KR102602826B1 - 감소된 양의 리코펜을 갖는 생물학적-활성 토마토 조성물 - Google Patents

감소된 양의 리코펜을 갖는 생물학적-활성 토마토 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리코펜, 피토엔 및 피토플루엔 중 하나 또는 둘다, 및 피토스테롤을 포함하는 조성물로서, 여기서, 상기 리코펜의 농도는 0.3% 내지 2%(w/w) 범위에 있고, 상기 리코펜 대 피토엔 및 피토플루엔 중 하나 또는 둘다의 중량비가 1:1 내지 1:2.5의 범위에 있는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 제조하는 방법을 포함한다.

Description

감소된 양의 리코펜을 갖는 생물학적-활성 토마토 조성물{Biologically-active tomato composition having reduced amount of lycopene}
본 발명은 식품 가공 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 감소된 양의 리코펜을 갖는 생물학적-활성 토마토 조성물에 관한 것이다.
토마토 생성물은 식품 산업, 및 날로 증가적으로 기능성 식품 및 약용 화장품 조성물의 제조 둘다에 광범위하게 사용된다. US 5,837,311은 특히 고수준의 카로티노이드 리코펜을 함유하는 토마토 올레오레신을 포함하는 토마토-유래된 생성물의 제조를 위한 산업적 공정을 기재한다. 상기 올레오레신 생성물은 또한 토코페롤 및 피토스테롤 뿐만 아니라 피토엔, 피토플루엔 및 베타-카로틴과 같은 카로티노이드를 포함하는 막대한 범위의 추가의 약리학적 활성 성분을 함유한다. 상기 올레오레신 생성물은 시판되고 있고 지금 수년 동안 광범위하게 그리고 성공적으로 사용되어 오고 있고 이것으로 예방되고/되거나 치료될 수 있는 의학적 병태의 범위는 암성 병태 (특히, 전립선 암), 상승된 혈압, 죽상동맥경화증, 피부 병태 및 세포 및 DNA 손상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상기 토마토 올레오레신 제제는 건강 관리 및 질환의 예방에 매우 효과적인 것으로 입증되었지만, 일부 상황에서 예를 들어, 화장학적 또는 약용 화장학적 제제로서 피부 상의 사용이 고려되는 경우 이의 두드러진 적색은 불리할 수 있다.
본 발명의 목적은 Lyc-O-Mato®로서 시판되는 것으로 공지되어 있지만 이의 낮은 리코펜 함량에 의해 훨씬 덜 현저한 적색을 갖는, 상기 언급된 토마토 올레오레신과 유사한 (또는 개선된) 범위의 치료학적 활성을 갖는 토마토-유래된 생성물을 제공함에 의해 상기 문제점에 대한 해결책을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목표 및 목적은 기재됨에 따라 자명해질 것이다.
발명의 요약
본 발명은 주로 리코펜, 및 피토엔 및 피토플루엔 중 하나 또는 둘다를 포함하는, 감소된-리코펜 토마토-유래된 조성물에 관한 것이고, 여기서, 상기 리코펜의 농도는 0.3% 내지 2% (중량/중량)의 범위이고, 상기 리코펜 대 피토엔 및 피토플루엔 중 하나 또는 둘다의 중량비는 1:1 내지 1:2.5의 범위이다. 또한, 상기 조성물은 피토스테롤을 추가로 포함한다.
상기된 조성물의 하나의 바람직한 구현예에서, 상기 피토스테롤 농도는 적어도 2% (중량/중량)이다.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기된 조성물은 적어도 2% (중량/중량) 농도로 비타민 E를 추가로 포함한다.
본 발명의 하나의 바람직한 구현예에서, 피토엔 및 피토플루엔 중 하나 또는 둘다의 농도는 0.25% 내지 3%의 총 농도이다.
본원에 개시된 내용에서, 용어 "감소된-리코펜" 및 "낮은-리코펜" 조성물 등은 상호교환적으로 사용되고, 상기 용어 모두는 이전의 문단에 한정된 카로티노이드 조성물을 갖는 조성물을 언급하는 것으로 이해되어야만 한다.
상기 조성물의 리코펜 함량이 선행 기술 분야의 통상적으로-사용된 토마토 올레오레신 생성물 (Lyc-O-Mato®)과 비교하는 경우 적어도 3배 감소된 사실에도 불구하고, 본 발명의 조성물은 상당한 생물학적 활성 (소염 활성을 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 갖는 것으로 주지되어야 한다. 토마토 올레오레신의 많은 치료학적 효과는 이들의 리코펜 함량에 기인하기 때문에 상기 결과는 전반적으로 예상되지 않았다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 50ppm 미만의 용매 농도를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 또한 추가의 카로티노이드, 비타민 E 및 폴리페놀, 예를 들어, 카르노신산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가의 약리학적-활성 성분을 포함할 수 있다. 추가의 카로티노이드의 바람직한 예는 피토엔, 피토플루엔, 루테인, 제악산틴, 베타-카로틴, 아스탁산틴을 포함한다. 그러나, 다른 카로티노이드는 또한 상기 예시된 것에 추가로 또는 이를 대신하여 조성물에 존재할 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 구현예에서, 감소된-리코펜 조성물은 카르노스산을 추가로 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 감소된-리코펜 조성물은 가용성 토마토 고형분을 추가로 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 베타-카로틴 및 비타민 E를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 언급된 추가의 성분은 하기의 농도 범위로 존재한다: 0.2% 내지 1.0% 베타-카로틴; 2.0% 내지 4% 비타민 E.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기된 조성물은 토마토로부터 제조된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 낮은-리코펜 함량의 토마토-유래된 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 여기서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
1. 5% 내지 20% 리코펜 (예를 들어, US 5,837,311에 기재된 바와 같은)을 포함하는 토마토 생성물을 제공하는 단계.
