JP6827947B2 - 人工鼓膜デバイスおよびその使用 - Google Patents

Description

本明細書は、人工グラフトに関する。

３次元（３Ｄ）印刷は、所望の３Ｄ形状または３Ｄ物体が、利用可能な材料供給源から構築される付加製造法（ａｄｄｉｔｉｖｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）の一種である。場合によっては、材料は最初、製造プロセス中に一時的に溶融する固体、固化する液体、または固化する粉末である。３Ｄ印刷技術の例として、光応答性樹脂がレーザで硬化する、ステレオリソグラフィ；固体材料が溶融し、印刷され、そして固化したときに周囲の材料に融合する、溶融堆積モデリング（ＦＤＭ）；インクが圧力によりノズルヘッドから押し出されて、得られた物体が硬化または焼結し得る、フィラメント状押出し／ダイレクトインクライティング、および粒状材料の層が、多くの場合熱または流体結合剤により結合する、粒状材料結合が挙げられる。他の３Ｄ付加製造法として、熱溶融フィラメント製造（ＦＦＦ）、ステレオリソグラフィ（ＳＬＡ）、デジタルライトプロセシング（ＤＬＰ）、電子ビーム溶融（ＥＢＭ）、選択的レーザ溶融（ＳＬＭ）、選択的加熱焼結（ＳＨＳ）、選択的レーザ焼結（ＳＬＳ）、直接金属レーザ焼結（ＤＭＬＳ）、薄膜積層法（ＬＯＭ）、および電子ビーム自由形状加工（ＥＢＦ３）が挙げられる。

鼓膜グラフトは、患者の鼓膜を再構築および／または修復するために行われる外科的操作である鼓室形成術の実施に用いられる、インプラントまたは移植体である。鼓室形成術の手順はまた、中耳小骨を、鼓膜と連続させて再構築することを含む。鼓膜グラフトは典型的に、自己由来の側頭筋膜、軟骨膜、軟骨、および／または皮膚グラフトからなる。鼓室形成術は多くの場合、鼓膜だけが外科的に対処される場合に、鼓膜形成術と呼ばれる。

人工鼓膜デバイスは、リブのスキャフォールドを、例えば３Ｄ印刷によって調製し、かつその後、または同時に、リブ間の開放空間（ｏｐｅｎ ｓｐａｃｅ）または空隙（ｖｏｉｄ）を、同じもしくは異なる材料で充填して膜を形成することによって、構築され得る。スキャフォールドおよび膜は一緒に、人工鼓膜デバイスを形成し、これはその後、対象、例えばヒト患者中に移植されることになる外科用グラフトとして用いられ得る。当該ヒト患者は、例えば、慢性中耳炎（エウスタキオ管を通る換気の不良、患者の鼓膜中の穿孔、可動性が低くなる鼓膜の瘢痕化、軍隊または民間人の爆風損傷、鼓膜の慢性的収縮、および他の臨床的病因に起因する中耳の持続的な炎症）に苦しんでいる。

新しいグラフトデバイスはまた、膜の特定の構造的形状を分析してから、３Ｄ印刷プラットフォームによりこの形状を独立して再現することによって、鼓膜の特性を研究するためのインビトロツールとして用いられ得る。

２層鼓膜グラフトデバイス、例えばインターロック２層グラフトデバイスは、単一構成要素の人工鼓膜デバイスと類似の技術を用いて調製され得、かつ、鼓膜穿孔、例えば、ほぼ全体的な穿孔を修復するのに用いられ得る。これらの２構成要素の２層グラフトデバイスは、中耳に面する鼓膜の下側に接着するように設計されるアンダーレイグラフトデバイスと、外耳道に面する鼓膜の上部上に固定されるオーバーレイグラフトデバイスとを備える。２つのグラフト構成要素の１つ、例えばアンダーレイグラフトデバイスは、突出部、例えばインターロック突出部を備え、これは、穿孔にフィットし、かつ穿孔を通って延び、そして第２の構成要素、例えばオーバーレイグラフトデバイス中の開口部と噛み合って、２層グラフトデバイスを固定して、穿孔を囲み、かつ健康なＴＭ組織のカフを囲む鼓膜が、グラフトデバイスの２つの構成要素（層）の間に挟まれて、創傷の修復を促進し、かつ適切な生物学的環境を確保するように設計かつ構成されている。オーバーレイデバイス中の開口部、およびアンダーレイデバイスの突出部は、いわゆる「ロックアンドキー（ｌｏｃｋ ａｎｄ ｋｅｙ）」設計で一緒にフィットし得る。

一部の実施形態において、２つの構成要素を一緒に保持するために、組織、他の生体適合性の接着剤、例えばフィブリン糊、またはテザーもしくはステッチによって、２つのグラフト構成要素が固定されてよい。当該実施形態において、突出部が存在しなくてもよいし、各構成要素が、穿孔を通過して、他方の構成要素由来の突出部と直面して接触する突出部を備えてもよい（ゆえに、これらの突出部は典型的に、ロックアンドキーアプローチよりも構成が短く、かつ単純である）。また、ロックアンドキーアプローチであっても、接着剤が追加的に用いられてよい。

一態様において、本開示は、第１の材料または材料の組合せから製造される複数のリブを備えるスキャフォールドと、リブの間の、第１の材料もしくは材料の組合せ、異なる第２の材料、第１の材料および第２の材料の組合せ、または第２の材料および１つまたは複数の他の異なる材料の組合せで充填される、またはこれで形成された複数の開放空間または空隙とを備えて、例えば、リブの間に薄い人工膜を形成する、人工鼓膜グラフトデバイスを特徴とする。ある実現例において、当該グラフトデバイスは、例えば、人工鼓膜デバイスの表面に、鼓膜穿孔を通ってフィットするように構成される突出部を連結することによってアンダーレイグラフトデバイスを、またはアンダーレイグラフトデバイスの対応する突出部とフィットし、かつこれに係止するように構成される開口部を有するオーバーレイグラフトデバイスを、形成するのに用いられ得る。

新しいデバイスの実現例として、以下の特徴のあらゆる組合せ、１つ、または全てを含んでもよいし、いずれも含まなくてもよい。スキャフォールドの少なくとも一部のリブは、円形状で形成されてもよいし、スキャフォールドの少なくとも一部のリブは、放射状パターンを形成してもよい。スキャフォールドの少なくとも一部のリブは、ハブアンドスポーク（ｈｕｂ ａｎｄ ｓｐｏｋｅ）構成で形成されてよい。スキャフォールドの少なくとも一部のリブは、一群の同心の幾何形状、例えば平坦な円形状で形成されてよい。人工鼓膜は、円錐形状またはいくつかの他の３Ｄ形状、例えば円錐の一部を形成するように設計されてよい。種々の実施形態において、第１の材料、例えばスキャフォールドまたはリブの材料として、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ｐｏｌｙ （ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ））（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエステルカーボネートウレタン尿素（ＰＥＣＵＵ）、ポリオクタメチレンマレエート無水シトレート（ＰＯＭａＣ）、ポリ（グリセロールセバケート）（ＰＧＳ）、ポリ（オクタンジオール−コ−シトレート）（ＰＯＣ）、ポリウレタン、コラーゲン（例えばＩＩＩ型コラーゲン）、フィブリン、細胞外マトリックス、ナイロン、絹、ポリグレカプロン、およびエラスチンの１つまたは複数が挙げられ得る。ヒドロゲルが、例えば、既に先に列挙される他のスキャフォールド／リブ材との混合物中に含まれてもよい。

第２の材料、例えば充填材として、１つまたは複数の第１の材料、および／または１つまたは複数のヒドロゲル、および／または１もしくは複数の他の材料が挙げられ得る。本明細書中に記載される方法に用いられ得る充填材の一部の例として、限定されないが、コラーゲン、例えば、ＩＩＩ型コラーゲン、細胞外マトリックス、ヒドロゲル、例えばフィブリンヒドロゲル、二酸化チタン、セルロース、ゼラチン、アガロース、アルギン酸塩、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ヒアルロン酸、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリカプロラクトン、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレート）、プルロニックＰＬＡ、ＰＧＡ、トランスグルタミナーゼ、ＰＬＧＡ、ＰＤＭＳ、ポリグレカプロン、ポリエステルカーボネートウレタン尿素（ＰＥＣＵＵ）、ポリオクタメチレンマレエート無水シトレート（ＰＯＭａＣ）、ポリ（グリセロールセバケート）（ＰＧＳ）、ポリ（オクタンジオール−コ−シトレート）（ＰＯＣ）、ポリウレタン、ならびにコラーゲンおよびフィブリンの混合物が挙げられる。ゆえに、第２の材料として、これらの材料の２つ以上の混合物、例えば、細胞の増殖をサポートするコラーゲンおよびフィブリン、またはコラーゲン、フィブリン、およびヒドロゲルが挙げられ得る。当該充填材は、スキャフォールド／リブ材として用いられてもよいし、その逆も可能である。

デバイスはさらに、細胞接着物質および／または細胞侵入誘導物質、例えば増殖因子の１つまたは複数を含んでよい。デバイスはさらに、１つまたは複数の細胞、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、ケラチン生成細胞、幹細胞、前駆細胞、および上皮細胞を含んでよい。細胞は、患者から、または様々な入手源、例えば、別の対象由来もしくは培養細胞株由来の移植体から、採取されてよい。増殖因子として、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、およびケラチン生成細胞増殖因子（ＫＧＦ）が挙げられ得る。これらの増殖因子は、本来の増殖因子勾配を再現し、または鼓膜（ＴＭ）の両面を方向付けて、様々な細胞型の内殖を促進かつ「調整」するように、３Ｄ印刷プロセスの間に、充填材全体に直接含まれてもよいし、選択的にパターン化されてもよい。デバイスはさらに、１つまたは複数の薬物溶出物質を含んでよい。

種々の実施形態において、デバイスは、直径が０．５〜１２ミリメートル、例えば１、２、３、５、７、９、１０、または１１ｍｍであってよい。デバイスは、直径が、特定の患者、例えばヒト患者に基づいていてよい。デバイスは、厚さが１０〜７５０ミクロン、例えば、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、または７５０ミクロンであってよい。一部の実施形態において、デバイスは、空気に対して非透過性である一方、他の実施形態において、空気に対して透過性であってもよい。デバイスは、小分子、生物製剤、ステロイド、および抗生物質が挙げられる、１つまたは複数の薬物または他の剤に対して、透過性であるように設計されてもよい。

一部の実施形態において、デバイスは、鼓膜グラフトの片面上に耳小骨コネクタを備えてよい。耳小骨コネクタは、人工鼓膜臍、槌骨、または鐙骨として形成されてもよいし、鼓膜臍、槌骨、または鐙骨の１つの形状をとってもよいし、リング、ヒンジ、ループ、アーチウェイ、もしくはボールソケット（ｂａｌｌ ｏｒ ｓｏｃｋｅｔ）、またはそれらのいくつかの組合せであってもよい。例えば、そのような耳小骨コネクタは、人工鼓膜グラフトデバイス、例えばアンダーレイグラフトデバイスの表面に固定されてよい。種々の実施形態において、コネクタは、鼓膜グラフトが移植される前に、またはそれと同時に、患者の中耳内の残りの耳小骨連鎖に、または中耳内に移植された耳小骨プロテーゼに連結し得る。

別の態様において、本開示は、損傷した鼓膜を治癒もしくは増強するために、または喪失した鼓膜もしくはその一部を置換するために、例えば穿孔を修復するために、本明細書中に記載される人工鼓膜デバイスを患者中に移植する方法を特徴とする。本開示はまた、損傷し、または喪失した鼓膜を治癒し、増強し、または置換するための、本明細書中に記載されるデバイスのいずれかの使用を特徴とする。当該方法は、損傷し、または喪失した鼓膜にアクセスすることと；適切にサイズ設定され、かつ構成された人工鼓膜デバイスを得ることと；鼓膜の損傷部分をシールするように、人工鼓膜デバイスを固定すること、または喪失した鼓膜もしくはその喪失部分を置換することとを含む。例えば、当業者は、圧縮された、または巻かれたアンダーレイグラフトデバイスを、穿孔を通して挿入し、そしてアンダーレイグラフトデバイスを広げ、かつ中耳に面する鼓膜の下側に接着させてから、オーバーレイグラフトデバイスを、アンダーレイデバイスの突出部に連結することで、その少なくとも一部が穿孔を通って延びて、２層のグラフトデバイスを、グラフトデバイスの２層の間に挟まれた、穿孔を囲む鼓膜と共に固定することよって、鼓膜穿孔を修復することができる。アンダーレイグラフトおよび／またはオーバーレイグラフトを配置する挿入装置が用いられてもよい。

一部の実施形態において、突出部は、オーバーレイデバイスに固定されてもよいし、オーバーレイデバイスおよびアンダーレイデバイスは、耳への移植前に、一体的に連結または製造されてもよい（例えば、「ダンベル」の形状であり、ダンベルの狭い中心連結部分が、鼓膜中の穿孔を通過して、鼓膜の両面上に２つのより広い平坦部分を固定する）。

本開示はまた、本明細書中に記載される人工鼓膜グラフトデバイスおよびインターロック２層グラフトデバイスの１つまたは複数を製造する方法を特徴とする。当該方法は、第１の材料または材料の組合せを用いて、複数のリブを備えるスキャフォールドを形成して、リブの間に１つまたは複数の開放空間を定めることと；第１の材料もしくは材料の組合せ、異なる第２の材料、第１の材料および第２の材料の組合せ、または第２の材料および１つまたは複数の他の異なる材料の組合せを用いて、リブの間の開放空間内に薄膜を形成することとを含む。その後、または、例えばアンダーレイグラフトデバイス用に、第１の構成要素を構成する間に、具体的に成形された突出部が適所に構成され、または後にグラフトデバイスに固定される。突出部の少なくとも一部は、修復されることになる穿孔を通ってフィットするように構成される。例えば、突出部は、Ｔ字形状、ボタン形状、またはボール形状であってよい。突出部の外部輪郭が、鼓膜穿孔に正確に対応するように設計かつ構成され得る一方、このことは、突出部、または突出部の一部が、穿孔を通ってフィットする限り、必要とされない。第２の構成要素、例えばオーバーレイグラフトデバイスについて、これは、アンダーレイグラフトデバイス上の突出部の外部形状に対応する開口部を備えるように構成された後に、構成またはカットされる。

別の態様において、本開示は、本明細書中に記載される人工鼓膜デバイスを一対備える、またはそれらからなる新しい２層鼓膜デバイスを特徴とする。当該２層デバイスにおいて、一対の人工鼓膜デバイスの第１の構成要素はさらに、突出部を備え、一対の人工鼓膜デバイスの第２の構成要素はさらに、突出部の挿入を可能にするように構成された開口部を備え、第１の構成要素および第２の構成要素は、互いに固定され得る。一部の実現例において、開口部および突出部は、ロックアンドキー構成、ソケットアンドボール（ｓｏｃｋｅｔ ａｎｄ ｂａｌｌ）構成、またはオープニングアンドヒンジ（ｏｐｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｈｉｎｇｅ）構成を備えてよく、またはそれからなってよい。

