JP6817951B2 - 少量のリコペンを有する生物活性トマト組成物 - Google Patents

Description

本発明は食品加工の分野に関する。特に、本発明は少量のリコペンを有する生物活性トマト組成物に関する。

トマト生成物は食品業界で、また機能性食品及び機能性化粧品組成物の製造ではますます広く使用されている。ＵＳ ５，８３７，３１１は、特に高レベルのカロテノイドリコペンを含有しているトマトオレオレジンを含めたトマト由来生成物を製造するための工業的方法を記載している。このオレオレジン生成物は、フィトエン、フィトフルエン及びβ−カロテンのような他のカロテノイド、及びトコフェロール及びフィトステロールを含めた印象的に広範囲の薬剤活性成分をも含有している。このオレオレジン生成物はここ数年間広く且つうまく販売され、使用されており、この生成物で予防及び／または治療され得る病的状態の範囲には、癌性症状（特に、前立腺癌）、高血圧、アテローム性動脈硬化症、皮膚症状、並びに細胞及びＤＮＡ損傷が含まれるが、これらに限定されない。

このトマトオレオレジン製剤は健康の管理及び疾患の予防において非常に有効であると立証されているが、その顕著な赤色は幾つかの状況では、例えば化粧品または機能性化粧品としての皮膚への使用が考えられるときには不利であり得る。

米国特許第５，８３７，３１１号明細書

本発明の目的は、Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ^（Ｒ）として公知であり、市販されている上記トマトオレオレジンと類似（または、改善された）治療活性を有しているが、その低いリコペン含量のために非常に薄い赤色を有しているトマト由来生成物を提供することによりこの問題の解決を提供することである。

本発明の他の目的及び目標は説明が進むにつれて明らかとなるであろう。

本発明は主に、リコペン、並びにフィトエン及びフィトフルエンの一方または両方を含む組成物であって、リコペンの濃度が０．３％から２％（重量／重量）の範囲であり、且つ、リコペン：フィトエン及びフィトフルエンの一方または両方の重量比が１：１から１：２．５の範囲である少リコペンのトマト由来組成物に関する。加えて、上記組成物は更にフィトステロールを含む。

上に開示されている組成物の１つの好ましい実施形態では、フィトステロール濃度は少なくとも２％（重量／重量）である。

１つの好ましい実施形態では、上に開示されている組成物は更にビタミンＥを少なくとも２％（重量／重量）の濃度で含む。

本発明の１つの好ましい実施形態では、フィトエン及びフィトフルエンの一方または両方は０．２５％〜３％の総濃度で存在する。

本明細書の文脈において、用語「少リコペン」及び「低リコペン」組成物等は互換可能に使用されており、これらの用語のすべては前パラグラフに規定されているカロテノイド組成を有する組成物を指すと理解すべきである。

本発明の組成物のリコペン含量が従来技術の一般的に使用されているトマトオレオレジン生成物（Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ^（Ｒ））と比較して少なくとも１／３に減量されているという事実にもかかわらず、本発明の組成物が重要な生物学的活性（非限定的に、抗炎症活性が挙げられる）を有していることに注目すべきである。トマトオレオレジンの治療効果の多くはリコペン含量に起因しているので、この結果は全く予想外である。

１つの好ましい実施形態では、本発明の組成物は５０ｐｐｍ未満の溶媒濃度を有する。

幾つかの実施形態では、本発明の組成物は１つ以上の追加医薬活性成分をも含み得、これらの成分には追加カロテノイド、ビタミンＥ、及びカルノシン酸のようなポリフェノールが含まれるが、これらに限定されない。追加カロテノイドの好ましい例には、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、β−カロテン、アスタキサンチンが含まれる。しかしながら、上にリストした例に加えて、またはその代わりに他のカロテノイドを組成物中に存在させてもよい。

本発明の１つの好ましい実施形態では、少リコペン組成物は更にカルノシン酸を含む。

別の好ましい実施形態では、少リコペン組成物は更に可溶性トマト固形物を含む。

更に好ましい実施形態では、本発明の組成物は更にβ−カロテン及びビタミンＥを含む。好ましくは、上記追加成分は０．２％〜１．０％のβ−カロテン及び２．０％〜４％のビタミンＥの濃度範囲で存在する。