2. 에탄올, 이소프로필 알콜 (IPA) 또는 아세톤을 포함하는(이에 제한되지 않는), 지질을 용해시키지만 리코펜을 용해시키지 않는, 1:1 (용매:토마토 생성물) 보다 높은 비율, 바람직하게 3:1의 비율로 용매 또는 용매 혼합물을 첨가하는 단계.
3. 약 25℃ 내지 60℃의 온도에서 용매/토마토 추출물 혼합물을 가열하는 단계.
4. 여과 및/또는 원심분리 분리에 의해 용매로부터 결정성 물질을 분리하는 단계.
5. 임의로 대략 70%의 리코펜을 함유하는 결정을 착색제 제형에 혼입하는 단계.
6. 용매를 증발시키는 (이는 이어서 단계 2에 사용하기 위해 재활용될 수 있는) 단계(에탄올의 경우에 바람직하게 50ppm 미만의 에탄올을 갖는 용액을 잔류시키는).
7. 수득한 용액을 예를 들어, 공급 조성물을 첨가함에 의해 요구되는 농도로 표준화시키는 단계.
상기된 방법의 하나의 바람직한 구현예에서, 단계 2에 사용된 용매는 에탄올이다.
상기된 방법의 하나의 바람직한 구현예에서, 용매:토마토 생성물 비율은 4: 1이다.
토마토로부터 유래된 임의의 적합한 카로티노이드-함유 생성물은 상기 방법을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있고, 하나의 고도로 바람직한 구현예에서, 출발 물질로서 사용되는 토마토 생성물은 올레오레신이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 출발 물질로서 사용되는 토마토 생성물은 토마토 껍질(peel)을 포함한다.
본원에 기재된 조성물은 이의 크게 감소된 리코펜 농도(선행 기술 분야의 토마토 올레오레신과 비교하여)에도 불구하고 혈관 조직에서 산화질소(NO)의 생성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 본 발명의 조성물은 혈관 내피에서 내피 산화질소 신타제 효소를 상당히 유도하는 것으로 밝혀졌다.
본원에 기재된 조성물은 또한 예상치않게 항산화제 반응성 요소(ARE) 시스템의 활성을 상당히 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
본원에 기재된 조성물은 추가로 예상치 않게 염증 촉진성 NFkB 전사 시스템을 상당히 억제하는 것으로 밝혀졌다.
상기된 조성물은 많은 상이한 유형의 의학적 병태를 치료하기 위한 약물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 상기 약물은 상승된 혈압을 포함하지만 이에 제한되지 않는 심혈관계의 장애를 치료하는데 사용하기에 적합하다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 약물은 당뇨병 대상체에서 혈관 손상 및/또는 신경병증을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 치료될 병태는 염증 성분을 가짐을 특징으로 한다. 하나의 특히 바람직한 구현예에서, 상기 약물은 혈관 염증을 치료하고/하거나 예방하기 위해 사용된다.
여전히 추가의 바람직한 구현예에서, 신생물 병태의 발병을 예방하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 본원의 상기 언급된 하나 이상의 추가의 활성 성분, 예를 들어, 추가의 카로티노이드, 폴리페놀 (예를 들어, 카르노스산), 비타민 E, 피토스테롤 및 가용성 토마토 고형분 (예를 들어, 펄프-혈청 분리 후 토마토로부터 수득된 혈청을 농축시킴에 의해 제조된 청명한 토마토 농축물 (CTC) 형태로)을 추가로 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 국소 약물의 제조에서 상기 정의된 감소된-리코펜 토마토-유래된 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 양상의 하나의 바람직한 구현예에서, 국소 약물은 화장품 또는 약용 화장품 제제이고 크림, 로션, 연고, 겔 등의 형태로 제조될 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기 화장품 또는 약용 화장품 제제가 선크린제로서 사용되고, 여기서, 상기 약용 화장품 조성물은 또한 PABA, 산화아연, 산화티탄, 시녹세이트, 파디메이트 O 및 페닐벤즈이미다졸 설폰산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 통상의 선스크린 제제를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 토마토-유래된 조성물은 항노화제로서 사용된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 정의된 토마토 조성물은 유일한 활성제로서 사용되고, 다른 경우에, 화장품 또는 약용 화장품 제제는 추가의 활성 성분을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 약물 전달용 약물 및 비경구 전달을 위해 적합한 약물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 전신 투여된 약물의 제조에서 상기 정의된 감소된-리코펜 토마토-유래된 조성물의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명의 조성물은 국소 투여용으로 적합한 약물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
도 1은 낮은-리코펜 함량의 토마토 조성물을 제조하기 위한 방법을 도식적으로 설명한다.
