウェルの４０％を手作業で検証し、残りの項目に関してウェルの全セットを検証した。表１および２において対応する項目を比較したところ、提唱された方法は使用に適したウェルの数を劇的に増加させたことが示される。わずかな誤差は、見失われた持続的に目立たない蛍光細胞によるものか、または記録の持続時間８０％より長い間、細胞が持続的に別の細胞によって遮られたためであった。総合的にみれば、９０％未満の収率は、使用者が過剰な数のナノウェルを手作業で分析しなければならなくなるため、自動化画像分析結果を使用に適さないものにする。９８％に近い収量であれば、使用者は単に、自動化された結果とそれらが必然的に伴う適度の誤差を受け入れるだけでよい。
[00217]実施例１．１０．細胞セグメンテーションおよび追跡の性能
[00218]このデータセットにおいて、ほぼ５，０６１個の細胞をセグメント化して追跡した。自動化セグメンテーションおよび追跡の結果をムービー上に重ね、免疫学者に提示し、誤差を、アンダーセグメンテーション；オーバーセグメンテーション；および不正確な関連付けのようにスコア付けした。オーバーセグメンテーションの誤差は、細胞が２またはそれより多くの対象物として同定される場合に出現する。アンダーセグメンテーションは、複数の細胞に同じ標識が割り当てられる場合に生じる。これらの誤差の両方は、細胞数が不正確である場合に起こる可能性がある。不正確な対応は、通常セグメンテーションの誤差によって追跡が失敗した場合に起こる。
[00219]出願人は、単一の関連付けの誤差を、ナノウェルのムービーの追跡結果を使用に不適にするのに十分とみなす。この厳密な要件と大量のデータにもかかわらず、アルゴリズムは極めて正確である（表３）。
Figure 0006855382
[00220]次に、出願人は、３０個の無作為に選択された標的およびエフェクター細胞の自動的なセグメンテーションを、手作業のセグメンテーションと比較した。標的細胞に関するジャカールの相似指数は、エフェクター細胞に対して０．８６±０．１２（平均±標準偏差）および０．７８±０．１７であったことから、優れたセグメンテーションの正確性が示された。
[00221]実施例１．１１．データ分析
[00222]出願人がインビトロで８時間にわたり６分のインターバルで拡大したＮＫ細胞によってＫ５６２細胞の殺滅の動力学を画像化した１１，５２０個のナノウェル（６×６個のウェルの３２０個のブロック）を含有するＴＩＭＩＮＧのデータセットを、出願人が分析した。自動的に抽出されたフィーチャから、出願人は、少なくとも６分の安定なエフェクター−標的の接触（２つの連続したフレーム）と、標的の死のケースでは死の前のエフェクターによる接触とを示す、正確に１つのエフェクターと１つの標的細胞を含有するナノウェルのみを選択した。それにより、多重的なエフェクターの共同作用または連続殺滅に関連する混乱を起こさずに、エフェクターの動的な挙動を分析するのに理想的な、５５２個のナノウェルのコホートが得られた。
[00223]腫瘍細胞とコンジュゲートしている間における接触なしの運動性および速さの比較から、殺滅に参加するＮＫ細胞は、両方の期間中より高い運動性を表したことが実証され（図１０Ａ）、これは、運動性は活性化された免疫細胞のバイオマーカーであり得ることを実証した出願人の近年の報告と一致する（実施例２を参照）。さらに、ＮＫ細胞の場合、標的細胞とライゲートしているときの速度および停止の変化が、十分に立証されている。
[00224]第２に、出願人は、生細胞または死細胞との相互作用におけるＮＫ細胞挙動の差を定量することに関心を持った。殺滅に参加する全てのＮＫ細胞のうち、１８％のみが再びコンジュゲートし、続いてアポトーシスを起こし、それらが行われたとき、それらのコンジュゲーションの持続時間である１８±１４分は、同じＮＫ細胞が媒介する生きた腫瘍細胞へのコンジュゲーション（５２±７２分）より有意に短かった（図１０Ｂ）。これらの結果から、ＮＫ細胞の大部分が死んだ標的細胞へのコンジュゲーションを回避して、それらが行われたとしても、コンジュゲーションを終わらせる早期の決定がなされることが示唆される。
[00225]実施例１．１２．実行
[00226]３６ウェルおよび６０個の細胞を含むブロックの場合、処理時間は、４０ＣＰＵコア、１ＴＢのＲＡＭ、およびＲＡＩＤ５ストレージシステムを有するデル９１０パワーエッジ（Dell 910 PowerEdge）サーバーで、１タイムポイント当たり９〜１０秒／ブロックである。細胞の追跡は、１．１秒／ブロックを要した。セグメンテーションは、３．１秒／ブロックを要した。ウェル検出は、１．５秒／ブロックを要した。フィーチャの計算結果は、３．５秒／ブロックを要した。コンパイルされた実行可能なＭＡＴＬＡＢを使用したスペクトラルクラスタリングを除いて、ＰｙｔｈｏｎおよびＣ＋＋でアルゴリズムを実行した。
[00227]実施例１．１３．結論
[00228]ナノウェルアレイと出願人の自動化された閉じ込めにより拘束された画像分析方法とからなる組み合わされたＴＩＭＩＮＧシステムは、手作業で可能なものよりはるかに多くの包括的な細胞事象のサンプリングを可能にする。提唱されたアルゴリズムは、自動化された分析の収量および正確性を、自動的に生成された細胞の測定値を編集をほとんどせずに生物学的研究に直接利用できるレベルに劇的に改善した。ほとんどのセグメンテーションおよび／または追跡の誤差（大部分が延長された持続時間にわたる持続的に低い蛍光または閉塞に起因する）は、信頼性の測定基準に基づき検出することができ、対応するナノウェルは、無視されるかまたは編集されるかのいずれかであり得る。出願人の方法は、マルチテラバイトのＴＩＭＩＮＧのデータセットに拡張でき、精巧な初期化または慎重なパラメーターのチューニングを必要としない。
[00229]実施例２．動的なＴ細胞挙動の統合された単一細胞の機能性および分子のプロファイリング
[00230]この実施例において、出願人は、タンパク質分泌を検出するためのマイクロビーズ分子バイオセンサーに基づく応答、細胞の運動性および細胞間相互作用をモニタリングするための自動化された微速度撮影の顕微鏡法、ならびに高度に多重化された転写プロファイリングのためのマイクロ流体定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を統合する、拡張可能な単一細胞の手法の開発および検証を実証する。３，１２２個の腫瘍標的細胞と相互作用する１，１７８個の単一の腫瘍反応性Ｔ細胞の５時間にわたる分析から、標的の殺滅およびＩＦＮ−γ分泌の両方を有する多機能性Ｔ細胞の統合された挙動は、ＩＦＮ−γ分泌のないシリアルキラーの挙動と類似していたことが解明された。これから、細胞崩壊が、相互作用の挙動の優勢な決定要素であったこと、および殺滅が、より速いシナプスの終結を可能にすることが示唆された。
[00231]特定には、出願人は、単一Ｔ細胞からのサイトカイン分泌を検出するためのマイクロビーズベースの分子センサーと、同時に、封入を必要とすることのないＴ細胞の運動性および細胞傷害性をモニタリングするためのナノウェルのグリッド（ＴＩＭＩＮＧ）における微速度撮影での画像化とを組み合わせる統合された手法を検証した。ＴＩＭＩＮＧを使用して、単一細胞レベルでの機能性および分子のスクリーニングを、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞上の多重化された転写プロファイリング（９６種の遺伝子）を実行することと組み合わせた。個々の腫瘍特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞と複数の標的細胞との相互作用を同時に定量化したところ、ＩＦＮ−γが、惹起された最も一般的な機能であったことが実証された。しかしながら、殺滅能力、特に連続殺滅能力を有するＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γを分泌する単機能性の細胞と比較してより短い標的細胞のコンジュゲーションの持続時間を必要としたが、これは、サイトカイン分泌に対して殺滅が可能なＴ細胞による急速なシナプス終結を示す。殺滅とＩＦＮ−γ分泌の両方を示す多機能性Ｔ細胞の挙動の相互作用は、ＩＦＮ−γ分泌のないシリアルキラーの相互作用と類似していたが、これは、殺滅が相互作用の挙動の優勢な決定要素であったことを示唆している。
[00232]縦方向の微速度撮影で画像化することによってこれらの細胞の速さを追跡することから、これらのシリアルキラーＴ細胞（ＩＦＮ−γ分泌ありまたはなし）は、それらのより高い接触なしの基底の運動性に基づき同定され得ることが解明された。それらの基底の運動性によってのみ同定されたＴ細胞の単一細胞の多重化された転写プロファイリングから、運動性細胞は、活性化された表現型を発現し、パーフォリンおよび走化性に関連する他の遺伝子の量が有意に増加したことが確認された。
[00233]理論に縛られることはないが、出願人は、これらの結果に基づき、機能的なＣＤ８＋Ｔ細胞挙動の統合されたモデルを提唱する。さらに、これらの結果は、単一細胞レベルで多重化された機能性および分子のスクリーニングを組み合わせるための治験ツールとして出願人の手法を確立し、運動性は、免疫療法に関して潜在的重要性があるキラーの表現型を有するＴ細胞を同定するための代用バイオマーカーであり得ることを示唆するものである。
[00234]実施例２．１．タンパク質分泌および動的な細胞間相互作用の同時のプロファイリングのための統合されたプラットフォームの設計
[00235]この実施例において、出願人は、Ｔ細胞の多機能性の性質：サイトカイン分泌、標的細胞との相互作用の動力学、細胞傷害性、および分子のプロファイリングを決定することにおいて独立したモジュールを追加または除去する能力を有する統合された方法を設計した（図１１）。出願人が近年報告したＴＩＭＩＮＧアッセイ（実施例１）を手始めに、出願人は、サイトカイン分泌をプロファイリングするための個々のナノウェル内の局在的な微環境のバイオセンサーとしての機能化したビーズ（図１２Ａ）、および遺伝子発現プロファイリングを容易にするためのマイクロ流体ｑＰＣＲを実行した。したがってこの統合されたアプローチを使用して、１つの統一された顕微鏡プラットフォームで細胞傷害性と同時にサイトカイン分泌をプロファイリングすることが可能になった。
[00236]実施例２．２．ナノウェルアレイ内の機能化したマイクロビーズによって列挙されたＩＦＮγを分泌するＴ細胞の頻度は、ＥＬＩＳｐｏｔを使用して決定された同じ応答に相関する
[00237]出願人はまず、分析物の異なる濃度で機能化したビーズの検出限界（ＬｏＤ）を測定することによって、個々のナノウェル中でのインキュベーション後に単一細胞によって分泌されたタンパク質を効率的に捕獲する機能化したマイクロビーズの能力を試験した。簡単に言えば、抗体でコーティングしたビーズを、３７℃で２時間にわたり様々な濃度のＩＦＮ−γ（０〜５０００ｐｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、ナノウェルアレイ上にローディングし、続いて蛍光標識した二次抗体を用いて検出した。最低限３０個のビーズにわたり定量されたバックグラウンド補正した平均蛍光強度（ＭＦＩ）から、ＩＦＮ−γは５００ｐｇ／ｍＬの濃度で検出可能であることが確認された（図１２Ｂ）。
[00238]次に、活性化時にＩＦＮ−γを分泌する単一Ｔ細胞の頻度を定量するためのナノウェル封入ビーズアッセイとＥＬＩＳｐｏｔとの相関を決定した。刺激の変動とＴ細胞集団の多様性を考慮して、ＩＦＮ−γを分泌する単一Ｔ細胞の頻度を、以下の３セットの条件：共通のウイルス抗原を標的化するＨＬＡクラスＩペプチドプールでの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激；ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシンでのＰＢＭＣの刺激；およびＰＭＡ／イオノマイシンでのインビトロで拡大した黒色腫特異的ＴＩＬの刺激の下に列挙した。３〜５時間にわたり細胞１０６個のアリコートを刺激し、細胞約１００，０００個のアリコートをナノウェルアレイ上にローディングした（８４，６７２個のナノウェル、それぞれ１２５ｐＬ）。それに続いて抗ＩＦＮ−γで予めコーティングした２００，０００個のビーズの懸濁液をナノウェルアレイ上にローディングし、３７℃で２時間にわたりインキュベートした。ナノウェル内の１個またはそれより多くのビーズにマッチングされた平均１０，１８２±８，５８９（平均±ｓ．ｄ．）個の単一細胞を分析することによって、活性化されたＴ細胞のＩＦＮ−γ応答の頻度は、０．４０〜７．８％であることが決定された。これらの応答の規模は、ＥＬＩＳｐｏｔによって記録された規模［０．２０〜１１．２％］に類似しており、両方のアッセイの結果は有意に相関していたことから（ｒ２＝０．８７、ｐ値＝０．０００８）、ビーズは、単一細胞からサイトカイン分泌を捕獲するのに効率的に利用できることが実証された（図１２Ｃ）。刺激の非存在下で、Ｔ細胞と共にインキュベートした場合に検出されたＩＦＮ−γビーズの頻度は１０，０００個のうち＜１であったことから、本発明者らのアッセイの検出限界を０．０１％に設定した。
[00239]実施例２．３．オープンウェルシステムにおいて、ビーズ上の分析物の部分占有率は、分析物を捕獲するのに使用される抗体の密度が減少するにつれて増加する
[00240]封入システムとは対照的に、オープンウェルの立体配置は、ガスおよび栄養素の連続的な交換を可能にすることから、細胞運命および機能の長期のモニタリングにとって有利であり得る。さらに、それらは、クローズドシステムで一般的に見出される分析物の人工的に高い局在的な濃度が原因の可能性がある細胞挙動の起こり得る変更を回避する。
[00241]オープンウェルシステムの不利益は、ナノウェル内の個々の細胞によって分泌された分析物が、バルクの媒体への持続的な拡散に晒され、感受性を低くする可能性があることである。それゆえに、出願人は、有限要素シミュレーションを使用して簡易化したオープンウェルシステムをモデル化することによってビーズ上への分析物の捕獲効率の定量を試みた（図１３Ａ）。液状媒体中の分析物の濃度（Ｃ）は、方程式８で例示されるようなフィックの第二法則を使用して説明することができる。
Figure 0006855382
[00242]方程式８において、Ｄは、分析物の拡散係数を表す。ＰＤＭＳの壁は大部分がタンパク質不浸透性と仮定することができるため、これらの境界における流動をゼロに設定した。一定速度の細胞からの分析物分泌下で（分子１０個／秒）、ビーズ表面上における分析物濃度の質量のバランス（Ｃｓ）を、方程式９によって決定した。
Figure 0006855382
[00243]方程式９において、Ｄｓは、ビーズ表面上における分析物の拡散率を表し、ｋｏｎおよびｋｏｆｆは、捕獲抗体−分析物の相互作用の強度によって決定された反応速度論の結合定数を表し、θ０は、ビーズの単位表面積当たりの利用可能な捕獲抗体の数を表す。パラメーター値の選択（図１３Ａ）は、商業的に入手可能な抗体結合親和性、公知のＴ細胞からのサイトカイン分泌速度、およびこれまでに報告されたクローズドシステムの数値シミュレーションに基づいてなされた。液状媒体およびビーズ表面おける分析物の初期濃度をゼロに設定し、細胞が分析物を分泌するときの経時的なビーズの部分占有率
