JP6830496B2 - 遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセット、及びその調製方法と応用 - Google Patents

遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセット、及びその調製方法と応用 Download PDF

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Description

本発明は核酸シーケンシングの技術分野に関し、具体的には、遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセット、及びその調製方法と応用に関する。
現在の次世代シーケンシングでは、サンプル調製（ライブラリー調製）や装置システムそのものの要因で（ＤＮＡ自体の酸化損傷や脱アミノ損失などライブラリー調製過程におけるＰＣＲ酵素複製時に入り込む突然変異、シーケンシング時の装置による塩基読み取りの際に入り込むエラー等）、シーケンシングにより得られる各塩基にエラーが発生する確率は１／１０００〜１／１００の間となっている。即ち、塩基１０００個につき１〜１０個の誤った塩基が出現する。
ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ（生殖細胞変異）の検出では、突然変異発生位置がサンプルに占める割合は０％、５０％、１００％の３種類の状況に限られる。そのため、システム的な塩基の読み取りエラーについては、データ分析において同一領域のオーバーラップリード（ｏｖｅｒｌａｐ ｒｅａｄｓ）により補正することで、高いシーケンシング精度を達成可能としている。
一方、腫瘍細胞の突然変異など、体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）等の突然変異位置については、細胞同士の異質性が大きい（細胞ごとの突然変異位置が全て異なっている可能性がある）。この種の突然変異はサンプルに占める割合が低いため（１％未満）、従来のバイオ情報学的手法で区別することはできない（システムの塩基エラー率であるノイズと腫瘍の突然変異位置の信号とのＳＮ比が低すぎる）。よって、通常のシーケンシング方法では腫瘍の突然変異位置を正確に検出することはできない。
しかし、その後進展した分子タグ（ＵＭＩ：ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）によれば、こうした課題を効果的に解決可能である。まず、サンプルの元のＤＮＡ分子にランダム配列タグを組み込むことで、分子ごとに固有の標識をする。次に、各分子をライブラリー調製過程で増幅させ、最後にシーケンシングする。この場合、ライブラリー調製及びシーケンシング過程で発生する大部分の突然変異（エラー）をバイオ情報学的分析により除去可能なため、シーケンシングの塩基エラー率を１×１０−５まで低下させられる。仮に、腫瘍の突然変異を検出するために１０倍のＳＮ比が必要だとすると、この方法によって１×１０−４の突然変異率を正確に検出可能となる。
このように、腫瘍の突然変異率の検出感度を如何に向上させるかは早急に解決すべき課題である。
本発明の目的は、遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセットを提供することである。
本発明の他の目的は、前記マルチポジショニングダブルタグアダプターセットの調製方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、前記マルチポジショニングダブルタグアダプターセットの具体的応用を提供することである。
遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセットにおいて、ダブルタグアダプターＡ、ダブルタグアダプターＢ及びダブルタグアダプターＣを含み、ダブルタグアダプターＡ、ダブルタグアダプターＢ及びダブルタグアダプターＣは、アダプタープライマーＰ５と、５’末端がビオチン修飾されたアダプタープライマーＰ７−Ａ、アダプタープライマーＰ７−Ｂ及びアダプタープライマーＰ７−Ｃとが各々合成されることでそれぞれ得られ、アダプタープライマーＰ５は、Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０２に示す配列に連結して取得され、アダプタープライマーＰ７−Ａは、ＦＦＦＦＦＥＥＥＥＥＪＪＪＪＪＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３の５’末端に連結し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３を更にＩ７ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０４に示す配列に連結して取得され、アダプタープライマーＰ７−Ｂは、ＦＦＦＦＦＥＥＥＥＥＫＫＫＫＫＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３の５’末端に連結し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３を更にＩ７ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０４に示す配列に連結して取得され、アダプタープライマーＰ７−Ｃは、ＦＦＦＦＦＥＥＥＥＥＬＬＬＬＬＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３の５’末端に連結し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３を更にＩ７ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０４に示す配列に連結して取得され、前記ＦＦＦＦＦは酵素切断点の保護塩基、ＥＥＥＥＥは酵素切断点、ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬはポジショニングタグ配列であり、且つ、ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬは互いに異なっており、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはランダム分子タグ配列であり、ＦＦＦＦＦ、ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ、ＬＬＬＬＬ及びＥＥＥＥＥは５つの同一塩基を含むがこれに限らず、Ｉ７ｉｎｄｅｘ配列は６〜８個の塩基であり、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮは４〜１２のランダム塩基であり、且つ、４つの連続した同一塩基は存在しない。
本発明の好ましい実施方案において、前記ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはＢＤＨＶＢＤＨＶで示され、Ｂは当該位置がＡ以外の塩基であることを、Ｄ位置は当該位置がＣ以外の塩基であることを、Ｈは当該位置がＧ以外の塩基であることを、Ｖは当該位置がＴ以外の塩基であることを示している。
本発明の好ましい実施方案において、前記Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０５〜１２から選択され、前記Ｉ７Ｉｎｄｅｘ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３〜２３から選択され、前記ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬの配列は前記ＥＥＥＥＥの配列と部分的又は完全に重複してもよく、部分的又は完全に重複する場合、重複部分の塩基は１回のみ出現する。