１つの好ましい実施形態では、上に開示されている組成物はトマトから製造される。

別の態様において、本発明は、上に規定した低リコペン含量のトマト由来組成物の製造方法を提供し、その方法は、
１．（例えば、ＵＳ ５，８３７，３１１に記載されているような）５％〜２０％のリコペンを含むトマト生成物を用意するステップ；
２．非限定的に例示されるエタノール、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）またはアセトンのような脂質を溶解するが、リコペンを溶解しない溶媒または溶媒混合物を１：１（溶媒：トマト生成物）を超える比で、好ましくは３：１の比で添加するステップ；
３．溶媒／トマト抽出物混合物を約２５〜６０℃の温度で加熱するステップ；
４．溶媒から結晶性物質を濾過及び／または遠心分離により分離するステップ；
５．場合により、おおよそ７０％のリコペンを含有している結晶を着色剤処方物に配合するステップ；
６．その後ステップ２において使用するために再循環させ得る溶媒を蒸発させる（エタノールの場合には、５０ｐｐｍ未満のエタノールを有する液体を残すことが好ましい）ステップ；
７．生じた液体を例えば供給組成物を添加することにより所要濃度に標準化するステップ；
を含む。

上に開示されている方法の１つの好ましい実施形態では、ステップ２において使用される溶媒はエタノールである。

上に開示されている方法の１つの好ましい実施形態では、溶媒：トマト生成物比は４：１である。

この方法の出発材料としてトマト由来の適当なカロテノイド含有生成物を使用し得るが、１つの非常に好ましい実施形態では出発材料として使用されるトマト生成物はオレオレジンである。別の好ましい実施形態では、出発材料として使用されるトマト生成物はトマトの皮から構成される。

そのリコペン濃度が（従来技術のトマトオレオレジンに比べて）非常に少ないにもかかわらず、本明細書中に開示されている組成物が血管組織において一酸化窒素（ＮＯ）の生成を増加させることが驚くことに知見された。更に、本発明の組成物が血管内皮において内皮一酸化窒素シンターゼ酵素を有意に誘導させることが知見された。

本明細書中に開示されている組成物が抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）系の活性を有意に上昇させることも予期せぬことに知見された。

更に、本明細書中に開示されている組成物が炎症誘発性ＮＦκＢ転写系を有意に阻害することが予期せぬことに知見された。

上に開示されている組成物は、多くの異なるタイプの病状を治療するための薬剤を製造するために使用され得る。１つの好ましい実施形態では、薬剤は心血管系の障害を治療する際に使用するのに適しており、前記心血管系の障害には高血圧が含まれるが、これに限定されない。

別の好ましい実施形態では、薬剤は糖尿病患者における血管損傷及び／または神経障害を治療または予防するために使用され得る。

さらに別の好ましい実施形態では、治療対象の病状は炎症性成分を有していることを特徴とする。１つの特に好ましい実施形態では、薬剤は血管炎症を治療及び／または予防するために使用される。

更にもっと好ましい実施形態では、本発明の薬剤は腫瘍性病状の発症を予防するために使用され得る。

幾つかの実施形態では、組成物は更に１つ以上の上に挙げた追加活性成分、例えば追加カロテノイド、ポリフェノール（例えば、カルノシン酸）、ビタミンＥ、フィトステロール及び可溶性トマト固形物（例えば、果肉−セラム分離後トマトから得られるセラムを濃縮することにより作成される透明なトマト濃縮物（ＣＴＣ）の形態）を含む。

更なる態様において、本発明は、上に規定した少リコペンのトマト由来組成物の局所用薬剤の製造における、使用に関する。この態様の１つの好ましい実施形態では、局所用薬剤は化粧品または機能性化粧品であり、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、ゲル剤等の形態で作成され得る。

１つの好ましい実施形態では、化粧品または機能性化粧品は、更に慣用されている日焼け止め剤をも含み得るサンスクリーンとして使用され、前記日焼け止め剤にはＰＡＢＡ、酸化亜鉛、酸化チタン、シノキセート、パディメートＯ及びフェニルベンズイミダゾールスルホン酸が含まれるが、これらに限定されない。

別の好ましい実施形態では、本発明のトマト由来組成物はアンチエージング剤として使用される。本発明の幾つかの実施形態では、上に規定したトマト組成物は単一活性剤として使用され、他の場合には化粧品または機能性化粧品は追加活性成分を含む。

別の好ましい実施形態では、本発明は、上に規定した少リコペンのトマト由来組成物の全身投与用薬剤の製造における使用に関し、前記薬剤には経口デリバリー用薬剤及び非経口デリバリー用薬剤が含まれるが、これらに限定されない。加えて、本発明の組成物は局所投与に適した薬剤を製造するために使用され得る。