本開示はまた、鼓膜穿孔を修復する方法、およびそのような穿孔を修復するための新しい２層鼓膜デバイスの使用を特徴とする。当該方法は、本明細書中に記載される２層鼓膜デバイスを得ることと；アンダーレイグラフトデバイスとしての第１の構成要素を、穿孔中に挿入して、アンダーレイデバイスの表面を鼓膜に固定して、突出部が穿孔を通って突出するようにすることと；オーバーレイデバイスとしての第２の構成要素を、穿孔に適用して、突出部がオーバーレイデバイスの開口部を通って突出し、かつオーバーレイデバイスの表面を越えて延びるようにすることと；オーバーレイデバイス、および突出部またはアンダーレイデバイスの１つまたは両方を、互いに対して移動させて、突出部の一部が、オーバーレイデバイスの表面上にしっかりとフィットして、アンダーレイデバイスおよびオーバーレイデバイスを一緒にロックし、これらの間に鼓膜および穿孔をはさむようにすることとを含む。

当該方法において、アンダーレイデバイスの上面は、毛細管作用もしくは接着、またはフィブリン糊等の組織接着剤によって、鼓膜の内面に接着され得る。当該方法は、局所鎮痛を用いて、または用いない、そして鎮静または全身麻酔を用いない臨床現場で実行され得る。一部の実現例において、当該方法は、鎮静または麻酔を伴って、手術室で実行される。

新しい方法の実現例として、以下の特徴のあらゆる組合せ、１つ、または全てを含んでもよいし、いずれも含まなくてもよい。スキャフォールドを製造する新しい方法は、スキャフォールドを３次元（３Ｄ）プリンタで印刷することと、リブ間の１つまたは複数の空隙を、第２の材料で充填することによって充填することとを含んでよい。３Ｄプリンタは、第１の材料を押し出すためのノズルを備えてよく、ノズルは、直径が５００μｍ以下、例えば、直径が１０〜５００μｍ、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０μｍ以下の開口部を有してよい。スキャフォールドを印刷することは、ガラス、ポロクサマー、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、および金属箔、例えばアルミニウム箔の１つまたは複数が挙げられる担体上に、スキャフォールドを印刷することを含んでよい。スキャフォールドの空隙を第２の材料で充填することは、３Ｄプリンタの担体からスキャフォールドを取り出すことと；ウェルを、液体形態の第２の材料で充填することと；スキャフォールドを、第２の材料を有するウェル内に入れることと；スキャフォールドおよび充填された第２の材料を硬化させて、第２の材料を固化させることとを含んでよい。スキャフォールドおよび充填された第２の材料を硬化させて、第２の材料を固化させることは、スキャフォールドおよび充填された第２の材料を、脱イオン水中で３７℃にてインキュベートすることを含む。

一部の実現例において、スキャフォールドは、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエステルカーボネートウレタン尿素（ＰＥＣＵＵ）、ポリオクタメチレンマレエート無水シトレート（ＰＯＭａＣ）、ポリ（グリセロールセバケート）（ＰＧＳ）、ポリ（オクタンジオール−コ−シトレート）（ＰＯＣ）、ポリウレタン、エラスチン、コラーゲン、例えばスパンコラーゲン、フィブリン、ナイロン、絹、ポリグレカプロン、およびこれらの材料のいずれか１つまたは複数のポリマー、例えばヒアルロン酸ポリマーを用いて、調製されてよい。充填される第２の材料は、これらの材料のいずれかであってよく、および／またはウシフィブリンヒドロゲル等のヒドロゲルであってよい。

ここで記載される系およびプロセスが用いられて、いくつかの利点を提供することができる。新しい人工鼓膜グラフトデバイスおよびインターロック２層グラフトデバイスは、例えば特定の患者の、または患者群の、穿孔された、またはそれ以外では損傷した鼓膜の音響特性を模倣または改善するように、音響的に調整され得る。また、新しい人工鼓膜グラフトデバイスは、穿孔および収縮に抵抗するように、そして耳小骨連鎖に、または内耳中の底板に直接的に、しっかり取り付けられるように、設計され得る。これらのグラフトは、空気もしくは液体に対して非透過性であり、または空気に対して透過性であるが液体に対して透過性ではなく、かつ／または小分子および／もしくは生物製剤もしくは他の特定の剤に対して透過性であるように、設計され得る。一部の実施形態において、グラフトの幾何形状は、意図される特定の患者の解剖学的特徴および欠損に基づいて設計され得る。グラフトは、天然の鼓膜、または穿孔および／もしくは収縮の機会を減らし得る天然の、組織ベースの膜グラフトと、機械強度が等しい、またはそれよりも機械強度が大きな材料で、製造され得る。材料は、寸法的に安定し得、このことが収縮を避け、かつ耳小骨連鎖にしっかりと取り付けられる一助となり得る。固有のＴＭの円錐形状を再現し、または患者のＴＭの湾曲に一致するようにパッチを設計するために、３Ｄ印刷技術が用いられる。円錐形状が、支持鋳型、またはプルロニックインク等の犠牲材料の使用によって、作り出され得る。

当該デバイスは、耳小骨コネクタ構成要素を伴って、または伴わずに設計されてよく、これは、鼓膜中に組み込まれて、鼓膜の、耳小骨連鎖への、または内耳の底板への直接的な取り付けを可能にして、鼓膜から内耳への音響エネルギーの強固なカップリングを確実にすることとなる。本明細書中に記載される鼓膜グラフトは、中耳への薬物および／または空気の送達を容易にするので、創傷治癒を向上させ得、かつ迅速化し得、伝音性を向上させ得、再置換手術のための再手術の必要性を減らし得、そして患者の欠陥サイズおよび音響ニーズに基づいてグラフトを提供するようにカスタマイズおよび／または個人化され得る。

新しい鼓膜グラフトの使用は、聴覚再構築のための第２の手術の必要性を回避することができる。当該グラフトは、術前に適切なサイズに定められるため、外科的操作の容易さを増大させ得、かつ容易に取り扱われ得る。また、患者固有の基準および実行されることになる外科手術の基準に基づいて、吸収性材料または非吸収性材料が使用かつ選択され得る。新しいインターロック２層グラフトデバイスは、デバイスの２つの部分を操作するための標準的な外科用ツールを用いて、または穿孔を通って中耳中にグラフトが容易に展開することを可能にする、円筒形チューブの形状を有する特殊挿入ツールを用いて、患者の耳中に挿入されて、鼓膜穿孔を修復することができる。また、新しい方法は、多くの場合、全身麻酔を必要とせずに医院で実施され得るので、多くの状況で、外科手術および入院の必要性を避けることができる。

他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。適切な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書中に記載されるのと類似の、または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験に用いられ得る。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配することとなる。また、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することは意図されない。

本発明の他の特徴および利点が、以下の発明を実施するための形態から、そして特許請求の範囲から、明らかになるであろう。
種々の図面における同様の参照符号は、同様の要素を示す。

図１Ａ（ＦＩＧ．１Ａ）は、ヒト鼓膜の概略図である。 図１Ｂ（ＦＩＧ．１Ｂ）は、鼓膜グラフトデバイスの一例の平面図である。 図２Ａ（ＦＩＧ．２Ａ）は、鼓膜グラフトのスキャフォールドの一例の図である。 図２Ｂ（ＦＩＧ．２Ｂ）は、リングコネクタを備える鼓膜グラフトのスキャフォールドの一例の図である。 図２Ｃ（ＦＩＧ．２Ｃ）は、耳小骨連鎖に取り付けるための１重のアーチリングコネクタ設計を有する鼓膜グラフトデバイススキャフォールドの表面上の耳小骨コネクタの一例の写真である。 図２Ｄ（ＦＩＧ．２Ｄ）は、耳小骨連鎖に取り付けるための２重のアーチリングコネクタ設計を有する鼓膜グラフトデバイススキャフォールドの表面上の耳小骨コネクタの一例の写真である。 図２Ｅ−Ａ〜２Ｅ−Ｄ（ＦＩＧ．２Ｅ−Ａ〜２Ｅ−Ｄ）は、種々の設計の鼓膜パッチグラフトスキャフォールドの写真である。 図３Ａ（ＦＩＧ．３Ａ）は、様々なサイズおよび幾何構造のスキャフォールドの例の図である。 図３Ｂ−Ａ〜図３Ｂ−Ｃ（ＦＩＧ．３Ｂ−Ａ〜ＦＩＧ．３Ｂ−Ｃ）は、ＰＤＭＳ、ＰＬＡ、およびＰＣＬそれぞれのフィラメント／リブから構成される鼓膜スキャフォールドの一連の画像であり、８Ｃ（Ｃ＝円周繊維／リブ構造体）／８Ｒ（Ｒ＋放射状繊維／リブ構造体）および１６Ｃ／１６Ｒのフィラメント構造がある。各ボックスの第１列のＴＭは、全直径が２５ｍｍである。次の２つの列はそれぞれ、スケールバーが１ｍｍである５０×の、そしてスケールバーが５００μｍである１００×の高倍率画像を示す。図３Ｂ−Ｄ（ＦＩＧ．３Ｂ−Ｄ）は、主要設計の形状を強調する代表的な印刷されたスキャフォールドの画像である。 図３Ｃ−Ａ（ＦＩＧ．３Ｃ−Ａ）は、境界リブ構造を有するフラクタル繊維／リブ構造パターンを有するグラフトデバイスの写真である。図３Ｃ−Ｂ（ＦＩＧ．３Ｃ−Ｂ）は、境界リブ構造を有していないフラクタル繊維／リブ構造パターンを有するグラフトデバイスの写真である。 図４Ａ（ＦＩＧ．４Ａ）は、アンダーレイグラフトデバイスの概略図である。 図４Ｂ（ＦＩＧ．４Ｂ）は、オーバーレイグラフトデバイスの概略図である。 図５Ａ（ＦＩＧ．５Ａ）は、鼓膜グラフトのスキャフォールドの例である。 図５Ｂ（ＦＩＧ．５Ｂ）は、鼓膜グラフトのスキャフォールドの例である。 図６Ａ（ＦＩＧ．６Ａ）および図６Ｂ（ＦＩＧ．６Ｂ）はそれぞれ、アンダーレイグラフトデバイスおよびオーバーレイグラフトデバイスの写真であり、スキャフォールドおよび充填材を示している。図６Ｃ（ＦＩＧ．６Ｃ）は、組み合わせた２層グラフトデバイスの写真であり、図６Ａのアンダーレイの突出部が、図６Ｂのオーバーレイデバイス中の開口部を通して引っ張られ、そしてオーバーレイデバイスが回転して、オーバーレイデバイスの表面をおおうＴ字形状突出部の上部すなわち「アーム」をくさび留めすることによって、２つを一緒に固定している。 図７Ａ（ＦＩＧ．７Ａ）は、鼓膜グラフトを作製するためのプロセスの一例のフローチャートである。 図７Ｂ（ＦＩＧ．７Ｂ）は、鼓膜グラフトを作製するためのプロセスの一例のフローチャートである。 図８Ａ（ＦＩＧ．８Ａ）は、３Ｄプリンタによって印刷されることになる鼓膜グラフトスキャフォールドの一例を示す概略図である。 図８Ｂ（ＦＩＧ．８Ｂ）は、３Ｄプリンタによって印刷されることになる鼓膜グラフトスキャフォールドの一例を示す概略図である。 図８Ｃ（ＦＩＧ．８Ｃ）は、３Ｄプリンタによって印刷されることになる鼓膜グラフトスキャフォールドの一例を示す概略図である。 図８Ｄ（ＦＩＧ．８Ｄ）は、充填材で充填されているスキャフォールドを示す。 図８Ｅ（ＦＩＧ．８Ｅ）は、医師がどのようにして外耳道中に、そして鼓膜上に鼓膜グラフトデバイスの１つを配置することができるかの概略図である。 図９Ａ（ＦＩＧ．９Ａ）は、鼓膜穿孔をシールするための、本明細書中に記載される２層グラフトデバイスの使用の概略図である。 図９Ｂ（ＦＩＧ．９Ｂ）は、鼓膜穿孔をシールするための、本明細書中に記載される２層グラフトデバイスの使用の概略図である。 図９Ｃ（ＦＩＧ．９Ｃ）は、鼓膜穿孔をシールするための、本明細書中に記載される２層グラフトデバイスの使用の概略図である。 図９Ｄ（ＦＩＧ．９Ｄ）は、鼓膜穿孔をシールするための、本明細書中に記載される２層グラフトデバイスの使用の概略図である。 図１０Ａ（ＦＩＧ．１０Ａ）は、繊維／リブ構成鋳型を示す概略図である。図１０Ｂ（ＦＩＧ．１０Ｂ）は、繊維鋳型上に画像化された鼓膜穿孔を示す概略図である。図１０Ｃ（ＦＩＧ．１０Ｃ）は、中心領域が、穿孔の位置内のリブに一致するように設計されたリブを備える、カスタマイズされた鼓膜パッチグラフトまたは２層グラフトデバイスを示す概略図である。図１０Ｄ（ＦＩＧ．１０Ｄ）は、修復をもたらすように穿孔を覆うデバイスの配置を示す概略図である。 図１１Ａ−１〜図１１Ａ−４（ＦＩＧ．１１Ａ−１〜ＦＩＧ．１１Ａ−４）は、ＰＤＭＳスキャフォールド（１１Ａ−１）、コラーゲン／フィブリン充填スキャフォールド（１１Ａ−２）、デバイス上で増殖する細胞を示す、図１１Ａ−２の拡大画像（１１Ａ−３）、および図１１Ａ−３の更なる拡大画像（１１Ａ−４）である。図１１Ｂ−１（ＦＩＧ．１１Ｂ−１）および図１１Ｂ−２（ＦＩＧ．１１Ｂ−２）は、インビトロ細胞研究中に、スキャフォールドおよび充填材の表面上で増殖した細胞を示す３次元プロットである。 図１２Ａ−Ａ〜１２Ａ−Ｇ（ＦＩＧ．１２Ａ−Ａ〜１２Ａ−Ｇ）は、音響試験装置の写真、および音響試験から収集された、印刷された鼓膜の音響特性のデータのグラフ表示である。 図１２Ｂ−１〜１２Ｂ−８（ＦＩＧ．１２Ｂ−１〜１２Ｂ−８）は、音響試験装置の写真、および音響試験から収集された、印刷された鼓膜の音響特性のデータのグラフ表示である。 図１２Ｃ−１Ａ〜１２Ｃ−１Ｄ（ＦＩＧ．１２Ｃ−１Ａ〜１２Ｃ−１Ｄ）および図１２Ｃ−２Ａ〜１２Ｃ−２Ｄ（ＦＩＧ．１２Ｃ−２Ａ〜１２Ｃ−２Ｄ）は、音響試験装置の写真、および音響試験から収集された、印刷された鼓膜の音響特性のデータのグラフ表示である。 図１２Ｄ−１Ａ〜１２Ｄ−１Ｂ（ＦＩＧ．１２Ｄ−１Ａ〜１２Ｄ−１Ｂ）および図１２Ｄ−２Ａ〜１２Ｄ−２Ｂ（ＦＩＧ．１２Ｄ−２Ａ〜１２Ｄ−２Ｂ）は、音響試験装置の写真、および音響試験から収集された、印刷された鼓膜の音響特性のデータのグラフ表示である。 図１３Ａ（ＦＩＧ．１３Ａ）は、ヒツジの鼓膜中の穿孔を修復するために移植された、トリミングされた鼓膜グラフトを示す写真である。 図１３Ｂ（ＦＩＧ．１３Ｂ）は、ヒツジの鼓膜中の穿孔を修復するために移植された、トリミングされた鼓膜グラフトを示す写真である。 図１４Ａ〜１４Ｃ（ＦＩＧ．１４Ａ〜１４Ｃ）は、チンチラモデル中のＴＭ穿孔をシールするための鼓膜パッチグラフトの使用の写真である。 図１５Ａ〜図１５Ｄ（ＦＩＧ．１５Ａ〜ＦＩＧ．１５Ｄ）は、本明細書中に記載されるグラフトデバイス上のレーザドップラ振動（「ＬＤＶ」）測定の結果を示す一連のグラフである。 図１６のＡ〜Ｃ（ＦＩＧ．１６、Ａ〜Ｃ）は、円錐形状を有する鼓膜グラフトの写真である。