上記の遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセットの調製方法であって、（１）アダプタープライマーＰ５、アダプタープライマーＰ７−Ａ、アダプタープライマーＰ７−Ｂ、アダプタープライマーＰ７−Ｃ及び緩衝液を適量の脱イオン水と混合した後に、アニーリング処理を行ってアニーリングアダプターＡ、アニーリングアダプターＢ及びアニーリングアダプターＣを取得するアニーリングステップと、（２）取得したアニーリングアダプターＡ、アニーリングアダプターＢ及びアニーリングアダプターＣをポリメラーゼで延伸させ、延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣを取得するアニーリングアダプター延伸ステップと、（３）取得した延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣをそれぞれエタノール又はイソプロパノールで沈殿させて精製することで、精製後の延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣを取得する第１沈殿ステップと、（４）精製後の延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣに、３’Ｔ突出末端を発生可能な制限酵素をそれぞれ導入し、酵素切断することにより酵素切断アダプターＡ、酵素切断アダプターＢ及び酵素切断アダプターＣを取得する酵素切断ステップと、（５）取得した酵素切断アダプターＡ、酵素切断アダプターＢ及び酵素切断アダプターＣをエタノール又はイソプロパノールで沈殿させ、精製することで、ダブルタグアダプターＡ、ダブルタグアダプターＢ及びダブルタグアダプターＣを取得する第２沈殿ステップと、 （６）ステップ（５）で取得したダブルタグアダプターＡ、ダブルタグアダプターＢ及びダブルタグアダプターＣをビオチンと親和させて精製するビオチン精製ステップと、（７）ステップ（６）で取得した生成物をエタノール又はイソプロパノールで沈殿させ、精製することで、前記マルチポジショニングダブルタグアダプターセットを取得する第３沈殿ステップと、を含む。
上記のマルチポジショニングダブルタグアダプターセットの具体的応用は以下の通りである。
ライブラリー調製方法であって、１０ｎｇ〜１μｇの検出対象のＤＮＡを２００〜５００ｂｐのＤＮＡ断片に切断した後、ＤＮＡ断片を末端修復酵素に加えて末端修復してからＡ尾部を付加し、上記のマルチポジショニングダブルタグアダプターセットを付加してライゲーションし、ライゲーション完了後にＡｍｐｕｒｅ磁性ビーズを用いるか、或いは切断により３４０〜６６０ｂｐの断片を選択する。
シーケンシング方法であって、（１）上記のライブラリー調製方法でライブラリーを調製するステップと、（２）前記シーケンスライブラリーをシーケンシングするステップ、を含む。
核酸配列を特定する方法であって、（１）上記のライブラリー調製方法でライブラリーを調製するステップと、（２）前記シーケンスライブラリーをシーケンシングするステップと、（３）シーケンシング結果に基づいて結果を判定するステップと、を含み、前記結果を判定する方法は、ａ．設定パラメータに基づいて、アライメントされた塩基のＱ値が３０より大きいシーケンシングにおける唯一のマッピング配列を選択するステップと、ｂ．ランダムタグ配列に基づいて反復（Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）判定を実施することで塩基の再補正を実施するステップと、ｃ．ＳＮＰ ｃａｌｌｉｎｇソフトを用いてＳＮＰ座位検出を実施し、ＳＮＰ座位情報を統計して、最終的にＳＮＰ座位及び対応するＭＡＦ情報を取得するステップと、ｄ．検出したＳＮＰ座位及びＭＡＦ情報と、対照群の突然変異位置及び集団ゲノムの変異情報データベースとを比較して同一の突然変異位置をフィルタリングし、最後に残った突然変異位置情報を最終的に検出した突然変異位置情報とするステップ、を含む。
表１及び表２にＩ５ｉｎｄｅｘ配列、Ｉ７ｉｎｄｅｘ配列及びＥＥＥＥＥ配列の一部を列記するが、これらに限らない。
本発明で使用するダブルタグライブラリーシーケンシングでは、ＤＮＡの２本鎖に２つの異なるＵＭＩを同時に導入し、ＤＮＡの２本鎖特性を利用することで、２本鎖の相互補正シーケンシングで取得した情報を用いて、シーケンシングの塩基エラー率を２．４×１０−６まで低下させられる。これによれば、１×１０−５の遺伝子突然変異率を正確に検出可能なため、遺伝子突然変異の検出感度を効果的に向上させられる。また、ハイスループットシーケンシングのスループットと組み合わせることで、１回のシーケンシングで複数の遺伝子における複数の突然変異位置を検出可能となる。
１．シーケンシング結果については、まずフォーマット変換を行い、アダプター尾部のポジショニング塩基によってシーケンシング配列のシーケンシング品質を評価する。ポジショニング塩基が見つからない場合には、一対のシーケンシング配列全てを破棄する。また、一対のシーケンシング配列先端のランダム塩基配列を切除し、配列ＩＤにマージする。
２．フィルタリングした配列をリファレンスゲノムとアライメントし（Ｈｇ１９、ＧＲＣｈ３７等）、設定パラメータに基づいて不合格のシーケンシング配列（ｒｅａｄｓ）をフィルタリングする（ｍａｐｐｉｎｇ ｑｕａｌｉｔｙが過度に低い、複数座位でマッピング、Ｒｅａｄ１とＲｅａｄ２の配列が一致しない等）。最後に、分析に適用可能な質の高い唯一のマッピング配列（ｕｎｉｑｕｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒｅａｄｓ）が得られる。
３．第１ステップでＩＤ位置に付加されたランダムタグ配列を用いて反復（Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）判定を実施することで、同一位置にアライメントされており、且つ、同一タグを有する配列が同一ソースの初期鋳型ＤＮＡであると思われる場合、一つのクラスターとして塩基の再補正を実施する。
４．ＳＮＰ ｃａｌｌｉｎｇソフトを用いてＳＮＰ座位検出を実施し、ＳＮＰ座位情報を統計して、最終的にＳＮＰ座位及び関連のＭＡＦ情報を取得する。
検出した遺伝子突然変位情報と対照群（同一患者に由来する健康組織のＤＮＡ）の突然変異位置及び集団ゲノムの変異情報データベースとを比較して同一の突然変異位置をフィルタリングし、最後に残った突然変異位置情報を最終的に検出した遺伝子突然変異位置情報とする。
本発明は、以下の有益な効果を有する。
１．２つのＩｎｄｅｘアダプターを使用することで、装置によるシーケンシング１回あたりのサンプル数が増加する（シーケンシングコストが低下する）。且つ、両端のＩｎｄｅｘによって異なるサンプルをいっそう効果的に区別可能となる。この点は、遺伝子の低頻度突然変異を検出するにあたって非常に重要である。なぜなら、一般的に検出される遺伝子突然変異位置の突然変異率は１／１０００〜１／１００程度であり、異なる突然変異位置を有する別サンプルに交差汚染が発生した場合、最終的な突然変異位置の判定時に問題が生じやすいからである。
２．使用するアダプターは長尺のアダプターである。即ち、アダプターにはシーケンシング時及びシーケンシング装置のフローセルで結合される関連配列（Ｐ５，Ｐ７）が備わっているため、ＰＣＲ連結の後にＰＣＲ増幅を行ってＰ５及びＰ７配列を導入しなくとも、ＰＣＲ−ｆｒｅｅライブラリー調製を完了することができる。よって、ライブラリー調製過程でのＰＣＲによる塩基エラー（突然変異）や増幅断片の過大評価、及びＰＣＲによる非天然キメラ配列の発生が回避される。
本発明のアダプター構造は、図１に示すように、左側のＹ型構造（分子タグ及びポジショニングタグを含まない）がイルミナシーケンシングプラットフォームの標準アダプターと同一となっている。Ｙ型アダプターの平行部分の塩基は相補的対合となっているが、フォーク部分の塩基に対合配列は存在しない。Ｐ５及びＰ７（Ｐ７−Ａ、Ｐ７−Ｂ及びＰ７−Ｃ）逆相補は、イルミナシーケンシング装置におけるシーケンシングチップ上のプローブと交雑した後、ブリッジ増幅して信号増幅する必要がある。Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列とＩ７ｉｎｄｅｘ配列は、調製する各シーケンスライブラリーのタグとして、サンプル別に調製されるライブラリーの区別に用いられる。Ｒｅａｄ１シーケンシング配列とＲｅａｄ２シーケンシング配列は、シーケンシングプライマーと結合することで合成しつつシーケンシングするために用いられる。分子タグはＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮのランダムタグ配列であり、ハイスループットシーケンシングのＤＮＡライブラリー鋳型に異なる標識を付与するために用いられる。分子タグ配列はランダムであるため、後段において固定配列に追加されるポジショニング塩基をデータ分析時に分子タグの位置及び配列を判断するために用いる必要がある。
本発明では、ダブルタグアダプター上のランダムタグ配列を利用し、ハイスループットシーケンシングのライブラリー調製過程におけるアダプター付加ステップにおいて、各鋳型ＤＮＡに異なる配列タグを追加する。そして、後続のＰＣＲ濃縮過程で各初期鋳型とそのタグ配列とが共に複数回複製されることで、複数のコピー（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）が発生する。これらコピーをハイスループットシーケンシングし、配列タグからシーケンシング断片の由来を識別してから（データ分析時にシーケンシング結果を補正できるよう、ライブラリー調製過程で発生する反復配列――ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎを区別するため）、鋳型のコピーを用いて配列を補正する（増幅エラー及びシーケンシング装置の塩基識別エラー）。そして、１回目の補正後にＤＮＡの２本鎖逆相補構造を利用して、タグ配列の２つずつ逆向きの相補的対合によって配列を再び補正する（ＤＮＡライブラリーの調製前及びライブラリー調製過程において発生する脱アミノ、酸化等の損傷）。