Figure 0006855382
の増加をモデル化した。
[00244]これまでに公開されたデータを用いてモデルを検証するとき、出願人は、２つの主要なチューニング可能な変数、ビーズのサイズ、および捕獲抗体の表面密度の最適化を試み、部分占有率（それゆえに蛍光性の画素強度）を最大化した。シミュレーションから、全ての３つのビーズサイズの部分占有率は時間の関数として直線的に増加したこと（１〜６時間）、インキュベーション時間に関係なく、３μｍのビーズが、５μｍおよび７μｍビーズと比較して１．８倍および２．７倍高い部分占有率を有していたこと（図１３Ｂ）が実証された。
[00245]ビーズ直径が一定に保持されたが（３μｍ）、結合部位密度が３桁にわたり変更された場合、結合部位密度が最も低い（１０−９ｍｏｌ／ｍ２）ビーズは、最大の部分占有率を有した（図１３Ｃ）。これらの結果から、部分占有率の増加は、ビーズサイズまたは結合部位密度のどちらかの減少によって結合部位の総数が減少する場合に観察されることが示され、これは、分析物捕獲に使用される抗体の数を少なくすることによってより高い感受性が達成できることを予測する周囲の分析物理論と一致する。
[00246]さらに、低い部分占有率（脱着を無視する）におけるナノモル濃度の結合剤の場合、シミュレーションから、分析物捕獲の速度論は拡散によって限定されることが予測され（図１３Ａ）、これは、抗体のマイクロスポット、クローズドウェルシステム、および２区画の数学モデルに関する以前の研究に一致する。しかしながら、注目すべきことに、マイクロスポットアッセイとは異なり、本発明のシステムは、ビーズ表面上への捕獲による分析物の枯渇が、利用可能な総分析物と比較して無視できない程度であるため、周囲の分析物の条件に従わない。
[00247]実施例２．４．ＴＩＭＩＮＧを使用した腫瘍特異的ＣＤ８ ＋ ＣＡＲ ＋ Ｔ細胞における細胞傷害性とＩＦＮ−γ分泌との同時の定量化
[00248]エンドポイント実験から、活性化時に単一Ｔ細胞からＩＦＮ−γを検出するする能力が確認され、モデル化から、ビーズはオープンウェルシステムで十分機能すると予想されることが示唆されたことから、単一細胞の解像で、あらゆる分泌されたＩＦＮ−γタンパク質も捕獲しながらエフェクターと標的の相互作用の測定を可能にするために、出願人は、ビーズをＴＩＭＩＮＧのワークフローに統合した。
[00249]出願人は、サイトカイン分泌および細胞傷害性に関して腫瘍特異的な個々のＣＤ８＋Ｔ細胞の多機能性を照合することを選んだ。キメラＣＤ３およびＣＤ２８エンドドメインを介してＴ細胞を活性化する第２世代ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９ＲＣＤ２８と名付けられた）を発現させるために健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から遺伝子改変して増殖させたＴ細胞を生成した（図１４）。４週間にわたり細胞（ＡａＰＣ）を活性化および増殖させて数的に拡大した後、ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、優勢にはＣＤ８＋であった（＞９９％、図１５Ａ）。ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の表現型の特徴付けから、Ｔ細胞の優勢なサブセットはナイーブ様（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、６０．７％、図１５Ｂ）であったことが実証された。ＣＤ１９抗原を提示する細胞との相互作用時にＩＦＮ−γを特異的に分泌するこれらのＴ細胞の能力は、ＮＡＬＭ−６腫瘍細胞（ＣＤ１９陽性）およびＥＬ４細胞（ＣＤ１９陰性、図１５Ｃ）の両方と共にインキュベートすることによって確認された。
[00250]ナノウェルのグリッドアレイ上に、エフェクターとしてのＣＡＲ＋Ｔ細胞、標的としてのＮＡＬＭ−６腫瘍細胞、およびサイトカインセンサーとしてのＩＦＮ−γ捕獲抗体でコーティングした事前に機能化したビーズを逐次的にローディングした。アネキシンＶ染色を使用してエフェクターによって媒介される腫瘍の溶解を検出し、個々のナノウェルごとに（１４，４００ウェル、それぞれ６４ｐＬ）を５時間にわたりプロファイリングし（図１６Ａ）、ビーズ上におけるイムノサンドイッチの形成によってサイトカイン分泌を定量化した（図１６Ｂ）。
[00251]出願人は、細胞の自動化セグメンテーションおよび追跡を可能にすることに加えて、そこでＩＦＮ−γの分泌を報告するためにビーズ上における蛍光強度の同定を容易にするように、これまでに報告された画像分析アルゴリズムを改変した。単純な直径ベースのゲーティングの後、出願人は、単一Ｔ細胞、２〜５個の腫瘍細胞、および１個またはそれより多くのビーズを含有する目的の１，１７８ウェルを同定した。複数の殺滅事象に参加する個々のＴ細胞の観察を可能にするために、複数の腫瘍細胞を含有するナノウェルが特定的に選ばれた。このサブセット内で、全てのＴ細胞が複数の腫瘍細胞と共にインキュベートされたため、３つの別々の機能的な定義：少なくとも２つの腫瘍細胞を殺滅するシリアルキラー細胞、厳密には１つの腫瘍細胞を殺滅するモノキラー細胞、およびＩＦＮ−γを分泌する細胞を採用した。
[00252]１つまたはそれより多くの腫瘍細胞へのコンジュゲーションの後、ＩＦＮ−γ分泌が、単一Ｔ細胞で記録された最も一般的に観察された機能であった（６４．２％、図１７Ａ）。複数の腫瘍細胞を殺滅するＣＡＲ＋Ｔ細胞（４４．１％）、または少なくとも１つの腫瘍細胞を殺滅でき、同時にＩＦＮ−γを分泌する細胞のいずれかと定義された多機能性細胞のほうが、わずかに低かった（５３．６％、図１７Ａ）。複数殺滅およびＩＦＮ−γ分泌の両方が可能な細胞のサブセットは、集団の３０％を構成していた。
[00253]実施例２．５．キラーＣＡＲ ＋ Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γを分泌する細胞と比較して、標的細胞からより速く脱離する
[00254]ＴＩＭＩＮＧアッセイは、上述したように、コンジュゲート形成と機能的リードアウトの両方をモニタリングする能力を有すること、およびＣＤ８＋Ｔ細胞は均一に高親和性の免疫受容体を発現したことから、出願人は、機能的リードアウトの前にコンジュゲーションの総持続時間を分析することによって活性化に関する閾値を定量化した。ＩＦＮ−γ（一機能性）を分泌しただけのＴ細胞は、全ての機能的なＴ細胞のなかでも最長のコンジュゲーション持続時間（１５９±８分）を示した。この持続時間は、ＩＦＮ−γ分泌あり（９４±５分）もしくはなし（８９±６分）で１つのみの腫瘍細胞を殺滅する細胞、またはＩＦＮ−γあり（７４±２分）もしくはなし（７９±４分）で複数の腫瘍細胞を殺滅する細胞のいずれかより有意に長かった（図１７Ｂ）。
[00255]これらの結果から、殺滅を引き起こすＴ細胞と腫瘍細胞とのコンジュゲーションの持続時間は、ＩＦＮ−γ（単機能）と比較して機能的な活性化に関してより低い閾値を有することが示唆される。それに続く殺滅を引き起こす個々のＴ細胞と腫瘍細胞との相互作用の速度論を定義するために、２つの相互作用パラメーター、ｔＣｏｎｔａｃｔ、第１の接触から標的の死までのコンジュゲーションの累積的な持続時間；およびｔＤｅａｔｈ、第１の接触から標的のアポトーシスまでの時間をコンピューターで計算した（図１８）。ｔＣｏｎｔａｃｔパラメーターは、安定なコンジュゲーションの持続時間を反映し、ｔＤｅａｔｈは、標的のアポトーシスの速度論を反映する。
[00256]モノキラーおよびシリアルキラーの両方について、ｔＣｏｎｔａｃｔは、ｔＤｅａｔｈより有意に低かったことから、Ｔ細胞の脱離が腫瘍細胞のアネキシンＶ染色より前に起こることが実証される（図１９）。第２に、全てのキラーＴ細胞のコンジュゲーションの総持続時間（８１±２分）は、非キラーＴ細胞（１５４±６分）より低かった（ｐ値＜０．０００１、図１９Ｂ）。
[00257]上述の結果から、単一細胞レベルでは、単一Ｔ細胞がシナプスを終結させる正確な時間と標的細胞のアポトーシスの時間との関係はヘテロジニアスであることが示唆される。概して、キラーＴ細胞は、殺滅開始時に、ただし腫瘍細胞におけるアポトーシスマーカー出現の前にシナプスを終結させた。
[00258]ＩＦＮ−γ分泌ありまたはなしのシリアルキラーＣＡＲ＋Ｔ細胞を比較したところｔＣｏｎｔａｃｔにおいて有意差は観察されなかったことから（図１７Ｃ）、コンジュゲーションの持続時間を決定することにおいて、殺滅は優勢な挙動であることが示唆される。ＩＦＮ−γ分泌あり（３５３／１１７８＝３０％）またはＩＦＮγ分泌なし（１６６／１１７８＝１４％）のいずれかの個々のシリアルキラーＴ細胞の頻度は、ＩＦＮ−γのみを分泌したＴ細胞と有意に異なっていなかったことから（１４７／１１７８＝１２％）（フィッシャーの２×２検定、ｐ値＝０．２）、コンジュゲーションの持続時間がより短くても、なおサイトカイン分泌にとって十分な活性化が提供されることが確認される。
[00259]次に、出願人は、ｔＣｏｎｔａｃｔおよびｔＤｅａｔｈによって測定された付随するＩＦＮ−γ分泌ありおよびなしのモノキラーおよびシリアルキラーを比較した。直接比較を容易にするために、シリアルキラーＴ細胞によって殺滅された標的のそれぞれを、それらがエフェクター細胞と接触する順番に基づいてソートした。ＩＦＮ−γ分泌の非存在下で、シリアルキラーエフェクター細胞は、遭遇した第１の標的の殺滅においてｔＣｏｎｔａｃｔ（６９±５分）またはｔＤｅａｔｈ（９４±６分）のいずれかにおいて、モノキラーと比較して（ｔＣｏｎｔａｃｔ：８９±６分、ｔＤｅａｔｈ：１１７±７分、図１７Ｃ〜Ｄ）有意差がないことが示された。
[00260]対照的に、ＩＦＮ−γも分泌するシリアルキラーエフェクター細胞は、ＩＦＮ−γを分泌するモノキラーと比較して（ｔＣｏｎｔａｃｔ：９４±５分、ｔＤｅａｔｈ：１２１±５分）、コンジュゲーションの持続時間の減少（ｔＣｏｎｔａｃｔ：６８±３分）および遭遇した第１の標的の殺滅における殺滅効率の増加（ｔＤｅａｔｈ：９３±４分）を示した。この差は、シリアルキラーによって殺滅されたそれに続く標的がｔＣｏｎｔａｃｔまたはｔＤｅａｔｈのいずれかにおける有意差を示さなかったことから（図１７Ｃ〜Ｄ）、第１の標的の場合にのみ観察された。まとめると、これらの結果から、連続殺滅とＩＦＮ−γ分泌の両方に参加できる多機能性Ｔ細胞は、機能的な応答前の活性化の継続期間に関してより低い閾値を有することが示された。
[00261]実施例２．６．標的細胞と接触していないときの基底の運動性は、シリアルキラー多機能性ＣＡＲ ＋ Ｔ細胞を同定するのに使用することができる
[00262]次に、出願人は、腫瘍細胞のコンジュゲーション前の基底の運動性（ｄＷｅｌｌ：５分にわたるナノウェル内における平均の転移）のような固有のＴ細胞の挙動パラメーターが、腫瘍細胞のコンジュゲーション後のそれらの機能的な能力についての識見を提供し得るのかどうかを調査した。腫瘍細胞のコンジュゲーション時にどのような機能性（死滅／ＩＦＮ−γ分泌）も表すことができなかった個々のＣＡＲ＋Ｔ細胞は、プロファイリングされたＴ細胞サブグループのなかでも最も低い接触なしの運動性（ｄＷｅｌｌ：１．３±０．１μｍ）も示した（図１７Ｅ）。
[00263]対照的に、複数の腫瘍細胞を殺滅でき、ＩＦＮ−γを分泌するエフェクター細胞は、殺滅なしでＩＦＮ−γのみを分泌した細胞（ｄＷｅｌｌ：１．６±０．１μｍ）および上述の非機能的Ｔ細胞（それぞれｐ値＝０．０４３および０．００２）と比較して、より有意に高い接触なしの運動性（ｄＷｅｌｌ：２．２±０．１μｍ）を示した（図１７Ｅ）。
[00264]このより高い運動性の観察はまた、ＩＦＮ−γのみを分泌したエフェクター細胞または非機能的細胞（それぞれｐ値＝０．００７および０．０００２）と比較して、ＩＦＮ−γを分泌しないシリアルキラーエフェクター細胞（ｄＷｅｌｌ：２．４±０．２μｍ）でも記録された。しかしながら、意外なことに、これらの観察は、１つの腫瘍細胞を殺滅することのみ可能なエフェクター細胞に当てはまらなかった。これは、それらの平均転移が、殺滅しない細胞と比較してそれほど有意に高くなかったためであり、シリアルキラーはおそらく、局在的な微環境内で素早い標的の発見を可能にする高い運動性によって利益を得る可能性があることを示唆している。これらの観察は接触なしの運動性にのみ当てはまっており、当然のことながら、惹起された機能に関係なく、全ての機能的なエフェクター細胞は、腫瘍細胞とのコンジュゲーション中の運動性における差を示さなかった（図２０）。
[00265]実施例２．７．運動性ＣＡＲ ＋ Ｔ細胞の転写プロファイリングは活性化された表現型を解明する
[00266]ＴＩＭＩＮＧの結果から、基底の運動性は多機能性キラー細胞の同定を可能にすることが表示されたため、出願人は次に、運動性ＣＤ８＋Ｔ細胞の基礎となる分子プロファイルを定義することを試みた。したがって、Ｔ細胞の機能に関連する９０種の遺伝子のセットを同定し、多重化された単一細胞のＲＴ−ｑＰＣＲを実行した（図２１）。これらのＣＤ８＋Ｔ細胞の基底の運動性を研究するために、ＴＩＭＩＮＧ実験を、腫瘍細胞の影響を受けない個々の生きたＴ細胞を追跡するように組み立てた。それらの運動性プロファイル：「運動性または高い運動性」（ｄＷｅｌｌ：２．６±０．８μｍ、ｎ＝４１）または「非運動性または低い運動性」（ｄＷｅｌｌ：０．８±０．４μｍｎ＝４３）に基づいて単一細胞をピックアップして、それらの転写プロファイルを決定した（図６Ａおよび２３）。マイクロ流体ｑＰＣＲとろ過の後、運動性および非運動性グループ間の６２種の遺伝子のｔ検定比較から、１５種の遺伝子が、有意に変更された発現レベル（ｐ＜０．０５）および１．５より大きい変化倍数を有していたことが示され、ＣＤ２４４、ＣＤ５８、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８６（活性化マーカー）；ＣＣＲ１、ＣＸＣＲ３、１Ｌ１８Ｒ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ４Ｒ（ケモカインおよびサイトカイン受容体）、およびＧＡＴＡ３（転写因子）は上方調節されたが、一方でＣＸ３ＣＲ１、ＣＣＲ４（ケモカイン受容体）；ＣＤ６９（活性化マーカー）、およびＩＲＦ４（転写因子）は下方調節された（図２２Ｂ）。これらの１５種の遺伝子の遺伝子および細胞に正規化したデータを用いて教師なし階層的クラスター分析を実行し、サンプルのクラスタリングにより、公知のカテゴリー（運動性対非運動性）に従って８３％の正確性で分類を達成した（図２２Ｃ）。