低リコペン含量のトマト組成物を製造するための方法を概略的に示す。 本発明の低リコペン組成物で処理した後の血管内皮細胞中のＮＯレベルの上昇をグラフで示す。 本発明の低リコペン組成物で処理した後の血管内皮細胞中のｐｅＮＯＳ誘導の増加をグラフで示す。 本発明の低リコペン組成物により引き起こされるＬＮＣａＰ前立腺癌細胞中のＡＲＥ活性の増加をグラフで示す。 本発明の低リコペン組成物により引き起こされるＴ４７Ｄ乳癌細胞中のＡＲＥ活性の増加をグラフで示す。 本発明の低リコペン組成物により引き起こされるＴ４７Ｄ乳癌細胞中のＮＦκＢ転写系の阻害をグラフで示す。

［好ましい実施形態の詳細説明］
上に開示されているように、本発明は少リコペンのトマト生成物を含む組成物を提供し、前記組成物の製造方法の一般的スキームは図１に要約されており、以下のステップを含む：
［ステップ１］：５％〜２０％のリコペンを含むトマト生成物（例えば、ＵＳ ５，８３７，３１１に記載されているオレオレジン、またはトマトの皮）を用意する；
［ステップ２］：エタノール、イソプロパノールまたはアセトンのような脂質を溶解するが、リコペンを溶解しない溶媒または溶媒混合物を１：１（溶媒：トマト生成物）を超える比、好ましくは３：１または４：１の比で添加する；
［ステップ３］：溶媒／トマト抽出物混合物を約２５〜６０℃の温度で加熱する；
［ステップ４］：溶媒から結晶性物質を濾過または遠心分離により分離する；
［ステップ５］：場合により、おおよそ７０％のリコペンを含有している結晶を着色剤処方物に配合する；
［ステップ６］：溶媒を部分的に蒸発させて（好ましくは、５０ｐｐｍ未満の溶媒を有する液体を残す）、この溶媒はステップ２において使用するために再循環され得る；
［ステップ７］：供給組成物を添加することにより生じた液体を所要濃度に標準化する。

＜医薬組成物＞
活性物質のリコペン及びフィトエン／フィトフルエンは、場合により他のカロテノイド及び／または追加物質と一緒に、単独で投与してもよいが、これらの化合物は、活性成分を医薬的に許容され得る担体または賦形剤と一緒に含有する医薬組成物の形で投与することが考えられる。

本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性化合物の医薬的に使用可能である製剤への加工を容易にする賦形剤及び添加剤からなる生理学的に許容され得る担体を１つ以上用いて慣用の方法で製剤化され得る。活性物質は医薬組成物として製剤化され、哺乳動物被験者、例えばヒト患者に対して液体、固体及び半固体のような各種形態で投与される。医薬組成物は被験者に対して当業者に公知の方法により、例えば経口的に、局所的に、非経口的に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、心室内に、頭蓋内に、または腫瘍内に投与され得る。経口投与の場合、化合物は活性化合物を当業界で公知の医薬的に許容され得る担体と組み合わせることにより製剤化され得る。組成物は当業界で公知の固体または液体剤形で製剤化され得、前記剤形には錠剤、カプレット剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、ペレット剤、ピル剤、散剤、シロップ剤、ゲル剤、スラリー剤、顆粒剤、懸濁液剤、分散液剤、エマルション剤、液剤、溶液剤、糖衣錠、ビーズ剤及びビードレット剤が含まれるが、これらに限定されない。経口組成物は、即放性製剤として、または活性成分を所定期間にわたり長期間放出できる制御放出性または徐放性製剤として製剤化できる。

固体製剤用に適した賦形剤には、増量剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含めた糖；澱粉ベースの賦形剤、例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、コメ澱粉、ジャガイモ澱粉等、ゼラチン、トラガカントガム；セルロースベースの賦形剤、例えば結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が含まれるが、これらに限定されない。ポリマー、例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及び架橋ＰＶＰも使用され得る。加えて、組成物は更に、結合剤（例：アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポピドン）、崩壊剤（例：コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロートナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、澱粉グリコール酸ナトリウム）、界面活性剤（例：ラウリル硫酸ナトリウム）、及び滑沢剤（例：ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）を含み得る。

