JP6815411B2 - 自己発光部材を送達可能なマイコバクテリウムファージ及びその使用 - Google Patents
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本発明の別の目的は、上記ファージミドの細菌検出及び/又はその薬剤感受性の検出における使用を提供することである。
宿主細菌を自己発光させることができるファージミドであって、
前記ファージミドに宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列を含み、前記塩基配列に発光に必要な遺伝子LuxCDABEを含むファージミド。
さらに、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、トランスポゾンシステム、耐性遺伝子及び/又はプロモーターをさらに含む。
さらに、前記トランスポゾンシステムは、宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列を宿主ゲノムに転移する。
さらに、前記トランスポゾンシステムは、Himar1 mariner、TnAファミリーから選択される1種である。
さらに、前記耐性遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子Hyg、カナマイシン耐性遺伝子Kan、チオスポリン耐性遺伝子Tsr、アプラマイシン耐性遺伝子Aprから選択される少なくとも1種である。
さらに、前記プロモーターは、宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列が宿主ゲノムのあるサイトに転移したときに、該サイトの前後の遺伝子の正常発現を保証するためのものである。
さらに、前記プロモーターは、プロモーターMop、G13、Hsp60、A37から選択される少なくとも1種である。
さらに、前記トランスポゾンシステムは、トランスポザーゼ遺伝子及び逆方向反復配列を含み、
前記耐性遺伝子は遺伝子LuxCDABEと結合し、LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子断片の両端にプロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーターと記するプロモーターが結合され、プロモーターは、トランスポゾンが宿主ゲノムのあるサイトに転移したときに、該サイトの前後の遺伝子の正常発現を保証するためのものであり、
前記プロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーター断片の両端に、それぞれトランスポゾンシステムにおける2つの逆方向反復配列が結合されることにより、トランスポザーゼの作用でプロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーター断片を宿主ゲノムに転移することを実現する。
さらに、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、大腸菌内で複製可能な複製開始点をさらに含むことにより、前記塩基配列は、プラスミド又はファージミド内で大量に複製することができる。
さらに、上記複製開始点はoriEである。
さらに、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、CosAサイトをさらに含む。
さらに、前記宿主細菌を自己発光させることができる目的塩基配列に、ファージミド骨格と相同組換えすることができる組換えサイトをさらに含むことにより、前記塩基配列をファージミド骨格内に結合することができる。
さらに、前記ファージミド骨格は、ファージミドphAE159に由来する。
さらに、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列は、SEQ ID NO:1に示される。
さらに、前記ファージミドに、phAE159骨格をさらに含み、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列は、phAE159骨格の2つの組換えサイトの間に位置する。
上記ファージミドの製造方法では、遺伝子LuxCDABEを含む目的断片と組換えできるようにファージミド骨格を線状配列に酵素消化し、酵素消化されたファージミド骨格と遺伝子LuxCDABEを含む目的断片とを混合して共に大腸菌コンピテントセルに導入し、大腸菌内で組換え、増幅を行い、陽性組換え大腸菌のプラスミドを抽出することにより、ファージミドを得る。
さらに、上記ファージミドの製造方法において、制限酵素PacIでファージミド骨格phAE159を消化し、酵素消化された大断片生成物を回収し、回収された生成物とSEQ ID NO:1に示される塩基断片とを混合して共に大腸菌コンピテントセルに導入し、陽性組換え大腸菌のプラスミドを抽出することにより、ファージミドを得る。
さらに、SEQ ID NO:1に示される塩基断片の製造方法は、以下のステップ(1)〜(8)を含む。
ステップ(1):pUCF2プラスミドの構築
SEQ ID NO:2に示されるF0断片を人工合成し、F0断片をpUC19担体に結合することでpUCF0プラスミドを得、制限酵素XbaIでpUCF0プラスミドを消化し、約2.8kbの断片を回収し、XbaIで消化されたハイグロマイシン耐性遺伝子Hygを含む断片と回収された約2.8kbの断片とを結合することにより、約3.9kbのプラスミドpUCF2を得る。
ステップ(2):pUCF3プラスミドの構築
SEQ ID NO:3に示されるF1断片を人工合成し、F1断片をpUC19担体に結合することでpUCF1プラスミドを得、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF1プラスミドを消化し、約2.7kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF2を消化し、約1.3kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4kbのプラスミドpUCF3を得る。