[00267]出願人が運動性に特異的なフィーチャであるｄＷｅｌｌおよびアスペクト比（ＡＲ、短軸／長軸の比率）を用いて凝集クラスタリングを遺伝子に沿って繰り返したところ、クラスターのツリー構造は概ね変わらず、ｄＷｅｌｌはＣＤ２４４およびＩＬ２ＲＢの発現を用いて厳密にクラスタリングされ、一方でＡＲはＩＲＦ４と高度な相関を示した（図２４）。転写プロファイルをスチューデントのｔ検定および階層的クラスター分析と比較することにより、出願人は運動性および非運動性グループ間の差を推論することが可能になったが、出願人は、この細胞集団の不均質性が、細胞ごとの遺伝子発現における段階的な変化を特徴とする細胞の進行としても説明できると仮説を立てた。基礎的なセットとして、１５種の差次的に発現される遺伝子および２つの運動性パラメーター、ｄＷｅｌｌおよびＡＲのセットを、進行を支持すると考えられる１０種の遺伝子を同定した部分空間の傾向発見ツールであるＳＴｒｅｎＤのために使用した（図２２Ｄ）。選択された遺伝子およびフィーチャを用いて、ＳＴｒｅｎＤは、入力フィーチャによって同定された細胞の進行を表すツリー構造を出力する（図２２Ｅ）。
[00268]ＴｒｅｅＶｉｓを使用してツリーを可視化して着色することによって、出願人は、ツリーの中心から右側に一緒にクラスタリングされた非運動性細胞を明確に同定することができ、同時に運動性細胞をこのプールから２つの分枝に分裂させ、ここで分枝の１つは、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ１８Ｒ１、ＣＤ５８、ＬＡＧ３およびＧＡＴＡ３の高い発現（図２２Ｅ、左上の分枝）を示し、もう一方は、これらの低い発現とＩＲＦ４の極めて低い発現とを示すが、それでもなお高い運動性および高いＣＤ２４４発現を示す（図２２Ｅ、左下の分枝）。
[00269]ここで概説された観察と一致して、ジーンマニア（GeneMania）を使用したネットワーク分析から、同定された転写物と関連する主要な経路が、陽性Ｔ細胞の活性化およびリンパ球の移動に関係していたことが確認された（図２２Ｆ）。結論として、ＣＤ８＋Ｔ細胞が媒介する即時の細胞傷害性の主要なメカニズムの１つは、グランザイムＢ／パーフォリン経路を介しており、出願人のＴＩＭＩＮＧの結果から、多機能性シリアルキラーであるＣＤ８＋Ｔ細胞はより高い基底の運動性を有していたことが示されたことから、出願人は、運動性および非運動性細胞中におけるこれらの特異的な転写物の発現における差を定量化した。ＧＺＭＢは有意な差次的発現がなされないにもかかわらず、運動性細胞において、ＰＲＦ１転写物がより有意に高いレベルで検出された（ｐ値＝０．０３、図２５）。
[00270]実施例２．８．議論
[00271]出願人は、この実施例において、組み合わされたＴ細胞挙動の機能的なおよび分子のプロファイリングのための統合されたモジュラー式のハイスループット分析パイプラインを実証した。この単一細胞のアッセイは、運動性、細胞傷害性、およびサイトカイン分泌などのＴ細胞の主要な機能的な属性を直接追跡することに加えて、多重化された転写プロファイリングを使用して分子レベルで照合可能な機能的な属性を同定するためのフロントエンドのスクリーニングとしても役立つ統合された方法を提供する。出願人は、この方法の適用をＴ細胞挙動の状況で実証したが、プラットフォームは、組み合わされた細胞挙動、タンパク質分泌、および転写プロファイリングをモニタリングするために、他の細胞型に適合させることができる。
[00272]腫瘍細胞とのライゲーション時におけるＩＦＮ−γ分泌および殺滅（および複数殺滅）に関する腫瘍特異的な個々のＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の多機能性を評価した。全ての機能的なＴ細胞のなかでも、単機能としてＩＦＮ−γを分泌したグループが、標的細胞の溶解に参加するＴ細胞と比較して、最長の腫瘍細胞へのコンジュゲーションの持続時間を表した。全てのＴ細胞がＣＡＲで均一に改変され、標的細胞上の抗原の濃度が均質であったため（図２６）、出願人の結果から、異なる機能的な結果（ＩＦＮ−γ対死滅）を引き起こす安定なコンジュゲーションの持続時間はヘテロジニアスであり得ることが明らかになった。したがって出願人の結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、低い抗原密度で短い溶解性シナプスを形成することができ、高い抗原密度でＩＦＮ−γを生じる長い安定な刺激性シナプスを形成することができることを示す抗原濃度を滴定することにより得られた以前の研究を補完する。有意に、単一細胞レベルでの出願人の結果から、標的細胞からの脱離は、殺滅によって可能になることもあり得るし、コンジュゲーションを終結させる決定は、アネキシンＶ染色の前に起こる可能性があることが示唆される（図１９）。
[00273]同時のＩＦＮ−γ分泌ありおよびなしのシリアルキラーＴ細胞の頻度追跡することにおいて有意差は観察されなかったことから、コンジュゲーションの早期の終結は、ＩＦＮ−γ分泌のためのＴ細胞活性化に影響を与えなかったことが示唆される。出願人の結果は、Ｔ細胞の標的細胞へのコンジュゲーションの持続時間は、異なる機能的な結果を反映する可能性があること、を単一細胞レベルで実証しており、この結果は、標的の脱離の失敗により、長期にわたるＴ細胞からのＩＦＮ−γ過剰分泌が生じる可能性があり、標的細胞内のカスパーゼの開始が、Ｔ細胞によりシナプスを終結させ得る可能性があることを示した、集団レベルの機能的な研究とマウス／ヒトＴ細胞における単一細胞のカルシウム活性化とを組み合わせた近年の報告と一致している。
[00274]加えて、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の転移を追跡することから、多機能性細胞、具体的にはシリアルキラーＴ細胞が、非機能的Ｔ細胞、またはＩＦＮ−γのみを分泌したエフェクター細胞のいずれかと比較して、接触なしの基底の運動性の上昇を示したことが解明された。高度な運動性を有する細胞の免疫学的な状況への分子的な識見を得るために、多重化された転写プロファイリングを単一細胞レベルで実行して、Ｔ細胞の活性化、分化および記憶に関連する遺伝子を標的化した。ｔ検定および階層的クラスター分析とそれに続く進行発見モデリングを使用した統計的検定の組合せにより、運動性および非運動性Ｔ細胞を区別することにおいて有用な可能性がある免疫学的な遺伝子のコアセットが同定された。運動性Ｔ細胞が多機能性のサブセット内で濃縮されるというＴＩＭＩＮＧの観察と一致して、分子のプロファイリングから、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＣＤ５８、ＬＡＧ３、ＩＬ２ＲＢ（ＣＤ１２２）、ＩＬ１８Ｒ１、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３および転写因子ＧＡＴＡ３などの最近の活性化に関連するマーカーが、運動性細胞内で上方調節されたことが表示された。同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞が媒介する即時の細胞傷害性に必要な、孔を形成するタンパク質であるパーフォリンの転写物も、運動性Ｔ細胞内で上方調節された（図２５）。
[00275]運動性が増加した個々のＴ細胞もまた、腫瘍の微環境へのトラフィッキングに関連する主要なケモカイン受容体の１つであり、乳がんおよび黒色腫などの多様ながんにおいて活性化されたＴＩＬ上で発現されるＣＸＣＲ３転写物における一致した増加（図２７Ａ）を示した。ＣＸＣＲ３の発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化時に上方調節され、走化性におけるその機能的な役割に加えて、ＣＸＣＲ３によって誘導されるシグナル伝達は、エフェクターおよびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の発生にも影響を与えると考えられる。同様に、ＣＤ２転写物の数から、Ｔ細胞の運動性との正相関が示された（図２７Ｂ）。
[00276]ＣＤ２とその結合パートナーＣＤ５８との動的な分子の相互作用は、細胞間の接触を安定化することによりＴ細胞の認識を容易にする。単一細胞の転写プロファイリングによって、運動性Ｔ細胞におけるＣＤ５８およびＣＤ２の一致した上方調節が表示されたことから（図２７Ｃ）、これらの分子は、両方ともインビトロおよびインビボにおいてＴ細胞の活性化、増殖および分化を促進することが公知の、同型のＴ細胞／Ｔ細胞相互作用とクラスター形成を媒介することができると考えられる。注目すべきことに、ＣＤ２４４も運動性Ｔ細胞において上方調節されたことから、これは、ＣＤ４８に結合することによってＴ細胞の同型の相互作用を調節できる類似の接着分子である（図２７Ｄ）。したがって出願人は、運動性、連続殺滅、ＩＦＮ−γ分泌および転写プロファイリングを統合する出願人の結果の全てを集約した統合されたモデルを提唱する（図２８）。
[00277]まとめると、機能性および分子のスクリーニングを組み合わせた出願人の統合された手法は、単一細胞の解像で、複雑な細胞挙動を調査することを可能にする。出願人のモジュラー式の拡張可能な方法は、ＣＡＲのパネルで操作されたＴ細胞の効能に必要な可能性がある異なるＴ細胞の機能の組合せをスクリーニングすること、さらに、導入された免疫受容体がインビボで治療の成功をもたらすかどうかを予測することに好適である。Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するためのＣＡＲ＋Ｔ細胞の治療上の可能性は、同様に操作された代替の特異性を有するＴ細胞がヒトにおいても抗腫瘍効果を有するかどうかという問題を提起する。したがって、遺伝子改変されたＣＤ１９特異的Ｔ細胞の研究は、標的他の血液系腫瘍および固形腫瘍を標的化するＣＡＲ＋Ｔ細胞の本発明者らの理解を助長するための土台として役立つ。
[00278]現在のところ、ほとんどの研究者は、どのＣＡＲの設計およびＴＩＬ集団がヒトへの適用に進められるかの情報を得るためにマウス実験に頼っているが、これは、すぐにスケールアップするのには向いていない。ここで実証されたように、出願人は、インビトロでのハイスループットシステムが、臨床前解釈および臨床解釈のためのサブセットを選択する前にＴ細胞のパネルの機能的な特徴を評価するのに採用できることを提唱する。この報告において顕微鏡法ツールの実行が解明され、運動性は腫瘍細胞の殺滅と相関するという観察は、小動物での試験を必要とすることなく遺伝子改変されたＴ細胞を同定するアプローチを研究者に提供することができる。
[00279]実施例２．９．細胞株、一次Ｔ細胞、ＴＩＬ、および試薬
[00280]ヒトプレＢ細胞株ＮＡＬＭ−６（ＡＴＣＣ）およびＣＡＲ＋Ｔ細胞を上述したようにして培養した。細胞株を慣例的に試験して、それらにマイコプラスマ汚染がないことを確認し、フローサイトメトリーを利用して、ＣＤ１９の発現を確認した。ＴＩＬを単離して、これまでに述べられたようにして拡大した。簡単に言えば、最初のＴＩＬ拡大は、２４−ウェルプレートで、小さい３〜５ｍｍ２の腫瘍断片または酵素消化物のいずれかから実行し、続いてフィコール（FICOLL）を用いて遠心分離した。次いで、ＴＩＬを、６０００ＩＵ／ｍＬのヒト組換えＩＬ−２を含有するＴＩＬ完全培地（プロメテウス（Prometheus））中でそのまま３〜５週間増殖させた。望ましい数のＴＩＬが達成されたら、急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）を実行し、それにおいてＴＩＬを、Ｇ−ＲＥＸ１００Ｍフラスコ中、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、eBioscience）が前もってローディングされたＰＢＭＣフィーダー細胞と共に（１個のＴＩＬ：２００個のフィーダー）望ましい数の細胞が達成されるまで培養して、採取した。
[00281]実施例２．１０．ビーズの調製：一次捕獲抗体でのビーズのコーティング
[00282]溶液中、約１μＬのＰｒｏｍａｇ ３シリーズのヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃビーズ（約２．３×１０５個のビーズ）を１０μＬのＰＢＳで洗浄し、１９．６μＬのＰＢＳ（約０．０５％の固体）に再懸濁した。次いでマウス抗ヒトＩＦＮ−γ（クローン１Ｄ１Ｋ）を、１０μｇ／ｍＬの最終濃度でビーズに添加し、室温（ＲＴ）で３０分インキュベートし、続いて洗浄して、１００μＬのＰＢＳ中に再懸濁した。
[00283]実施例２．１１．ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
[00284]ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、新鮮なＰＢＭＣおよびＴＩＬを用いてこれまでに述べられたようにして実行した。簡単に言えば、マイクロウェルプレートを、１０μｇ／ｍＬで、捕獲抗体である抗ヒトＩＦＮγ−１Ｄ１Ｋで、４℃で一晩コーティングした。次の日、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、ＲＰＭＩ−ＰＬＧＨ＋１０％ＦＢＳで、３７℃で４５分ブロックした。細胞を以下のように３連で調製した：（１）４，０００個のＰＢＭＣを、ウェル１つ当たり１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ／１μｇ／ｍＬのイオノマイシンで刺激した。（２）４，０００個の黒色腫特異的ＴＩＬを、ウェル１つ当たり１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ／１μｇ／ｍＬのイオノマイシンで刺激した。（３）２００，０００個のＰＢＭＣを２μｇ／ｍＬのＣＥＦペプチドで刺激した。（４）対応する刺激されていない細胞。次に、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で１８時間インキュベートし、続いてＰＢＳで５回洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ中、ビオチン化した検出用抗ヒトＩＦＮγ ７−Ｂ６１と共に、３７℃／５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。ＰＢＳで７回洗浄した後、イムノサンドイッチを完了させ、続いてエクストラアビジン−アルカリホスファターゼを添加した（３７℃／５％ＣＯ２で１時間のインキュベーション［シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）］）。プレートをＰＢＳで５回洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（シグマ−アルドリッチ）基質を添加し、３７℃／５％ＣＯ２で１５分インキュベートした。続いて、バックグラウンドの測定値を考慮に入れて、プレートをＥＬＩＳｐｏｔリーダー（Ｃ．Ｔ．Ｌ．カウンター）を用いて読み取った。
[00285]実施例２．１２．ナノウェルアレイの製作および細胞の調製
[00286]単一細胞レベルにおけるエフェクター機能の照合のためのナノウェルアレイの製作を上述したようにして実行した。およそ１００万個のエフェクター細胞および標的細胞を両方とも４００×ｇで５分遠沈させ、続いて製造元のプロトコールに従ってそれぞれ１μＭのＰＫＨ６７およびＰＫＨ２６蛍光色素で標識した。次いで過量の未結合の色素を洗浄して落とし、細胞約２００万個／ｍＬの濃度で細胞を完全細胞培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）中に再懸濁した。