도 2는 본 발명의 낮은-리코펜 조성물을 사용한 치료 후, 혈관 내피 세포에서 NO 수준의 증가를 그래프로 설명한다.
도 3은 본 발명의 낮은-리코펜 조성물을 사용한 치료 후 혈관 내피 세포에서 peNOS 유도 증가를 그래프로 설명한다.
도 4는 본 발명의 낮은-리코펜 조성물에 의해 유발된 LNCaP 전립선 암 세포에서 ARE 활성 증가를 그래프로 도시한다.
도 5는 본 발명의 낮은-리코펜 조성물에 의해 유발된 T47D 유방암 세포에서 ARE 활성의 증가를 그래프로 도시한다.
도 6은 본 발명의 낮은-리코펜 조성물에 의해 유발되는 T47D 유방암 세포에서 NFkB 전사 시스템의 억제를 그래프로 도시한다.
상기된 바와 같이, 본 발명은 감소된 리코펜 토마토 생성물을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 조성물을 제조하기 위한 공정의 반응식은 도 1에 요약되어 있고 다음의 단계를 포함한다:
단계 1: 5% 내지 20% 리코펜(예를 들어, US 5,837,311에 기재된 바와 같은 올레오레신, 또는 토마토 껍질)을 포함하는 토마토 생성물을 제공하는 단계.
단계 2: 에탄올 또는 이소프로판올 또는 아세톤과 같은, 지질을 용해시키지만 리코펜을 용해시키지 않는 용매 또는 용매 혼합물을 1:1 (용매:토마토 생성물)의 비율, 바람직하게 3:1 또는 4:1의 비율로 첨가하는 단계.
단계 3: 약 25℃ 내지 60℃의 온도에서 용매/토마토 추출물 혼합물을 가열하는 단계.
단계 4: 여과 또는 원심분리 분리에 의해 용매로부터 결정성 물질을 분리하는 단계.
단계 5: 임의로 대략 70%의 리코펜을 함유하는 결정을 착색제 제형으로 혼입하는 단계.
단계 6: 용매 (바람직하게 50ppm 미만의 용매를 갖는 용액을 잔류시키는)를 부분적으로 증발시키는 (이는 이어서 단계 2에 사용하기 위해 재활용될 수 있는) 단계.
단계 7: 공급 조성물을 첨가함에 의해 수득한 용액을 요구되는 농도로 표준화시키는 단계.
약제학적 조성물
임의로 다른 카로티노이드 및/또는 추가의 제제와 배합된 활성제, 리코펜 및 피토엔/피토플루엔은 단독으로 투여될 수 있지만, 이들 화합물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물로 투여된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 화합물의 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 촉진시키는, 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하는 통상의 방식으로 제형화될 수 있다. 상기 활성제는 약제학적 조성물로서 제형화되고 인간 환자와 같은 포유동물 대상체에게 액체, 고체 및 반고체와 같은 다양한 형태로 투여된다. 약제학적 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로, 예를 들어, 경구로, 국소적으로, 비경구로, 경점막으로, 경피로, 근육내로, 정맥내로, 피내로, 피하내로, 복강내로, 심실내, 두개내 또는 종양내로 대상체에게 투여될 수 있다. 경구 투여를 위해, 상기 화합물은 활성 화합물을 당업계에 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 배합함에 의해 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 정제, 카플렛(caplet) 캡슐제, 미세캡슐제, 펠렛, 환제, 산제, 시럽, 겔, 슬러리, 과립, 현탁제, 분산제, 에멀젼, 액체, 용액, 드라제, 비드 및 비들렛을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 고체 또는 액체 투여 형태로 제형화될 수 있다. 경구 조성물은 속방출 제형으로서 또는 미리 결정된 시기 동안 활성 성분(들)의 연장된 방출을 가능하게 하는 서방성 또는 지연된 방출 제형으로서 제형화될 수 있다.
고체 제형을 위해 적합한 부형제는 충전제, 예를 들어, 락토스, 슈크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당; 전분 기반 부형제, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등, 겔라틴, 트라가칸트 고무, 미세결정성 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 메틸하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 등의 셀룰로스 기반 부형제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리비닐피롤리돈 (PVP) 및 가교 결합된 PVP와 같은 중합체가 또한 사용될 수 있다. 추가로, 상기 조성물은 추가로 결합제(예를 들어, 아카시아, 옥수수전분, 겔라틴, 카보머, 에틸 셀룰로스, 구아 검, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 포비돈), 붕해제 (예를 들어, 옥수수전분, 감자 전분, 알긴산, 이산화규소, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 구아 검, 나트륨 전분 글리콜레이트), 계면활성제(예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트), 및 윤활제(예를 들어, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트)를 포함할 수 있다.