人工鼓膜デバイスおよびインターロック２層グラフトデバイスが、そのような膜デバイスを製造するためのいくつかのプロセス、そのような膜デバイスの使用、およびそのような膜デバイスに実行された試験の結果と共に記載される。

特に部分鼓膜穿孔（臨床診療において見られる大多数の穿孔を代表する）を扱うために、発明者らは、穿孔修復を容易にするための２層インターロックＴＭグラフトを考案した。グラフトは潜在的に、臨床現場で用いられ、これにより、例えば耳後方の、または経外耳道の軟組織切開に由来する、全身麻酔および外科手術に関連する罹患を回避し得る。代わりに、グラフトは、特定の状況において必要とされるならば、手術室の環境において、鎮静または麻酔と共に用いられ得る。外耳道を通って配置される新しいグラフトデバイスは、手術の必要のない外科的鼓室形成術の利点を提供する。２層設計により、好都合な音響特性および弾力のある機械特性を有するスキャフォールド繊維構成を用いた、アンダーレイおよびオーバーレイのグラフトアプローチの組合せを可能にする。ＴＭ修復への「パッチ」アプローチとは異なり、この「サンドイッチ」２層設計は、ＴＭの外耳表面および内耳表面の両方に構成要素を接合させて、損傷後のＴＭの細胞の移動および増殖、ならびに治癒にとって理想的な環境を提供する。陽または陰の中耳圧に曝された場合であっても、グラフトの安定性を確実にする新しいキー／ロックデバイスを生産する３Ｄ印刷が用いられてよい。しかしながら、ロックアンドキーの代わりに、他のタイプの形状が用いられてよい。例えば、ボールアンドソケット（ｂａｌｌ ａｎｄ ｓｏｃｋｅｔ）、ヒンジ、テザー、ステッチ、および／または接着剤が用いられ得る。

鼓膜グラフトデバイス
本明細書中に記載される人工鼓膜グラフトデバイスまたは単に「グラフト」は、音響的に調整され（すなわち、音響特性が、特定の患者における最良の伝音に調節される程度に修正され）、穿孔および収縮に抵抗し、かつ耳小骨連鎖にしっかりと取り付けられるように設計される。人工鼓膜グラフトは、リブからなり、リブ間に空隙がある、例えば２Ｄ層または３Ｄ層のスキャフォールドを有し得る。典型的には、空隙を充填するのに、そして固体の、場合によっては半透過性の、人工鼓膜グラフトを作製するのに、充填材、例えばヒドロゲルが用いられる。これらの人工鼓膜グラフトは、患者の鼓膜を修復し、置換し、またはこれにパッチを当てるためのインプラントとして用いられ得る。同様に、インターロック２層グラフトは、鼓膜穿孔をシールするために用いられ得る。

一部の実施形態において、人工グラフト、例えばインターロック２層グラフトは、いかなる生細胞も存在しない状態で移植されるが、患者の外耳道から細胞を誘導して、数週〜数ヶ月の期間内にグラフトに移動させて定着させることとなる剤を含む。他の実施形態において、スキャフォールド材および／または充填材は、スキャフォールド材および／または充填材の全部または一部を被覆する、またはこの内部に統合されるための、例えば、患者または他の対象から採取された生細胞の基質として用いられる。

図１Ａは、ヒト鼓膜の先行技術の概略図である。３Ｄ印刷される鼓膜の円形かつ放射状のリブ構造の着想は、天然の鼓膜における繊維構成に由来した。視覚Ｇコードプログラムを用いて、円形かつ放射状の繊維、および槌骨領域をトレースした。当該図面は、ＳＥ１７００ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のフィラメント状押出しを介して３Ｄ印刷されるＧコードプログラムに変換された。

一部の実施形態において、生体適合性の「インク」を出す３Ｄプリンタを用いて、スキャフォールドを最初に「印刷」することによって、人工鼓膜グラフト、ならびに２層グラフトの２つの層および突出部が製造され得る。固化して３Ｄプリンタの印刷面から取り出されると、スキャフォールドは、硬化性の液体に浸漬されてよい。この液体は、スキャフォールドのリブ間の空隙を充填してから硬化して、スキャフォールドのリブ間に固体膜を形成し得る。硬化すると、人工鼓膜グラフトは、患者の鼓膜の再構築のための鼓室形成術および／または鼓膜形成術に用いられ得る。また、２層グラフトは、鼓膜穿孔を簡単かつ効果的に修復するのに用いられ得る。

他の実施形態において、１つまたは複数のタイプの生体適合性インクを出す３Ｄプリンタを用いて、スキャフォールドおよび充填材を同時に、または連続して印刷することによって、人工鼓膜グラフト、および２層グラフトが製造され得る。リブおよび充填材は、２つの異なる印刷物質からなってもよいし、場合によっては、同じ材料の異なるパターンからなってもよい。製造が完了すると、グラフトは３Ｄプリンタの印刷面から取り出されて、例えば熱硬化、ＵＶ光、二酸化炭素もしくは他のガス、圧力、または冷却による硬化が挙げられ得る１つまたは複数の方法によって、硬化される。当該材料は、吸収性または非吸収性、透過性または非透過性、薬物溶出性、細胞化性等の他の有用な特性を有し得る。

図１Ｂは、人工鼓膜グラフト１００の概略平面図である。鼓膜グラフト１００の形状は、略円形であってよく、円形の、平坦な、または円錐形の構造体であり、またはこれに近い全体形状を形成するように、中心が持ち上げられていてもよいし、平坦であってもよい。鼓膜グラフト１００は、リブ１０２、および充填材で充填される空隙１０４を含む。リブのこの構成により、３Ｄ印刷された鼓膜は、天然の鼓膜と比較して同様な、または向上した音響特性および機械特性を有し得る生体模倣構造が可能となる。

鼓膜グラフト１００の全体的なサイズおよび形状は、鼓膜グラフト１００が作製される患者に基づいて選択されてよい。例えば、成人用に、鼓膜グラフト１００は、直径が数ミリメートルのオーダーで作製されてよい。例えば、鼓膜グラフト１００の直径は、技術的に、かつ生理学的に適切なままで、約０．５、１、２、３、５、８、１０、１２、１４、１６、１７、１８、もしく１９ミリメートル、またはそれ以上もしくはそれ以下であってよい。例えば、鼓膜にパッチを当てるには、サイズが小さいほど適切であり得る一方、鼓膜を完全に置換するのに用いられる場合には、サイズが大きいほど適切であり得る。

２層グラフトのサイズおよび形状は、患者の鼓膜全体のサイズに依存するが、より重要なことには、穿孔のサイズに基づくこととなる。アンダーレイグラフトおよびオーバーレイグラフトの両方が、穿孔の最大寸法よりも、少なくとも約１〜２ｍｍ大きなサイズであるべきである。また、アンダーレイ（またはオーバーレイ）上の突出部は、配置を容易にするような多くの様々な形状およびサイズであってよい。

スキャフォールド
図２Ａおよび図２Ｂは、鼓膜グラフトのスキャフォールドの例の図である。示される図は、全ての充填材がスキャフォールドの空隙を充填するために加えられる前に撮られたスキャフォールドの写真から作成されたものである。

スキャフォールドは、多くのリブを備える。スキャフォールドのリブの一部は、円形の形状に、またはほぼ円形の形状に形成される。また、スキャフォールドのリブの一部は、まっ直ぐに、またはほぼまっ直ぐに形成されて、放射状パターンに配置される。代わりに、スキャフォールドのリブの一部は、ハブアンドスポーク構成を形成すると記載され得る一方、スキャフォールドの他の一部のリブは、同心幾何形状のグループに形成される。

スキャフォールドのリブ間には空隙がある。空隙は、スキャフォールドのいずれの材料もない領域である。以下で考察されるように、空隙を充填するのに充填材が用いられる。一部の実施形態において、空隙を充填するための材料の薄いシートを３Ｄ印刷するのに、リブに用いられるのと同じ材料が用いられてもよいし、異なる材料が用いられてもよい。

リブの断面形状は、技術的に適切なあらゆる形状であってよく、円形、矩形（例えば正方形）、三角形、または不規則形状が挙げられるが、これらに限定されない。リブの（最も広い点での）直径または厚さは、およそ数十〜数百ミクロンであってよい。例えば、個々のリブの厚さは、技術的に、かつ生理学的に適切なままで、５〜５０ミクロンから最大５００〜８００ミクロン、例えば１０〜１００ミクロン、１００〜５００ミクロン、もしくは５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０もしくは８００ミクロン、またはそれ以上もしくはそれ以下であってよい。リブはまた、鼓膜グラフトの、槌骨、砧骨、もしくは鐙骨への、耳小骨の１つの残りの部分への、市販の既存のプロテーゼへの、または直接的な内耳への、例えば、卵円窓の底板への連結を可能にする耳小骨コネクタを形成するように、成形され得る。当該コネクタは、耳小骨連鎖全体、またはその一構成要素を置換してよい。当該コネクタは、スキャフォールドの残りの部分に用いられる材料と同じ、または異なる材料、例えばヒドロキシアパタイト、チタン、またはニチノールで製造されてよい。図２Ｂから図２Ｄに示されるように、当該コネクタは、鼓膜から、天然の、または合成の耳小骨まで、統合された構成要素を取り付けることとなるボールアンドソケット、スナップ、ヒンジ、円形開口、または異なる連結構成の形状をとり得る。

図２Ａは、スキャフォールドの外周を越えて追加の材料を有するスキャフォールドの例を示す。追加の材料は、グラフトスキャフォールドおよび充填材と同じ材料であってもよいし、異なる材料であってもよく、インビトロ試験のための、またはライブサージェリにおいて外耳道に至るように鼓膜内に取り付けるための、グラフトを固定する手段として機能し得る。中心領域は、放射状に延びるリブによって囲まれたスキャフォールドである。リブ間の空隙が、充填材で充填され得る。

図２Ｂは、耳小骨人工器官にグラフトを取り付けるためのコネクタ領域として機能する追加の材料を有するスキャフォールドの例を示す。コネクタループを備える印刷されたスキャフォールドにより、耳小骨プロテーゼが、鼓膜グラフト上にクリンプされて、鼓膜グラフトと耳小骨連鎖または卵円窓との間に堅固な連結をもたらすことが可能となる。図２Ｃは、耳小骨連鎖に取り付けるための１重のアーチリングコネクタ設計を有する鼓膜グラフトデバイススキャフォールドの表面上の耳小骨コネクタの一例の写真である。図２Ｄは、耳小骨連鎖に取り付けるための２重のアーチリングコネクタ設計を有する鼓膜グラフトデバイススキャフォールドの表面上の耳小骨コネクタの一例の写真である。

図２Ｅ−Ａ〜図２Ｅ−Ｄは、アーク繊維（Ａ）、放射状繊維（Ｒ）、およびデバイスの外側周囲の境界領域を含む、本明細書で調整可能なアークパッチと呼ばれる様々な設計の鼓膜パッチグラフトスキャフォールドの写真である。当該パッチは、個別に、または本明細書中に記載される２層デバイスの一部として用いられ得る。デバイスのこれらの要素はそれぞれ、特定の患者の特定のニーズを満たすように設計（すなわち「調整」）され得る。

図３Ａは、様々なサイズおよび幾何構造の様々なスキャフォールド３００〜３１４のいくつかの例を示す図である。示されるように、スキャフォールドは、様々な全体直径で作製され得、８ｍｍから１４ｍｍに及ぶ直径が挙げられる。しかしながら、特定の患者のニーズに応じて、より大きな直径および／またはより小さな直径が可能である。スキャフォールド３００〜３１４はそれぞれ、リブを備え、スキャフォールド３００〜３１４はそれぞれ、様々な構成で配置された異なる数のリブおよび空隙を含む。図３Ｂ−Ａ〜図３Ｂ−Ｃは、放射状繊維（Ｒ）、円周繊維（Ｃ）、および境界領域繊維の数および構成が異なる他のスキャフォールドを示しており、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエステルカーボネートウレタン尿素（ＰＥＣＵＵ）、ポリオクタメチレンマレエート無水シトレート（ＰＯＭａＣ）、ポリ（グリセロールセバケート）（ＰＧＳ）、ポリ（オクタンジオール−コ−シトレート）（ＰＯＣ）、および／またはポリウレタンで製造される。図３Ｂ−Ｄは、基本フォーマットを示す。

アンダーレイグラフトデバイスおよびオーバーレイグラフトデバイスは、特定の穿孔を修復するのに必要な約２〜８ｍｍまたはそれ以上の範囲で製造されてよい。これらのデバイスは典型的に、約１００〜３００ミクロンの厚さ、例えば約１５０〜２５０ミクロン、例えば２００ミクロンの厚さである。