３．ダブルタグアダプターのポジショニングタグは、分子タグ配列の位置を特定するために用いられる。分子タグの識別は極めて重要であり、一般的に、その配列には例えばＡＣＴ、ＧＡＣＴ、ＴＧＡＣＴ等の固定配列が用いられる。イルミナシーケンシングプラットフォーム（Ｎｅｘｔｓｅｑ５００、ＣＮ５００、Ｍｉｓｅｑ、Ｎｅｘｔｓｅｑを含む）は、シーケンシング開始段階において前から２５サイクルの塩基シーケンシングの状況に基づいて鋳型クラスターのＰＦ値を演算する（最終的に保留される高品質の鋳型クラスターが全鋳型クラスターに占める割合）。シーケンシングチップのクラスター密度には限界があるため、ＰＦ値によってシーケンシングにおける有効データの生成量が決定される。
ダブルタグアダプターのポジショニングタグはシーケンシングの開始から約９〜１５サイクル内に位置している。しかし、単一配列を使用する場合には、当該位置の塩基多様性が過度に低くなることから（４種類の塩基の比率）、シーケンシング時にＰＦ値の深刻な低下が招来され、最終的にはデータ生成量に影響が及ぶ。
そこで、本発明では、アニーリングステップにおいて、アダプタープライマーＰ７−Ａ、アダプタープライマーＰ７−Ｂ及びアダプタープライマーＰ７−Ｃがそれぞれ配列の異なる３種類のポジショニングタグ配列ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬを用いることで、ポジショニング塩基が３’から５’に向かって各座位で異なるよう保証している。これにより、アダプターポジショニングタグの塩基多様性が増し、シーケンシングのＰＦ値が効果的に向上する結果、シーケンシングにおける有効データの生成量が顕著に向上する。
４．アダプターの作製過程において、酵素反応では完全な反応が難しいため、酵素切断過程で延長産物の一部が酵素により切断されず、最終的には酵素切断点の保護塩基（約８ｂｐ）を有する平滑末端アダプターが一部残留してしまう。平滑末端アダプターＰ５の配列の３’末端とＰ７配列の５’末端にはＯＨ基が１つずつ備わっている。アダプターのライゲーション過程では（図２）、当該部分の平滑末端アダプターがＰ５配列の３’末端のＯＨ基を介して２本鎖の鋳型ＤＮＡの５’末端におけるリン酸基に連結される（もう一方の鎖はいずれもＯＨ基のため連結不可能）。（１）２本鎖の鋳型ＤＮＡの両端に平滑末端アダプターが付加される場合には、鋳型両端のアダプター連結箇所にはいずれも切り欠きが存在するため、後続のＰＣＲ増幅を実施不可能となり、一部の鋳型ＤＮＡが損失してしまう。（２）鋳型ＤＮＡの一端に平滑末端アダプターが連結され、他端に正常なアダプターが連結される場合には、平滑末端アダプターＰ５の配列−鋳型ＤＮＡの１本鎖−正常なアダプターＰ７の末端という配列の鋳型が有効なＰＣＲ鋳型となって増幅する。しかし、鋳型ＤＮＡの他方の鎖は両側のアダプター連結箇所に切り欠きがあるため増幅不可能であり、損失が生じる。このように、（１）及び（２）のいずれの場合もサンプルの鋳型ＤＮＡにロスが発生する。また、（２）の場合には、ＤＮＡの２本鎖のうち１本が失われるため２本鎖のランダムタグ補正時に鋳型ＤＮＡが相補鎖を探し出せず、２本鎖の補正性能に影響してしまう。また、平滑末端アダプターＰ５鎖の３’末端に保護塩基が残留することで鋳型配列が汚染されるため、シーケンシング結果におけるＲｅａｄ１配列部分のデータの無駄やシーケンシング情報の損失が招来される。
これに対し、本発明ではＰ７アダプタープライマーの５’末端にビオチン修飾を導入している。Ｐ５及びＰ７アダプタープライマーは、アニーリングと延伸を経ることでＰ７鎖の５’末端にビオチン標識を備える。酵素切断することで正常なアダプターのビオチン標識は失われるが、酵素切断されていない平滑末端アダプター（即ち、アダプターの残留延伸産物）にはビオチン標識が備わったままとなるため、酵素切断アダプターはアビジン磁性ビーズにより精製する。これにより、残留した平滑末端アダプターを除去可能となり、更には酵素切断の不完全さに起因するアダプターの残留保護塩基配列が効果的に除去される。以上に関しては、図１に示す。
図１は、本発明の実施例１で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプターの構造を示す図である。 図２は、本発明における平滑末端アダプター（残留延伸アダプター）のシーケンスライブラリーに対する影響を示す図である。 図３は、本発明におけるＰＣＲによってＩｎｄｅｘが導入されたダブルタグアダプターを示す図である。 図４は、本発明の実施例２におけるシングルポジショニングダブルタグアダプターによるライブラリー調製フローである。 図５は、本発明の実施例３におけるシングルポジショニングダブルタグアダプターにより細胞の突然変異を鑑定する際のフローである。 図６は、本発明の実施例４におけるマルチポジショニングダブルタグアダプターセットの調製過程を示す図である。
以下に、具体的実施形態と図面を組み合わせて本発明の技術方案につき更に説明及び記載する。
実施例１：シングルポジショニングダブルタグアダプターの調製
２つのプライマーであるアダプタープライマーＰ５とアダプタープライマーＰ７（アダプタープライマーＰ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１がＩ５ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に連結されて得られる配列。アダプタープライマーＰ７はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３がＩ７ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に連結されて得られる配列。ＦＦＦＦＦＥＥＥＥＥＤＤＤＤＤＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の５’末端に順に連結されている。合成メーカー：生工生物工程（上海）股ふん有限公司）をｄｄＨ２Ｏ（又はＴＥ緩衝液）で１００μＭまで希釈した。
このうち、ＦＦＦＦＦは酵素切断点の保護塩基、ＥＥＥＥＥは酵素切断点、ＤＤＤＤＤはポジショニングタグタグ配列、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはランダム分子タグ配列であった。また、前記Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５〜１２から選択し、前記Ｉ７ｉｎｄｅｘ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２〜２３から選択した。
ＦＦＦＦＦ／ＤＤＤＤＤ／ＥＥＥＥＥ／は５つの同一塩基を含んでいたがこれに限らない。また、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮは４〜１２のランダム塩基であり、且つ、４つの連続した同一塩基は存在しなかった。
シングルポジショニングダブルタグアダプターの調製方法は、以下のステップからなった（図３参照）。
（１）アニーリング：０．２ｍＬのＥＰ管内に、アダプタープライマーＰ５：１０μＬ、アダプタープライマーＰ７：１０μＬ、ＮＥバッファー２：３μＬ、ｄｄＨ２Ｏ：７μＬ、合計３０μＬからなる体系を調製した。当該体系をＰＣＲ装置においてアニーリング反応させた。即ち、９５℃で５ｍｉｎの後、０．２〜０．５℃／ｓの勾配で９５〜２４℃まで降温させ、２４℃で維持した。
（２）アニーリング断片の増幅：元のＰＣＲ管に、１０×ＮＥバッファー：２μＬ、１０ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ：５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ：８μＬ、Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−（５Ｕ／μＬ）：５μＬ、合計５０μＬを加え、均一に混合した後、３７℃で１ｈ放置した。
（３）１回目の沈殿：ステップ（２）で取得した生成物に体積の１／１０のＮａＡＣ（３Ｍ）と体積の２．５倍の無水エタノールを加え、均一に混合した後に−２０℃で２ｈ放置し、１３０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離した。次に、上清を取り、６００μＬの７０％エタノールを加えて洗浄し、沈殿させてから、４°Ｃ且つ１３０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離した。そして、上清を取り、ＤＮＡを室温で５〜１０ｍｉｎ乾かし、３０μＬのｄｄＨ２Ｏを用いてＤＮＡを再懸濁させた。