액체 제형에 대해, 약제학적으로 허용되는 담체는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 오일일 수 있다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 주사가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하고 식염수 및 완충 매질을 포함한다. 오일의 예는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 광유, 올리브유, 해바라기유 및 어간유(fish-liver oil)가 있다.
바람직한 경구 약제학적 조성물은 겔라틴, 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제로 구성된 연질의 밀봉된 캡슐 뿐만 아니라 겔라틴으로 구성된 캡슐을 포함한다. 연질의 캡슐에서, 활성 화합물은 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 액체 중에 용해되거나 현탁될 수 있다. 추가로, 안정화제가 첨가될 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 캡슐은 동물 기원의 성분을 배제하고 채식주의자 및 절대 채식주의자에게 허용가능하다.
연질의 겔라틴 캡슐 및 이들을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 비제한적인 예는 미국 특허 제6,217,902호; 제6,258,380호; 제5,916,591호, 및 제4,891,229호에서 찾을 수 있고, 상기 모든 문헌은 본원에 참조로 인용된다.
당업자에게 공지된 다른 허용가능한 부형제 및 첨가제는 본 발명의 조성물에 포함될 수 있고, 예를 들어, 안정화제, 가용화제, 긴장성 증진제, 완충 물질, 방부제, 증점제, 복합제 및 다른 부형제, 및 추가의 치료학적 제제가 있다.
가용화제는 예를 들어, 틸록사폴, 지방산 글리세롤 폴리에틸렌 글리콜 에스테르, 지방산 폴리에틸렌 글리콜 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 에테르 또는 상기 화합물의 혼합물일 수 있다. 가용화제의 특정 예는 폴리옥시에틸화된 캐스터 오일, 예를 들어, 시판 제품 Cremophor® 또는 Cremophor® RH40이다. 가용화제의 또 다른 예는 틸록사폴이다. 사용되는 농도는 특히 활성 성분의 농도에 의존한다. 부가된 양은 전형적으로 활성 성분을 가용화하는데 충분하다. 예를 들어, 가용화제의 농도는 활성 성분 농도의 0.1 내지 5000배이다.
완충 물질의 예는 아세테이트, 아스코르베이트, 보레이트, 탄산수소/카보네이트, 시트레이트, 글루코네이트, 락테이트, 포스페이트, 프로피오네이트 및 TRIS (트로메타민) 완충제이다. 부가되는 완충 물질의 양은 예를 들어, 생리학적으로 허용되는 pH 범위를 보장하고 유지하기 위해 필요한 양이다. pH 범위는 전형적으로5 내지 9의 범위, 바람직하게 5.2 내지 8.5의 범위이다.
본 발명의 조성물은 비-독성 부형제, 예를 들어, 유화제, 습윤제 또는 충전제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG200, 300, 400 및 600) 또는 Carbowax® (CarbowaxlOOO, 1500, 4000, 6000 및 10000)을 추가로 포함할 수 있다. 목적하는 경우 사용될 수 있는 다른 부형제는 하기에 열거되어 있지만 이들은 어떠한 방식으로든지 가능한 성분의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이들은 복합제, 예를 들어, 이나트륨-EDTA 또는 EDTA 5 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산, 아세틸시스테인, 시스테인, 아황산수소나트륨, 부틸-하이드록시아니졸, 부틸-하이드록시톨루엔; 안정화제, 상기 티오우레아, 티오소르비톨, 나트륨 디옥틸 설포숙시네이트 또는 모노티오글리세롤; 또는 다른 부형제, 예를 들어, 라우르산 소르비톨 에스테르, 메탄올 아민 올레에이트 또는 팔미트산 에스테르일 수 있다.
투여될 조성물의 양은 물론 치료될 대상체, 고통의 중증도, 투여 방식 및 처방 담당의의 판단을 포함하는 많은 인자에 의존한다. 그러나, 사용되는 용량은 일반적으로 환자의 연령 및 성별, 및 치료될 질환의 중증도를 포함하는 많은 인자들에 의존한다.
바람직하게, 상기 제제는 단위 용량 형태이고, 이는 경구 투여용으로 의도된다. 상기 형태에서, 상기 제제는 적당양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 세분된다. 상기 단위 용량 형태는 팩키징된 제제, 구분된 양의 제제를 함유하는 팩키지, 예를 들어, 정제, 캡슐 및 바이엘 또는 앰푸울 중 산제일 수 있다. 단위 투여 형태는 또한 캡슐, 카쉐 또는 정제 자체일 수 있거나 팩키징된 형태의 적당수의 임의의 것들일 수 있다.