液体製剤の場合、医薬的に許容され得る担体は水性または非水性の溶液、懸濁液、エマルション、または油であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール及び注射用有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液、例えば食塩液及び緩衝媒体が含まれる。油の例には、石油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、オリーブ油、サンフラワー油及び魚肝油のような動物、植物または合成起源の油が含まれるが、これらに限定されない。

好ましい経口医薬組成物には、ゼラチンからなるカプセル剤、及びゼラチンと可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）からなる軟質封入カプセル剤が含まれる。軟カプセル剤の場合、活性成分は適当な液体、例えば脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁され得る。加えて、安定化剤を添加してもよい。ある好ましい実施形態では、カプセル剤は動物起源の成分を除いており、ベジタリアンや完全ベジタリアンにとって許容できる。

軟質ゼラチンカプセル剤及びその製造方法は当業界で公知である。非限定例は、いずれも参照により本明細書に組み入れる米国特許第６，２１７，９０２号、第６，２５８，３８０号、第５，９１６，５９１号及び第４，８９１，２２９号中に見出すことができる。

本発明の組成物には、当業者に公知の他の許容され得る賦形剤及び添加剤、例えば安定化剤、可溶化剤、張度向上剤、緩衝物質、保存剤、増粘剤、錯化剤及び他の賦形剤、並びに追加の治療用物質を配合し得る。

可溶化剤は、例えばチロキサポール、脂肪酸グリセロール、ポリエチレングリコールエステル、脂肪酸ポリエチレングリコールエステル、ポリエチレングリコール、グリセロールエーテル、またはこれらの化合物の混合物であり得る。可溶化剤の具体例はポリオキシエチル化ヒマシ油、例えば市販品のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ^（Ｒ）またはＣｒｅｍｏｐｈｏｒ^（Ｒ）ＲＨ４０である。可溶化剤の別の例はチロキサポールである。使用する濃度は特に活性成分の濃度に依存する。典型的には、活性成分を可溶化するのに十分な量を添加する。例えば、可溶化剤の濃度は活性成分の濃度の０．１〜５０００倍である。

緩衝物質の例は、酢酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、炭酸水素塩／炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、リン酸塩、プロピオン酸塩及びＴＲＩＳ（トロメタミン）緩衝剤である。添加される緩衝物質の量は、例えば生理学的に許容され得るｐＨ範囲を確保し、維持するのに必要な量である。ｐＨ範囲は典型的には５から９、好ましくは５．２から８．５の範囲である。

本発明の組成物は、更に非毒性賦形剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００、３００、４００及び６００）、またはＣａｒｂｏｗａｘ^（Ｒ）（ＣａｒｂｏｗａｘｌＯＯＯ、１５００、４０００、６０００及び１００００）のような乳化剤、湿潤剤または増量剤を含み得る。所望により使用され得る他の賦形剤を以下にリストするが、これらは可能な賦形剤の範囲を決して限定すると意図されない。賦形剤は、錯化剤、例えばＥＤＴＡ二ナトリウムまたはＥＤＴＡ；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、アセチルシステイン、システイン、亜硫酸水素ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン；安定化剤、例えばチオウレア、チオソルビトール、ナトリウムジオクチルスルホスクシネーまたはモノチオグリセロール；または他の賦形剤、例えばラウリン酸ソルビトールエステル、メタノールアミンオレエートまたはパルミチン酸エステルであり得る。

投与しようする組成物の量は、もちろん治療対象の被験者、痛みの重度、投与方法、及び処方する医者の判断を含めた多くの要因に依存する。しかしながら、使用する用量は通常、患者の年齢及び性別、及び治療対象の疾患の重症度を含めた複数の要因に依存する。

好ましくは、製剤は経口投与用に意図された単位投与形態である。そのような形態では、製剤は適切な量の活性成分を含有する単位用量に小分けされる。単位投与形態はパッケージ製剤であり、パッケージは例えばバイアルまたはアンプル中の錠剤、カプセル剤及び散剤のようなばらばらの量の製剤を収容している。はカプセル剤、カシェ剤または錠剤そのものであり得、または適当な数の単位投与形態が包装されていてもよい。

本発明の組成物の投与スケジュールは具体的用途及び活性成分の力価に応じて変更され得る。適切な量の決定は当業者の範囲内でてある。便宜上、１日１回投与が好ましい。或いは、総１日用量を、例えば１日２回、１日３回等のように１日の間に小分けして投与してもよい。隔週、毎週、隔月及び毎月投与も考えられる。