（４）酵素分解（ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩエンドヌクレアーゼの場合、酵素切断点：ＡＣＮＧＴ、対応するアダプタープライマーＰ７配列のＥＥＥＥＥがＡＣＡＧＴ）：ステップ（３）で取得した生成物を３０μＬ取り、１０×ＮＥＢ ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー：５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ：１０μＬ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ（５Ｕ／μＬ）：５μＬ、合計５０μＬを加えて均一に混合した後、３７℃で１６ｈ酵素分解した。
（５）２回目の沈殿：ステップ（４）で取得した生成物に体積の１／１０のＮａＡＣ（３Ｍ）と体積の２．５倍の無水エタノールを加え、均一に混合した後に−２０℃で２ｈ放置し、４℃且つ１３０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離した。次に、上清を取り、６００μＬの７０％エタノールを加えて洗浄し、沈殿させてから、４°Ｃ且つ１３０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離した。そして、上清を取り、ＤＮＡを室温で５〜１０ｍｉｎ乾かしてから２６μＬのＴＥ ｌｏｗバッファーでＤＮＡを再懸濁させた。これを最終的なシングルポジショニングダブルタグアダプターとし（２５μＭ、構造は図２参照）、５μＬずつ分包して−８０℃で冷凍保存した。
実施例２：シングルポジショニングダブルタグアダプターによる血漿ＤＮＡの突然変異率検出
本実施例では、保護塩基がＴＣＴＴＣＴ、酵素切断点の配列がＡＣＡＧＴ（枠内はポジショニング塩基。酵素切断点とポジショニング塩基が部分的に重複）、分子タグがＢＤＨＶＢＤＨＶである実施例１で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプターを用いた。
Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列とＩ７ｉｎｄｅｘ配列の組み合わせとしては、Ｉ５０１−Ｉ７０１、Ｉ５０２−Ｉ７０２、Ｉ５０３−Ｉ７０３、Ｉ５０４−Ｉ７０４、Ｉ５０５−Ｉ７０５、Ｉ５０６−Ｉ７０６、Ｉ５０７−Ｉ７０７、Ｉ５０８−Ｉ７０８、Ｉ５０１−Ｉ７０７、Ｉ５０２−Ｉ７０８、Ｉ５０３−Ｉ７０９、Ｉ５０４−Ｉ７１０が可能であった（番号に対応する塩基配列については表１を参照）。
サンプルの選択と品質制御：肺癌患者の血漿サンプルを５つ採取し、ＱＩＡＧＥＮの血漿ＤＮＡ抽出キットを用いて血漿ＤＮＡを抽出した後、分光光度計によりＤＮＡサンプルの純度を測定した（Ａ２６０／２８０が１．８〜２０の間となるよう要求）。次に、Ｑｕｂｉｔ２．０を用いてＤＮＡ濃度を測定した（全体量が５〜１５ｎｇの間）。そして、Ｄ１０００チップ（アジレント社）を用いてＤＮＡサンプル断片の分布を測定し（約１６０〜２００ｂｐ）、デジタルＰＣＲ（バイオ・ラッド社）で腫瘍サンプルのＥＧＦＲ遺伝子Ｔ７９０Ｍ突然変異率を測定した（１．９％、０．８％、０．１８％、０．１２％、１．４４％）。
ライブラリー調製：ＫＡＰＡ ＤＮＡライブラリー調製キットでライブラリー調製を行った。なお、ＤＮＡサンプルは全てライブラリー調製に使用した。
以下の試験で使用した末端修復酵素、末端修復バッファー等はいずれも試薬キットＫＡＰＡ ＨＴＰ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ｐｌａｔｆｏｒｍｓのものを用いた。
ＤＮＡサンプルを末端修復し（７μＬの１０×末端修復バッファー、５μＬの末端修復酵素を添加。２０℃で３０ｍｉｎ）、生成物を精製した後、Ａ−ｔａｌｉｎｇ酵素を用いてＡ尾部を付加した（５μＬの１０×末端修復バッファー、３μＬの末端修復酵素。３０℃で３０ｍｉｎ）。生成物は精製後に２つに分割した。次に、アダプター付加ステップにおいて、実施例２で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプターを用い（モル比１０：１でＡ尾部付加断片にシングルポジショニングダブルタグアダプターを付加）、ライブラリー調製するか（図４参照）、或いは、通常のライブラリー調製アダプターを用いた（配列については、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４及び２５）。次に、１０μＬの５×ライゲーションバッファ＋５μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、２０°Ｃで２０ｍｉｎライゲーションした。ライゲーション産物は２段階の１×Ａｍｐｕｒｅ磁性ビーズで精製し、精製した生成物をＫＡＰＡハイフィデリティー酵素ｍｉｘ（２５μＬ）とフォワード／リバース増幅プライマー（２５μＭ）各１μＬとで増幅した。
このうち、通常のライブラリー調製アダプターを付加したものは対照群とした。一方、実験群については実施例２で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプターを添加した。対照群と実験群は使用したアダプター配列が異なるだけで、手順については同様であった。
通常のライブラリー調製アダプターサンプル群に使用したフォワード／リバース増幅プライマーは汎用プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）とＩｎｄｅｘプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）の組み合わせとした。一方、実施例２で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプターサンプル群に使用したフォワード／リバースプライマーの組み合わせはＰＣＲ−Ｐ５プライマー＋ＰＣＲ−Ｐ７プライマーとした。
通常のライブラリー調製アダプターの配列情報：
5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3' SEQ ID NO:24
3'-CTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAG-p-5' SEQ ID NO:25
通常のライブラリー調製アダプターに対応するフォワード／リバースプライマーの配列：
汎用プライマー：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATC-s-T-3'（-s-はチオ（ｔｈｉｏ）を表す。以下同様） SEQ ID NO:26
Ｉｎｄｅｘプライマー：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７がＩ７ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に連結されて得られる配列。
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT SEQ ID NO:27
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3' SEQ ID NO:28
このうち、Ｉ７Ｉｎｄｅｘ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２〜２３から選択した。
実施例１で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプターに対応するＰ５プライマー及びＰ７プライマーの配列：実施例１で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプターを用いてアダプターを付加した後にＰＣＲを実施したため、以下のプライマー配列を使用した。
PCR-P5: AATGATACGGCGACCACCG-s-A SEQ ID NO:29
PCR-P7: CAAGCAGAAGACGGCATACG-s-A SEQ ID NO:30
キャプチャー：Ｒｏｃｈｅ ＳｅｑＣａｐ ＥＺ ｃｕｓｔｏｍ ｋｉｔ（２５０ｋ）を用いてライブラリーのターゲットキャプチャーを実施し、キャプチャーライブラリーが品質検査に合格してから（アジレント２１００／２２００でライブラリーの断片サイズを判定する。例えば、ライブラリー調製時に導入した断片（鋳型）サイズが２００〜３５０ｂｐであり、両端にアダプターＰ５、Ｐ７を付加した後に１４０ｂｐ増加した場合、ライブラリーのサイズ分布は３４０ｂｐ〜４９０ｂｐとなるはずである。キャプチャー効果をＱＰＣＲで判定した結果、平均濃縮倍数が１０未満の場合にはキャプチャー失敗であり、再キャプチャーが必要であることを意味する）シーケンシングを実施した。