[00287]実施例２．１３．有限要素シミュレーション
[00288]ＣＯＭＳＯＬのマルチフィジックス４．１（Multiphysics 4.1）における化学反応工学モジュールである希釈種輸送のインターフェースを使用して、分析物濃度であるＣおよびＣｓの経時的な変動をモデル化するための連立偏微分方程式を解いた。Ｃｓを含む質量平衡等式を、その弱い形態を使用して解いた。細胞およびビーズの位置の変化、対流輸送、ビーズ表面上での拡散（Ｄｓ＝１０−２５ｍ２／秒）、壁への非特異的な吸着および分析物の劣化を無視して、数値シミュレーションを簡易化した。
[00289]実施例２．１４．エフェクターの細胞溶解性の表現型およびＩＦＮ−γ分泌のマルチプレックス研究のためのＴＩＭＩＮＧアッセイ
[00290]捕獲抗体でコーティングしたビーズならびに標識されたエフェクターおよび標的細胞をナノウェルアレイ上に連続的にローディングした。必要な場合はいつでも、アレイを５００μＬの細胞培養培地で洗浄して、過量のビーズまたは細胞を除去した。次に、アネキシンＶ−アレクサフルオロ６４７（ＡＦ６４７）（ライフテクノロジーズ）（標的アポトーシスを検出するため）を含有する検出溶液を、２．５ｍＬのフェノールレッド非含有完全細胞培養培地にストックからの５０μＬの溶液を添加することによって調製した。次いでナノウェルアレイを、２０×０．４５ＮＡの対物レンズを利用したライカ（LEICA）／ＺＥＮ蛍光顕微鏡および科学ＣＭＯＳカメラ（オルカフラッシュ４．０（Orca Flash 4.0））を使用して、５時間かけて５分のインターバルで画像化した。続いて、マウス抗ヒトＩＦＮ−γビオチンを２．５ｍＬの細胞培地に１：１０００を超える希釈率で添加した。これを３０分インキュベートし、続いて洗浄して、５μｇ／ｍＬストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートした。チップ全体を再度画像化して、マイクロビーズ上のＰＥシグナルの強度を決定し、特注の情報学アルゴリズムを使用して２つのデータセットを一致させた。
[00291]実施例２．１５．画像処理、細胞セグメンテーションおよび追跡、ならびにデータの分析論
[00292]画像分析および細胞のセグメンテーション／追跡を上述したようにして実行した。統計データ分析を用いた画像処理および細胞セグメンテーション末端のパイプラインは、自動化セグメンテーションおよび細胞の追跡アルゴリズムによって生成された表を用いた時空的な測定データに基づく。さらなる分析のために、１個のエフェクターおよび２〜５個の腫瘍細胞を含有するナノウェルを選択した。次に、出願人は、これらの事象全てを、細胞の機能性（すなわち単一殺滅、連続殺滅、およびＩＦＮγ分泌）に基づいて分配した。最大画素面積に基づくサイズ排除フィルターを使用して、ビーズから細胞を効果的に分別した（すなわち、ビーズは細胞よりかなり小さかった）。特別に指示がある場合、細胞追跡をＭＡＴＬＡＢ（マスワークス社（Mathworks Inc.）、マサチューセッツ州）を使用して表した。
[00293]実施例２．１６．遺伝子発現のプロファイリング
[00294]ＰＫＨで緑色に染色されたＣＤ８＋Ｔ細胞をナノウェルアレイ上にローディングし、アネキシン−ＡＦ６４７（ライフテクノロジーズ）を含有するフェノールレッド非含有完全細胞培養培地に浸し、上述したようにＴＩＭＩＮＧを正確に使用して３時間かけて画像化した。チップ上の細胞を冷ＰＢＳ（４℃）で３回慎重に洗浄した後、細胞を回収まで４℃で維持した。微速度撮影シーケンスを手作業で分析して、生きた高いおよび低い運動性の細胞を同定した。細胞を自動化された顕微操作システム（セルセレクター（CellCelector）、ＡＬＳ）を使用して個々に収集し、５μＬの２×セルディレクト（CellsDirect）緩衝液およびＲＮアーゼ阻害剤を含有するヌクレアーゼ非含有マイクロチューブ（インビトロジェン（Invitrogen））中に堆積させた。次いで単一細胞ＲＴ−ｑＰＣＲを、フリューダイム（Fluidigm）により開発されたプロトコールＡＤＰ４１を使用して実行した。９２個の細胞（４８個の運動性および４４個の非運動性）を、１０および１００個の細胞のバルクサンプル、ならびに細胞なしおよびＲＴなし対照と共にアッセイした。Ｔ細胞活性化、シグナル伝達および遺伝子調節に関連する遺伝子を包含する９５種の遺伝子のパネル（図２１）を、フリューダイムのＤ３アッセイデザイン（D3 AssayDesign）によって設計し製造した。
[00295]データ分析のために、出願人はまず、上述したように２９の閾値からＣｔ値を引くことによってＬｏｇ２Ｅｘ値を抽出した。次いで出願人は、ｉ）増幅された遺伝子の４０％未満を有し、母平均±３ＳＤの範囲からはずれたＬｏｇ２Ｅｘの平均を有していた細胞からのデータ、およびｉｉ）細胞の＜１０％で増幅された遺伝子からのデータを排除した。エクセル（Excel）（マイクロソフト（Microsoft））、プリズム（Prism）（グラフパッド（GraphPad））、ＭｅＶ、ＳＴｒｅｎＤ（https://github.com/YanXuHappygela/STrenD-release-1.0）およびジーンマニアウェブツール（http://www.genemania.org/）を使用して、後処理分析を行った。
[00296]実施例３．個々の運動性ＣＤ４ ＋ Ｔ細胞は、複数の腫瘍細胞へのコンジュゲーションを介して効率的な複数殺滅に参加することができる
[00297]この実施例において、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＡＲ４細胞）は、同時に起こる複数の腫瘍細胞へのコンジュゲーションを介して複数殺滅に従事できるという直接証拠を提供するために、出願人はＴＩＭＩＮＧを実行した。ＣＡＲ４細胞とＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＡＲ８細胞）との比較から、ＣＡＲ４細胞は殺滅および複数殺滅に参加できる一方で、それらは、おそらくより低いグランザイムＢ含量のためにより遅い速度でそれを行うことが実証される。重要なことに、両方のＴ細胞のセットにおいて、少数派の個々のＴ細胞の部分集団がそれらの高い運動性によって同定され、単一の腫瘍細胞の効率的な殺滅を実証した。マルチキラーおよびシングルキラーＣＡＲ＋Ｔ細胞の両方を比較することによって、Ｔ細胞アポトーシスの性質および速度論は、機能的なコンジュゲーションの数によって調節されたと考えられる。Ｔ細胞は、急速なアポトーシスを受けた。さらに、より高い頻度で（すなわち、Ｔ細胞が、独立して単一の腫瘍細胞にコンジュゲートされた場合）、この作用はＣＡＲ８細胞においてより顕著であった。
[00298]出願人の結果から、複数殺滅に参加するＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）に耐性を有するそれらの能力に関して評価されるべきであることが示唆される。出願人は、ＴＩＭＩＮＧは、Ｔ細胞集団の効力を迅速に決定するのに利用でき、効能が改善された次世代のＣＡＲ＋Ｔ細胞の設計および製造を容易できることを予期する。
[00299]実施例３．１．細胞株および抗体
[00300]全ての抗体は、バイオレジェンド（Biolegend）（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。ヒトプレＢ細胞株ＮＡＬＭ−６（ＡＴＣＣ）、Ｄａｕｄｉ−β２ｍ（ＡＴＣＣ）、Ｔ細胞リンパ腫ＥＬ−４（ＡＴＣＣ）および改変されたＣＤ１９＋ＥＬ−４細胞を上述したようにして培養した。細胞株を慣例的に試験して、それらにマイコプラスマ汚染がないことを確認し、フローサイトメトリーを利用して、ＣＤ１９の発現を確認した。
[00301]実施例３．２．細胞の遺伝学的改変および伝播
[00302]健康な志願者からのＰＢＭＣに、第２代ＣＡＲ（ＣＤ１９ＲＣＤ２８と名付けられた）およびＳＢ１１トランスポゼースをコードするＤＮＡプラスミドと共にヌクレオフェクターＩＩ（Nucleofector II）（Amaxa／ロンザ）を使用してエレクトロポレーションを行い、上述したように７日の刺激サイクルでサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−２１）と共にγ線照射したＫ５６２ ａＡＰＣ（クローン４）と２８日間共培養した。単一細胞分析のために、凍結したＣＡＲ＋Ｔ細胞を元に戻し、それらを実験で使用する前に照射したＫ５６２ ａＡＰＣで再刺激した。
[00303]実施例３．３．フローサイトメトリー
[00304]細胞を細胞表面マーカー（ＣＡＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３）に関して染色し、固定し、４℃で２０分かけて透過性にした（サイトフィックス（Cytofix）／サイトパーム（Cytoperm）、ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences））。続いて細胞を、透過化／洗浄緩衝液中で細胞内のグランザイムＢに関して４℃で３０分かけて染色し、ＦＡＣＳキャリバー（Calibur）で捕捉し、これまでに述べられたようにしてＦＣＳエクスプレス（FCS Express）／ＦｌｏｗＪｏを使用して分析し、ＧｚＢ発現を決定するための統計分析をＲ内で実行した。
[00305]実施例３．４．エンドポイント細胞傷害性アッセイ
[00306]単一細胞レベルでエフェクター−標的相互作用を照合するためのナノウェルアレイの製作および対応する細胞傷害性アッセイを上述したようにして実行した。簡単に言えば、１μＭの赤色蛍光色素、ＰＫＨ２６（シグマ）で標識されたＣＡＲ＋Ｔ細胞および１μＭの緑色蛍光色素ＰＫＨ６７で標識された標的細胞を、ナノウェルアレイ上に細胞１０６個／ｍＬの濃度で共にローディングした。１０×０．３ＮＡの対物レンズを使用した浜松のＥＭ−ＣＣＤカメラを備えたカールツァイス（Carl Zeiss）のアクシオオブザーバー（Axio Observer）で画像を捕捉した。チップ全体の自動化された画像捕捉を０および６時間で実行し、アレクサ−６４７（ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州カールスバッド）にコンジュゲートしたアネキシンＶで染色することによってアポトーシスを同定した。
[00307]実施例３．５．ＴＩＭＩＮＧアッセイ
[00308]ナノウェルのグリッドを６０ｍｍのペトリ皿上で所定位置に固定した。細胞を標識し、エンドポイントアッセイに関して説明した通りに正確にローディングし、２０×０．４５ＮＡの対物レンズを使用したツァイスのアクシオオブザーバーで画像化した。１２〜１６時間かけて７〜１０分のインターバルで画像を捕捉した。
[00309]実施例３．６．フローサイトメトリーベースの細胞傷害アッセイ
[00310]ＣＡＲ４細胞（１×１０６個の細胞）と、ＣＤ１９＋標的細胞（０．２×１０６個の細胞；Ｄａｕｄｉβ２ｍ、ＮＡＬＭ−６、ＣＤ１９ＥＬ−４）とを、５：１のＥ：Ｔの比率で、５ｍＭのＥＧＴＡの存在または非存在下で、２４−ウェルプレート中、５％ＣＯ２、３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＣＤ３（Ｔ細胞）およびＣＤ１９（腫瘍標的）に関して染色し、ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤバイオサイエンス）上で捕捉し、ＦＣＳエクスプレスバージョン３．００．００７（ソーンヒル、カナダ）を使用して分析した。
[00311]実施例３．７．画像処理および細胞セグメンテーション
[00312]カメラおよびステージの動きにもかかわらず細胞の転移の正確な計算結果を許容するために、方向および倍率値の予測される範囲で前もって構築した形状のテンプレートを相関させることによって、個々のナノウェルを＞９９％の正確性で自動的に検出した。相関値は、ウェルの中心における最大値であり、これらのポイントは、極大値のクラスタリングアルゴリズムを使用して検出される。各画像のチャネル中の細胞は、３段階の方法を使用して自動的に分析される。第１に、３つのガウス分布の混成としての画像強度のモデル化に基づき、明るいフォアグラウンド、中間のフォアグラウンド、および暗いバックグラウンドとして各画素を階層化する。フォアグラウンドの画素は、マルチレベルの二値化に供される（出願人は、最大のフォアグラウンド強度値と最小のフォアグラウンド強度値との間の１０の等しく間隔を開けたレベルを使用した）。極大値のクラスタリングを各閾値でコンピューターにより計算されたユークリッド距離マップの平均で使用して、細胞の中心を検出する。これらの細胞の中心を使用して、画像のフォアグラウンドを、正規化したカットアルゴリズムを使用して個々の細胞区域に分配して、細胞のサイズおよび形状を定量化できるようにする。画像化条件下で使用される色素間のスペクトルのオーバーラップを、画像処理中に自動的な「アンミキシング」プロセスを介して消去したが、これは、実験の各セットにつき独立して実行される。加えて、セグメンテーションのスクリプトが、所与の細胞に関連する全ての画素で平均化することによって統合された蛍光強度を計算することから、接触中の細胞膜にわたる色素の拡散に起因するエフェクター／標的分類におけるいかなる曖昧さも消去される。
[00313]実施例３．８．細胞の追跡
[00314]検出された細胞は、
Figure 0006855382
（式中Ｎは、ウェル中の細胞の数であり、Ｔは、フレームの数である）で表され、これは、細胞が頂点に相当し、エッジが時間関連の仮説を表す有向グラフでグラフ理論的なエッジ選択アルゴリズムを使用して、フレームからフレームにわたり追跡される。
時間ｔにおけるオブジェクトｉから時間ｔ＋１におけるオブジェクトｊの間における各エッジ
Figure 0006855382
の関連コストは、細胞の配置およびサイズに基づき計算される。時間的な対応は、拘束に供される総関連コストを最大化する整数計画法アルゴリズムを使用して同定され、所与のフレーム中の各細胞がそれに続くフレームで最大１つの細胞と連携し、その逆もまた同様であることを確実にする。
[00315]実施例３．９．ＣＡＲ ＋ Ｔ細胞の生産および表現型
[00316]遺伝子改変して増殖させたＴ細胞を、スリーピングビューティー（ＳＢ）系２７を使用して誘導された健康な志願者であるドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から生成し、キメラＣＤ３およびＣＤ２８エンドドメインを介してＴ細胞を活性化する第２代ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９ＲＣＤ２８と名付けられた）を発現させた（図２９Ａ）。拡大した後、２つの別々のドナーからのＣＡＲ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を優勢に含有していた（図２９Ｂ）。