図示したものに加えて、リブの他の構成が可能であり、非規則的な、または規則的な幾何構成が挙げられる。スキャフォールド３００〜３１４はそれぞれ、異なる数および構成のリブを有するので、スキャフォールド３００〜３１４はそれぞれ、異なるサイズ、形状、および集合体サイズの空隙を有する。すなわち、任意の２つのスキャフォールド（示されていないものを含む）間の空隙の総容量は、同じである必要はない。後に記載されるように、これらの鼓膜グラフトは、異なる種の異なる患者を含む、異なる患者に用いられるように設計されてよい。このように、スキャフォールドのサイズ、ゆえに最終の鼓膜グラフトは、グラフトを受け入れることとなる患者に基づいて選択され得る。

スキャフォールドは、技術的に適切なあらゆる材料から作製され得る。例えば、用いられる材料は、生体適合性であり、スキャフォールドが設計されるサイズに製造され得、かつ、一旦移植されると、患者への振動の伝達を容易にするのに必須の機械特性を有し得るように、選択されてよい。本明細書中に記載される方法に用いられ得る材料の一部の例として、限定されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（体によって吸収されない）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）（吸収性である）、ポリ（グリセロールセバケート）（ＰＧＳ）（例えばＲＥＧＥＮＥＲＥＺ（登録商標）−エラストマ特性を有する、ＰＧＳ製の調整可能な生体吸収性エラストマ）、ポリウレタン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ナイロン、絹、ポリグレカプロン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）（体によって吸収される）、ポリエステルカーボネートウレタン尿素（ＰＥＣＵＵ）、ポリオクタメチレンマレエート無水シトレート（ＰＯＭａＣ）、ポリ（オクタンジオール−コ−シトレート）（ＰＯＣ）、コラーゲン、フィブリン、およびエラスチンが挙げられる。

スキャフォールドはまた、プラズマ処理されて、充填材の接着性を高め、かつ細胞結合能力を高めることができる。プラズマ処理は、サンプルをクリーニングし、そしてまた、表面上に親水基を置くので、コラーゲンおよびフィブリン等の生物学的材料がより容易に接着し得る。スキャフォールドの他の処置として、酸化を含む、細胞接着を向上させる物質の利用、ポリ−Ｄ−リシン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）による処置、およびグルタルアルデヒド（ＧＡ）による架橋が挙げられ得る。場合によっては、スキャフォールドは、薬物溶出性であってよい。例えば、β線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−β）、シプロフロキサシン、およびデキサメタゾン等の薬物が、新しいグラフトデバイスを用いて送達され得る。

これらの同じタイプのスキャフォールドが用いられて、突出部をアンダーレイグラフトデバイス上に、そして対応する開口部またはアパーチャをオーバーレイグラフトデバイス中に生成するようないくつかの変更を有する新しい２層グラフトデバイスが作製され得る。突出部は、リブと同じ、または異なるスキャフォールド材から作製され、リブが生産されるのと同時に製造されてもよいし、別個に製造されてから、アンダーレイデバイス用のスキャフォールドの表面に固定されてもよい。同様に、オーバーレイデバイス中の開口部は、本明細書に記載される膜貫通型グラフトデバイスの１つと同様に、スキャフォールドが設置されている間に作製されてもよいし、スキャフォールドが完成してから、オーバーレイデバイスからカットされてもよい。

一般に、繊維および／またはリブ構成は、機械的に硬化した、弾力のある構造体を作製するために、２〜８またはそれ以上の構成を含有してよい。例えば、４つの円形リブ構造、８つの円形リブ構造に対して４つの放射状リブ構造、および８つの放射状リブ構造がある。これらの構成は、例えば、図３Ｃ−Ａおよび図３Ｃ−Ｂに示されるような、細胞増殖を促進するための、六角形またはフラクタル設計等の他のパターンを形成してもよい。そのようなフラクタル設計として、繰返しパターン、分岐リブ、または雪片様パターンが挙げられ得る。

２層グラフトデバイスの寸法は、オーバーレイグラフトデバイスおよびアンダーレイグラフトデバイスの両方について、直径２〜８ｍｍ×厚さ２００ミクロンの範囲内であってよく、アンダーレイデバイス上の突出部（「キー」）は、約２００ミクロン×１ｍｍであってよい。

図４Ａに示されるように、アンダーレイデバイス３５０は、スキャフォールド３６０および突出部３７０を有してよく、これは、浅い「Ｔ」の形状を有してよく、「Ｔ」の短い基部は、スキャフォールド材３６０の一部であり、またはスキャフォールド材３６０に、例えば円形のアンダーグラフトデバイス２５０の中央にあるリブに固定されており、そして、オーバーレイグラフトデバイス３８０（図４Ｂに示される）の厚さとほぼ同じサイズであり、またはこれよりも僅かに大きい距離だけ、上方に延びている。「Ｔ」の頂部は、基部から直角方向に延びており、頂部の長さは、オーバーレイデバイス中の開口部の最大寸法とほぼ同じサイズであり、またはこれよりも僅かに小さい。一般に、「Ｔ」形状の突出部に対応するために、図４Ｂに示されように、オーバーレイデバイス３８０中の開口部３９０は、形状が、略矩形、例えば正方形であり、「Ｔ」の上部の平面図と同じ一般寸法を有するので、Ｔ字形状の突出部３７０の頂部は、開口部３８０を容易に通過することができるが、アンダーレイデバイス３５０に対してオーバーレイが回転すると、オーバーレイグラフトデバイス３８０の上面を通過して、オーバーレイデバイスをアンダーレイデバイスに、いわゆる「ロックアンドキー」方式で固定することができる。勿論、突出部３７０は、他の形状を有してよく、開口部３９０は、２つが一緒にロックアンドキー方式で機能するような対応する形状を有してよい。

他のタイプの突出部および「ロックアンドキー」タイプの機構として、ボタン形状設計、フックアンドループ系（ｈｏｏｋ ａｎｄ ｌｏｏｐ ｓｙｓｔｅｍ）、ボールアンドソケット、展開可能な傘（ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ ｕｍｂｒｅｌｌａ）、およびスナップ機構が挙げられる。

充填材
鼓膜グラフトデバイスまたは２層グラフトデバイスのスキャフォールドの空隙を充填するために１つまたは複数の材料が用いられてよく、これらは様々な技術を用いてスキャフォールドに加えられてよい。当該充填材または材料の組合せは、例えば、グラフトの透過性または不透過性を決定し得る。材料はまた、治療物質、または（スキャフォールド材に用いられるのと同じ、または異なる薬物用の）薬物溶出物質を含んでもよく、グラフトの表面特性（例えば質感）および他の物理特性を決定し得る。場合によっては、空隙を充填するために用いられる材料は、スキャフォールドを作製するために用いられる材料の一部もしくは全てと同じであり、またはこれを含む。また、充填材は、別個のステップにおいてスキャフォールドに加えることもでき、あるいは、スキャフォールドのリブの堆積と同じステップにおいて堆積することもできる。例えば、３Ｄプリンタは、１ステップにおいてリブおよび充填材を堆積させるようにプログラムされ得、スキャフォールドおよび充填材（リブ間の膜）に用いられる材料は、同じ材料であっても異なる材料であってもよい。なぜなら、３Ｄプリンタは、１つ、２つ、またはそれ以上の異なる材料を同時に印刷することができるからである。

図５Ａおよび図５Ｂは、鼓膜グラフトのスキャフォールドを充填する概略図である。図５Ａにおいて、幾分平坦な、円錐形状のスキャフォールド４００が、一対の止血鉗子または鉗子４０２によって印刷担体から取り出されて、図５Ｂに示される充填材４０４を含有するウェルに移される。止血鉗子または鉗子４０２に加えて、あらゆる種類のマニピュレータが用いられてよく、人間が操作するマニピュレータ、および人間の直接的な制御下で作動する、または自動で作動するロボットマニピュレータが挙げられるが、これらに限定されない。図５Ｂにおいて、充填材４０４は、スキャフォールド４００の空隙を充填して、固化している。

図６Ａは、矩形のＴ字形状突出部３７０を有するアンダーレイグラフトデバイス３５０を示す。図６Ｂは、リブ３８２を有するオーバーレイグラフトデバイス３８０を示し、リブ間の充填材３８５を明瞭に示している。開口部３９０は、充填材が除かれている。図６Ｃに示されるように、突出部３７０は、オーバーレイデバイス３８０中の開口部３９０を通って挿入されて、または引かれてから、オーバーレイデバイスが回転するので、突出部３７０が、開口部３９０とフィットして、オーバーレイデバイスをアンダーレイデバイスに固定する。

充填材３８５，４０４として、技術的に適切なあらゆる材料が挙げられ得る。例えば、材料は、生体適合性であり、スキャフォールド中の空隙を充填し得、かつ、一旦移植されると、患者への振動の伝達を容易にするのに必須の機械特性を有し得るように、選択されてよい。用いられる材料は、印刷スキャフォールドに用いられる材料の一部または全てを含んでよい。本明細書に記載される方法に用いられ得る充填材の一部の例として、限定されないが、コラーゲン、例えば、ＩＩＩ型コラーゲン、細胞外マトリックス、ヒドロゲル、例えばフィブリンヒドロゲル、二酸化チタン、セルロース、ゼラチン、アガロース、アルギン酸塩、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ヒアルロン酸、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレート）、プルロニックＰＬＡ、ＰＧＡ、トランスグルタミナーゼ、ＰＬＧＡ、ＰＤＭＳ、ポリグレカプロン、ポリエステルカーボネートウレタン尿素（ＰＥＣＵＵ）、ポリオクタメチレンマレエート無水シトレート（ＰＯＭａＣ）、ポリ（グリセロールセバケート）、ポリ（オクタンジオール−コ−シトレート）（ＰＯＣ）、ポリウレタン、ならびにコラーゲンおよびフィブリンの混合物が挙げられる。これらの材料は、単独で、または２つ以上の異なる材料の組合せで用いられてよい。

一部の実施形態において、充填材として、細胞接着物質および侵入物質が挙げられ得る。例えば、移植後に外耳道および／または中耳内の患者の組織を、鼓膜グラフトに接着するように、かつその上で増殖するように、または移植前にグラフトを細胞で被覆するように促すための材料が挙げられ得る。そのような細胞接着物質および侵入物質の例として、限定されないが、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターロイキン−４、または類似した生物学的特性を有する他の因子の１つまたは複数等の増殖因子が挙げられる。

さらに、充填材として、細胞物質が挙げられ得、または充填材は、別個のステップにおいて、細胞物質でコーティングされてよい。例えば、このような細胞物質として、線維芽細胞、軟骨細胞、ケラチン生成細胞、および上皮細胞の１つまたは複数が挙げられ得るが、これらに限定されない。これらの細胞は、インプラントを受けることになる患者から、患者の親戚から、またはインプラントを受けることになる患者とは無関係のヒト対象から、採取されてよい。

また、充填材として、１つまたは複数の薬物溶出物質が挙げられ得、または充填材は、別個のステップにおいて、１つまたは複数の薬物溶出物質でコーティングされてよい。例えば、そのような薬物溶出物質は、グラフト部位にて組織に薬物を送達するために含まれてよい。そのような薬物溶出物質の例として、ポリエチレン−酢酸ビニル（ＰＥＶＡ）、ポリｎ−ブチルメタクリレート（ＰＢＭＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、エチレン−酢酸ビニル（ＥＶＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレート（ＰＨＢＶ）、ホスホリコリン、およびフルオロポリマー等の薬物溶出の調整を可能にするポリマーが挙げられる。薬物を有するポリマーが、印刷、スプレーコーティング、および／または浸漬コーティングされてよい。場合によっては、１〜３層、またはそれ以上の層が、コーティングに用いられ得るので、用量が調整されてよい。溶出されることになる薬物として、ステロイド、抗生物質、ビスホスホネート、非ステロイド系抗炎症薬／免疫調節薬、例えば生物製剤、ＴＮＦ阻害剤、ＩＬ−６阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、Ｔ細胞メディエータ、炎症細胞、例えばＢ細胞および細胞接着分子を標的とする抗体、メトトレキサート、ならびにシクロスポリンが挙げられるが、これらに限定されない。

人工鼓膜グラフトを製造する方法
一般に、本明細書中に記載される鼓膜グラフトデバイスまたは２層グラフトデバイスの作製または製造は、１つまたは複数のスキャフォールドの作製に続いて、スキャフォールドの空隙を充填材で充填することを含んでよい。場合によっては、充填材は、液体として始まり、その後固められる。追加のステップ、または異なる順序のステップが、技術的に適切なものとして用いられてよい。例えば、グラフトを製造するのに異なるステップ（例えば、代わりの順序またはタイプの製造）が用いられてもよいし、グラフトが作製されてから追加のステップが実行されてもよい（例えば、消毒、試験、パッケージング）。例えば、紫外線が挙げられる放射線、酸化、または化学滅菌を用いて、最終的な人工鼓膜グラフトが滅菌されてよい。

例えば、スキャフォールドおよび充填材に用いられる材料の性質に応じて、以下の滅菌剤のいずれか１つまたは複数が用いられてよい：エチレンオキシド、オゾン、漂白剤、グルタルアルデヒドおよび／もしくはホルムアルデヒド、フタルアルデヒド、過酸化水素、過酢酸、または銀。また、これらの材料の一部、例えば銀が、製造中にスキャフォールド材および／または充填材中に組み込まれてもよい。勿論、人工グラフトが生細胞で被覆されることになるならば、人工グラフトは、滅菌されてから、生細胞がグラフトに加えられて定着することとなる。

以下に記載されるのは、鼓膜グラフトを製造するための考えられる一プロセスである。このプロセスでは、スキャフォールドが３Ｄプリンタで印刷されて、スキャフォールドが印刷された後に、スキャフォールドは、液状の硬化性充填材中に沈められる。異なるプロセスでは、スキャフォールドおよび充填材は両方とも、同じ、または２つの異なる３Ｄプリンタによって印刷される。

さらに別のプロセスでは、第１の材料を第１の鋳型内で鋳造することによってスキャフォールドが作製され、そして３Ｄ印刷、液状の硬化性材料の使用、または、第２の材料もしくは組合せ材料の、スキャフォールドと一緒の、第２の鋳型における第２の鋳造によって、スキャフォールド空隙が充填される。他の方法も考えられる。

図７Ａおよび図７Ｂは共に、３Ｄプリンタでスキャフォールドを印刷することによって鼓膜グラフトデバイスまたは２層グラフトデバイスを作製し、続いて、スキャフォールドが印刷された後に、スキャフォールドが、液状の硬化性充填材中に沈められるプロセス５００の一例のフローチャート図を形成する。明確にするために、プロセス５００は、自律型材料ハンドリングロボットによって助力される機械の特定のセットで記載される。しかしながら、プロセス５００または類似したプロセスを実行するような様々な機械、および人間のオペレータが挙げられる様々な材料ハンドリング系が用いられてよい。同様に、この例では、明確にするために単一の鼓膜グラフトの作製が考察される。しかしながら、同一のコピー、または異なる、例えば、特性が異なる、パーソナライズされたコピーのいずれかの、多くの鼓膜グラフトを一度に作製することができるいくつかの構成が用いられてよい。