本発明を以下の実施例において更に記載する。これらの実施例は例示の目的のみで提示されており、本発明の範囲を決して限定しない。

［製造例１］
＜本発明の低リコペン濃度のトマト由来組成物の製造方法＞
本発明の低リコペン濃度組成物を以下のステップに従って製造した：
１．次の組成：
１０．１％ リコペン
１．７％ フィトエン及びフィトフルエン
２．５％ フィトステロール
２．５％ ビタミンＥ
８２．７％ 遊離脂肪酸
０．５％ 水
を有するトマトオレオレジンをＵＳ ５，８３７，３１１に開示されている方法に従って調製した。（この調製物はイスラエル国ベエルシェバのＬｙｃｏＲｅｄ Ｌｔｄ．製Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ^（Ｒ）の商標名で販売され得ることに注目すべきである）
２．ステップ１に従って調製したトマトオレオレジン（１００ｍｌ）を９８％ エタノール（３００ｍｌ）を収容している混合容器に添加し、４０℃で０．５時間混合した。
３．プレスフィルターを使用してエタノール溶媒から結晶性物質を分離した。この分離により、１０．９４ｇの８５％ リコペン及び１５％ 脂肪酸を含む結晶性物質が生じた。
４．次いで、大部分のエタノールを除去するためにステップ３からの濾液を蒸発させると、８９ｇの以下の組成：
２．０％ リコペン
２．２％ フィトエン及びフィトフルエン
２．８％ フィトステロール
２．８％ ビタミンＥ
を有する液体（本発明の低リコペン生成物である）が残った。

（一般的方法）
＜細胞培養及び処理＞
初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を臍帯から単離した。細胞を０．１％ コラゲナーゼ処理（米国ニュージャージー州レイクウッドのＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）により収集した。ＨＵＶＥＣを０．２％ ゼラチンをプレコートした組織培養フラスコ（米国イリノイ州ヴァーノン・ヒルズのＣｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）中２０％ ＢＣＳ及びＥＡ．ｈｙ９２６について記載されている他のサプリメントを含むＭ−１９９培地において増殖させた。ＥＡ．ｈｙ９２６細胞は経代３７まで使用し、ＨＵＶＥＣは経代３−８で使用した。Ｕ９３７単核細胞を１０％ ＢＣＳ、Ｌ−グルタミン及び先に特定した抗生物質を含むＲＰＭＩ １６４０培地において培養した。多くの実験では、７０〜９０％ コンフルエンスの内皮細胞を５％ ＢＣＳ ＤＭＥＭ／Ｍｌ９９培地を用いて２４時間餓死させ、ビヒクルまたは５％ ＢＣＳ ＤＭＥＭ／Ｍ１９９中のカロテノイド溶液と１８〜２４時間プレインキュベートし、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−α（米国ニュージャージー州ロッキー・ヒルのＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いて規定時間活性化した。

＜カロテノイド溶液＞
６％または７％ リコペン、０．１％ β−カルテン、１％ ビタミンＥ及びポリフェノールを含有するオレオレジン（イスラエル国ベエルシェバのＬｙｃｏｒｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ．）、及び（上記製造例１に従って得た）本発明の低リコペン組成物のストック溶液（４００ｕＭ）を酸化剤として０．０２５％ ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含有する新鮮テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（いずれも米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ）を用いて調製し、Ｎ_２流下で光を抑えて培地に添加した。

［実験例１］
＜本発明の低リコペン濃度のトマト由来組成物の一酸化窒素（ＮＯ）の発現に対する影響＞
ＮＯは、多くの生物学的プロセス及び組織中の主要シグナル分子である。血管組織の場合には、内皮は一酸化窒素を使用して周囲の平滑筋を弛緩させるように合図し、よって血管拡張及び多い血流が生ずる。ＮＯは更に、血管平滑筋増殖、血小板凝集、及び内皮への白血球接着を抑制することにより血管機能において役割を発揮する。心血管病巣の存在を特徴するヒト疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、糖尿病または高血圧）の多くの場合、損なわれたＮＯ経路機能がしばしば見られ得る。

本研究では、培養したヒト冠状内皮細胞モデルを使用して、本発明の低リコペン（２％）濃度組成物のＮＯ誘導に対する影響を評価した。これは、培養細胞によるＮＯ生成を直接測定すること及び内皮細胞型ＮＯシンターゼ酵素ｐｅＮＯＳの活性をアッセイすることの両方により達成された。本発明の組成物で達成された結果を高リコペントマト由来組成物の７％ Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（イスラエル国ベエルシェバのＬｙｃｏＲｅｄ Ｌｔｄ．より製造、供給されている）で得られた結果と比較した。