[00317]実施例３．１０．個々のＣＡＲ ＋ Ｔ細胞の細胞傷害性の可能性、特異性および複数殺滅の能力
[00318]ドナーから誘導されたＣＡＲ＋Ｔ細胞集団を、ＣＤ１９＋ＥＬ４標的細胞を溶解させるそれらの能力に関して、ナノウェルのグリッド内での共培養により評価した（図２９Ｃおよび３０）。１：１のＥ：Ｔにおいて、両方のドナーで平均して、単一ＣＡＲ＋Ｔ細胞の２９％が、６時間以内にＣＤ１９＋ＥＬ４細胞のアポトーシスを誘導し（事象の数、Ｎｔｏｔａｌ＝４，０４８）、それに対してそれらは、同じ時間枠でＣＤ１９−ＥＬ４細胞のちょうど１％（Ｎｔｏｔａｌ＝３，６８２）のアポトーシスを誘導した。ＣＤ１９−標的と比べてＣＤ１９＋溶解の２９倍を超える増加は、ＴＡＡ特異的な溶解の確証となる（図２９Ｄ、ｐ値＜０．０００１、フィッシャーの２×２検定）。平行して、従来の４時間の５１クロム放出アッセイ（ＣＲＡ）を同じＥ：Ｔ比率（１：１）で実行し、単一細胞の解像はないが、全体的に類似の規模の標的細胞の殺滅（ＣＤ１９−ＥＬ４細胞に比べて、ＣＤ１９＋溶解の平均１４倍の増加）が報告された（図２９Ｄ）。ヒトＣＤ１９＋腫瘍細胞を溶解させることに特異性を再び方向付ける能力が、プレＢ細胞株ＮＡＬＭ−６を使用して確認された（データは示されない）。
[00319]両方のドナーで平均したところ、観察の６時間以内に、個々のＣＡＲ＋Ｔ細胞が、１：１のＥ：Ｔ比率において、ＮＡＬＭ−６標的細胞の３４％（Ｎｔｏｔａｌ＝３，５０３）でアポトーシスを誘導した。試験されたサンプルの全てにわたり、単一細胞アッセイによりＣＲＡへの直線的な相関が実証された（図２９Ｄ、ｒ２＝０．８４、ｐ値＝０．０１）。１つより多くの標的細胞を消去する個々のＴ細胞の能力を、複数の標的を含有するナノウェルを分析することによって定量化した（図３１）。両方のドナーで平均して、１：２のＥ：Ｔ比率において、６時間以内に、単一ＣＡＲ＋Ｔ細胞の２１％（Ｎｔｏｔａｌ＝２，２９４）が正確に１つのＣＤ１９＋ＥＬ４標的細胞を殺滅し、それに対して２３％が両方の標的を殺滅した（図２９Ｅ）。
[00320]この同じ時間枠中、１：３のＥ：Ｔ比率において、単一ＣＡＲ＋Ｔ細胞の２２％（Ｎｔｏｔａｌ＝１，１０８）が正確に１つの標的を殺滅し、２２％が正確に２つの標的を殺滅し、９％が全ての３つの標的を殺滅した（図２９Ｅ）。したがって、定義された観察枠内で、個々のＣＡＲ＋Ｔ細胞が１つより多くの腫瘍細胞を殺滅した見込みは、これがより高い細胞密度でより高い頻度の相互作用を反映する可能性があるとしても、ナノウェル内の標的の数が増加するにつれて改善した。
[00321]また上述の発見は、共培養の６時間後に複数殺滅の頻度が低減したにもかかわらず、標的細胞としてＮＡＬＭ−６を代わりに用いた場合にも観察された（図３２）。概して、これらのデータから、単一細胞のアッセイによって測定された応答はＣＲＡの結果と一致すること、およびマルチキラーＣＡＲ＋Ｔ細胞（少なくとも２つの標的を溶解する能力）がＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の２０％（Ｎｔｏｔａｌ＝３，４０２）を構成することが実証される。
[00322]実施例３．１１．運動性ＣＤ８ ＋ 細胞傷害性Ｔ細胞は、活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）の可能性が減少した効率的なキラーである
[00323]個々のＣＡＲ＋Ｔ細胞とＮＡＬＭ−６腫瘍細胞との相互作用に対する機械論的な理解の改善を達成するために、出願人は、図３３で例示されたＴＩＭＩＮＧアッセイを実行した。Ｔ細胞に固有の挙動運動性（ｄＷｅｌｌ）および分極のアスペクト比（ＡＲ）、コンジュゲーション（接触の継続＞７分、ｔＳｅｅｋおよびｔＣｏｎｔａｃｔ）、ならびに死（ｔＤｅａｔｈおよびｔＡＩＣＤ）を説明する６つのパラメーターをコンピューターで計算して、エフェクターと腫瘍細胞との各相互作用対を定義した（図３４Ａ〜Ｃ）。１：１のＥ：Ｔにおいて、少なくとも１つのコンジュゲートを作製する単一のＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＡＲ８細胞）の７７％（Ｎｔｏｔａｌ＝２６８）が、結合した白血病細胞を殺滅することができた。その後の殺滅を引き起こす腫瘍細胞との異なる挙動の相互作用を示したＴ細胞のサブグループを同定するために、３つのフィーチャ、コンジュゲーションの総持続時間、ｄＷｅｌｌおよびＡＲのそれぞれｏｆの時系列データを階層的クラスター分析で処理した（図３５）。
[00324]集合的にシングルキラーＣＡＲ８細胞の７０％を占める３つのＴ細胞のサブグループを、以下のように記載した：Ｓ１（１４％［７〜２０％］範囲）、低いコンジュゲーションおよび高い運動性；Ｓ２（４９％［３２〜６６％］）、高いコンジュゲーションおよび低い運動性；およびＳ３（２１％［１９〜２２％］）、低いコンジュゲーションおよび低い運動性（図３５）。高い運動性のサブグループであるＳ１は、初期の「ラグフェーズ」を有していた細長いＴ細胞から優勢に構成されるが（ｔＳｅｅｋ１８４±３８分、平均±ＳＥＭ）、標的アポトーシスの前に（ｔＤｅａｔｈ、２０４±３５分）、安定なコンジュゲートを形成した（ｔＣｏｎｔａｃｔ、９８±１３分）（図３４Ｄ〜Ｆ）。これらのＴ細胞の大部分は、腫瘍細胞コンジュゲーション中に運動性の減少および環状化の増加を示し、腫瘍細胞死の後に脱離し、正常な移動の機能を再開させることから、低い頻度のエフェクター細胞しかＡＩＣＤを受けなかった（ここにデータを示す）。
[00325]優勢なサブグループであるＳ２における代表的な細胞は、コンジュゲーションを迅速に確立し（ｔＳｅｅｋ、３６±６分）、殺滅の前に（ｔＤｅａｔｈ １５８±１８分）持続的なコンジュゲーションを表した（ｔＣｏｎｔａｃｔ １４５±１６分）（図３４Ｅ〜Ｆ）。これらのＴ細胞の大半は、腫瘍細胞溶解後に脱離したりまたは移動の機能を再開させたりせず、優勢に円形の形態を保持し、コンジュゲートした腫瘍細胞の死の後でさえも１０時間より長くコンジュゲートした状態を保った。さらに、Ｓ２エフェクター細胞の８８％が観察の最初の１０時間以内にアポトーシスを受けた（データは示されない）。最終的に、Ｓ３サブグループ中のＴ細胞は、コンジュゲーション後に停止状態になるが、腫瘍細胞の脱離／死滅の後に移動を再開させることができなかった急速なキラー（ｔＣｏｎｔａｃｔ、８４±８分、ｔＤｅａｔｈ、１１８±２０分）であった（図３４Ｅ〜Ｆ）。これらのＳ３エフェクターは致死性のヒットを送達した後に腫瘍細胞から脱離したにもかかわらず、５３％がアポトーシスを受けた（データは示されない）。
[00326]総合すると、これらの結果から、１：１のＥ：Ｔ比率において、それらの運動性の欠如および腫瘍細胞への早期のコンジュゲーションによって同定された細胞の優勢なサブグループであるＳ２は、ＡＩＣＤを受けたことが実証される。それとは逆に、高度に運動性のＣＡＲ８細胞であるＳ１は、効率的に脱離し、局在的な微環境の探索を再開したことから、ＣＡＲ８細胞の運動性は、ＡＩＣＤに関する性質が減少した効率的なキラーの同定を助長する可能性があることが示される。ＣＡＲ８細胞（Ｓ２サブグループ）の大半が、腫瘍細胞死の後でさえも長期の接触を維持したという観察は、ＨＩＶ特異的なＣＴＬに対する調査と一致する。
[00327]実施例３．１２．増加した腫瘍細胞密度におけるＣＡＲ８細胞の運動性は多重化殺滅を容易にする
[00328]注入された過剰な数のエフェクターで腫瘍負荷量を消去するＣＡＲ＋Ｔ細胞の効能は、存続して連続殺滅に参加するそれらの能力に起因する。マルチキラーの同定を容易にするために、出願人は次に、単一ＣＡＲ８細胞および２〜５個のＮＡＬＭ−６腫瘍細胞（Ｅ：Ｔは１：２〜５）を含有するナノウェル中での相互作用をプロファイリングした。２つまたはそれより多くの腫瘍細胞に同時にコンジュゲートできたＣＡＲ８細胞の頻度は、ナノウェル内の標的の数が増加するにつれて２５％から４９％に増加したことから、多重化殺滅は重要な可能性があることが示される（図３６Ａ）。腫瘍の細胞死を引き起こす同時の腫瘍コンジュゲートの頻度（４６％［４３〜５０％］）が、異なる腫瘍細胞に付着し、殺滅し、脱離して、付着する真のシリアルキラーとあまり異なっていなかったことから（４９％［４４〜５３％］）、ＣＡＲ８細胞は、おそらく腫瘍細胞密度に依存していずれかの殺滅様式を惹起することが可能であることが示唆される。個々のマルチキラーＣＡＲ８細胞（Ｎｔｏｔａｌ＝７０）は、１つの腫瘍細胞にコンジュゲートした場合、運動性をほんのわずか減少させたことが実証されたが、複数の腫瘍細胞へのコンジュゲーション時に運動性における有意な変化はなかったことが示された（ｄＷｅｌｌ（コンジュゲートしていない）：５．９±０．５μｍ対ｄＷｅｌｌ（単一の標的）：４．６±０．３μｍ対ｄＷｅｌｌ（２つの標的）：４．７±０．３μｍ）（図３６Ｂ）。
[00329]異なる腫瘍細胞と接触した場合におけるマルチキラーの唯一の差は、コンジュゲートを確立するそれらの時間の差であった（ｔＳｅｅｋ標的１：１８±４分対標的２：９８±１３分、図３６Ｃ）。コンジュゲーションの持続時間（ｔＣｏｎｔａｃｔ標的１：１０１±９分対標的２：１１３±１５分）と殺滅効率（ｔＤｅａｔｈ標的１：１５６±１７分対標的２：１７７±２４分）は両方とも異なっていなかった（図３６Ｄ）。
[00330]接触の持続時間に加えて、第１の腫瘍細胞（両方のドナーの６１％）との遭遇中に殺滅を引き起こすＣＡＲ８細胞と腫瘍細胞のコンジュゲーションの数も、第２の腫瘍細胞との遭遇中に標的細胞の殺滅を引き起こすコンジュゲーションの数と有意に異なっていなかった（７４％［７０〜７９％］）。これらのＴＩＭＩＮＧデータから、第２の腫瘍細胞を殺滅する効率は概ね、第１の標的におけるヒットによる影響を受けないことが示唆される（ｐ値＞０．９９）。さらに、シングルキラーＣＡＲ８細胞と比較して、マルチキラーＣＡＲ８細胞は、腫瘍細胞にコンジュゲートした場合、より高い腫瘍細胞密度のために密集度が増加したにもかかわらずより大きい運動性を表した。
[00331]実施例３．１３．運動性は、細胞傷害効率が強化されたＣＡＲ４細胞のサブグループを同定することができる
[00332]次に、２人のドナーから誘導された集団からの個々のＣＡＲ４細胞とＮＡＬＭ−６腫瘍細胞との相互作用（図３７Ａ）を、ＴＩＭＩＮＧを使用してプロファイリングした。続いて、１：１のＥ：Ｔ比率において、ＮＡＬＭ−６細胞にコンジュゲートした単一ＣＡＲ４細胞の５５％（Ｎｔｏｔａｌ＝５４９）は腫瘍細胞を殺滅した。ＣＡＲ８細胞の場合と同様に、ＣＡＲ４細胞とＮＡＬＭ−６細胞との相互作用の挙動は、３つのサブグループ、Ｓ１〜Ｓ３に分類することができた（図３８）。強化された運動性サブグループであるＳ１におけるＣＡＲ４細胞（両方のドナーの１１％）は、優勢なＳ２（３４％［３１〜３６％］）サブグループ（ｔＤｅａｔｈ、３１８±２３分、図１６Ｂ〜Ｄ）と比較して、より有意に速い腫瘍細胞死の速度論を表した（ｔＤｅａｔｈ、１５７±１７分）。この反応速度論効率の増加は、Ｓ２サブグループ（ｔＣｏｎｔａｃｔ、３００±２１分）と比較したＳ１サブグループの細胞（ｔＣｏｎｔａｃｔ、１２２±１１分）が要するコンジュゲーション時間の減少と一致した（データは示されない）。これらの結果から、ＣＡＲ８細胞と同様に、ＣＡＲ４細胞の運動性は、ほとんどの効率的なキラーの同定を助長する可能性があることが示唆される。
[00333]実施例３．１４．シングルキラーおよびマルチキラーＣＡＲ４細胞の両方は、より長いコンジュゲーションを必要とし、ＣＡＲ８細胞と比較して殺滅の遅い速度論を実証した
[00334]１：１のＥ：Ｔ比率において、ＣＡＲ４細胞（ｔＤｅａｔｈ、２８４±１１分）およびＣＡＲ８細胞（１６３±１２分）の殺滅効率の比較から、個々のＣＡＲ４細胞は、腫瘍細胞死を誘導するのに平均して２時間余分に要したことが実証された（図３７Ｅ）。Ｓ２サブグループはＣＡＲ＋Ｔ細胞の優勢な集団であるという観察と一致して、Ｓ２サブグループ中のＣＡＲ４細胞（ｔＤｅａｔｈ、３１８±２３分）は、Ｓ２サブグループ中のＣＡＲ８細胞と比較して（ｔＤｅａｔｈ、１５８±１８分）殺滅の遅い速度論を実証した（データは示されない）。本明細書で述べられたように、ＣＡＲ４細胞の運動性は、ほとんどの効率的なキラーを同定するのに使用できたことから（図３７Ｃ）、Ｓ１サブグループ中のＣＡＲ４細胞（ｔＤｅａｔｈ、１５７±１７分）と、Ｓ１サブグループ中のＣＡＲ８細胞（ｔＤｅａｔｈ、２０４±３４分）との反応速度論効率の比較から、有意差がないことが実証された。これは、運動性が効率的な細胞溶解性のＣＡＲ＋Ｔ細胞を同定することにおいて有用なパラメーターであり得るという観念をさらに裏付けるものである。
[00335]マルチキラーＣＡＲ４細胞の単一細胞の挙動の相互作用（Ｎｔｏｔａｌ＝７８）をＣＡＲ８細胞と比較したところ、両方の表現型の細胞にわたりほとんどのフィーチャが保存されたことが実証された。第１に、ＣＡＲ４細胞のコンジュゲートしていない運動性（ｄＷｅｌｌ、６．９±０．５μｍ）は、ＣＡＲ８細胞（ｄＷｅｌｌ、５．９±０．５μｍ、図３９Ａ）と異なっていなかった。第２に、ＣＡＲ８細胞のように、ＣＡＲ４細胞は、１つまたはそれより多くの腫瘍細胞にコンジュゲートした場合、一致した運動性の減少（図３９Ａ）と環状化の増加を実証した。第３に、マルチキラーＣＡＲ４細胞の好ましい接触様式も、複数の腫瘍細胞への同時に起こるコンジュゲーションであった（データは示されない）。第４に、殺滅を引き起こす同時のコンジュゲートが、殺滅事象の６１％［６０〜６３％］を占めたことから、これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のみならずＴ細胞にも固有な重要な殺滅様式であることが示される。第５に、個々のマルチキラーＣＡＲ４細胞によって殺滅された異なる腫瘍細胞のｔＤｅａｔｈの比較から、差は実証されなかった（図３９Ｂ）。最後に、第１の腫瘍細胞の遭遇中に殺滅を引き起こすＣＡＲ４細胞と腫瘍細胞のコンジュゲーションの数（６０％［５８〜６１％］）は、第２の腫瘍細胞の遭遇時に殺滅を引き起こす接触の数（６０％［５７〜６３％］）と有意に異なっていないことから、殺滅効率は不変であることが示唆される。
[00336]１：１のＥ：Ｔにおける観察と一致して、マルチキラーＣＡＲ４細胞は、長期のコンジュゲーションを要し（ｔＣｏｎｔａｃｔ ２１４±１８分）、ＣＡＲ８細胞と比較して、第１の腫瘍細胞を殺滅する前に（ｔＤｅａｔｈ ３１０±２３分）より遅い速度論を実証した（図３９Ｂ）。概して、これらの結果から、単一殺滅または複数殺滅のいずれかに参加するＣＡＲ４細胞およびＣＡＲ８細胞における主要な差は、腫瘍細胞死の速度論であることが実証される。
[00337]実施例３．１５．細胞内ＧｚＢ含量は、殺滅効率における差を説明することができる