３Ｄプリンタおよび関連装置を制御するコンピュータ５０２が用いられる。コンピュータ５０２は、デスクトップコンピュータまたはサーバコンピュータ等の汎用コンピュータであってよい。コンピュータ５０２は、図７Ａおよび図７Ｂに示される系の他の構成要素用の製造命令を作成するソフトウェアを備える。プリンタ５０４は、コンピュータ５０２から受け取った製造命令に基づいて、１つまたは複数のスキャフォールドを印刷することができる３Ｄプリンタである。硬化炉およびプラズマ処理装置５０６は、印刷されたスキャフォールドを硬化し得、および／または印刷されたスキャフォールドにプラズマ処理を施し得る機械である。ホットプレートおよび充填ステーション５０８は、スキャフォールドが充填され得る温度制御環境を実現する機械である。インキュベータ５１０は、温度制御環境において鼓膜グラフトを保持することができる機械である。

コンピュータ５０２は、１つまたは複数の鼓膜グラフトの製造のためのパラメータ５１２を受けることができる。例えば、ユーザは、患者の年齢、患者の外耳道および中耳の解剖学的構造の測定値、患者の解剖学的構造の医学的画像、および／または患者のための処方等が挙げられる、特定の患者についてのパラメータを入力することができる。加えて、または代わりに、ユーザは、鼓膜グラフト自体の所望のパラメータを入力することができる。例えば、ユーザは、所望の直径；層の数、厚さ；スキャフォールドの設計；ならびに／または薬物、増殖因子、および／もしくは細胞接着、および侵入物質を入力することができる。一部の構成において、コンピュータ５０２は、購入用または注文用コンピュータ等のネットワーク接続データソースから、電子カルテから、または別の適切なデータソースから、パラメータの一部または全てを受けることができる。

当該パラメータから、コンピュータ５０２は、所望の鼓膜グラフトについての構築計画５１４を生成することができる。構築計画５１４は、例えば、鼓膜グラフトの作製に関与する機械用の機械命令、人間の操作者のための説明書、包装情報および標識情報等を含み得る。

一例において、プリンタ５０４用の命令を作成するために、３Ｄスキャフォールドモデルが、３Ｄスキャフォールドモデルのライブラリから選択されてよい。選択されるモデルは、例えば、パラメータ内で指定されたサイズおよび形状のフィッティングに基づいて選ばれてよい。加えて、または代わりに、例えば、拡大縮小し、リブの厚さを変更し、膜の３Ｄ円錐形状を深くし、またはより浅くしたりすることによって、３Ｄスキャフォールドモデルが修正されてよい。その後、この構築のために選択または作製された３Ｄモデルは、プリンタ５０４によって実行される場合に、プリンタ５０４に所望のスキャフォールドを印刷させる３Ｄプリンタ命令に変換され得る。

一例において、硬化炉およびプラズマ処理装置５０６用の命令を作成するために、例えば、スキャフォールドの幾何構造、スキャフォールドを印刷するのに用いられる材料、および他の適切なデータに基づいて、硬化時間、硬化温度、およびプラズマ処理パラメータが調べられ得、または算出され得る。

一例において、ホットプレートおよび充填ステーション５０８用の命令を作成するために、コンピュータ５０２は、充填材として用いられる１つまたは複数の材料を選択することができる。充填材は、例えば、スキャフォールド中の空隙のサイズおよび形状；所望の表面特性；ならびに／または所望の薬物、成長因子、および／もしくは細胞接着物質、および侵入物質に基づいて選ばれてよい。構築計画は、これらの材料を、例えば、各材料の容量測定値または容量比率、ならびにウェルに加えられるべき順序と共に、列挙してよい。

一例において、インキュベータ５１０用の命令を作成するために、コンピュータ５０２は、鼓膜グラフトをインキュベートするのに必要な環境因子を特定してよい。例えば、充填材が８０℃のオーブン内で硬化されるならば、充填材は、３７℃のホットプレート上で架橋／ゲル化される。約２０分の期間の後、充填材は、脱イオン水のバスに移されて、３７℃のインキュベータ内に入れられる。充填材が光硬化性である別の例において、構築計画は、適切な温度にて、そして特定の時間長の間、人工光源下で鼓膜グラフトを保持する命令を含んでよい。

一例において、自動材料ハンドリング装置用の命令を作成するために、コンピュータ５０２は、構築操作の順序および／または各構築操作に必要な時間を指定してよい。構築計画は、例えば、プリンタ５０４から信号が受信されるまで待機してから、プリンタ５０４からスキャフォールドを取り出す命令を含んでよい。構築計画はまた、例えば、指定された時間待機してから、硬化ステーション５０８から鼓膜グラフトを取り出す命令を含んでもよい。

プリンタ５０４、硬化炉およびプラズマ処理装置５０６、ホットプレートおよび充填ステーション５０８、ならびにインキュベータ５１０は、構築計画を受け入れる（５１６）。例えば、コンピュータ５０２は、有線または無線のいずれかのデータネットワークを介して、受信機に従う構築計画またはその一部を、製造系内の他の機械に送信することができる。加えてまたは代わりに、例えば、技術者が、製造プロセスを承認し、監視し、および／またはこれに参加することができるように、構築計画に関する情報がユーザデバイスに出力されてよい。

プリンタ５０４は、スキャフォールドを印刷することができる（５１８）。図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｃは、３Ｄプリンタによって印刷されることになる鼓膜グラフトまたは２層グラフトスキャフォールドの一例を示す。例えば、プリンタ５０４は、構築計画から印刷ジョブを生成して、スキャフォールドを印刷し始める。一般に、ほとんどのプリンタ５０４は、ゲル、液体、または粉末から固体物体を作製する機構を備える。一例において、プリンタ５０４は、担体上に構築材料を押し出すためのノズルを備えてよい。プリンタ５０４は、２次元（例えば、ｘおよびｙ）においてノズルの位置を制御し、３次元（例えばｚ）において担体の高さを制御することができる。場合によっては、スキャフォールドは、１層に印刷することができ、その場合、担体の高さは、印刷プロセスの間、一定に保たれてよい。場合によっては、スキャフォールドは、薄い３次元の形状を得るために、複数の層に印刷されてもよいし、平らでない表面（例えば円錐）上に印刷されてもよく、この場合、担体の高さは移行し得、例えば１層から次の層に下げられる。

プリンタ５０４のノズルは、例えば、ガラスまたは金属、例えばアルミニウムまたはステンレス鋼で製造されてよい。構築材料は、ノズルの開口部を通って押し出され得、その後、ノズル開口部のサイズに基づいた厚さの層を形成し得る。一部の例示的なノズルは、直径がミクロンオーダーの開口部を有してよい。例えば、ノズル開口部は、技術的に適切であるままで、２、５、１０、２５、７５、１００、１２０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３３３、４７５、５００、または５２０ミクロン、それらの間の値、またはそれ以上もしくはそれ以下であってよい。

印刷されるスキャフォールドを受け取る担体は、構築材料に適した材料で製造されてよい。例えば、担体材料は、材料の凝集特性に基づいて、構築材料と共に選択され得るので、スキャフォールドは、印刷されるにつれて移動しないが、印刷プロセスが完了したときに確実に取り外され得る。担体材料の例として、例えば、ガラス（例えばプルロニックでコーティングしたガラス）、ポロキサマー、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、アルミニウム箔等の金属箔、またはセルロース等の生分解性物質が挙げられるが、これらに限定されない。担体は、平面形状であっても３次元形状であってもよく、これにより、薄い構造物が奥行をもって作製され得る（例えば円錐形の膜）。次いで、スキャフォールドは、例えば、（図８Ａおよび図８Ｃに示されるような）一連の円形リブ構造体、および／または（図８Ｃに示されるような）放射状リブ構造体として、担体上に堆積する。

スキャフォールドは、硬化され得る（ステップ５２０）。例えば、材料ハンドリング系は、スキャフォールドを硬化炉およびプラズマ処理装置５０６に移して、硬化炉に指令信号を送ってよい。次いで、硬化炉は、構築計画５１６によって指示される時間および温度で、スキャフォールドを硬化させてよい。

スキャフォールドは、プラズマ処理されてよい（ステップ５２２）。例えば、硬化炉およびプラズマ処理装置５０６は、構築計画５１６によって指定されるプラズマ処理を施すことができる。当該プラズマ処理は、例えば、スキャフォールドをクリーニングし、および／または、スキャフォールドの表面特性を変えることができる。

構築計画を受けた後、ホットプレートおよび充填ステーション５０８は、同定された充填材を調製する。例えば、ホットプレートおよび充填ステーション５０８は、この操作を、スキャフォールドが印刷されている間に、スキャフォールドが印刷されたという指示に応じて、または特定の時間にて、実行してよい。

ホットプレートおよび充填ステーション５０８は、例えば、自動化された源、または人間が操作する源から、液状の形態の充填材（複数可）を受け取ることができる。必要に応じて、ウェルステーションはまた、構築計画において指定されて、または別の方法で、充填に必須のあらゆる環境条件を準備することもできる。例えば、ベントフード内のファンが作動され得、空気の温度または湿度が制御され得、および／または照明が加減され得る。

必要に応じて、他の材料が加えられてよい。例えば、あらゆる薬物、増殖因子、ならびに／または細胞接着物質および侵入物質が加えられてよい。もしあれば、添加の順序および混合のタイプは、材料のタイプに基づいて指定される。例えば、非揮発性の液体が最初に、続いて揮発性の液体が加えられてよく、これにより、揮発性の液体の蒸発時間が短くなる。別の例において、２つ以上の材料が同時に混合されてよい。

充填材は、スキャフォールド５２６に導入される。図８Ｄは、充填材を受け入れる鼓膜グラフトスキャフォールドの一例を示す。例えば、自動化された材料ハンドラ、例えば自動化されたロボット、または人間のオペレータが、硬化炉およびプラズマ処理装置５０６からスキャフォールドを取り出して、スキャフォールドをホットプレートおよび充填ステーション５０８に加えることができる。ここで、スキャフォールドの空隙は、充填材によって充填され得る。場合によっては、充填材は、人間、または自動化された系等によって、スキャフォールドの空隙中にピペットで移されてよい。場合によっては、充填材中にスキャフォールドを沈めることで、空隙が充填される。場合によっては、スキャフォールドおよび充填材を保持するコンテナがかき混ぜられて、および／または充填材が撹拌されて、充填材が空隙を充填するように促される。充填材で空隙を充填する一部の操作において、スキャフォールドは反転されてよく、充填材はスキャフォールドの両面に加えられる。一部の操作において、反転は必要とされない。

充填材がスキャフォールドの空隙を充填した後、材料ハンドリング系は、硬化していない鼓膜グラフトをインキュベータ５１０に移してよい。インキュベータは、鼓膜グラフトが単固体となるように、鼓膜グラフトをインキュベートして保存することができる（５２６）。インキュベータ５１０の構成は、充填材および／または他の材料に基づいて設計される。例えば、インキュベータ５１０は、温度制御される水バス、湿度制御される空気フード、または充填材を硬化させる他の技術的に適切なあらゆる系を備えてよい。デバイスが完成すると、図８Ｅに模式的に示されるように、鼓室形成術のアンダーレイおよびオーバーレイを実行するために、デバイスが鼓膜の上または中に埋め込まれ得る（または鼓膜を置換し得る）。これは、全身麻酔または鎮静を必要とせずに鼓膜修復がなされ得る方法を表す。勿論、ある状況において、鎮静または麻酔が必要とされてよい。

グラフトの特性
先に記載されるように、鼓膜グラフトの幾何学的特性は、例えば、移植を受け入れる特定の患者または患者群に基づいて、予め指定される。当該特性は、一般的に（ヒトまたは他の対象についての特定のサイズおよび形状、例えばモルモット、子羊、チンチラ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、サルその他についての様々なサイズおよび形状）、または特異的に（特定の患者の測定値または画像化に基づいて）決定されてよい。

鼓膜グラフトは、一般に、音響的に調整され、穿孔および収縮に抵抗し、かつ／もしくは耳小骨連鎖に対する強固な取付点、例えば、槌骨、砧骨、鐙骨、これらの耳小骨の１つの残りの部分への、市販のプロテーゼへの直結を実現し、または、疾患の場合には、耳小骨連鎖を完全に置換し、かつ蝸牛の卵円窓に直結するように、設計される。例えば、鼓膜グラフトは、天然に存在する鼓膜、または穿孔および／もしくは収縮の機会を減らす膜グラフトよりも、機械強度が大きな材料で製造され得る。他の実施形態において、材料は、サイズおよび可撓性が安定してよく、これらは、収縮を回避し、耳小骨連鎖のあらゆる構成要素への、または直接的な卵円窓への固定を実現する一助となり得る。

スキャフォールド材および／または充填材の選択によって、鼓膜グラフトは、空気、水等の流体、および破片が中耳に入らないようにするために、非透過性にされてよい。一方、鼓膜グラフトは、空気に対して透過性であるが、液体を中に入れない材料で製造されてもよい。これにより、例えば、中耳内の気圧が、外耳内の圧力で正常化し得る。これは、エウスタキオ管を通る換気が不良の患者にとって所望され得る。加えて、鼓膜グラフトは、「半透過性の膜」と呼ばれる、小分子および／または生物製剤に対しても透過性である材料で製造されてもよい。半透過性の膜は、例えばステロイド、抗生物質、炎症メディエータ、および／または他の薬物の、鼓膜グラフトを通る透過を可能にして、中耳および／または内耳への薬物送達を可能にする。

グラフトの使用および移植方法
本明細書中に記載される人工鼓膜グラフトは、患者の鼓膜の再構築のためのあらゆる適切な鼓室形成術および／または鼓膜形成術に使用され得、ヒトおよびヒト以外の患者の両方での使用を含む。２層グラフトデバイスは、鼓膜修復の低侵襲的方法として、鼓膜穿孔を簡単かつ効果的にシールするために用いられ得る。

多くの処置において、鼓膜へのアクセスは、外科用ポータルとして機能する外耳道自体を通るものであってよく、またはグラフトを必要とする鼓膜にアクセスするために、耳の後方または前方で切開がなされてもよい。当該切開は、耳内切開または耳後部切開の１つであってよい。患者の鼓膜へのアクセスが達成されると、元来の（罹患した、または残っている）鼓膜が取り除かれて、全体（総鼓膜置換）または一部（パッチ／部分）が再構築されてもよいし、パッチとして、欠陥のある既存の鼓膜の上部に置かれてもよい（側方鼓膜形成術）。