結果：各サンプルのシーケンシング深度は２００００×であり、シーケンシングにより得られたサンプルのｒａｗ ｄａｔａは８．２０Ｇ、ｃｌｅａｎ ｄａｔａ Ｑ２０は９４．２５％、Ｑ３０は０．３％、ｍａｐｐｉｎｇ ｒａｔｅは９９．９％、ｃｏｖｅｒａｇｅは９９．８９％であった。検出結果については、通常アダプターサンプル群では１．９％と１．４４％の２つのサンプルの突然変異位置を正確に検出可能であった。これに対し、前記シングルポジショニングダブルタグアダプターサンプル群では、１．９％、０．８％、０．１８％、０．１２％、１．４４％の全サンプルの突然変異位置を検出可能であり（ライブラリー調製前のサンプルについてデジタルＰＣＲで検出した突然変異位置及び突然変異率情報に基づき、ハイスループットシーケンシングデータについてソフトウェア（ＦａｓｔＱＣ，ｓａｍｔｏｏｌｓ，ＢＷＡ／ｂｏｗｔｉｅ２，ＧＡＴＫ，Ｆｒｅｅｂａｙｅｓ／ｐｉｃａｒｄ等）でこれらの位置における突然変異の有無及び突然変異率を分析するとともに、デジタルＰＣＲの結果と比較して検出率を特定した）、検出率は１００％であった（デジタルＰＣＲの検出結果との比較については、例えばデジタルＰＣＲで５つのサンプルから低頻度の突然変異位置を１０個検出した場合、ハイスループットシーケンシングにより１０個全てを検出できた場合には検出率１００％、５つ検出した場合には検出率５０％となる）。
実施例３：シングルポジショニングダブルタグアダプターによる細胞系の突然変異率検出
２つの細胞系ＮＣＩ−Ｈ１６５０及びＨＣＴのＤＮＡを実験材料として選択した。ＮＣＩ−Ｈ１６５０細胞のＤＮＡをそれぞれ１０％、１％、０．１％の質量比でＨＣＴ細胞のＤＮＡに導入する一方、ＮＣＩ−Ｈ１６５０及びＨＣＴ細胞の１００％ＤＮＡをそれぞれ２つのサンプルとし、各々を１０％群、１％群、０．１％群、ＮＣＩ−Ｈ１６５０群及びＨＣＴ群と表記した（ＮＣＩ−Ｈ１６５０群とＨＣＴ群は混合に用いた細胞系ＤＮＡの遺伝背景――ヘテロ接合やホモ接合といった対立遺伝子の位置情報を特定するためにすぎない。これら２つのサンプルのシーケンシング情報からホモ接合の塩基座位を探し出し、次に、同一座位における塩基の異なる座位を見付けてその他のサンプル群の分析統計座位とした）。
ＤＮＡサンプルを十分均一に混合した後、それぞれから２μｇずつ取ってＤＮＡライブラリーを調製した（ＫＡＰＡ ＤＮＡライブラリー調製キット）。次に、断片にＡ尾部を付加するステップの後、１０％、１％、０．１％のサンプルをそれぞれ２分割して２組に分けた。そして、アダプター付加ステップにおいて、通常アダプター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す配列）と実施例１で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプター（図５参照）を各々に付加した。その後、後続のライブラリー調製ステップとキャプチャーステップを実施した。キャプチャーにはＲｏｃｈｅ ＳｅｑＣａｐ ＥＺ ｃｕｓｔｏｍ ｋｉｔ（２５０ｋ）を使用した。最後に機器によるシーケンシングを実施した。シーケンシング深度は２００００×とし、シーケンシング結果についてフィルタリングしたＱ３０のｕｎｉｑｕｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒｅａｄｓによりＳＮＰ検出を実施した。
シングルポジショニングダブルタグアダプターのＦＦＦＦＦはＴＣＴＴＣＴ、ＥＥＥＥＥはＡＣＡＧＴであった。また、ＤＤＤＤＤはＡＧＴであり、前述のＥＥＥＥＥ配列と重複していた。
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはＢＤＨＶＢＤＨＶで示される配列であり、Ｂは当該位置がＡ以外の塩基であることを、Ｄ位置は当該位置がＣ以外の塩基であることを、Ｈは当該位置がＧ以外の塩基であることを、Ｖは当該位置がＴ以外の塩基であることを示している。
結果：まず、２つのサンプルＮＣＩ−Ｈ１６５０とＨＣＴのデータを分析した。ＳＮＰ検出情報に基づいてＲｏｃｈｅキャプチャーチップ２５０Ｋ ｂｐのキャプチャー領域における塩基ＭＡＦ（マイナーアレル頻度）を探し出し、ＭＡＦが０％の塩基座位（ＳＮＰホモ接合陰性）と１００％の塩基座位（ＳＮＰホモ接合陽性）を選別した（実際の判断基準としては例えば０．１％というような閾値を規定し、某座位のＭＡＦ値が０．１％未満の場合には当該座位が０％の塩基座位であり、ＳＮＰホモ接合陰性座位であるとした。１００％座位についても同様）。そして、２つの細胞系における対応座位（ゲノムの同一位置）の一方がホモ接合陽性であり、他方がホモ接合陰性である座位を選別し、これらの座位を後続のその他のサンプル群における分析座位として、サンプルごとに検出率、偽陽性、偽陰性等の情報を統計した。
ＮＣＩ−Ｈ１６５０群及びＨＣＴ群（１００％）では、合計１７８個のホモ接合対立ＳＮＰ座位（即ち、各座位において一方の細胞系がホモ接合陰性、他方の細胞系がホモ接合陽性）を検出した。続いて、アダプターの異なる１０％、１％、０．１％のサンプルにつきこれら１７８個の座位をそれぞれ分析したところ、各比率のサンプルにおける１７８個の座位の突然変異率（ヘテロ接合比率）はそれぞれ１０％、１％及び０．１％であった。結果、通常アダプターは、１０％サンプル群の陽性検出率が１００％、１％群の検出率が９８．８６％、０．１％群の検出率が８１．２９％であった。これに対し、実施例１で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプターは、１０％、１％及び０．１％群の検出率がいずれも１００％であった。また、偽陽性率については、感度１％の場合、通常アダプターの偽陽性率は０．０１％であり、感度０．１％の場合、通常アダプターの偽陽性率は５％以上であった。一方で、実施例１で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプターの偽陽性率は、感度０．１％の場合には０．００１％であった（感度の値が某閾値を超える塩基変異頻度の座位を突然変異の検出位置とみなす。例えば、感度１％とは塩基変異頻度の閾値が１％であることをいい、１％を超える座位を突然変異の検出位置とみなす）。
実施例４：マルチポジショニングダブルタグアダプターセットの調製
アダプタープライマーＰ５、５’末端がビオチン修飾されたアダプタープライマーＰ７−Ａ、アダプタープライマーＰ７−Ｂ及びアダプタープライマーＰ７−Ｃ（合成メーカー：生工生物工程（上海）股ふん有限公司）をそれぞれｄｄＨ２Ｏで１００μＭまで希釈した。
アダプタープライマーＰ５は、Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０２に示す配列に連結して取得した。
アダプタープライマーＰ７−Ａは、ＦＦＦＦＦＥＥＥＥＥＪＪＪＪＪＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３の５’末端に連結し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３を更にＩ７ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０４に示す配列に連結して取得した。
アダプタープライマーＰ７−Ｂは、ＦＦＦＦＦＥＥＥＥＥＫＫＫＫＫＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３の５’末端に連結し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３を更にＩ７ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０４に示す配列に連結して取得した。
アダプタープライマーＰ７−Ｃは、ＦＦＦＦＦＥＥＥＥＥＬＬＬＬＬＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３の５’末端に連結し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３を更にＩ７ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０４に示す配列に連結して取得した。
前記ＦＦＦＦＦは酵素切断点の保護塩基、ＥＥＥＥＥは酵素切断点、ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬはポジショニングタグ配列であった。且つ、ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬは互いに異なっており、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはランダム分子タグ配列であった。ＦＦＦＦＦ、ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ、ＬＬＬＬＬ及びＥＥＥＥＥは５つの同一塩基を含んでいたがこれに限らない。また、Ｉ７ｉｎｄｅｘ配列は６〜８個の塩基であった。ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮは４〜１２のランダム塩基であり、且つ、４つの連続した同一塩基は存在しなかった。