＜方法及び材料＞
（上記したように製造した）本発明の低リコペン（２％）組成物及び各種対照溶液（培地、ＴＨＦ及び７％ Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ）を（６０ｍｍ皿あたり２ｍｌの内皮細胞基本培地において平板培養した）集密的に培養したヒト冠状内皮細胞に２４時間添加し、その後上清培養液を集めた。

＜硝酸塩及び亜硝酸塩分析＞
カロテノイドに曝露してから２４時間後に集めた培地中の一酸化窒素の安定な酸化生成物である硝酸塩及び亜硝酸塩（ＮＯｘ）をグリース試薬を用い、Ｍｉｒａｎｄａ ＫＭ，Ｅｓｐｅｙ ＭＧ ａｎｄ Ｗｉｎｋ ＤＡ，２００１（Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ ５：６２−７１；“Ａ ｒａｐｉｄ，ｓｉｍｐｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｔｅ”）に記載されている方法を用いて測定した。

実験は記載されているように室温または暖かい部屋において３７℃で実施した。

＜ｐｅＮＯＳ分析＞
内皮型ＮＯシンターゼ酵素のｐｅＮＯＳの発現を当業界で公知のウェスタンブロット分析を用いて評価した。要するに、内皮細胞ライゼートのタンパク質含量をＢＣＡタンパク質アッセイキット（米国イリノイ州ロックフオードのＰｉｅｒｃｅ）を用いて定量した。等量の細胞タンバク質を７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜にブロットした。ブロックし、一次ｐｅＮＯＳ抗体とインキュベートした後、タンパク質含量の相対的変化を反射モードのデンシトメトリーを用いて定量した。

＜結果＞
図２に示すように、本発明の低リコペン（２％）組成物は５．０μΜの濃度で使用したとき培地及びＴＨＦ対照と比較してＮＯ誘導レベルを大きく上昇させた。予期せぬことに、ＮＯ発現の測定可能な増加をも引き起こすが、７％ Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏは本発明の組成物よりもこの点ではるかに不活性であった（おおよそ１／４）。

図３は、培養内皮細胞におけるｐｅＮＯＳレベルのウェスタンブロット分析から得た結果を示す。すなわち、この図から、培地及びＴＨＦ対照と比較して、（１．０μΜで使用した）本発明の低リコペン（２％）組成物はｐｅＮＯＳを非常に有意に増加させることが分かり得る。この結果は、未処理の細胞と比較してｐｅＮＯＳ発現を増加させなかった７％ Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（１．０μΜ）を用いて得た結果と著しく異なる。

これらの結果から、本発明の低リコペン濃度組成物は血管内皮細胞におけるＮＯの誘導を有意に増加させ得ること、この効果は少なくとも部分的に前記細胞におけるＮＯシンターゼ酵素の高い発現に起因していることが結論づけられ得る。これらの結果にてらして、本発明の組成物は各種タイプの心血管疾患の治療及び予防において利用され得る当該活性を有していると結論づけられ得る。

［実験例２］
＜本発明の低リコペン濃度のトマト由来組成物によるＡＲＥ転写系の刺激＞
抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）は遺伝子プロモーターにおいて同定され、化学保護性応答系を含む一連の遺伝子の転写誘導を媒介する。前記系は幅広い抗癌物質に対する抵抗にとって必須である。加えて、細胞保護性ＡＲＥ調節遺伝子を活性化すると炎症応答が抑制され得、これらの遺伝子の発現が少ないと自己免疫疾患及び酸化剤傷害に対する高い炎症応答が生ずる。従って、このＡＲＥモデルは試験組成物の抗炎症作用を調べるためにも使用される。

本研究の目的は、本発明の低リコペン（０．７％ｗ／ｗ）修飾オレオレジン組成物のＡＲＥ系における活性を評価することであった。この組成物を用いて得られる結果をリコペンが等モル濃度で存在しているＬｙｃｏＭａｔｏ（６％または７％ リコペンを含有する）を用いて得た結果と比較した。