人工膜グラフトが適所に配置されると、槌骨柄（存在する場合）は、膜の表面と接触して、膜を鼓室に向けて引っ張ることが保証される。人工膜への槌骨柄の接着および取付けを確実にするような材料が用いられてよい。耳小骨への人工膜の取付けにより、膜の側面が凹形状および円錐形状にされ得る。円錐形状の奥行は、グラフトを配置する前に評価されてもよく（ａｓｓｅｄ）、適切に選択され得る。次に、槌骨は、膜の凹部の最も低い、または最も窪んだ部分に（例えば、耳小骨コネクタとして機能する人工鼓膜臍の位置にて）取り付けられてよい。

患者の特定のニーズに応じて、変形が可能である。例えば、耳小骨コネクタのない鼓膜グラフトが、元来の耳小骨連鎖上に置かれて、槌骨柄を直接治癒することができる。槌骨が罹患しており、または部分的に縮小しているならば、槌骨に取り付く耳小骨コネクタを有する鼓膜が用いられてよい。当該グラフトは、残りの骨用のソケットを介して、残りの槌骨に連結することができる。当該ソケットは、術前イメージングによって製造されてもよいし、標準的な幾何構造に作製されてもよい。

砧骨または残りの砧骨に連結する耳小骨コネクタを備えた鼓膜が用いられてもよい。一構成において、リングが鼓膜中に組み込まれることで、人工装具がリングに取り付けられ、かつ砧骨に至るまで延びることが可能となる。当該コネクタにより、聴覚の安定した再構築が可能となるであろう。他の実施形態において、鐙骨または残りの鐙骨に連結する耳小骨コネクタを有する鼓膜が用いられてもよい。この実施形態もまた、リングがグラフトの下面に取り付けられた形態をとることで、人工装具が、リングを通って掛かるワイヤーにより、鐙骨の上に落ち着くことが可能となる。当該コネクタは、ニチノール製であってよく、これにより、用いられることになるレーザが、「金属記憶」を活性化して、周囲の構造体に至るまで、そしてリングの全体をおおって、プロテーゼを締め付けることが可能となる。また、耳小骨コネクタの他の構成も考えられ、リング、ヒンジ、ボールアンドソケットジョイント、またはスライドジョイントが挙げられるであろう。

新しい２層グラフトデバイスは、図９Ａ〜図９Ｄに示されるように、多段階プロセスで鼓膜穿孔を修復するように設置される。先ず、図９Ａに示されるように、鼓膜中の穿孔が分析されて、サイズおよび形状が判定される。次に、図９Ｂに示されるように、アンダーレイグラフトデバイスは、全体のサイズが引き下げられるようにカールまたはロールされて、穿孔を通して押し出されて、鼓膜の後方で広げられることで、突出部が穿孔を通って突出し得る。アンダーレイデバイスの上面は、毛細管作用もしくは接着によって、鼓膜の裏面に接着することとなる。または、フィブリン糊等の組織接着剤が、例えば挿入の直前に、アンダーレイデバイスの表面に塗布されてよい。

次に、図９Ｃに示されるように、オーバーレイグラフトデバイスは、アンダーレイデバイスの近傍に持ち込まれる。次に、突出部は、オーバーレイデバイス中の穿孔および開口部を通して引っ張られる。次いで、図９Ｄに示されるように、オーバーレイデバイスは、中心軸の周りを回転するので、概して移動しない（または移動しないように適所に保持されている）突出部の頂部が、オーバーレイデバイスの表面上にしっかりとフィットして、アンダーレイデバイスおよびオーバーレイデバイスを一緒にロックすることで、それらの間に鼓膜を挟む。図９Ｄは、矩形の突出部が、オーバーレイデバイス中の開口部に対して僅かな角度でどのようにずれているかを示している。

図１０Ａ〜図１０Ｄは、グラフトデバイスのリブが、修復されることになる鼓膜の構造体に適合するように設計されている別の修復を示す。特に、図１０Ａ〜図１０Ｄは、修復されることになる鼓膜の画像に基づいた、繊維／リブ構成鋳型（図１０Ａ）、繊維鋳型上に画像化された鼓膜穿孔（図１０Ｂ）、中心領域が、穿孔の位置内の天然の構造体に一致するように設計されたリブを備える、カスタマイズされた鼓膜パッチグラフトまたは２層グラフトデバイス（図１０Ｃ）、および修復をもたらすように穿孔を覆うデバイスの配置（図１０Ｄ）を示す。

代替案
スキャフォールドおよび空隙の様々な構成が本明細書中に記載され、かつ示されているが、他の構成も考えられる。構成の他の例として、真円の形状で形成されるリブ、または不規則な円形状が挙げられ得る。一部の他の例において、スキャフォールドのリブは、異なる構成に従ってよい。例えば、スキャフォールドは、概して真っ直ぐなリブから形成されてよく、その一部は、例えば三角形、正方形、平行四辺形、六角形（例えば、図３Ｃ−Ａおよび図３Ｃ−Ｂ参照）、または他の形状の、規則的なパターンまたはメッシュを形成するような角度（例えば、４５°または９０°）だけずれている。別の例において、各リブの形状は、自然なパターン、例えばブラウン運動またはフラクタルパターンを反映するように作製されて、不規則なメッシュが形成されてもよいし、ランダムなパターンが作成されてもよい。

上記のように、薬物、増殖因子、ならびに／または細胞接着物質および侵入物質が、充填材もしくはスキャフォールド材と混合され、またはこれらに加えられてもよいし、スキャフォールド材および／または充填材上にコーティングされ、またはこれらの中に浸透してもよい。しかしながら、一部の実現例において、これらの薬物、増殖因子、ならびに／または細胞接着物質および侵入物質の一部または全てが、その代わりとして、移植の前または後に、グラフトデバイスの外面に塗布されてもよい。これは、例えば、そのような塗布のない大量生産されたグラフトを用いる場合に、しかし特定の患者のために、薬物、増殖因子、ならびに／または細胞接着物質および侵入物質が加えられる場合に、所望され得る。

先に記載されるように、様々な製造プロセスが用いられて、本明細書中に記載されるグラフトデバイスが作製され得る。例えば、スキャフォールドを充填流体中に沈めることによってスキャフォールドの空隙を充填する代わりに、空隙は、３Ｄ印刷によって充填されてよい。例えば、一部の３Ｄプリンタによれば、複数の印刷物質が単一のデバイス内で用いられ得る。そのようなプリンタでは、スキャフォールドは、第１の材料で印刷され得、そして第２の材料は、空隙中に印刷され得る。代わりに、完成したスキャフォールドは、完成したスキャフォールドの空隙中に充填材を印刷するように命令される異なる３Ｄプリンタ中にロードされてよい。

場合によっては、充填材は、スキャフォールドを形成するために用いられるのと同じ材料であってよい。例えば、スキャフォールドを印刷した後に、同じ３Ｄプリンタが、空隙内に充填材を印刷し得る。そのようにすることによって、グラフト全体が単一の材料で印刷されるとしても、スキャフォールドの機械特性は保存され得る。

本発明はさらに、以下の実施例において説明されるが、これは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１−スキャフォールドの印刷
本実施例は、ヒト鼓膜に基づいて設計した鼓膜グラフトスキャフォールドの作製を包含する。

ヒト鼓膜の超微細構造を解析して、膜の繊維層のコンピュータ化した３Ｄモデルを作成した。リブのパターン、厚さ、および３Ｄ円錐構成を、印刷するスキャフォールドについての設計変数として用いた。

３Ｄプリンタを用いて、多層の人工鼓膜グラフトスキャフォールドを製造した。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）インクにより、ヒト鼓膜の検査に由来するパターンで、１２０ミクロンのリブ厚さ、１２ミリメートルの全直径、および３Ｄ円錐構成を有するスキャフォールドを印刷した。印刷が完了したときに、スキャフォールドを熱硬化させて、鉗子を用いて担体から取り外した。印刷した鼓膜グラフトスキャフォールドの例を、図２Ａ〜図２Ｅに示す。

図２Ａは、グラフトデバイススキャフォールドの平面図を示し、中心領域が充填材で充填されている。図２Ｂは、耳小骨連鎖に取り付けるための単一のリング設計を有するグラフトデバイスを示す。図２Ｃは、耳小骨連鎖に取り付けるための１重のアーチリング設計を有するグラフトデバイスを示す。図２Ｄは、耳小骨連鎖に取り付けるための２重のアーチリング設計を有するグラフトデバイスを示す。

図２Ｅ−Ａ〜図２Ｅ−Ｄは、鼓膜パッチグラフトスキャフォールドの写真であり、これらは、２つの繊維構成：４本の放射状（Ｒ）繊維および４本のアーク（Ａ）繊維、ならびに６本のＲ繊維および６本のＡ繊維において、５ｍｍの全直径で設計して印刷したものである。ヒト鼓膜の基本的な円周繊維構成および放射状繊維構成を模倣し、印刷結果の間で一貫性を達成し、かつ繊維構成を容易に操作する能力を得るという願望に基づいて、放射状繊維構成および円周繊維構成を選択した。同じ材料を用いて、ＴＭパッチスキャフォールドを安定化させ、かつ細胞研究に適した位置決めを可能にするために、より厚い周辺境界領域も印刷した。境界領域は、内側の正方形の鼓膜グラフトパッチスキャフォールドの最も外側の頂点と交差する１つの外側リングからなり、直線繊維が、スキャフォールドの各辺の中点を境界リングに連結している。

これらの結果は、充填材で充填されることになる空隙を有する３Ｄ印刷したスキャフォールドに基づいて、鼓膜グラフトを製造することができることを実証している。

実施例２−スキャフォールドの空隙の充填
本実施例は、充填材で鼓膜グラフトスキャフォールドを充填して、固体グラフトを作製することを包含する。ＩＩＩ型コラーゲンとフィブリン３０％の充填剤混合物を調製して、ピペット内に入れた。図５Ａに示すように、印刷した鼓膜グラフトスキャフォールドを、鉗子を用いて円形のウェル中に入れた。次に、図８Ｄに示すように、スキャフォールドの空隙中に充填材を導入した。スキャフォールドを３７℃にて２０分間、コラーゲン中に静置した。鉗子を用いて、ウェルからグラフトを取り出して、３７℃のインキュベータ内の脱イオン水中に入れた。図５Ｂは、コラーゲンがスキャフォールドの空隙を充填しているグラフトを示す。これらの結果は、充填材を用いてスキャフォールドの空隙を充填すること、かつ硬化させて鼓膜グラフトを作製することができることを実証している。

実施例３−インビトロ細胞研究
本実施例は、ヒト新生児真皮線維芽細胞が、非吸収性（ＰＤＭＳ）の、または吸収性（ＰＬＡ）の鼓膜膜グラフトの全体をインビトロでおおって定着し、かつ増殖することとなるかを判定するために設計した実験を包含する。

実施例１に記載するように、そして図１１Ａ−１に示すように、ＰＤＭＳスキャフォールドまたはＰＬＡスキャフォールドを調製した。次いで、実施例２に記載するように、フィブリン／コラーゲン充填混合物で一部をコーティングし、その結果を図１１Ａ−２に示す。次いで、硬化して固化したスキャフォールドおよび充填材を、新生児真皮線維芽細胞と一緒に細胞培養皿内に入れた。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）発現ヒト新生児真皮線維芽細胞（ＨＮＤＦ）を、２００，０００細胞／ウェルにて６ウェルプレート中に播種して、２４時間皿に付着させて、コンフルエントな層が形成された。この時間中、鼓膜グラフトをインキュベータ内で一晩、培地中に沈めた。鼓膜グラフトをＨＮＤＦのコンフルエント層の上部に直接置いて、ガラススライド片で押し続けて、ＨＮＤＦと接触させ、かつ浮遊を阻止した。ガラス片を２４時間後に取り出して、６日（１４４時間）後に画像化を行った。

図１１Ａ−３および図１１Ａ−４は、１ウェルあたり２００，０００個のＨＮＤＦに隣接する、６日後の、ｚ軸におけるＨＮＤＦの位置を示す高さマップを示す。赤色（灰色）は、ウェルプレートの底にあるＨＮＤＦを表し、緑色（薄い灰色）は、表示面の上部にあるＨＮＤＦを表す。図１１Ｂ−１および図１１Ｂ−２は、フィブリン充填物を単独で、またはフィブリン／コラーゲン充填物を有するＰＬＡスキャフォールド上での細胞増殖を実証する共焦点顕微鏡ｚ−スタック画像である。図１１Ｂ−１および図１１Ｂ−２は、Ｚ軸に沿って示される図１１Ａ−４に示されるのと同じデータを、異なる視野から、Ｙ軸に沿って示す。

当該研究は、細胞が、スキャフォールドおよび充填材の表面上で増殖することができたことを示している。また、当該研究は、スキャフォールドおよび充填材（ＰＤＭＳ／ＰＬＡ／フィブリン／コラーゲン）が、線維芽細胞に対して有毒ではなく、そして移植後の細胞の内殖および接着を可能とすることとなったことを実証している。細胞毒性研究として、これらが、鼓膜インプラントとして妥当な材料であることが分かる。特に、このタイプの細胞増殖は、中耳および外耳道からグラフトの上、かつ中への細胞増殖があるので、グラフトの取入れを確実にすることとなることを示している。

実施例４−音響試験および機械試験
側頭筋膜、および無傷の耳小骨連鎖を有する正常な鼓膜との関係における、非吸収性グラフトおよび吸収性グラフトの音響特性を判定するために、音響試験を設計した。電子顕微鏡を用いてヒト鼓膜繊維層を検査して、最初の鼓膜設計用の基礎として用いた。生体適合性の吸収性材料および非吸収性材料を、薄いシートおよびパターン化した鼓膜スキャフォールドとして印刷した。スキャフォールドをフィブリン／コラーゲン充填材で層状にして、上記の実施例１および実施例２に記載したように、非透過性の膜を作製した。特に、様々な直径（８〜１２ｍｍ）、厚さ（５０〜２００ミクロン）、および放射状のリブ構成（４〜３２リブ）のスキャフォールドを首尾よく印刷して、半透明のコラーゲン／フィブリン充填物で積層した。

次いで、印刷した鼓膜の音響特性を、デジタルオプトエレクトロニックホログラフィによって判定して、新鮮なヒト遺体側頭筋膜、および無傷の耳小骨連鎖を有するヒト遺体鼓膜と比較した。印刷し、かつ充填した鼓膜を、直径９ｍｍ、長さ２５ｍｍの外耳道の環境を再現した人工外耳道ホルダ内に取り付けた。材料の表面の反射率を向上させるために、グラフトを二酸化チタンでコーティングすることができる。取り付けたグラフトを、ヒトが認識する５つの異なる周波数での短期間の総音圧（トーンピップ）に曝して、聴力検査：０．５〜１５ｋＨｚ中に定期的に試験した。音圧の振幅は、８０〜１１０ｄＢのＳＰＬ、５０〜１００μｓのパルス幅に及んだ。音響刺激は、人工外耳道の長い端部を介して、パワーアンプによって駆動される広帯域音源によって生じる。