본 발명의 조성물의 용량 투여 스케줄은 활성 성분의 특정 적용 및 효능에 따라 다양할 수 있다. 적당한 투여 용량의 결정은 당업자 기술 범위 내에 있다. 편의를 위해, 단일 하루 용량이 바람직하다. 대안적으로, 총 하루 투여 용량은 세분될 수 있고 하루에 2회, 하루에 3회 등과 같은 하루 동안에 분획으로 투여될 수 있다. 격주, 매주, 격월 및 매월 투여가 또한 고려된다.
본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 기재되고 이것은 단지 설명을 목적으로 제공되고 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
제조 실시예 1
본 발명의 낮은-리코펜 농도의 토마토-유래된 조성물의 제조 방법
본 발명의 낮은-리코펜 농도 조성물은 하기의 공정 단계에 따라 제조하였다:
1. 하기의 조성물을 갖는 토마토 올레오레신은 문헌[참조:US 5,837,311]에 기재된 공정에 따라 제조하였다:
10.1% 리코펜
1.7% 피토엔 및 피토플루엔
2.5% 피토스테롤
2.5% 비타민 E
82.7% 유리된 지방산
0.5% 물
(상기 제제는 제조원[LycoRed Ltd. of Be'er Sheva, Israel]에 의해 제조된 상표명 Lyc-O-Mato®하에 구입될 수 있음을 주지해야 한다.)
2. 단계 1에 따라 제조된 100ml의 토마토 올레오레신을 300ml의 98% 에탄올을 함유하는 혼합 용기에 첨가하고 0.5시간 동안 40℃에서 혼합하였다.
3. 에탄올 용매로부터 결정성 물질을 분리하기 위해 프레스 필터를 사용하였다. 상기 분리는 85% 리코펜 및 15% 지방산을 포함하는 10.94g의 결정성 물질을 생성시켰다.
4. 단계 3으로부터 여과물은 이어서 증발시켜 에탄올 대부분을 제거하고, 하기의 조성을 갖는 89g의 용액(이는 본 발명의 낮은-리코펜 생성물이다)이 잔류한다:
2.0% 리코펜
2.2% 피토엔 및 피토플루엔
2.8% 피토스테롤
2.8% 비타민 E
실험 실시예
일반 방법
세포 배양 및 처리
1차 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)는 탯줄로부터 분리하였다. 세포는 0.1% 콜라겐아제 처리(Worthington, Lakewood, NJ, USA)에 의해 수거하였다. HUVEC는 20% BCS 및 EA.hy926에 대해 기재된 바와 같은 다른 보충물을 갖는 M-199 배지 중에서 0.2% 겔라틴 예비-코팅된 조직-배양 플라스크(Corning, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA) 상에서 성장시켰다. EA.hy926 세포는 37회 계대때까지 사용하였고, HUVEC는 3 내지 8회 계대에 사용하였다. U937 단핵구는 앞서 특정된 바와 같이 10% BCS, L-글루타민 및 항생제를 갖는 RPMI 1640 배지 중에서 배양하였다. 대부분의 실험에 대해, 70 내지 90% 컨플루언스에서 내피 세포는 24시간 동안 5% BCS DMEM/M199 배지에서 고갈시키고 18 내지 24시간 동안 5% BCS DMEM/M199 중에서 비히클 또는 카로티노이드 용액과 예비 항온처리하고, 특정 시간 동안 10ng/mL의 TNF-α(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)로 활성화시켰다.
카로티노이드 용액
6% 또는 7% 리코펜, 0.1% β-카로틴, 1% 비타민 E 및 폴리페놀을 함유하는 올레오레신(Lycored Natural Products Ltd., Beer-Sheva, Israel)의 스톡 용액 (400uM) 및 본 발명의 낮은-리코펜 조성물 (상기 제조 실시예 1에 따라 수득된 바와 같은)은 항산화제로서 0.025% 부틸화된 하이드로하이톨루엔 (BHT)을 함유하는 새로운 테트라하이드로푸란 (THF)(둘다 제조원(Sigma, St. Louis, MO, USA)으로부터) 중에서 제조하고 N2 기류 및 감소된 밝기 하에 배양 배지에 첨가하였다.
실험 실시예 1
산화질소 (NO)의 발현에 대한 본 발명의 낮은-리코펜 농도의 토마토-유래된 조성물의 효과
NO는 많은 생물학적 공정 및 조직에서 주요 신호 전달 분자이다. 혈관 조직의 경우에, 내피는 주변의 평활근이 이완되도록하는 신호를 전달함에 따라서 혈관 확장시키고 혈류를 증가시키기 위해 산화 질소를 사용한다. NO는 추가로 혈관 평활근 성장, 혈소판 응집 및 백혈구의 내피 세포로의 접착을 억제함에 의해 혈관 기능에서의 역할을 수행한다. 심혈관 병변(예를 들어, 죽상동맥경화증, 당뇨병 또는 고혈압과 같은)의 존재를 특징으로 하는 많은 인간 질환의 경우에, 손상된 NO 경로 기능이 흔히 발견될 수 있다.