＜方法及び材料＞
乳癌（Ｔ４７Ｄ）及び前立腺癌（ＬｎＣＡＰ）細胞を用いる細胞培養モデルを上に開示されているように製造した本発明の低リコペン組成物のＡＲＥ系に対する活性を評価するために評価した。低リコペン組成物は０．７％のリコペン、１．７％のフィトエン／フィトフルエン、２．４％のフィトステロール及び２．５％のビタミンＥを含んでいた。比較の目的で、２つの市販されている高リコペン組成物（ＬｙｃｏＭａｔｏ ６％及びＬｙｃｏＭａｔｏ ７％；イスラエル国ベエルシェバのＬｙｃｏＲｅｄ Ｌｔｄ．製）も試験した。

＜細胞培養＞
ヒト前立腺癌細胞のＬＮＣａＰはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国バージニア州マナサス）から購入し、ピルビン酸ナトリウム（０．１１ｍｇ／ｍｌ）及びＤＨＴ（１０〜９Ｍ）を含有しているＲＰＭＩ １６４０培地において増殖させた。各培地に対してペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ナイスタチン（１２．５μｇ／ｍｌ）、Ｈｅｐｅｓ（１０ｍＭ）及び１０％ ＦＣＳを添加した。

ヒト乳癌細胞株のＴ４７ＤはＩａｆａ Ｋｅｙｄａｒ博士（イスラエルのテルアビブ大学）から好意により提供された。Ｔ４７Ｄ細胞をインスリン（０．６μｇ／ｍｌまたは６μｇ／ｍｌ）を含有しているＤＭＥＭにおいて増殖させた。

＜一過性トランスフェクション及びＡＲＥレポーター遺伝子アッセイ＞
Ｔ４７Ｄ細胞を２４ウェルプレート（１００，０００細胞／ウェル）にｊｅｔ ＰＥＩ試薬（フランス国イルキルシュのＰｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いてトランスフェクトした。細胞を血清なしの適切な培地で１回濯いだ後、０．４５ｍｌの３％ ＤＣＣ−ＦＣＳを含有する培地、及び５０μｌのＤＮＡ及びｊｅｔＰＥＩ試薬を１：５の充填比で含有している混合物を添加した。ＤＮＡの総量は０．２μｇのレポーター及び０．０５μｇのレニラルシフェラーゼを含有する０．２５μｇであった。次いで、細胞を９５％ 空気／５％ ＣＯ_２中３７℃で４〜６時間インキュベートした。培地を３％ ＤＣＣ−ＦＣＳ＋試験化合物を補充したものと交換し、細胞を更に１６時間インキュベートした。

ＬＮＣａＰ細胞をｊｅｔＰＥＩ試薬を用いてトランスフェクトした。細胞（７０，０００）を１ｍｌの３％ ＤＣＣＦＣＳ含有のフェノールレッド不含培地に接種した。翌日、５００μｌの培地を取り除き、５０μｌのＤＮＡ及びｊｅｔＰＥＩ試薬を１：１０の充填比で含有している混合物を添加した。ＤＮＡの総量は０．１６μｇのレポーター及び０．０４μｇのレニラルシフェラーゼベクターを含有する０．２μｇであった。細胞を４〜６時間インキュベートした後、試験化合物を２４時間かけて添加した。

＜ＡＲＥ活性評価のためのルシフェラーゼレポーターアッセイ＞
細胞抽出物を製造業者の説明書に従ってルシフェラーゼレポーターアッセイ（デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（ＤＬＲ（ＴＭ））システム，Ｐｒｏｍｅｇａ）のために作成した。デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系はデュアルレポーターアッセイを実施するための効率的な手段を提供する。ＤＬＲ（ＴＭ）アッセイでは、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，ウミシイタケとしても公知）ルシフェラーゼの活性を１個のサンプルから順次測定した。まず、安定化発光シグナルを発生させるためにルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（ＬＡＲ ＩＩ）を添加することによりホタルルシフェラーゼレポーターを調べた。ホタルルミネッセンスを定量した後、この反応をクエンチし、同時にＳｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ^（Ｒ）試薬を同一チューブに添加することによりレニラルシフェラーゼ反応を開始する。Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ^（Ｒ）試薬は、測定中にゆっくり減衰するレニラルシフェラーゼ由来の安定化シグナルをも発生させる。

＜結果＞
図４に示すように、等モル濃度のリコペンと比較すると、本発明の低リコペン組成物はＬＮＣａＰ前立腺癌細胞においてＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏよりも有意に高いＡＲＥ活性を誘導する。観察された効果は用量依存性である。曲線の変局点（約１０μΜ）を超えると、ＡＲＥ誘導に関する本発明の組成物とＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏの差はより有意である。