デジタルオプトエレクトロニックホログラフィ（ＤＯＥＨ）は、膜運動のリアルタイム平均ホログラムを提供し、ＴＭグラフトの音誘発運動に関する定性的かつ定量的なフルフィールド情報を提供する。図１２Ａ−Ａ〜図１２Ａ−Ｇは、異なるグラフト試験ホルダの例の画像を示す。図１２Ａ−Ａ〜図１２Ａ−Ｄは、鼓膜グラフトを適所に保持するためにピストン設計を用いるグラフトホルダの一バージョンの蓋（Ａ）および基部（Ｂ）のコンピュータ生成画像である。ホルダは、単一のＴＭ複合グラフトまたは側頭筋膜を確実に配置するためのウェルを備えた。スキャフォールドおよびコラーゲン／フィブリン充填物のみが音響試験に曝されるように、境界領域を完全に被覆するようにキャップを設計した。基部の寸法の例は、内孔直径９ｍｍ、ウェルの直径２５．５ｍｍ、外径３５ｍｍ、ウェルの内部奥行３ｍｍ、そして全長３０ｍｍであってよい。キャップは、押出部の直径が２５ｍｍ、押出部の長さが２．５ｍｍ、そして全長が５．５ｍｍである基部と同じ内側半径および外側半径を有することができる。図１２Ａ−Ｃおよび図１２Ａ−Ｄの画像は、試験用の鼓膜グラフトを固定するために摺動機構を用いる鼓膜グラフトホルダの別のバージョンの蓋およびホルダを示す。図１２Ａ−Ｅは、図１２Ａ−Ａ〜図１２Ａ−Ｄのコンピュータ画像の実際の組立てを示す写真である。図１２Ａ−Ｆは、図１２Ａ−Ｃ／Ｄに示す試験装置の内側に３Ｄ印刷した鼓膜グラフトを示す。図１２Ａ−Ｇは、閉じた場合のグラフトホルダを示す。これらのホルダを、ホログラフィおよび機械インピーダンス試験系に用いる。

取り付けたグラフトをＤＯＥＨにかけて、音響刺激後の運動の大きさおよび位相角を評価した。一様な刺激に対するモーダル応答、および３Ｄ印刷した鼓膜の、進行波に支配される運動の両方を記録した。３Ｄ印刷した鼓膜グラフトの適切な厚さを決定するために、材料および厚さが、音響エネルギーに応答して、変位にどのように影響するかを理解する予備実験を行った。多くの材料および厚さを試験した。代表的な画像を示す。図１２Ｂ−１〜図１２Ｂ−４は、耳小骨連鎖およびヒト側頭筋膜に取り付けられたヒト鼓膜と比較した、鼓室形成術中に現在用いられている鼓膜グラフト物質であるＰＤＭＳまたはＰＬＡの３Ｄ印刷シートの類似した変位の大きさを示している。図１２Ｂ−１は、ヒト遺体側頭骨における耳小骨連鎖に取り付けられた鼓膜の正常な変位の大きさを示す。側頭骨モデルにおけるヒトＴＭの最大変位は、約０．２５マイクロメートルであった。

図１２Ｂ−２に示すヒト側頭筋膜、図１２Ｂ−３に示すＰＤＭＳ（厚さ１００μｍ）、および図１２Ｂ−４に示すＦｌｅｘＥｃｏ（商標）ＰＬＡ（厚さ２００μｍ）の３つの比較群を示す。これらの比較データは、類似した変位の大きさを示す。側頭骨内のヒト遺体鼓膜と比較した、ヒト側頭筋膜、ＰＤＭＳ、およびＰＬＡの変位の僅かな増大は、モデルにおいて無傷の耳小骨連鎖がないことによる減少効果の不在による可能性がある。図の下段（図１２Ｂ−５〜図１２Ｂ−８）は、音に反応する鼓膜の異なる位相を示す。図１２Ｂ−５は、耳小骨連鎖に連結されている鼓膜の均一なパターンを示す。図１２Ｂ−６〜図１２Ｂ−８は、ＦｌｅｘＥｃｏ ＰＬＡ（１２Ｂ−８）およびＰＤＭＳデバイス（１２Ｂ−７）が両方とも、ヒトＴＭ（１２Ｂ−５）と比較して、類似した位相分布を示すが、側頭筋膜（１２Ｂ−６）で製造されたデバイスと比較して、僅かに異なる。

繊維配列によって影響を受ける３Ｄ印刷鼓膜グラフトの音響特性の代表的な比較を、５２２Ｈｚの純音への反応後のデジタルオプトエレクトロニックホログラフィを用いて、実行した。図１２Ｃの最上段は、ＢＹＴＡＣテフロン（商標）印刷面上の２つの構成のＳＥ１７００ ＰＤＭＳの３Ｄ印刷リブ構造体を示しており、１つは３２本の円形（Ｃ）リブおよび３２本の放射状リブ（Ｒ）を有し（図１２Ｃ−１Ａ）、１つは１６本のＣリブおよび８本のＲリブを有する（図１２Ｃ−２Ａ）。第２の段は、コラーゲン／フィブリン混合物で充填したこれらの同じスキャフォールドを示す（図１２Ｃ−１Ｂおよび図１２Ｃ−２Ｂ）。第３の段は、これらの同じＰＤＭＳスキャフォールドの変位の大きさを示す（図１２Ｃ−１Ｃおよび図１２−２Ｃ）。リブの動きが、スキャフォールドのリブの構成に基づいて異なることを示す、類似した変位の大きさに留意されたい。図１２Ｃ−１Ｄおよび図１２Ｃ−２Ｄは、リブの数および構成に基づいた、相の明確な差異を示す。これは、リブの数および構成に基づいた、ＴＭグラフトの「調整可能性」を意味する。

ヒトＴＭおよび付着した耳小骨連鎖の、３２本の円形リブおよび３２本の放射状リブを有する３Ｄ印刷した鼓膜グラフトとの、高周波数の純音に対する代表的な比較を実行した。図１２Ｄ−１Ａおよび図１２Ｄ−２Ａはそれぞれ、３２本の円形スキャフォールドリブおよび３２本の放射状リブを有するＰＤＭＳスキャフォールドと比較した、ヒトＴＭおよび耳小骨連鎖の変位の大きさを示す（変位の大きさ、および複合波の類似点に留意されたい）。図１２Ｄ−１Ｂおよび図１２Ｄ−２Ｂはそれぞれ、耳小骨連鎖を有するヒトＴＭ、および３Ｄ印刷した鼓膜の両方の複雑な位相パターンを示す。

デジタルオプトエレクトロニックホログラフィの結果を、天然のヒト鼓膜で取得したデータと比較した。３Ｄ印刷物質内で、特定の音響特性（大きさおよび位相角）と構造（リブの大きさおよび配向）との関係を判定した。最適な音響特性を、正常で健康なヒトの鼓膜の特性と定義した。

充填材を有する印刷したシートおよびスキャフォールドは、１０００、４０００、および８０００Ｈｚでの運動パターン（ピークの数および位置）で、周波数依存性の変動を示した。運動パターンは、シートを調製するのに用いた材料の影響を受け、そしてまた、スキャフォールドのリブパターンの影響も受けた。鼓膜スキャフォールドの特定の材料および設計が、ヒト鼓膜および筋膜と類似した運動パターンを示した。シートおよびスキャフォールド、ならびに充填材の正規化した変位の大きさ（マイクロメートル／Ｐａ）は、筋膜および鼓膜の変位と類似した。

３Ｄ印刷鼓膜グラフトの追加試験に機械的試験を含め、これは、陰圧および陽圧に対する膨張性の判定を含んだ。中耳腔圧は、＋５０〜−２００ｄＰａに及ぶ。慢性エウスタキオ管機能不全（ＥＴＤ）では、中耳内で陰圧が継続する場合がある。密閉した真空チャンバ内の鼓膜ホルダを用いて、３Ｄ鼓膜グラフトを、１日、１週間、および１ヶ月等のいくつかの時点について、様々な生理学的値および／または前掲の生理学的値にて、陰圧または陽圧に曝す。次いで、鼓膜グラフトを顕微鏡によって調査して、全体の形状および超微細構造のあらゆる変化を判定する。ヒト側頭筋膜に同様の試験をして、対照として機能させる。追加の音響実験に、陰圧または陽圧後の音響試験、および機械的変形を含めて、音響特性および超微細構造に対する何らかの変化があるかを判定する。

３Ｄ印刷鼓膜グラフトの追加試験に、様々な材料の鼓膜グラフトについてのレーザドップラ振動（「ＬＤＶ」）測定を含めた。図１５Ａ−Ｄは、ヒトの周波数範囲にわたって、鼓膜複合グラフト、筋膜、およびヒトＴＭの刺激音圧によって正規化した速度を示す。図１５Ａは、全ての試験材料の比較試験のグラフ結果を示しており、様々な組成（ＰＤＭＳ、ＰＬＡ、およびＰＣＬ）の８Ｃ／８Ｒ ＴＭ複合グラフトの３つの標本、筋膜、ならびに中耳が無傷であるヒトＴＭについて、平均速度を測定した。図１５Ｂ−Ｄは、材料が異なり（それぞれＰＤＭＳ、ＰＬＡ、およびＰＣＬ）、設計が異なる（８Ｃ／８Ｒおよび１６Ｃ／１６Ｒ）グラフトの比較についてのグラフ結果を示す。グラフトの繊維数が高くなるにつれ、平均速度が僅かに低くなることを示した。

これらの音響試験の結果は、材料および印刷寸法が、人工鼓膜スキャフォールドとして有用であり、かつ音響的に調整可能であることを示すことを示した。また、これらの試験により、例えば、放射状リブ構成および円形リブ構成、他の幾何パラメータ、材料等を変えることによって、鼓膜グラフトデバイスおよび２層グラフトデバイスを音響的に調整し得ることが確認される。鼓膜の運動パターンを反映するグラフトの音誘発運動パターンを判定かつ分析して、繊維／リブの数および材料の種類を変えた。

実施例５−動物研究−モルモット、ヒツジ、およびチンチラ
モルモット、ヒツジ、およびチンチラのモデルを、耳毒性および聴力の試験に用いた。モルモットは、耳毒性および聴力の研究に有用な動物モデルである。なぜなら、中耳腔は容易にアクセス可能であり、当業者は、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を実行して聴覚閾値を判定することができるからである。ヒツジは、鼓膜グラフト研究に有用なモデルである。チンチラモデルは、耳毒性試験、ベースラインＡＢＲ試験、および歪成分耳音響放射（ＤＰＯＥ）試験に有用である。

図１３Ａは、穿孔を形成したヒツジモデルの鼓膜を示す。図１３Ｂは、ヒツジモデルにおける、トリミングした鼓膜グラフトを示す。サイズ、アクセシビリティ、および中耳環境は概して、ヒトの耳を反映している。ヒツジは、中耳手術の訓練に、そして耳科手術における薬物およびデバイス試験に用いられてきた。また、本明細書中に記載する鼓膜グラフトデバイスを、ヒト遺体鼓膜内に配置する。

生理学的実験および組織学的実験の両方を用いて、耳毒性研究を行った。生理学的実験用に、動物をベースライン聴性脳幹反応（ＡＢＲ）試験にかけて、ベースライン聴力閾値を判定する。次に、耳後方を切開して、骨胞を通して中耳腔に入れる。中耳腔に入れてから、様々な多くのタイプのグラフト物質（先に記載）を、蝸牛窓に隣接させて配置する。次に、中耳腔の開口部を、軟組織、例えば、筋肉および／または筋膜で被覆し、切開部を縫合し、そして動物を回復させる。次に、１週、２週、３週、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、最大１年、またはあらゆる順列で、ＡＢＲを介した聴力閾値の試験に動物をかける。結果は、利用した材料（ＰＤＭＳ、ＰＬＡ、ＰＣＬ、コラーゲン、フィブリン、およびヒドロゲル）の耳毒性の特徴を示唆しない。

組織学的実験用に、動物に、生理食塩水に続いてパラホルムアルデヒドを灌流する。次に、中耳構造体および内耳構造体を切片化して、組織学的に分析する。蝸牛における炎症、カルシウム沈着、ならびに有毛細胞喪失およびニューロン喪失のマーカーの証拠について、切片を観察する。この目的のために、様々な免疫組織学的染色を用いる。また、炎症、分解、または他の変化のあらゆる徴候を理解するために、中耳腔内に置いた３Ｄ印刷物質も、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、および／または電子顕微鏡によって調査する。

ヒツジの大動物モデルにおけるグラフト修復実験用に、動物を適切に麻酔する。鼓膜内を切開する。その後、人間の手術と同様に、グラフトを適切な大きさにして、欠陥の上または下に配置する。動物を回復させる。反対側の耳または鼓膜に形成したがグラフトのない類似の欠陥を有する別の動物を、対照として使用する。最大１２ヶ月まで毎月、グラフトの摂取、鼓膜の治癒について動物を評価して、感染、炎症、グラフト物質のシフト、または他の顕著な変化の徴候を判定する。同様の時点の後、周囲の構造を除去した動物の鼓膜グラフトを取り出して、組織学的に分析する。炎症、分解、または他の変化のあらゆる徴候を理解するために、グラフト物質を、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、および／または電子顕微鏡によって調査する。

図１４Ａ〜図１４Ｃは、チンチラ小動物モデルにおける鼓膜の穿孔をシールするための、本明細書中に記載する鼓膜グラフト「パッチ」の使用を示す。３つの具体的な、３Ｄ印刷した鼓膜複合グラフトを、チンチラ中耳腔内に外科的に移植することによって、その耳毒性を試験した。当該グラフトデバイスは、ＰＤＭＳ、ＰＬＡ、およびＰＣＬ製であり、本明細書中に記載するように３Ｄ印刷した。次いで、グラフトスキャフォールドを、ウシフィブリンヒドロゲルで充填した。麻酔をかけた動物を、ベースライン聴性脳幹反応（ＡＢＲ）および歪成分耳音響放射（ＤＰＯＥ）測定にかけた。

滅菌条件下で、骨胞を通して、ＴＭの鼓膜表面と蝸牛窓のニッチとの間に、３ｍｍのＴＭグラフトを配置した。対照操作として、反対側の骨胞に入れたが、グラフトを配置しなかった。外科手術およびグラフトの移植に対する生理学的反応を、ＡＢＲおよびＤＰＯＥを介して、３または６ヶ月目に評価する。次いで、標準的な病理学的技術を用いて、グラフトおよびチンチラの内耳を、炎症メディエータについて分析して、対照耳と比較することとする。また、ＩＢＡ１、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、およびＣＤ４５等のマクロファージ／単球マーカーを評価するために、免疫組織化学的技術を用いることとする。