[00338]同じ集団の細胞間およびＣＡＲ４細胞とＣＡＲ８細胞との比較における両方の変化する効率は、細胞傷害性酵素の発現における差に起因する可能性があるという仮説を試験するために、出願人は、フローサイトメトリーを使用した単一細胞レベルでの細胞内染色を採用して、これらの細胞内のＧｚＢ発現を同定した。ベースラインの対照を確立するために、２つの別々のドナーのＰＢＭＣ中におけるＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞（２．３６±０．０１）およびＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（３．８９±０．０４）の細胞内ＧｚＢ含量を決定した（図３９Ｃ）。本発明者らの以前の報告と一致して、ＣＡＲ４細胞（３８．６±０．２）およびＣＡＲ８細胞（２６７±２）の両方が、対照と比較してＧｚＢ発現の有意な増加を示した（図３９Ｃ）。殺滅効率データと一致して（図３９Ｂ）、ＣＡＲ４細胞は、ＣＡＲ８細胞と比較してより低い量のＧｚＢを発現したことから、これらの細胞の異なる反応速度効率の発端は、ＧｚＢ含量における差であり得ることを示唆される（図３９Ｃ）。
[00339]単一細胞レベルで腫瘍細胞を殺滅することに対するＧｚＢ分泌の寄与を定量化するために、カルシウムキレート化剤ＥＧＴＡの存在下で腫瘍細胞を殺滅するＣＡＲ４細胞の能力をフローサイトメトリーを使用して研究した。ＥＧＴＡは細胞傷害性顆粒のエキソサイトーシスをブロックするため、ＧｚＢが媒介する殺滅を消去すると予想される。予想通り、５ｍＭのＥＧＴＡの存在下で腫瘍細胞と共培養されたＣＡＲ４細胞は、３つの異なる細胞株、Ｄａｕｄｉ−β２ｍ、ＮＡＬＭ−６およびＣＤ１９＋ＥＬ４にわたり腫瘍細胞殺滅の実質的な低減を実証した（図３９Ｄ）。ＣＡＲ４細胞が媒介する殺滅が完全に無効になったＤａｕｂｉ−β２ｍ腫瘍細胞で最も著しい低減が見られた（図３９Ｄ）。
[00340]実施例３．１６．ＣＡＲ ＋ Ｔ細胞運命は腫瘍−細胞密度に依存する
[00341]ＡＩＣＤは、Ｔ細胞が機能的な活性化に応答してプログラム化されたアポトーシスを受けるメカニズムである。ＡＩＣＤを受ける個々の細胞溶解性ＣＡＲ＋Ｔ細胞の頻度および速度論を、高いおよび低い腫瘍密度という２つの条件下でモニタリングした。単一の標的のアポトーシスを誘導するＣＡＲ８細胞は、同じドナーからのマルチキラーＣＡＲ８細胞と比較して（ｔＡＩＣＤ、３７１±２９分、図４０Ａ）、ＡＩＣＤより有意に速い速度論を実証した（ｔＡＩＣＤ、２２１±１４分）。このより低い腫瘍細胞密度におけるより速いＡＩＣＤの速度論という傾向はまた、遅い速度論であったがＣＡＲ４細胞でも観察された（図４０Ａ）。同じ腫瘍細胞密度での異なる表現型を有する細胞の直接の比較から、シングルキラーＣＡＲ８細胞は、ＣＡＲ４細胞（ｔＡＩＣＤ、３２８±１９分）と比較してより速いＡＩＣＤ（ｔＡＩＣＤ、２２１±１４分）を受けたことが表示された（図４０Ａ）。マルチキラーは効率的にＡＩＣＤに耐性を有するという予測と一致して、４人のドナーのうち３人からのこれらのＴ細胞は、ＡＩＣＤを受けた細胞の低い頻度を表した（１３〜２５％、図４０Ｂ）。しかしながら、最後のドナーからのマルチキラーＴ細胞は、上昇した頻度で（５８％）ＡＩＣＤを表したことから、複数の腫瘍細胞に作用するマルチキラーの効率は、それらがＡＩＣＤに耐性を有する能力を有する状況下で評価しなければならないことが強調される（図４０Ｂ）。
[00342]出願人は、ナノウェルのグリッド内でＣＡＲ８細胞をＣＤ１９−ＥＬ４細胞と共にインキュベートすることによって、観察されたエフェクターのアポトーシスは機能的な抗原性刺激を必要としたことを確認し、それらをＴＩＭＩＮＧを使用して画像化した。これらの条件下でのアポトーシスのエフェクターの頻度はわずか４％であったことから、これも、現行の画像化条件下では光毒性はごくわずかであったことの確証になった。
[00343]重要なことに、４人全てのドナーにわたり、ＡＩＣＤを受けた細胞溶解性ＣＡＲ＋Ｔ細胞の頻度は、１：１のＥ：Ｔで、マルチキラーＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較してより高く、この作用は、ＣＡＲ８細胞でより誇張された（図４０Ｂ）。これらのデータは、ＣＤ１９＋腫瘍量が低下する場合、注入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞の数の減少に加えて消失さえも説明するのに役立ち得る。
[00344]実施例３．１７．要約
[00345]この実施例において、出願人は、ハイスループットの単一細胞のアッセイ（ＴＩＭＩＮＧ）を実行して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の機能性を動的にプロファイリングした。出願人の単一細胞レベルにおける分析から、ＣＡＲ８細胞とほぼ同様に、ＣＡＲ４細胞は、速度論の変化にもかかわらず、腫瘍細胞の殺滅に直接従事できることが実証される。出願人はさらに、ＣＡＲ４細胞は、複数の腫瘍細胞への同時に起こるコンジュゲーションを介して複数殺滅に参加することができることを実証する。
[00346]低い腫瘍細胞密度において（Ｅ：Ｔは１：１）、シングルキラーＣＡＲ８細胞の大半が、腫瘍細胞殺滅において、個々のＣＡＲ４細胞と比較してより有意に速かった（図３７Ｅ）。それに対して、それらの高い基底の運動性を特徴とするＳ１サブグループ内のシングルキラーＣＡＲ８およびＣＡＲ４細胞の両方が、腫瘍細胞殺滅の速度論における有意差を表さなかった。さらに、集団の残りとは対照的に、Ｓ１サブグループ中のＣＡＲ８およびＣＡＲ４細胞においてエフェクターのアポトーシスの頻度は低かった。集合的に、これらのデータから、ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＡＲ４またはＣＡＲ８）の高い基底の運動性は、ＡＩＣＤに関する性質を減少させて効率的なキラーの同定を助長する可能性があることが示唆された。
[00347]数が増加した腫瘍細胞と相互作用したところ（１：２〜１：５のＥ：Ｔ比率）、個々のＣＡＲ４およびＣＡＲ８細胞の両方は、複数の腫瘍細胞に効率的にコンジュゲートして、多重化殺滅を容易にした。これらの個々のマルチキラーＣＡＲ４／ＣＡＲ８細胞によって殺滅された異なる腫瘍細胞間の比較から、それらは、第１および第２の標的の殺滅の本質的に不変の殺滅効率（ｔＣｏｎｔａｃｔ）を表しただけでなく、１つのみの腫瘍細胞と共にインキュベートした（シングルキラー）ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較しても本質的に不変の殺滅効率（ｔＣｏｎｔａｃｔ）を表したことが実証された（データは示されない）。しかしながら、ＣＡＲ４細胞をＣＡＲ８細胞と比較したところ、１：１のＥ：Ｔ比率におけ観察と一致して、ＣＡＲ４細胞は腫瘍細胞殺滅においてより有意に遅かった。単一細胞レベルでの細胞内染色から、ＣＡＲ４およびＣＡＲ８細胞の反応速度効率における差の分子の発端は、それらのＧｚＢ含量が原因の可能性があることが示され、これをさらに、ＥＧＴＡを使用して顆粒のエキソサイトーシスをブロックすることによって確認した（図３９）。
[00348]ＣＡＲ４およびＣＡＲ８細胞の両方について、シングルキラーエフェクターは、マルチキラーＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較してより高い頻度およびより速い速度論でアポトーシスを受けた（図２９および３７）。これらのデータから、複数の標的にわたる溶解に関する活性化は、単一の標的との長期のコンジュゲーションとは対照的に、エフェクターのアポトーシスに関する性質を低減することが示される。これらのＴ細胞の抗原／標的密度に対する応答性に関する機械論的な基準は公知ではないが、規定の比率での放射線照射されたａＡＰＣにおけるこれらの細胞の連続的な伝播は、ＡＩＣＤを最小化しつつバランスの取れた活性化を可能にすると考えられる。集合的に、これらのデータから、多数のＣＤ１９＋腫瘍細胞の割り当てに応答して、注入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞の数が膨れ上がるが、エフェクターＴ細胞による複数殺滅のために腫瘍の生物学的負荷量が低減するにつれて数が下落するという観察への機械論的な識見を提供することができる。
[00349]概して、ＣＡＲ４細胞およびＣＡＲ８細胞の比較から、ＣＡＲ４細胞は殺滅および複数殺滅に参加できる一方で、それらは、おそらくより低いＧｚＢ含量のためにより遅い速度でそれを行うことが実証される。しかしながらこの減少した反応速度効率は、わずかに不利な可能性があり、出願人のナノウェルシステムでプロファイリングされたように、他の細胞からの助けの非存在下においてこれらの細胞がＡＩＣＤを受けるそれらの性質の減少によって相殺される。出願人は、この実施例においてＣＡＲ＋Ｔ細胞間の不均質性に焦点を当ててきたが、ここで示された結果は、腫瘍細胞における基礎となる不均質性の影響を受ける可能性もある。出願人のアッセイで標的として使用される細胞においてＣＤ１９の発現は均質であるが、ＣＡＲ＋Ｔ細胞が媒介する殺滅に耐性を有する腫瘍細胞の部分集団が存在し得る可能性がある。
[00350]実施例４．ＣＡＲ＋Ｔ細胞の効能の単一細胞における測定法
[00351]Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のためのＣＤ１９特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ヘテロジニアスな集団を包含する。Ｔ細胞の抗腫瘍効能の最もよく説明されている機能的な属性としては、なかでも、細胞傷害性（腫瘍細胞に対する）および持続する能力が挙げられる。単一細胞レベルにおけるこれらのＴ細胞の機能の直接的な測定は、細胞間相互作用、細胞移動、遺伝子発現、標的細胞を殺滅するそれらの能力およびエフェクター細胞の生存などの複数のパラメーターを同時にモニタリングすることを必要とする。
[00352]この実施例において、出願人は、単一細胞の手法は、インビトロで事前にＣＡＲ＋Ｔ細胞の効力を特徴付けるのに使用できることを実証する。２種の異なるＣＡＲコンストラクトの比較において、出願人は、腫瘍細胞に対する細胞傷害性と定義されたインビトロでの効力は、腫瘍細胞の進行を制御するインビボでの効能と一致していたことを示した。さらに、このアプローチにより、出願人は、効率的なキラーＣＡＲ＋Ｔ細胞が、より高いレベルのグランザイムＢ、（ＧＺＭＢ）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）およびＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２）を発現すると同定することができた。
[00353]図４１で例示されているように、ＴＩＭＩＮＧアッセイに続いて、単一細胞の遺伝子発現プロファイリングを利用した。図４２で示されるように、インビトロにおけるＣＡＲコンストラクトの比較から、ＩｇＧ４ヒンジに対してＣＤ８ヒンジを発現するＴ細胞の最適な運動性が実証された。図４３で示されるように、ＣＤ８ヒンジＣＡＲ＋Ｔ細胞は、より速くより多くの量で腫瘍細胞を殺滅する。
[00354]４時間のＴＩＭＩＮＧアッセイ後に単一ＣＡＲ＋Ｔ細胞を回収し、多重化ＲＴ−ｑＰＣＲによってアッセイした。細胞傷害性ＣＡＲ＋Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイルは、より高い発現レベルのＣＤ１３７、ＴＩＭ３およびＧＺＭＢ転写物を明らかにする。図４４に、遺伝子転写物のボルケーノプロット（細胞傷害性対非細胞傷害性）を示す。図４５に、３人のドナーの差次的に発現される遺伝子のベン図を示す。
[00355]図４６は、ＣＤ１３７が、活性化されたＣＡＲ＋Ｔ細胞および脱顆粒ＣＡＲ＋Ｔ細胞においてより高いレベルで発現されることを示す。図４７は、ＣＤ１３７刺激が、枯渇マーカーを減少させるが、その一方でＴＩＭ３の標的化は、ＣＴＬＡ４を誘導することを示す。図４８は、ＣＤ１３７およびＴＩＭ３の標的化が、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害性を増加させることを示す。図４９は、ＣＤ１３７およびＴＩＭ３の標的化が、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の殺滅および連続殺滅の速度論を増加させることを示す。
[00356]まとめると、この実施例から、ＴＩＭＩＮＧは、インビトロにおける個々のＴ細胞の動的なモニタリングを提供し、単一細胞の解像で細胞傷害性、サイトカイン分泌および遺伝子発現の同時測定を可能にすることが実証される。さらに、インビトロにおける個々のＣＡＲ＋Ｔ細胞の運動性および機能性の観察は、インビボにおける効能を予測することができる。
[00357]出願人はまた、この実施例において、ＣＤ１３７は細胞傷害性ＣＡＲ＋Ｔ細胞において動的に誘導されることも実証する。さらに、それに続く標的化は、枯渇を低減しながらＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害性を改善する。ＴＩＭ３転写物は細胞傷害性細胞中で濃縮され、タンパク質レベルでの標的化はＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害性を押し上げる。
[00358]これ以上詳述しないが、当業者であれば、本明細書の記載を使用して、本発明の開示を最大限利用できると考えられる。本明細書に記載の実施態様は、例示的なものであり、開示されていない部分をいかようにも決して拘束しないと解釈されるものとする。実施態様を示し説明してきたが、それらの多くの変化および改変を発明の本質および教示から逸脱することなく当業者によってなすことができる。したがって、保護範囲は上述された説明によって限定されないが、特許請求の範囲とその主題と等価な全てのものによってのみ限定される。本明細書において引用された全ての特許、特許出願および公報の開示は、それらが本明細書に記載のものに一致して、さらにそれに加えて手続き上または他の詳細を提供する程度に、ここでの参照により本明細書に組み入れられる。
これらに限定されるものではないが、本発明は以下の態様の発明を包含する。
[１］ 細胞活性を評価する方法であって、
（ａ）領域上に細胞集団を設置する工程；
（ｂ）該細胞集団の動的な挙動を、時間の関数としてアッセイする工程；
（ｃ）該動的な挙動に基づいて、１つまたはそれより多くの目的の細胞を同定する工程；
（ｄ）１つまたはそれより多くの同定された細胞の分子プロファイルを特徴付ける工程；および
（ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）から得られた情報を相関させる工程
を含む、上記方法。
[２］ 前記細胞集団を得る工程をさらに含む、[１］に記載の方法。
[３］ 前記細胞集団が、組織または血液サンプルから得られる、[２］に記載の方法。
[４］ 前記細胞集団が、フローサイトメトリー、陽性フローソーティング、陰性フローソーティング、磁気によるソーティング、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって得られる、[１］に記載の方法。
[５］ 前記細胞集団が、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、原核細胞、真核細胞、単細胞の細胞、多細胞の細胞、免疫細胞、およびそれらの組合せからなる群より選択される細胞を含む、[１］に記載の方法。