好ましくは、前記ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはＢＤＨＶＢＤＨＶで示され、Ｂは当該位置がＡ以外の塩基であることを、Ｄ位置は当該位置がＣ以外の塩基であることを、Ｈは当該位置がＧ以外の塩基であることを、Ｖは当該位置がＴ以外の塩基であることを示している。また、前記Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５〜１２から選択し、前記Ｉ７ｉｎｄｅｘ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３〜２３から選択した。
選択的に、前記ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬの配列は前記ＥＥＥＥＥの配列と部分的に重複してもよいし、完全に重複してもよく、部分的又は完全に重複する場合、重複部分の塩基は１回のみ出現する。
当該マルチポジショニングダブルタグアダプターセットの調製方法は、以下のステップからなった（図６）。
（１）アニーリング：アダプタープライマーＰ５、アダプタープライマーＰ７−Ａ、アダプタープライマーＰ７−Ｂ、アダプタープライマーＰ７−Ｃ及び緩衝液を適量の脱イオン水と混合した後に、アニーリング処理を行ってアニーリングアダプターＡ、アニーリングアダプターＢ及びアニーリングアダプターＣを取得した。具体的には、１５ｍＬの遠心分離管に、アダプタープライマーＰ５：１ｍＬ、アダプタープライマーＰ７−Ａ：３３４μＬ、アダプタープライマーＰ７−Ｂ：３３４μＬ、アダプタープライマーＰ７−Ｃ：３３４μＬ、ＮＥバッファー２：３００μＬ、ｄｄＨ２Ｏ：７００μＬ、合計３ｍＬからなる体系を調製した。当該体系を均一に混合した後、ウォーターバスにおいて９５℃で５ｍｉｎ反応させ、すぐに９５℃の熱湯を充填したビーカーに投入して、室温条件でゆっくりと２４〜２７℃まで降温させた。
（２）アニーリングアダプターの延伸：取得したアニーリングアダプターＡ、アニーリングアダプターＢ及びアニーリングアダプターＣをポリメラーゼで延伸させ、延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣを取得した。具体的には、元の１５ｍＬの遠心分離管に、１０×ＮＥバッファー：２００μＬ、２５ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ：２００μＬ、５００ｍＭのＤＴＴ：６μＬ、Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−（５Ｕ／μＬ）：１００μＬを投入し、ｄｄＨ２Ｏを体積が５ｍＬとなるまで補充した。これを均一に混合した後、３７℃のサーモスタット内で回転させつつ均一に混合し、１ｈインキュベートした。
（３）１回目の沈殿：取得した延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣをそれぞれエタノール又はイソプロパノールで沈殿させて精製することで、精製後の延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣを取得した。具体的には、ステップ（２）で取得した生成物に体積の１／１０のＮａＡＣ（３Ｍ）と体積の２．５倍の無水エタノールを加え、均一に混合した後に−２０℃で２ｈ放置し、１３０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離した。次に、上清を取り、５ｍＬの７０体積％のエタノールを加えて洗浄し、沈殿させてから、４°Ｃ且つ１３０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離した。そして、上清を取り、ＤＮＡを室温で２０〜３０ｍｉｎ乾かしてから、３ｍＬのｄｄＨ２ＯでＤＮＡを再懸濁させるとともに、Ｑｕａｎｔｕｓで濃度を測定した。
（４）酵素切断：精製後の延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣに、３’Ｔ突出末端を発生可能な制限酵素をそれぞれ導入し、酵素切断することにより酵素切断アダプターＡ、酵素切断アダプターＢ及び酵素切断アダプターＣを取得した。具体的には（ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩエンドヌクレアーゼの場合、酵素切断点：ＡＣＮＧＴ、対応するアダプタープライマーＰ７配列のＥＥＥＥＥがＡＣＡＧＴに変化）、前記ステップ（３）で取得した生成物を取り、その質量ｘ（μｇ）に基づいて１０×ＮＥＢ ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー：２ｘμＬ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ（５Ｕ／μＬ）：２ｘμＬを添加した。そして、ｄｄＨ２Ｏで体積が２０ｘμＬとなるまで補充し、均一に混合してから、３７℃のサーモスタット内で回転しつつインキュベートし、１６ｈ酵素分解した。
（５）２回目の沈殿：取得した酵素切断アダプターＡ、酵素切断アダプターＢ及び酵素切断アダプターＣをエタノール又はイソプロパノールで沈殿させ、精製することで、ダブルタグアダプターＡ、ダブルタグアダプターＢ及びダブルタグアダプターＣを取得した。具体的には、ステップ（４）で取得した生成物に体積の１／１０のＮａＡＣと体積の２．５倍の無水エタノールを加え、均一に混合した後に−２０℃で２ｈ放置し、４℃且つ１３０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離した。次に、上清を取り、１０ｍＬの７０％エタノールを加えて洗浄し、沈殿させてから、４°Ｃ且つ１３０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離した。そして、上清を取り、ＤＮＡを室温で２０〜３０ｍｉｎ乾かし、２ｍＬのｄｄＨ２Ｏを用いて再懸濁させた。
（６）ビオチン精製：ステップ（５）で取得したダブルタグアダプターＡ、ダブルタグアダプターＢ及びダブルタグアダプターＣをビオチンと親和させて精製した。具体的には、２ｍＬの磁性ビーズＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１を取り、１×Ｂ＆Ｗバッファーで磁性ビーズを洗浄した後、２ｍＬの２×Ｂ＆Ｗバッファーでビーズを再懸濁させた。次に、ステップ（５）で取得した２ｍＬの生成物を磁性ビーズに加え、４℃で３０ｍｉｎインキュベートしてから磁気フレームに静置した。そして、上清を新たな５０ｍＬ遠心分離管に取った。
（７）３回目の沈殿：ステップ（６）で取得した生成物をエタノール又はイソプロパノールで沈殿させ、精製することで、前記マルチポジショニングダブルタグアダプターセットを取得した。具体的には、ステップ（６）で取得した生成物に体積の１／１０のＮａＡＣと体積の２．５倍の無水エタノールを加え、均一に混合した後に−２０℃で２ｈ放置し、４℃且つ１３０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離した。次に、上清を取り、１０ｍＬの７０％エタノールを加えて洗浄し、沈殿させてから、４°Ｃ且つ１３０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離した。そして、上清を取り、ＤＮＡを室温で２０〜３０ｍｉｎ乾かしてから、１．５ｍＬのＴＥ ｌｏｗバッファーで再懸濁させることで前記マルチポジショニングダブルタグアダプターセットを取得した。前記マルチポジショニングダブルタグアダプターセットは品質制御合格後に分包し、−２０℃で冷凍保存した。
実施例５：前記マルチポジショニングダブルタグアダプターセットによるシーケンシングＰＦ値の改善状況
切断した３０ｎｇの白血球ＤＮＡ（平均長さ２２０ｂｐ）からライブラリー調製を開始した。実験は、実施例１で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプターでライブラリーを調製する群と、実施例４で調製したマルチポジショニングダブルタグアダプターセットでライブラリーを調製する群の２群に分けて実施した。ライブラリー調製キットとしては、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用した。なお、ライブラリー調製のステップは次の通りであった。
（１）３０ｎｇの切断ＤＮＡを取って７μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅｎｄ Ｐｒｅｐ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファーと３μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅｎｄ Ｐｒｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘに添加し、脱イオン水を体積が６０μＬとなるまで補充した。これをＰＣＲ装置において２０℃で３０ｍｉｎ→６５°Ｃで３０ｍｉｎ→４℃で維持した。