チンチラは、十分に確立された内耳および中耳の動物モデルであり、聴覚研究に一般的に用いられている。

予備的動物試験に基づいて、本明細書中に記載した、２層設計を含む生体模倣グラフトは、蝸牛毒性でないように思われる。これは、遺体モデルにおいて、穿孔した鼓膜穿孔を効果的に修復するのに用いることができる。

実施例６−円錐形状を有する鼓膜パッチグラフト
図１６のＡ−Ｃ（ＦＩＧ．１６Ａ−Ｃ）は、円錐形状を有する鼓膜パッチグラフトの写真である。図１６のＡは、中心の高さが２ｍｍである円錐形状の鼓膜グラフトを示す。図１６のＢは、中心の高さが３ｍｍである８Ｃ／８Ｒの鼓膜グラフトスキャフォールドを示す。図１６のＣは、様々な高さの鼓膜グラフトを示す。

ヒト鼓膜の繊維状スキャフォールド構造も円錐形状も有していない筋膜とは異なり、本明細書中に記載するようにして、３Ｄ印刷した鼓膜グラフトを作製することができる。そのような円錐形状の鼓膜グラフトは、グラフトの円錐奥行に依存する音誘発運動パターンを受け、かつ伝達し得る。

様々な円錐高さ（０ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、および３ｍｍ）の、直径９ｍｍの３Ｄ鋳型上に、グラフトを印刷した。ダイレクトインクライティングを用いて、ＰＤＭＳを、周囲条件下で、フィラメント形態に、４１０μｍのノズルに通して押し出して、厚さ２００μｍの固体シートおよびスキャフォールドを作製した。８Ｃ／８Ｒの鼓膜グラフトを、８０ｍｇ／ｍＬのウシフィブリンヒドロゲルで充填して、脱イオン水中で３７℃にて保存した。

有限要素解析（ＦＥＡ）を実行するために、３Ｄ印刷した膜の３Ｄ幾何構造およびメッシュを作製した。３Ｄ四面体二次要素を用いて、幾何形状を離散化した。発明者らの実験構成において、膜がホルダ表面を被覆する自由度を固定した。グラフトホルダの中心の円筒形状開口部に相当する９ｍｍの膜表面に、正弦波圧力を加えた。ヤング率は４．１ＭＰａであるとみなし、減衰比は２００Ｈｚにて０．０５６から、６３００Ｈｚにて０．０７１まで直線的に増大するとみなした。発明者らの研究室で開発した混合分析実験法を用いたレーザドップラ振動測定に基づいて、両方の材料パラメータを計算した。

デジタルオプトエレクトロニックホログラフィ（ＤＯＥＨ）を実行するために、干渉計を用いて、２つの干渉レーザビームによりリアルタイムで運動誘発ホログラムを記録して、膜の音誘発運動の定性的フルフィールド情報および定量的フルフィールド情報を得た。膜の表面上の４００，０００点を超える変位の大きさおよび位相角を、同時に取得した。膜を、音響カプラが統合されたホルダ内に取り付けて、干渉計のカメラヘッドの前方に配置して、膜の表面がレーザの物体ビームに対して直角をなすように、向きを定めた。膜支持体に制限した粘性力および陰圧の組合せによって、膜をホルダ内に保持した。純音（０．１、１、３、および６ｋＨｚ）を音源から再生して、膜表面上の各点についての変位波形を、ストロボモードで記録する。フーリエ変換を用いて、各点での変位の大きさおよび位相を計算した。

様々な奥行の円錐が、ＤＯＥＨによって測定される周波数依存性表面運動パターンを示す。表面運動パターンは、単純なもの（＜１０００Ｈｚ）から複雑なもの（３０００Ｈｚ）、そして高次なもの（６０００Ｈｚ）に進行する。絶対変位の大きさの値およびパターンは、円錐の高さによって変わる。平坦な膜は、１、２、または３ｍｍの円錐よりも１０００Ｈｚ未満で運動が５〜１０倍大きい傾向がある一方、より高い周波数では差が小さくなる。

有限要素解析（ＦＥＡ）は、音に反応する表面運動パターンを予測した。円錐奥行による運動パターンおよび変位の振幅における差異を、ＦＥＡを用いて予測した。印刷したグラフトの不規則性が、測定したパターンにおいて、非対称性を説明する。最大変位の節点が、ＤＯＥＨの結果において非対称的に現れて、より大きな円錐奥行にてより顕著になる。グラフトの製造プロセスにおける不規則性により、固体膜グラフトに沿うシームが残って、非対称運動をもたらす。充填したＴＭグラフトスキャフォールドが、固体シートと類似した変位を示す。低周波数では、コラーゲン／フィブリンヒドロゲルで充填したＰＤＭＳ ２ｍｍ円錐スキャフォールドの表面運動パターンが、単純な節点パターンを示す。

結果は、非結合ヒトＴＭの変位パターンが、本明細書中に記載する３Ｄグラフトデバイスと類似することを示す。単離したＴＭ（環形であるが中耳負荷なし）は、２ｍｍの固体円錐体および２ｍｍの内部充填グラフトスキャフォールドとのいくつかの類似性を示す変位パターンを測定した。しかしながら、内部充填グラフトおよび円錐膜は、ヒトＴＭほど移動しない。

レーザドップラ振動（「ＬＤＶ」）の結果は、円錐の奥行が増大すると、低周波数での剛性が高くなることを示している。印刷したグラフトの中心点でのＬＤＶ測定速度は一貫して、グラフトの高さと運動との間の逆関係を示す。これは、円錐形状が独立して、膜の剛性を増大させることを示唆している。平坦なグラフトおよび円錐形状のグラフトによって測定した第１の共鳴周波数は、より深い円錐について、より高い周波数への漸進的なシフトを示す。高周波数での速度差は、あまり明白でない。様々な高さの円錐形状のグラフトを比較した場合、１０００Ｈｚを超えると、一貫した差異がほとんど見られない。

他の実施形態
本発明を、その詳細な説明と共に記載してきたが、前述の説明は、本発明の範囲を例示することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されると理解されるべきである。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (31)

1. 第１の材料または材料の組合せを含む複数のリブを備えるスキャフォールドであって、前記スキャフォールドの少なくとも一部の前記リブは円形状で形成されており、前記スキャフォールドの少なくとも一部の前記リブは放射状パターンを形成している、前記スキャフォールドと；
   前記放射状パターンを形成している前記リブの間の複数の開放空間と
   を備え、
   前記スキャフォールドは、損傷した、または喪失した鼓膜を修復または置換するように、サイズ設定され、かつ構成されている、人工鼓膜デバイス。
2. 前記スキャフォールドの少なくとも一部のリブは、ハブアンドスポーク構成で形成されている、請求項１に記載のデバイス。
3. 前記スキャフォールドの少なくとも一部のリブは、一群の同心の円形状で形成されている、請求項１に記載のデバイス。
4. 前記人工鼓膜は、円形の３次元円錐形状を形成している、請求項１に記載のデバイス。
5. 前記第１の材料は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエステルカーボネートウレタン尿素（ＰＥＣＵＵ）、ポリオクタメチレンマレエート無水シトレート（ＰＯＭａＣ）、ポリ（グリセロールセバケート）（ＰＧＳ）、ポリ（オクタンジオール−コ−シトレート）（ＰＯＣ）、ポリウレタン、コラーゲン（例えばＩＩＩ型コラーゲン）、フィブリン、細胞外マトリックス、ナイロン、絹、ポリグレカプロン、およびエラスチンの１つまたは複数を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のデバイス。
6. 前記第２の材料は、コラーゲン、例えば、ＩＩＩ型コラーゲン、細胞外マトリックス、ヒドロゲル、例えばフィブリンヒドロゲル、二酸化チタン、セルロース、ゼラチン、アガロース、アルギン酸塩、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ヒアルロン酸、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリカプロラクトン、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレート）、プルロニックＰＬＡ、ＰＧＡ、トランスグルタミナーゼ、ＰＬＧＡ、ＰＤＭＳ、ポリグレカプロン、ポリエステルカーボネートウレタン尿素（ＰＥＣＵＵ）、ポリオクタメチレンマレエート無水シトレート（ＰＯＭａＣ）、ポリ（グリセロールセバケート）（ＰＧＳ）、ポリ（オクタンジオール−コ−シトレート）（ＰＯＣ）、ポリウレタン、ならびにコラーゲンおよびフィブリンの混合物の１つまたは複数を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のデバイス。
7. 細胞接着誘導物質、細胞侵入誘導物質、小分子、生物製剤、またはそれらのあらゆる組合せをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のデバイス。
8. 線維芽細胞、軟骨細胞、ケラチン生成細胞、幹細胞、前駆細胞、および上皮細胞からなる細胞の種類の群から選択される１つまたは複数の細胞の種類をさらに含む、請求項７に記載のデバイス。
9. 増殖因子をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のデバイス。
10. 前記増殖因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、およびケラチン生成細胞増殖因子（ＫＧＦ）の１つまたは複数を含む、請求項９に記載のデバイス。
11. 前記デバイスはさらに、薬物または薬物溶出物質を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のデバイス。
12. 前記デバイスは、直径が０．５〜１２．０ミリメートルである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のデバイス。
13. 前記デバイスは、直径が、天然の鼓膜、または特定の患者の天然の鼓膜中の穿孔または欠陥の直径に基づいている、請求項１２に記載のデバイス。
14. 前記天然の鼓膜は、ヒトの鼓膜である、請求項１３に記載のデバイス。
15. 前記リブは、直径が５〜８００ミクロンである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のデバイス。
16. 前記デバイスは、空気に対して非透過性である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のデバイス。
17. 前記デバイスは、空気に対して透過性である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のデバイス。
18. 前記デバイスは、小分子、生物製剤、ステロイド、および抗生物質のいずれか１つまたは複数に対して透過性である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のデバイス。
19. 前記鼓膜グラフトの片面上に耳小骨コネクタをさらに備える、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のデバイス。
20. 前記耳小骨コネクタは、人工鼓膜臍として形成され、かつ鼓膜臍、リング、ループ、ヒンジ、およびボールアンドソケットの１つの形状をとる、請求項１９に記載のデバイス。
21. 損傷した鼓膜を治癒または増強するために、または喪失した鼓膜もしくはその喪失部分を置換するために、患者に、移植する方法において用いられる、デバイスであって、前記方法は、
    損傷した、または喪失した前記鼓膜にアクセスすることと；
    適切にサイズ設定され、かつ構成された人工鼓膜デバイスを得ることと；
    前記鼓膜の損傷部分をシールするように、前記人工鼓膜デバイスを固定すること、または前記喪失した鼓膜もしくはその喪失部分を置換することと
    を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のデバイス。
22. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載のデバイスを製造する方法であって：
    第１の材料を用いて、複数のリブを備えるスキャフォールドを担体上に印刷して、前記放射状パターンを形成している前記リブの間に１つまたは複数の開放空間を定めることと；
    前記第１の材料、異なる第２の材料、前記第１の材料および第２の材料の組合せ、または第２の材料および１つまたは複数の他の異なる材料の組合せを用いて、前記放射状パターンを形成している前記リブの間の前記開放空間内に薄膜を形成することと
    を含み、
    前記デバイスは、損傷した、または喪失した鼓膜を修復または置換するように、サイズ設定され、かつ構成されている、方法。
23. 前記スキャフォールドを形成することは、前記スキャフォールドを３次元（３Ｄ）プリンタで印刷することを含み；
    前記リブの間の前記開放空間に前記薄膜を形成することは、前記開放空間を前記第１の材料または前記第２の材料で充填することを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記３Ｄプリンタは、前記第１の材料を押し出すためのノズルを備え、前記ノズルは、直径が５００μｍ以下の開口部を有する、請求項２３に記載の方法。
25. 前記スキャフォールドを印刷することは、ガラス、ポロキサマー、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、および金属箔の１つまたは複数を含む担体上に、前記スキャフォールドを印刷することを含む、請求項２３に記載の方法。
26. 前記スキャフォールドの前記開放空間を前記第２の材料で充填することは：
    前記担体から前記スキャフォールドを取り出すことと；
    コンテナを、液体形態の前記第２の材料で充填することと；
    前記スキャフォールドを、前記第２の材料を有する前記コンテナ内に入れることと；
    前記スキャフォールドおよび充填された第２の材料を硬化させて、前記第２の材料を固化させることと
    を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記スキャフォールドおよび充填された第２の材料を硬化させて、前記第２の材料を固化させることは、前記スキャフォールドおよび充填された第２の材料を、脱イオン水中で３７℃にてインキュベートすることを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 一対の請求項１〜２１のいずれか１項に記載の人工鼓膜デバイスを備える、２層鼓膜デバイスであって、前記一対の人工鼓膜デバイスの第１の構成要素がさらに、突出部を備え、前記一対の人工鼓膜デバイスの第２の構成要素がさらに、前記突出部の挿入を可能にするように構成された開口部を備え、前記第１の構成要素および前記第２の構成要素は、互いに固定され得る、２層鼓膜デバイス。
29. 前記開口部および前記突出部は、ロックアンドキー構成、ソケットアンドボール構成、またはオープニングアンドヒンジ構成を備える、請求項２８に記載の２層鼓膜デバイス。
30. 鼓膜穿孔を修復する方法において用いられる２層鼓膜デバイスであって、前記方法は、
    前記２層鼓膜デバイスを得ることと；
    アンダーレイグラフトデバイスとしての前記第１の構成要素を、前記穿孔中に挿入して、前記アンダーレイデバイスの表面を鼓膜に固定することで、前記突出部が前記穿孔を通って突出するようにすることと；
    オーバーレイデバイスとしての前記第２の構成要素を、前記穿孔に適用することで、前記突出部が前記オーバーレイデバイスの前記開口部を通って突出し、かつ前記オーバーレイデバイスの表面を越えて延びるようにすることと；
    前記オーバーレイデバイス、および前記突出部またはアンダーレイデバイスの１つまたは両方を、互いに対して移動させることで、前記突出部の一部が、前記オーバーレイデバイスの前記表面上にしっかりとフィットして、前記アンダーレイデバイスおよび前記オーバーレイデバイスを一緒にロックし、これらの間に前記鼓膜および穿孔をはさむようにすることと
    を含む、請求項２８または２９に記載の２層鼓膜デバイス。
31. 前記アンダーレイデバイスの上面は、毛細管作用もしくは接着、またはフィブリン糊等の組織接着剤によって、前記鼓膜の内面に接着する、請求項３０に記載の２層鼓膜デバイス。