[６］ 前記細胞集団が、免疫細胞を含む、[１］に記載の方法。
[７］ 前記細胞集団が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、腫瘍細胞、腫瘍幹細胞、腫瘍浸潤リンパ球、およびそれらの組合せからなる群より選択される細胞を含む、[１］に記載の方法。
[８］ 前記細胞集団が、Ｔ細胞を含む、[１］に記載の方法。
[９］ 前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、遺伝子改変されたＴ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変されたＴ細胞、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[８］に記載の方法。
[１０］ 前記細胞集団が、腫瘍細胞および免疫細胞を含む、[１］に記載の方法。
[１１］ 前記細胞集団が、個々の細胞として前記領域上に設置される、[１］に記載の方法。
[１２］ 前記領域が、複数の容器を含む、[１］に記載の方法。
[１３］ 前記容器が、ウェル、チャネル、区画、およびそれらの組合せの少なくとも１つの形態である、[１２］に記載の方法。
[１４］ 前記容器が、アレイの形態である、[１２］に記載の方法。
[１５］ 前記動的な挙動が、細胞の活性化、細胞の阻害、細胞の相互作用、タンパク質発現、タンパク質分泌、代謝産物分泌、脂質プロファイルの変化、微小胞分泌、エキソソーム分泌、微粒子分泌、細胞質量の変化、細胞増殖、細胞形態の変化、運動性、細胞死、細胞の細胞傷害性、細胞溶解、細胞膜の分極、シナプスの確立、タンパク質の動的なトラフィッキング、顆粒の分極、カルシウム活性化、代謝変化、小分子分泌、プロトン分泌、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[１］に記載の方法。
[１６］ 前記動的な挙動が、運動性を含む、[１］に記載の方法。
[１７］ 前記動的な挙動が、細胞の相互作用を含む、[１］に記載の方法。
[１８］ 前記細胞の相互作用が、異種細胞の相互作用、同種細胞の相互作用、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[１７］に記載の方法。
[１９］ 前記動的な挙動が、運動性、細胞の細胞傷害性、細胞死、タンパク質分泌、細胞の相互作用、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[１］に記載の方法。
[２０］ 前記アッセイする工程が、前記動的な挙動を可視化することによって行われる、[１］に記載の方法。
[２１］ 前記可視化することが、顕微鏡法、微速度撮影画像化顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、多光子顕微鏡法、定量位相差顕微鏡法、表面増強ラマン分光法、ビデオ撮影術、手作業の視覚分析、自動化された視覚分析、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって行われる、[２０］に記載の方法。
[２２］ 前記可視化することが、微速度撮影画像化顕微鏡法によって行われる、[２０］に記載の方法。
[２３］ 前記アッセイする工程が、前記細胞集団を標識することを含む、[１］に記載の方法。
[２４］ 前記細胞集団が、蛍光ベースの検出試薬で細胞を染色することによって標識される、[２３］に記載の方法。
[２５］ 前記アッセイが、自動的に行われる、[１］に記載の方法。
[２６］ 前記アッセイが、アルゴリズムの使用を介して自動的に行われる、[２５］に記載の方法。
[２７］ 前記アッセイする工程が、動的な挙動の定量化を含む、[１］に記載の方法。
[２８］ 前記アッセイする工程が、単一細胞レベルで行われる、[１］に記載の方法。
[２９］ 前記動的な挙動が、運動性を含み、該運動性は、細胞の配置、細胞の動き、細胞の転移、細胞の速度、前記領域上での細胞の動きの経路、細胞の浸潤、細胞のトラフィッキング、およびそれらの組合せの少なくとも１つを評価することによってアッセイされる、[１］に記載の方法。
[３０］ 前記動的な挙動が、細胞死を含み、該細胞死は、アポトーシスマーカーを検出することによって評価される、[１］に記載の方法。
[３１］ 前記動的な挙動が、細胞の細胞傷害性を含み、該細胞の細胞傷害性は、前記細胞集団からの細胞傷害性分子の放出を評価することによってアッセイされる、[１］に記載の方法。
[３２］ 前記動的な挙動が、細胞の相互作用を含み、該細胞の相互作用は、細胞の相互作用の持続時間、細胞の相互作用の数、カルシウム活性化、顆粒の分極、タンパク質局在化、細胞の相互作用中の運動性、細胞の相互作用の終結、およびそれらの組合せを評価することによってアッセイされる、[１］に記載の方法。
[３３］ 前記動的な挙動が、細胞死および細胞の相互作用を含み、該動的な挙動は、第１の細胞の接触から死までの時間、細胞死の前の細胞接触の数、第１の細胞の接触から標的細胞死までの細胞の相互作用の累積的な持続時間（ｔＣｏｎｔａｃｔ）、第１の細胞の接触から標的細胞死までの時間（ｔＤｅａｔｈ）、細胞接触の終結から標的細胞死までの時間、個々の細胞によって引き起こされる細胞死の数、およびそれらの組合せの少なくとも１つを評価することによってアッセイされる、[１］に記載の方法。
[３４］ 前記アッセイする工程が、前記領域と連携するセンサーの使用を含む、[１］に記載の方法。
[３５］ 前記センサーが、分析物結合剤を含む、[３４］に記載の方法。
[３６］ 前記分析物結合剤が、遺伝子、ヌクレオチド配列、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、アンチセンスペプチド、アンチジーンペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、抗体、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[３５］に記載の方法。
[３７］ 前記分析物結合剤が、目的の分析物に対するものである、[３６］に記載の方法。
[３８］ 前記目的の分析物が、分泌されたタンパク質、細胞溶解産物の要素、細胞受容体、代謝産物、脂質、微小胞、エキソソーム、微粒子、小分子、プロトン、炭水化物、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[３７］に記載の方法。
[３９］ 前記目的の分析物が前記センサーによって捕獲され、続いて前記目的の分析物が特徴付けられる、[３７］に記載の方法。
[４０］ 前記目的の分析物が、質量分析、シーケンシング、顕微鏡法、核酸ハイブリダイゼーション、イムノアッセイベースの検出、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって特徴付けられる、[３９］に記載の方法。
[４１］ 前記センサーが、ビーズの形態である、[３４］に記載の方法。
[４２］ 前記ビーズが、約１μｍから約１０μｍの範囲の直径を含む、[４１］に記載の方法。
[４３］ 前記ビーズが、約３μｍから約５μｍの範囲の直径を含む、[４１］に記載の方法。
[４４］ 前記センサーが、前記細胞集団中の単一細胞の前記動的な挙動をリアルタイムでアッセイするのに利用される、[３４］に記載の方法。
[４５］ 前記動的な挙動が、細胞の活性化、細胞の阻害、タンパク質分泌、微小胞分泌、エキソソーム分泌、微粒子分泌、代謝産物分泌、小分子分泌、プロトン分泌、タンパク質発現、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[３４］に記載の方法。
[４６］ 前記動的な挙動が、タンパク質発現を含み、該タンパク質発現が、前記センサーによって、細胞溶解産物の要素の捕獲を介してアッセイされる、[３４］に記載の方法。
[４７］ 前記動的な挙動がタンパク質分泌を含み、該タンパク質分泌が、前記センサーによって、分泌されたタンパク質の捕獲を介してアッセイされる、[３４］に記載の方法。
[４８］ 前記センサーが、前記アッセイ中の前記細胞集団のオートフォーカシングを可能にするための基準マーカーとして利用される、[３４］に記載の方法。
[４９］ 前記細胞集団が、前記センサーとのインキュベーションの前に溶解される、[３４］に記載の方法。
[５０］ 前記アッセイする工程が、所定期間にわたり連続的なインターバルで行われる、[１］に記載の方法。
[５１］ 前記所定期間が、約１時間から約２４時間の範囲である、[５０］に記載の方法。
[５２］ 前記連続的なインターバルが、約１分から約１０分の範囲である、[５０］に記載の方法。
[５３］ 前記１つまたはそれより多くの細胞が、アルゴリズムの使用を介して自動的に同定される、[１］に記載の方法。
[５４］ 特徴付けられた前記１つまたはそれより多くの同定された細胞の分子プロファイルが、転写活性、トランスクリプトームのプロファイル、遺伝子発現活性、ゲノムプロファイル、タンパク質発現活性、プロテオームのプロファイル、タンパク質の相互作用活性、細胞受容体の発現活性、脂質プロファイル、脂質活性、炭水化物プロファイル、微小胞活性、グルコース活性、代謝プロファイル、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[１］に記載の方法。
[５５］ 前記特徴付けが、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、タンパク質分析、脂質分析、代謝産物分析、質量分析、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって行われる、[１］に記載の方法。
[５６］ 前記特徴付けが、ＲＮＡまたはＤＮＡのシーケンシングによって行われる、[１］に記載の方法。
[５７］ 前記ＲＮＡまたはＤＮＡのシーケンシングが、全トランスクリプトームの分析、全ゲノム分析、ゲノムの全区域または標的化された区域のバーコード化されたシーケンシング、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって行われる、[５６］に記載の方法。
[５８］ 前記特徴付けが、タンパク質分析によって行われる、[１］に記載の方法。
[５９］ 前記タンパク質分析が、プロテオームレベルで、多重化された蛍光染色によって行われる、[５８］に記載の方法。
[６０］ 前記相関させる工程が、アッセイされた動的な挙動および特徴付けられた分子プロファイルを統合することを含む、[１］に記載の方法。
[６１］ 前記相関させる工程が、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞の前記運動性を、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞の遺伝子発現または転写活性に相関させることを含む、[１］に記載の方法。
[６２］ 前記相関させる工程が、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞の運動性を、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞のタンパク質の相互作用活性に相関させることを含む、[１］に記載の方法。
[６３］ 前記相関させる工程が、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞の細胞の相互作用活性を、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞のタンパク質発現活性に相関させることを含む、[１］に記載の方法。
[６４］ 前記方法が、処置の臨床転帰を予測すること、細胞をスクリーニングすること、細胞を回収すること、処置を容易にすること、疾患を診断すること、細胞活性をモニタリングすること、およびそれらの組合せの少なくとも１つのために利用される、[１］に記載の方法。
[６５］ 前記方法が、処置を容易にするのに利用され、該処置は、免疫療法を含む、[１］に記載の方法。
[６６］ 前記方法が、細胞活性をモニタリングするのに利用され、該細胞活性は、免疫応答を含む、[１］に記載の方法。
[６７］ 前記方法が、細胞をスクリーニングするのに利用され、該細胞は、マルチキラーＴ細胞を含む、[１］に記載の方法。
[６８］ 細胞活性を評価する方法であって、
（ａ）センサーと連携する領域上に細胞集団を設置する工程；および
（ｂ）該細胞集団の動的な挙動を、時間の関数としてアッセイする工程
を含む、上記方法。
[６９］ 前記センサーが、前記領域上に固定されている、[６８］に記載の方法。
[７０］ 前記センサーが、分析物結合剤を含む、[６８］に記載の方法。
[７１］ 前記分析物結合剤が、遺伝子、ヌクレオチド配列、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、アンチセンスペプチド、アンチジーンペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、抗体、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[７０］に記載の方法。
[７２］ 前記分析物結合剤が、目的の分析物に対するものである、[７０］に記載の方法。
[７３］ 前記目的の分析物が、分泌されたタンパク質、細胞溶解産物の要素、細胞受容体、代謝産物、脂質、微小胞、エキソソーム、微粒子、小分子、プロトン、炭水化物、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[７２］に記載の方法。
[７４］ 前記目的の分析物が前記センサーによって捕獲され、前記目的の分析物が特徴付けられる、[７２］に記載の方法。
[７５］ 前記目的の分析物が、質量分析、シーケンシング、顕微鏡法、核酸ハイブリダイゼーション、イムノアッセイベースの検出、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって特徴付けられる、[７４］に記載の方法。
[７６］ 前記センサーが、ビーズの形態である、[６８］に記載の方法。
[７７］ 前記ビーズが、約１μｍから約１０μｍの範囲の直径を含む、[７６］に記載の方法。
[７８］ 前記ビーズが、約３μｍから約５μｍの範囲の直径を含む、[７６］に記載の方法。
[７９］ 前記センサーが、前記細胞集団の前記動的な挙動をリアルタイムでアッセイするのに利用される、[６８］に記載の方法。
[８０］ 前記センサーが、前記細胞集団中の単一細胞の前記動的な挙動をリアルタイムでアッセイするのに利用される、[６８］に記載の方法。
[８１］ 前記動的な挙動が、細胞の活性化、細胞の阻害、細胞の相互作用、タンパク質発現、タンパク質分泌、微小胞分泌、エキソソーム分泌、微粒子分泌、代謝産物分泌、小分子分泌、プロトン分泌、細胞増殖、細胞形態の変化、運動性、細胞死、細胞の細胞傷害性、細胞溶解、細胞膜の分極、シナプスの確立、タンパク質の動的なトラフィッキング、顆粒の分極、カルシウム活性化、代謝変化、代謝産物分泌、脂質の変化、微小胞分泌、エキソソーム分泌、微粒子分泌、細胞質量の変化、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[６８］に記載の方法。