본 연구에서, 배양된 인간 관상 내피 세포 모델을 사용하여 NO의 유도에 대한 본 발명의 낮은-리코펜(2%) 농도 조성물의 효과를 평가하였다. 이것은 배양된 세포에 의한 NO 생성의 직접적인 측정 및 내피 세포 NO 신타제 효소인 peNOS의 활성 분석 둘다에 의해 성취되었다. 본 발명의 조성물로 성취된 결과는 높은-리코펜 토마토-유래된 조성물, 7% Lyc-O-Mato(제조원(LycoRed Ltd., Be'er Sheva, Israel)에 의해 제조되고 공급된)의 사용으로 수득된 결과와 비교하였다.
방법 및 재료:
본 발명의 낮은-리코펜 (2%) 조성물 (상기된 바와 같이 제조된) 및 다양한 대조군 용액 (배지, THF 및 7% Lyc-O-Mato)은 컨플루언트 배양된 인간 관상 내피 세포 (60mm 디쉬 당 2ml의 내피 세포 기저 배지에 플레이팅됨)에 24시간 동안 첨가하고 이후 상등액 배양 유체를 수거하였다.
니트레이트 및 니트라이트 분석
산화질소의 안정한 산화된 생성물인 니트라이트 및 니트레이트(NOx)는 문헌[참조: Miranda KM, Espey MG and Wink DA, 2001 (Nitric Oxide 5: 62-71; "A rapid, simple spectrophotometric method for simultaneous detection of nitrate and nitrite")]에 기재된 방법을 사용하여 그리스 시약 (Greiss reagent)을 사용한 카로티노이드로의 노출 24시간 후 수거된 배양 배지에서 측정하였다.
실험은 주지된 바와 같은 가온실에서 실온에서 또는 37℃에서 수행하였다.
peNOS 분석
내피 NO 신타제 효소인 peNOS의 발현은 당업계에 공지된 것 뿐만 아니라 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 평가하였다. 간략하게, 내피 세포 용해물의 단백질 함량은 BCA 단백질 검정 키트 (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량하였다. 동등한 양의 세포 단백질은 7.5% SDS-PAGE에 의해 분리하고 니트로셀룰로스 막에 블롯팅하였다. 1차 peNOS 항체를 사용한 차단 및 항온처리 후, 단백질 함량에서의 상대적 변화는 반사율 방식의 밀도 측정기를 사용하여 정량하였다.
결과
도 2에 도시된 바와 같이, 5.0μΜ의 농도로 사용되는 경우, 본 발명의 낮은-리코펜 (2%) 조성물은 배지 및 THF 대조군 둘다와 비교할때 NO 유도 수준을 상당히 증가시켰다. 예상치 않게, 7% Lyc-O-Mato은 또한 NO 발현에서 측정가능한 증가를 유발하였지만 이와 관련하여 본 발명의 조성물 보다 (대략 4의 인자 만큼) 훨씬 덜 활성이었다.
도 3은 배양된 내피 세포에서 peNOS 수준의 웨스턴 블롯 분석으로부터 수득된 결과를 제공한다. 따라서, 상기 도면으로부터 본 발명의 낮은 리코펜 (2%) 조성물 (1.0μΜ로 사용된)이 배지 및 THF 대조군 둘다와 비교하여 peNOS를 고도로 상당히 유도하였음을 알 수 있다. 상기 결과는 처리되지 않은 세포와의 비교시에 peNOS 발현에서 임의의 증가를 유발하지 않았던, 7% Lyc-O-Mato (1.0μΜ)를 사용하여 수득된 결과와는 현저히 상이하다.
이들 결과로부터 본 발명의 낮은-리코펜 농도 조성물이 혈관 내피 세포에서 NO의 유도를 상당히 증가시킬 수 있고 상기 효과가 적어도 부분적으로 상기 세포에서 NO 신타제 효소의 증가된 발현에 의해 유발되는 것으로 결론지을 수 있다. 이들 결과의 관점에서, 본 발명의 시스템의 조성물이 다양한 유형의 심혈관 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있는 관련 활성을 갖는 것으로 결론지을 수 있다.
실험 실시예 2
본 발명의 낮은-리코펜 농도의 토마토-유래된 조성물에 의한 ARE 전사 시스템의 자극
항산화제 반응성 요소 (ARE)는 유전자 프로모터에서 동정되고 화학보호 반응 시스템을 포함하는 유전자 배터리의 전사 유도를 매개한다. 상기 시스템은 광범위한 세트의 카르시노겐에 대한 내성을 위해 필수적이다. 추가로, 세포보호 ARE-조절된 유전자의 활성은 염증 반응을 억제할 수 있는 반면, 이들 유전자의 감소된 발현은 자가면역 질환 및 산화제 공격에 대한 증진된 염증 반응을 유도한다. 따라서, 상기 ARE 모델은 또한 시험된 조성물의 소염 효과를 결정하기 위해 사용된다.