（２）上記の体系を１μＬのアダプター（前記シングルポジショニングダブルタグアダプター又は前記マルチポジショニングダブルタグアダプターセット）に加えてから、３０μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと１μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒを加えて均一に混合し、２０℃で１５ｍｉｎ反応させた。そして、ライゲーション産物を０．９×Ａｍｐｕｒｅ磁性ビーズで精製し、精製後に２３μＬの精製水で洗浄した。
（３）ＰＣＲ管に２３μＬの前記ライゲーション産物、Ｉ５及びＩ７ｉｎｄｅｘプライマー各１μＬ（２５μＭ）、２５μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩＱ５ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを加え、均一に混合してからＰＣＲ装置で以下の反応を実施した。
９８°Ｃで３０ｓ。
９８°Ｃで１０ｓ→６５°Ｃで７５ｓ（８サイクル）。
６５°Ｃで５ｍｉｎ。
４℃で維持。
ＰＣＲ終了後に０．９×磁性ビーズを用いて精製し、続いてＱｕｂｉｔ２．０（又はＱｕａｎｔｕｓ）及びアジレント２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（又はアジレント ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ）を用いて品質制御を実施した。
調製したライブラリーについては、品質制御合格後にＮｅｘｔＳｅｑ５００プラットフォームでシーケンシングを実施した。シーケンシング試薬としてはＭｉｄ Ｏｕｔｐｕｔ ｋｉｔ（３００ｃｙｃｌｅｓ）を用い、Ｐｈｉｘ混入比率は１％とした。各ライブラリーは個別に装置でシーケンシングした。実験は３回繰り返し、それぞれについて装置によるシーケンシングを実施した。シーケンシングプラットフォームはＮｅｘｔＳｅｑ５００、シーケンシング試薬はＭｉｄ Ｏｕｔｐｕｔ ｋｉｔ（３００ｃｙｃｌｅｓ）、Ｐｈｉｘ混入比率は１％とした。また、シーケンシング結果の品質制御については次の通りであった。
実施例６：ビオチン精製後アダプターによるライブラリー調製の残留アダプター配列：
切断した３０ｎｇの白血球ＤＮＡ（平均長さ２２０ｂｐ）からライブラリー調製を開始した。実験は、実施例１で調製したシングルポジショニングダブルタグアダプターでライブラリーを調製する群と、実施例４で調製したマルチポジショニングダブルタグアダプターセットでライブラリーを調製する群の２群に分けて実施した。ライブラリー調製キットとしては、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用した。なお、ライブラリー調製のステップは次の通りであった。
（１）３０ｎｇの切断ＤＮＡを取って７μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅｎｄ Ｐｒｅｐ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファーと３μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅｎｄ Ｐｒｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘに添加し、脱イオン水を体積が６０μＬとなるまで補充した。これをＰＣＲ装置において２０℃で３０ｍｉｎ→６５°Ｃで３０ｍｉｎ→４℃で維持した。
（２）上記の体系を１μＬのアダプター（前記シングルポジショニングダブルタグアダプター又は前記マルチポジショニングダブルタグアダプターセット）に加えてから、３０μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと１μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒを加えて均一に混合し、２０℃で１５ｍｉｎ反応させた。そして、ライゲーション産物を０．９×Ａｍｐｕｒｅ磁性ビーズで精製し、精製後に２３μＬの精製水で洗浄した。
（３）ＰＣＲ管に２３μＬの前記ライゲーション産物、Ｉ５及びＩ７ｉｎｄｅｘプライマー各１μＬ（２５μＭ）、２５μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩＱ５ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを加え、均一に混合してからＰＣＲ装置で以下の反応を実施した。
９８°Ｃで３０ｓ。
９８°Ｃで１０ｓ→６５°Ｃで７５ｓ（８サイクル）。
６５°Ｃで５ｍｉｎ。
４℃で維持。
ＰＣＲ終了後に０．９×磁性ビーズを用いて精製し、続いてＱｕｂｉｔ２．０（又はＱｕａｎｔｕｓ）及びアジレント２１００ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（又はアジレント２２００ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ）を用いて品質制御を実施した。
調製したライブラリーについては、品質制御合格後にＮｅｘｔＳｅｑ５００プラットフォームでシーケンシングを実施した。シーケンシング試薬としてはＭｉｄ Ｏｕｔｐｕｔ ｋｉｔ（３００ｃｙｃｌｅｓ）を用いた。Ｐｈｉｘ混入比率は１％、各ライブラリーのデータ量は１Ｇｂであった。また、シーケンシング結果は以下の通りであった。
以上は本発明の好ましい実施例にすぎないため、これらによって本発明の実施範囲を限定することはできない。即ち、本発明の請求の範囲及び明細書の内容に基づき実施される等価の変形及び補足は、いずれも本発明の範囲に属する。
本発明は、遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセット、及びその調製方法と具体的応用を提供する。これによれば、１×１０−５の遺伝子突然変異率を正確に検出可能なため、遺伝子突然変異の検出感度を効果的に向上させられる。また、ハイスループットシーケンシングのスループットと組み合わせることで、１回のシーケンシングで複数の遺伝子における複数の突然変異位置を検出可能となる。

Claims (8)

  1. 遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセットであって、前記マルチポジショニングダブルタグアダプターセットは、ダブルタグアダプターＡ、ダブルタグアダプターＢ、ダブルタグアダプターＣを含み、前記ダブルタグアダプターＡ、前記ダブルタグアダプターＢ、前記ダブルタグアダプターＣは、相補的対合部分および相補的配列が存在しない非対合部分を有する二本のヌクレオチド鎖からなり、
    前記ダブルタグアダプターＡは、一方のヌクレオチド鎖が、５’末端側から順に、連続して、配列番号１の塩基配列、Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列、配列番号２の塩基配列、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮの相補的配列、ＪＪＪＪＪの相補的配列からなる塩基配列を有し、他方のヌクレオチド鎖が、５’末端側から順に、連続して、ＪＪＪＪＪ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ、配列番号３の塩基配列、Ｉ７ｉｎｄｅｘ配列、配列番号４の塩基配列からなる塩基配列を有し、
    前記ダブルタグアダプターＢは、一方のヌクレオチド鎖が、５’末端側から順に、連続して、配列番号１の塩基配列、Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列、配列番号２の塩基配列、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮの相補的配列、ＫＫＫＫＫの相補的配列からなる塩基配列を有し、他方のヌクレオチド鎖が、５’末端側から順に、連続して、ＫＫＫＫＫ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ、配列番号３の塩基配列、Ｉ７ｉｎｄｅｘ配列、配列番号４の塩基配列からなる塩基配列を有し、
    前記ダブルタグアダプターＣは、一方のヌクレオチド鎖が、５’末端側から順に、連続して、配列番号１の塩基配列、Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列、配列番号２の塩基配列、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮの相補的配列、ＬＬＬＬＬの相補的配列からなる塩基配列を有し、他方のヌクレオチド鎖が、５’末端側から順に、連続して、ＬＬＬＬＬ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ、配列番号３の塩基配列、Ｉ７ｉｎｄｅｘ配列、配列番号４の塩基配列からなる塩基配列を有し、
    ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬはポジショニングタグ配列であり、且つ、ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬは互いに異なっており、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはランダム分子タグ配列であり、ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬは５つの同一塩基を含むがこれに限らず、Ｉ７ｉｎｄｅｘ配列は６〜８個の塩基であり、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮは４〜１２のランダム塩基であり、且つ、４つの連続した同一塩基は存在しないことを特徴とする、遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセット。
  2. 前記ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはＢＤＨＶＢＤＨＶで示され、Ｂは当該位置がＡ以外の塩基であることを、Ｄ位置は当該位置がＣ以外の塩基であることを、Ｈは当該位置がＧ以外の塩基であることを、Ｖは当該位置がＴ以外の塩基であることを示していることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセット。
  3. 前記Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列は配列番号５〜１２から選択され、前記Ｉ７Ｉｎｄｅｘ配列は配列番号１３〜２３から選択されることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセット。
  4. 請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセットの調製方法であって、
    前記ダブルタグアダプターＡは、アダプタープライマーＰ５と５’末端がビオチン修飾されたアダプタープライマーＰ７−Ａとのアニーリング、ポリメラーゼによる延伸反応、制限酵素による切断を経て得られ、
    前記ダブルタグアダプターＢは、アダプタープライマーＰ５と５’末端がビオチン修飾されたアダプタープライマーＰ７−Ｂとのアニーリング、ポリメラーゼによる延伸反応、制限酵素による切断を経て得られ、
    前記ダブルタグアダプターＣは、アダプタープライマーＰ５と５’末端がビオチン修飾されたアダプタープライマーＰ７−Ｃとのアニーリング、ポリメラーゼによる延伸反応、制限酵素による切断を経て得られ、
    アダプタープライマーＰ５は、Ｉ５ｉｎｄｅｘ配列を介して配列番号１を配列番号２に示す配列に連結して取得され、
    アダプタープライマーＰ７−Ａは、ＦＦＦＦＦＥＥＥＥＥＪＪＪＪＪＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを順に配列番号３の５’末端に連結し、配列番号３を更にＩ７ｉｎｄｅｘ配列を介して配列番号４に示す配列に連結して取得され、
    アダプタープライマーＰ７−Ｂは、ＦＦＦＦＦＥＥＥＥＥＫＫＫＫＫＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを順に配列番号３の５’末端に連結し、配列番号３を更にＩ７ｉｎｄｅｘ配列を介してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０４に示す配列に連結して取得され、
    アダプタープライマーＰ７−Ｃは、ＦＦＦＦＦＥＥＥＥＥＬＬＬＬＬＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを順に配列番号３の５’末端に連結し、配列番号３を更にＩ７ｉｎｄｅｘ配列を介して配列番号４に示す配列に連結して取得され、
    前記ＦＦＦＦＦは酵素切断点の保護塩基、ＥＥＥＥＥは酵素切断点、ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬはポジショニングタグ配列であり、且つ、ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ及びＬＬＬＬＬは互いに異なっており、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはランダム分子タグ配列であり、ＦＦＦＦＦ、ＪＪＪＪＪ、ＫＫＫＫＫ、ＬＬＬＬＬ及びＥＥＥＥＥは５つの同一塩基を含むがこれに限らず、Ｉ７ｉｎｄｅｘ配列は６〜８個の塩基であり、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮは４〜１２のランダム塩基であり、且つ、４つの連続した同一塩基は存在しないことを特徴とする遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセットの調製方法。
  5. 請求項４に記載の遺伝子突然変異を検出するマルチポジショニングダブルタグアダプターセットの調製方法であって、
    （１）アダプタープライマーＰ５、アダプタープライマーＰ７−Ａ、アダプタープライマーＰ７−Ｂ、アダプタープライマーＰ７−Ｃ及び緩衝液を適量の脱イオン水と混合した後に、アニーリング処理を行ってアニーリングアダプターＡ、アニーリングアダプターＢ及びアニーリングアダプターＣを取得するアニーリングステップと、
    （２）取得したアニーリングアダプターＡ、アニーリングアダプターＢ及びアニーリン
    グアダプターＣをポリメラーゼで延伸させ、延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣを取得するアニーリングアダプター延伸ステップと、
    （３）取得した延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣをそれぞれエタノール又はイソプロパノールで沈殿させて精製することで、精製後の延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣを取得する第１沈殿ステップと、
    （４）精製後の延伸アダプターＡ、延伸アダプターＢ及び延伸アダプターＣに、３’Ｔ突出末端を発生可能な制限酵素をそれぞれ導入し、酵素切断することにより酵素切断アダプターＡ、酵素切断アダプターＢ及び酵素切断アダプターＣを取得する酵素切断ステップと、
    （５）取得した酵素切断アダプターＡ、酵素切断アダプターＢ及び酵素切断アダプターＣをエタノール又はイソプロパノールで沈殿させ、精製することで、ダブルタグアダプターＡ、ダブルタグアダプターＢ及びダブルタグアダプターＣを取得する第２沈殿ステップと、
    （６）ステップ（５）で取得したダブルタグアダプターＡ、ダブルタグアダプターＢ及びダブルタグアダプターＣをビオチンと親和させて精製するビオチン精製ステップと、
    （７）ステップ（６）で取得した生成物をエタノール又はイソプロパノールで沈殿させ、精製することで、前記マルチポジショニングダブルタグアダプターセットを取得する第３沈殿ステップと、を含むことを特徴とする方法。
  6. １０ｎｇ〜１μｇの検出対象のＤＮＡを２００〜５００ｂｐのＤＮＡ断片に切断した後、ＤＮＡ断片を末端修復酵素に加えて末端修復してからＡ尾部を付加し、請求項１〜３のいずれかに記載のマルチポジショニングダブルタグアダプターセットを付加してライゲーションし、ライゲーション完了後にＡｍｐｕｒｅ磁性ビーズを用いるか、或いは切断により３４０〜６６０ｂｐの断片を選択することを特徴とするライブラリー調製方法。
  7. （１）請求項６に記載のライブラリー調製方法でライブラリーを調製するステップと、
    （２）前記シーケンスライブラリーをシーケンシングするステップ、を含むことを特徴とするシーケンシング方法。
  8. （１）請求項６に記載のライブラリー調製方法でライブラリーを調製するステップと、
    （２）前記シーケンスライブラリーをシーケンシングするステップと、
    （３）シーケンシング結果に基づいて結果を判定するステップと、を含み、
    前記結果を判定する方法は、
    ａ．設定パラメータに基づいて、アライメントされた塩基のＱ値が３０より大きいシーケンシングにおける唯一のマッピング配列を選択するステップと、
    ｂ．ランダムタグ配列に基づいて反復判定を実施することで塩基の再補正を実施するステップと、
    ｃ．ＳＮＰ ｃａｌｌｉｎｇソフトを用いてＳＮＰ座位検出を実施し、ＳＮＰ座位情報を統計して、最終的にＳＮＰ座位及び対応するＭＡＦ情報を取得するステップと、
    ｄ．検出したＳＮＰ座位及びＭＡＦ情報と、対照群の突然変異位置及び集団ゲノムの変異情報データベースとを比較して同一の突然変異位置をフィルタリングし、最後に残った突然変異位置情報を最終的に検出した突然変異位置情報とするステップ、を含むことを特徴とする核酸配列を特定する方法。
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