[８２］ 前記アッセイする工程が、前記動的な挙動を可視化することによって行われる、[６８］に記載の方法。
[８３］ 前記可視化することが、顕微鏡法、微速度撮影画像化顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、多光子顕微鏡法、定量位相差顕微鏡法、表面増強ラマン分光法、ビデオ撮影術、手作業の視覚分析、自動化された視覚分析、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって行われる、[８２］に記載の方法。
[８４］ 前記動的な挙動が、タンパク質発現を含み、該タンパク質発現が、前記センサーによって、細胞溶解産物の要素の捕獲を介してアッセイされる、[６８］に記載の方法。
[８５］ 前記動的な挙動がタンパク質分泌を含み、該タンパク質分泌が、前記センサーによって、分泌されたタンパク質の捕獲を介してアッセイされる、[６８］に記載の方法。
[８６］ 前記センサーが、前記アッセイ中の前記細胞集団のオートフォーカシングを可能にするための基準マーカーとして利用される、[６８］に記載の方法。
[８７］ 前記細胞集団が、前記センサーと共にインキュベートされる、[６８］に記載の方法。
[８８］ 前記細胞集団が、前記センサーとのインキュベーションの前に溶解される、[６８］に記載の方法。
[８９］ 前記細胞集団が、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、原核細胞、真核細胞、単細胞の細胞、多細胞の細胞、免疫細胞、およびそれらの組合せからなる群より選択される細胞を含む、[６８］に記載の方法。
[９０］ 前記細胞集団が、免疫細胞を含む、[６８］に記載の方法。
[９１］ 前記細胞集団が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、腫瘍細胞、腫瘍幹細胞、腫瘍浸潤リンパ球、およびそれらの組合せからなる群より選択される細胞を含む、[６８］に記載の方法。
[９２］ 前記細胞集団が、Ｔ細胞を含む、[６８］に記載の方法。
[９３］ 前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、遺伝子改変されたＴ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変されたＴ細胞、およびそれらの組合せからなる群より選択される、[９２］に記載の方法。

Claims (12)

  1. （ａ）領域上に細胞集団を設置する工程；
    （ｂ）該細胞集団の動的な挙動を、単一細胞レベルで、時間の関数としてアッセイする工程；
    （ｃ）該動的な挙動に基づいて、１つまたはそれより多くの目的の細胞を同定する工程；
    （ｄ）１つまたはそれより多くの同定された細胞の分子プロファイルを、単一細胞レベルで特徴付ける工程；および
    （ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）から得られた情報を、単一細胞レベルで相関させる工程；
    を含む、細胞活性を評価する方法であって、
    相関工程が、アッセイされた動的な挙動と、特徴付けられた分子プロファイルと、を統合することを含む、上記方法。
  2. 前記細胞集団を得る工程をさらに含み、ここで前記細胞集団は、組織または血液サンプルから得られてもよい、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞集団が、
    （ａ）フローサイトメトリー、陽性フローソーティング、陰性フローソーティング、磁気によるソーティング、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって得られる；
    （ｂ）植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、原核細胞、真核細胞、単細胞の細胞、多細胞の細胞、免疫細胞、およびそれらの組合せからなる群より選択される細胞を含む；
    （ｃ）免疫細胞を含む；
    （ｄ）Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、腫瘍細胞、腫瘍幹細胞、腫瘍浸潤リンパ球、およびそれらの組合せからなる群より選択される細胞を含む；
    （ｅ）Ｔ細胞を含み、ここで前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、遺伝子改変されたＴ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変されたＴ細胞、およびそれらの組合せからなる群より選択されてもよい；
    （ｆ）腫瘍細胞および免疫細胞を含む；または
    （ｇ）個々の細胞として前記領域上に設置される；
    請求項１に記載の方法。
  4. 前記領域が、複数の容器を含み、ここで前記容器は、
    （ｉ）ウェル、チャネル、区画、およびそれらの組合せの少なくとも１つ；または
    （ｉｉ）アレイ；
    の形態であってもよい、請求項１に記載の方法。
  5. 前記動的な挙動が、
    （ａ）細胞の活性化、細胞の阻害、細胞の相互作用、タンパク質発現、タンパク質分泌、代謝産物分泌、脂質プロファイルの変化、微小胞分泌、エキソソーム分泌、微粒子分泌、細胞質量の変化、細胞増殖、細胞形態の変化、運動性、細胞死、細胞の細胞傷害性、細胞溶解、細胞膜の分極、シナプスの確立、タンパク質の動的なトラフィッキング、顆粒の分極、カルシウム活性化、代謝変化、小分子分泌、プロトン分泌、およびそれらの組合せからなる群より選択される；
    （ｂ）運動性を含む；
    （ｃ）細胞の相互作用を含み、ここで前記細胞の相互作用は、異種細胞の相互作用、同種細胞の相互作用、およびそれらの組合せからなる群より選択されてもよい；
    （ｄ）運動性、細胞の細胞傷害性、細胞死、タンパク質分泌、細胞の相互作用、および、それらの組合せからなる群より選択される；
    （ｅ）運動性を含み、該運動性は、細胞の配置、細胞の動き、細胞の転移、細胞の速度、前記領域上での細胞の動きの経路、細胞の浸潤、細胞のトラフィッキング、およびそれらの組合せの少なくとも１つを評価することによってアッセイされる；
    （ｆ）細胞死を含み、該細胞死は、アポトーシスマーカーを検出することによって評価される；
    （ｇ）細胞の細胞傷害性を含み、該細胞の細胞傷害性は、前記細胞集団からの細胞傷害性分子の放出を評価することによってアッセイされる；
    （ｈ）細胞の相互作用を含み、該細胞の相互作用は、細胞の相互作用の持続時間、細胞の相互作用の数、カルシウム活性化、顆粒の分極、タンパク質局在化、細胞の相互作用中の運動性、細胞の相互作用の終結、およびそれらの組合せを評価することによってアッセイされる；または
    （ｉ）細胞死および細胞の相互作用を含み、該動的な挙動は、第１の細胞の接触から死までの時間、細胞死の前の細胞接触の数、第１の細胞の接触から標的細胞死までの細胞の相互作用の累積的な持続時間（ｔＣｏｎｔａｃｔ）、第１の細胞の接触から標的細胞死までの時間（ｔＤｅａｔｈ）、細胞接触の終結から標的細胞死までの時間、個々の細胞によって引き起こされる細胞死の数、およびそれらの組合せの少なくとも１つを評価することによってアッセイされる；
    請求項１に記載の方法。
  6. 前記アッセイする工程が、前記動的な挙動を可視化することによって行われ、
    ここで前記可視化することは、
    （ｉ）顕微鏡法、微速度撮影画像化顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、多光子顕微鏡法、定量位相差顕微鏡法、表面増強ラマン分光法、ビデオ撮影術、手作業の視覚分析、自動化された視覚分析、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって；または
    （ｉｉ）微速度撮影画像化顕微鏡法によって；
    行われてもよい、請求項１に記載の方法。
  7. 前記アッセイする工程が、
    （ａ）前記細胞集団を標識することを含み、ここで前記細胞集団は、蛍光ベースの検出試薬で細胞を染色することによって標識されてもよい；
    （ｂ）自動的に行われ、ここで前記アッセイする工程は、アルゴリズムの使用を介して自動的に行われてもよい；
    （ｃ）動的な挙動の定量化を含む；または
    （ｄ）単一細胞レベルで行われる；
    請求項１に記載の方法。
  8. 前記アッセイする工程が、前記領域と連携するセンサーの使用を含む、請求項１に記載の方法。
  9. （ａ）前記センサーが、分析物結合剤を含み；ここで、
    （ｂ）前記分析物結合剤は、遺伝子、ヌクレオチド配列を含む物、ＲＮＡｉのためのＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、アンチセンスペプチド、アンチジーンペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、抗体、およびそれらの組合せからなる群より選択されてもよく；ここで、
    （ｃ）前記分析物結合剤は、目的の分析物に対するものであってもよく；ここで、
    （ｉ）前記目的の分析物は、分泌されたタンパク質、細胞溶解産物、細胞受容体、代謝産物、脂質、微小胞、エキソソーム、微粒子、小分子、プロトン、炭水化物、およびそれらの組合せからなる群より選択されてもよく；または
    （ｉｉ）前記目的の分析物は前記センサーによって捕獲されてもよく、続いて前記目的の分析物が特徴付けられ、ここで前記目的の分析物は、質量分析、シーケンシング、顕微鏡法、核酸ハイブリダイゼーション、イムノアッセイベースの検出、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって特徴付けられてもよい；
    請求項８に記載の方法。
  10. 前記センサーが、ビーズの形態であり、ここで、
    （ｉ）前記ビーズは、約１μｍから約１０μｍの範囲の直径を含んでもよく；または
    （ｉｉ）前記ビーズは、約３μｍから約５μｍの範囲の直径を含んでもよい；
    請求項８に記載の方法。
  11. （ａ）前記センサーが、前記細胞集団中の単一細胞の前記動的な挙動をリアルタイムでアッセイするのに利用される；
    （ｂ）前記動的な挙動が、細胞の活性化、細胞の阻害、タンパク質分泌、微小胞分泌、エキソソーム分泌、微粒子分泌、代謝産物分泌、小分子分泌、プロトン分泌、タンパク質発現、およびそれらの組合せからなる群より選択される；
    （ｃ）前記動的な挙動が、タンパク質発現を含み、該タンパク質発現が、前記センサーによって、細胞溶解産物の捕獲を介してアッセイされる；
    （ｄ）前記動的な挙動がタンパク質分泌を含み、該タンパク質分泌が、前記センサーによって、分泌されたタンパク質の捕獲を介してアッセイされる；
    （ｅ）前記センサーが、前記アッセイ中の前記細胞集団のオートフォーカシングを可能にするための基準マーカーとして利用される；または
    （ｆ）前記細胞集団が、前記センサーとのインキュベーションの前に溶解される；
    請求項８に記載の方法。
  12. （ａ）前記アッセイする工程が、所定期間にわたり連続的なインターバルで行われ、ここで、
    （ｉ）前記所定期間は、約１時間から約２４時間の範囲であってもよく、または
    （ｉｉ）前記連続的なインターバルは、約１分から約１０分の範囲であってもよい；
    （ｂ）前記１つまたはそれより多くの細胞が、アルゴリズムの使用を介して自動的に同定される；
    （ｃ）特徴付けられた前記１つまたはそれより多くの同定された細胞の分子プロファイルが、転写活性、トランスクリプトームのプロファイル、遺伝子発現活性、ゲノムプロファイル、タンパク質発現活性、プロテオームのプロファイル、タンパク質の相互作用活性、細胞受容体の発現活性、脂質プロファイル、脂質活性、炭水化物プロファイル、微小胞活性、グルコース活性、代謝プロファイル、およびそれらの組合せからなる群より選択される；
    （ｄ）前記特徴付ける工程が、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、タンパク質分析、脂質分析、代謝産物分析、質量分析、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって行われる；
    （ｅ）前記特徴付ける工程が、ＲＮＡまたはＤＮＡのシーケンシングによって行われ、ここで前記ＲＮＡまたはＤＮＡのシーケンシングは、全トランスクリプトームの分析、全ゲノム分析、ゲノムの全区域または標的化された区域のバーコード化されたシーケンシング、およびそれらの組合せからなる群より選択される方法によって行われてもよい；
    （ｆ）前記特徴付ける工程が、タンパク質分析によって行われ、ここで前記タンパク質分析は、プロテオームレベルで、多重化された蛍光染色によって行われてもよい；
    （ｇ）前記相関させる工程が、アッセイされた動的な挙動および特徴付けられた分子プロファイルを統合することを含む；
    （ｈ）前記相関させる工程が、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞の運動性を、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞の遺伝子発現または転写活性に相関させることを含む；
    （ｉ）前記相関させる工程が、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞の運動性を、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞のタンパク質の相互作用活性に相関させることを含む；
    （ｊ）前記相関させる工程が、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞の細胞の相互作用活性を、前記１つまたはそれより多くの同定された細胞のタンパク質発現活性に相関させることを含む；
    （ｋ）前記方法が、処置の臨床転帰を予測すること、細胞をスクリーニングすること、細胞を回収すること、処置を容易にすること、疾患を診断すること、細胞活性をモニタリングすること、およびそれらの組合せの少なくとも１つのために利用される；
    （ｌ）前記方法が、処置を容易にするのに利用され、該処置は、免疫療法を含む；
    （ｍ）前記方法が、細胞活性をモニタリングするのに利用され、該細胞活性は、免疫応答を含む；または
    （ｎ）前記方法が、細胞をスクリーニングするのに利用され、該細胞は、マルチキラーＴ細胞を含む；
    請求項１に記載の方法。
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