본 연구의 목적은 ARE 시스템에서 본 발명의 감소된-리코펜(0.7% w/w) 변형된 올레오레신 조성물의 활성을 평가하는 것이었다. 본 조성물을 사용하여 수득된 결과는 등몰 농도의 리코펜에 존재하는, LycoMato (6% 또는 7% 리코펜을 함유하는)를 사용하여 수득된 것들과 비교하였다.
방법 및 재료:
유방 (T47D) 및 전립선 (LnCAP) 암 세포 둘다를 사용한 세포 배양 모델을 사용하여 ARE 시스템에 대한 상기 개시된 바와 같이 제조된 본 발명의 낮은 리코펜 조성물의 활성을 평가하였다. 상기 낮은 리코펜 조성물은 0.7% 리코펜, 1.7% 피토엔/피토플루엔, 2.4% 피토스테롤 및 2.5% 비타민 E를 포함하였다. 2개의 시판되는 높은-리코펜 조성물(LycoMato 6% 및 LycoMato 7%; 제조원(LycoRed Ltd., Be'er Sheva, Israel)에 의해 제조된)은 또한 비교 목적을 위해 시험하였다.
세포 배양
인간 전립선 암 세포인 LNCaP는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (Manassas, VA, USA)으로부터 구입하였고 나트륨 피루베이트(0.11 mg/ml) 및 DHT (10-9M)를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 성장시켰다. 각각의 배지에, 페니실린 (100 단위/ml), 스트렙토마이신 (0.1 mg/ml), 니스타틴 (12.5 μg/ml), Hepes (10 mM), 및 10% FCS를 첨가하였다.
인간 유방 암 세포주인 T47D는 이아파 키다르 박사(Dr. Iafa Keydar) (Tel Aviv University, Israel)에 의해 선의로 제공되었다. T47D 세포는 인슐린(0.6 μg/ml 또는 6 μg/ml)을 함유하는 DMEM 중에서 성장시켰다.
일시적 형질감염 및 ARE 리포터 유전자 검정
T47D 세포는 24-웰 플레이트 (웰 당 100,000 세포) 중에서 jet PEI 시약 (Polyplus Transfection, Illkrich, France)을 사용하여 형질감염시켰다. 세포는 무혈청의 적당한 배양 배지로 1회 세정하고 이어서 3% DCC-FCS, 및 1:5 충전 비율로 DNA 및 jetPEI 시약을 함유하는 50㎕의 혼합물을 함유하는 0.45ml의 배지를 첨가하였다. DNA의 총량은 0.2 μg의 수용체 및 0.05 μg의 레닐라 루시페라제를 함유하여 0.25μg이었다. 이어서 상기 세포는 95%의 공기/5% C02 중에서 37℃에서 4 내지 6시간 동안 배양하였다. 배지는 3% DCC-FCS + 시험 화합물이 보충된 것으로 대체하고, 세포는 또 다른 16시간 동안 배양하였다.
LNCaP 세포는 jetPEI 시약을 사용하여 형질감염시켰다. 세포(70,000)는 페놀 레드가 없는 3% DCCFCS를 함유하는 1mL의 배지에 씨딩하였다. 다음 날에, 500㎕의 배지를 제거하고 1:10의 충전비로 DNA 및 jetPEI 시약을 함유하는 50㎕의 혼합물을 첨가하였다. DNA의 총량은 0.16 μg의 리포터 및 0.04 μg의 레닐라 루시퍼라제 벡터를 함유하여 0.2μg이었다. 세포는 4 내지 6시간 동안 항온처리하고 이어서 24시간 동안 시험 화합물을 첨가하였다.
ARE 활성 평가를 위한 루시퍼라제 리포터 검정
세포 추출물은 제조업자의 지침에 따라 루시퍼라제 리포터 검정 (이원 루시퍼라제 리포터 검정 (DLR™) 시스템, Promega)을 위해 제조하였다. 이원-루시퍼라제 리포터 검정 시스템은 이원-리포터 검정을 수행하는 효율적인 수단을 제공한다. DLR™ 검정에서, 반딧불이 (포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)) 및 레닐라 (레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis), 또한 산호류로서 공지된) 루시퍼라제의 활성은 연속적으로 단일 샘플로부터 측정한다. 반딧불이 루시퍼라제 리포터는 먼저 루시퍼라제 검정 시약 II (LAR II)를 첨가하여 안정화된 발광성 신호를 생성하여 측정한다. 반딧불이 발광을 정량한 후, 상기 반응을 켄칭시키고 레닐라 루시퍼라제 반응은 Stop & Glo® 시약을 동일한 튜브에 첨가함에 의해 동시에 개시한다. Stop & Glo® 시약은 또한 측정 과정 동안에 서서히 쇠퇴하는 레닐라 루시퍼라제로부터 안정화된 신호를 생성한다.
결과
도 4에 입증된 바와 같이, 본 발명의 낮은-리코펜 조성물은 등몰 농도의 리코펜에서 비교되는 경우 LNCaP 전립선 암 세포에서 Lyc-O-Mato 보다 상당히 큰 ARE 활성을 유도한다. 관찰된 효과는 용량-의존성이다. 곡선의 굴절점 초과에서(약 10 μΜ), ARE 유도와 관련하여 현재 청구된 조성물과 Lyc-O-Mato 간의 차이는 보다 상당하다.