図５に示すように、本発明の組成物をＴ４７Ｄ乳癌細胞に添加したときにも同様の結果が得られる。すなわち、前立腺癌細胞で得られた結果の場合のように、本発明の組成物はＡＲＥ系においてＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ対照で見られるよりも有意に高い活性を引き起こした。

これらの結果から、本発明の低リコペン濃度組成物はＡＲＥ活性の非常に高い誘導物質であると結論づけられ得る。従って、この組成物は癌の予防及び炎症の低下の両方において非常に重要である重要な細胞機構に影響を与える可能性を有する。

［実験例３］
＜本発明の低リコペン濃度のトマト由来組成物によるＮＦκＢ転写系の阻害＞
炎症性サイトカインの発現及び酵素タンパク質発現は、慢性炎症性疾患の病因の幾つかの態様に決定的に関わる転写因子核因子κＢ（ＮＦκＢ）の活性化により調節され得る。ＮＦκＢは、ΙκΒキナーゼ（ＩＫＫ）の活性化を介するΙκΒタンパク質のリン酸化、ユビキチン化、及びその後のタンパク質分解の結果として活性化される。遊離したＮＦκＢは核に転位し、誘導型一酸化窒素シンターゼ酵素（ｉＮＯＳ）のような炎症誘発性遺伝子のプロモーター、及びシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）ＴＮＦ−α及びＩＬ−Ιβのプロモーター中のモチーフに結合して、そのｍＲＮＡ発現が誘導される。既に開発されている抗炎症薬の多くは、ＮＦκＢ活性化経路を阻害することによりこれらの遺伝子の発現を抑制することが判明している。よって、ＮＦκＢインヒビターは炎症に関連するヒト疾患を調節するための臨床用途における強力な治療薬として有用であり得る。

本研究の目的は、本発明の低リコペン組成物がＴ４７Ｄ乳癌細胞においてＮＦκＢ転写系を阻害し得るかどうかを調べることであった。

本研究の結果を図６に示す。この図から、本発明の低リコペン組成物がＴ４７Ｄ乳癌細胞におけるＮＦκＢ転写系を６％ Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ対照よりも有意に大きく阻害することが示され得る。これらの結果は更に本発明の低リコペン組成物の抗炎症活性が高レベルである証拠を与える。

Claims (12)

1. リコペン、フィトエン及びフィトフルエンの一方または両方、並びにフィトステロールを含む組成物であって、リコペンの濃度が０．３％〜２％（ｗ／ｗ）の範囲であり、フィトステロールの濃度が、少なくとも２％（ｗ／ｗ）であり、且つ前記リコペン：前記フィトエン及びフィトフルエンの一方または両方の重量比が１：１から１：２．５の範囲である組成物。
2. 更にビタミンＥを少なくとも２％（ｗ／ｗ）の濃度で含む、請求項１に記載の組成物。
3. 更に追加のカロテノイド、ビタミンＥ及びポリフェノールからなる群から選択される１つ以上の追加成分を含む、請求項１に記載の組成物。
4. 更にβ−カロテンを含む、請求項１に記載の組成物。
5. 更にカルノシン酸を含む、請求項１に記載の組成物。
6. 前記組成物がトマト由来である、請求項１に記載の組成物。
7. 請求項１に規定されるリコペン、フィトエン及びフィトフルエンの一方または両方、並びにフィトステロールを含む組成物の製造方法であって、
   ａ）５〜２０％（ｗ／ｗ）のリコペンを含むトマト生成物を用意するステップ；
   ｂ）抽出溶媒としてエタノール、イソプロパノール、酢酸エチルまたはアセトンを１：１（溶媒：トマト生成物）を超える比で用いて前記トマト生成物からカロテノイドに富む材料を抽出するステップ；
   ｃ）前記溶媒／トマト生成物混合物を約２５〜６０℃の温度で加熱するステップ；
   ｄ）前記溶媒から結晶性物質を濾過または遠心分離により分離するステップ；及び
   ｅ）ステップ（ｄ）で得た上清を蒸発させて、前記組成物を得るステップ
   を含む方法。
8. 前記溶媒がエタノールである、請求項７に記載の方法。
9. 前記トマト生成物がオレオレジンである、請求項７に記載の方法。
10. 前記トマト生成物がトマトの皮から構成される、請求項７に記載の方法。
11. 薬剤の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
12. 化粧品または機能性化粧品の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物の使用。

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