도 5에 도시된 바와 같이, 유사한 결과는 또한 본 발명의 조성물이 T47D 유방 암 세포에 첨가되는 경우 수득된다. 따라서, 전립선 암 세포를 사용하여 수득된 결과의 경우에서와 같이, 현재 청구된 조성물은 Lyc-O-Mato 대조군을 사용하여 나타나는 것 보다 ARE 시스템에서 상당히 큰 활성을 유도하였다.
이들 결과로부터 본 발명의 낮은-리코펜 농도 조성물이 ARE 활성의 고도의 활성 유도제인 것으로 결론지을 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 암의 예방 및 염증의 감소 둘다에 매우 중요한 세포 기구에 영향을 주기 위한 잠재력을 갖는다.
실험 실시예 3
본 발명의 낮은-리코펜 농도의 토마토-유래된 조성물에 의한 NFkB 전사 시스템의 억제
효소 단백질 발현 뿐만 아니라 염증 사이토킨의 발현은 발병 만성 염증 질환의 여러 양상에 중요하게 관여하는 전사 인자 핵 인자-카파 B(NFκB)의 활성화에 의해 조절될 수 있다. NFκB는 ΙκΒ 키나제 (IKK)의 활성화를 통한 ΙκΒ 단백질의 인산화, 유비퀴틴화 및 후속적 단백질용해 분해의 결과로서 활성화된다. 유리된 NFκB는 핵으로 전위하고 유도성 산화질소 신타제(iNOS)와 같은 염증 촉진 유전자 및 사이클로옥시게나제 2 (COX2) TNF-α, 및 IL-Ιβ의 프로모터에서 모티프에 결합하여, 이들의 mRNA 발현의 유도를 유발한다. 이전에 개발된 많은 소염 약물은 NFκB 활성화 경로를 억제함에 의해 이들 유전자의 발현을 억제하는 것으로 나타났다.
따라서, NFκB 억제제는 염증 관련 인간 질환을 조절하기 위한 임상적 적용에서 잠재적 치료학적 약물로서 유용할 수 있다.
본 연구의 목적은 본 발명의 낮은-리코펜 조성물이 T47D 유방암 세포에서 NFκB 전사 시스템을 억제할 수 있는지를 조사하는 것이었다.
본 연구 결과는 도 6에 나타낸다. 본 도면으로부터 본 발명의 낮은-리코펜 조성물이 6% Lyc-O-Mato 대조군 보다 T47D 유방암 세포에서 NFκB 전사 시스템의 상당히 큰 억제를 유발함을 알 수 있다. 이들 결과는 본 발명을 위한 낮은-리코펜 조성물의 고수준의 소염 활성에 대한 추가의 증거를 제공한다.

Claims (14)

  1. 리코펜, 피토엔 및 피토플루엔 중 하나 또는 둘다, 및 피토스테롤을 포함하는, 소염 활성이 있는 기능성 식품 조성물로서, 여기서, 리코펜의 농도는 0.3% 내지 2% (w/w)의 범위에 있고 상기 리코펜 대 피토엔 및 피토플루엔 중 하나 또는 둘다의 중량비는 1:1 내지 1:2.5의 범위에 있는, 기능성 식품 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 피토스테롤의 농도는 적어도 2% (w/w)인, 기능성 식품 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 적어도 2% (w/w)의 농도로 비타민 E를 추가로 포함하는 기능성 식품 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 추가의 카로티노이드, 비타민 E, 및 가용성 토마토 고형분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 성분들을 추가로 포함하는 기능성 식품 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 베타-카로틴을 추가로 포함하는 기능성 식품 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 가용성 토마토 고형분을 추가로 포함하는 기능성 식품 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 토마토로부터 제조되는, 기능성 식품 조성물.
  9. 제 1항에 정의된 리코펜, 피토엔 및 피토플루엔 중 하나 또는 둘다 및 피토스테롤을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 여기서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는 방법:
    a) 5% 내지 20% 리코펜(w/w)을 포함하는 토마토 생성물을 제공하는 단계로서, 토마토 생성물이 토마토 올레오레신인, 단계;
    b) 추출 용매로서 1:1 (용매:토마토 추출물) 보다 높은 비율로 에탄올, 이소프로판올, 에틸 아세테이트 또는 아세톤을 사용하여 상기 토마토 생성물로부터 카로티노이드-풍부 물질을 추출하는 단계;
    c) 약 25℃ 내지 60℃의 온도에서 용매/토마토 추출물 혼합물을 가열하는 단계;
    d) 여과 또는 원심분리 분리에 의해 용매로부터 결정성 물질을 분리하는 단계; 및
    e) 단계 d)에서 수득된 상등액을 증발시켜 상기 토마토 조성물을 수득하는 단계.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 용매가 에탄올인, 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
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