ステップ(3):pUCRLlux2Pプラスミドの構築
制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpUCF3を消化し、約3.9kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpluxOKを消化し、約6.3kbの断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約10.2kbのプラスミドpUCRLlux2Pを得る。
ステップ(4):プラスミドpYUBTの構築
ファージMycoMarT7からトランスポザーゼのトランス遺伝子配列を増幅し、トランス遺伝子の5’端にNcoI酵素消化サイトを増加し、3’端にSpeI酵素消化サイトを増加し、増幅された生成物をNcoI及びSpeIで消化した後、約1kbの断片を回収し、プラスミドpYUB854を制限酵素NcoI及びSpeIで消化した後、約3.8kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドpYUBTを得る。
ステップ(5):プラスミドpYUOKの構築
プラスミドpUCRLlux2Pを制限酵素NcoI及びSpeIで消化し、約7.6kbの断片を回収し、制限酵素NcoI及びXbaIでプラスミドpYUBTを消化し、約2.9kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約10.5kbのプラスミドpYUOKを得る。
ステップ(6):プラスミドp159LARTの構築
SEQ ID NO:4に示される塩基断片を合成し、担体pUC19に結合することでプラスミドp159LRを得、プラスミドp159LRをNheIで消化して回収し、増幅して両端にNheI酵素消化サイトを有するApr遺伝子断片を得、該断片を制限酵素NheIで消化して回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドp159LARTを得る。
ステップ(7):プラスミドpYUOKLARTの構築
制限酵素PacIでプラスミドpYUOKを消化し、約10.5kbの断片を回収し、制限酵素PacIでプラスミドp159LARTを消化し、約2kb断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約12.5kbのプラスミドpYUOKLARTを得る。
ステップ(8):SEQ ID NO:1に示される塩基断片の取得
制限酵素SmaIでプラスミドpYUOKLARTを回収し、酵素消化された大断片生成物を回収することにより、SEQ ID NO:1に示される塩基断片を得る。
上記の何れかのファージミドを含む自己発光部材を送達可能なファージ。
上記の何れかファージミドの、宿主細菌検出及び/又は薬剤感受性検出における使用。
さらに、上記細菌はマイコバクテリウムである。
さらに、前記マイコバクテリウムは、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・マリヌム及びカルメット-ゲラン桿菌を含む。
上記ファージの、宿主細菌検出及び/又は薬剤感受性検出における使用。
上記ファージによる宿主細菌の検出方法は、
ファージを含む液体を検出されるサンプルに加えるステップ(1)と、
36.5〜42℃で35min以上培養し、蛍光照度計により発光を検出するステップ(2)と、
陰性対照群と比較した結果、顕著な蛍光を発した場合に、サンプルに大量の生きているマイコバクテリウムを含むことを示す一方、発した蛍光の強度がファージを加えていない陰性対照群の蛍光強度の120%よりも低い場合に、ファージを死滅させる試薬SKを加えることにより、ゲノムにおける、マイコバクテリウムに入っていない前記ファージを死滅させるステップ(3)であって、前記試薬SKは、過硫酸アンモニウム、硫酸第一鉄、硫酸アンモニア、硫酸第一鉄アンモニウムから選択される少なくとも1種であるステップ(3)と、
中和剤SNを加えて過剰な試薬SKを中和し、指示菌を加え、20〜32℃で12h以上培養するステップ(4)であって、前記中和剤SNは、MgSO4、重クロム酸カリウム、CaCl2、MnCl2から選択される少なくとも1種であるステップ(4)と、
蛍光照度計により指示菌を加えた後のサンプルの発光を検出した結果、サンプルが発光した場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していたことを示す一方、サンプルが発光しなかった場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していなかったことを示すステップ(5)と、
を含む。
さらに、前記指示菌は、上記ファージの宿主であり、前記ファージは該宿主内で増幅し続け、細胞を溶解することができる。
上記ファージによる、宿主細菌の薬剤感受性の検出方法は、
ファージと宿主細菌とを混合すると同時に、一定濃度の検出される薬物を添加するステップ(1)と、
36.5〜42℃で少なくとも2h培養した後、蛍光照度計により発光を検出するステップ(2)と、
検出されたサンプルの発光値と薬物を添加していないサンプルの発光値との間に顕著な差異がある場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して敏感であることを示す一方、顕著な差異がない場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して薬剤耐性を有することを示すステップ(3)と、
を含む。
1)本発明は、合成生物学を利用し、DNAの人工合成、遺伝子工学及び分子生物学等の手段により、新規な人工マイコバクテリウムファージ(ARP)を成功に構築した。ARPは、温度感受性ファージであり、30℃以下の場合に宿主を溶解できるが、37〜42℃の場合に宿主を溶解しない。ARPは、自己発光遺伝子部材を送達することにより、その宿主となるマイコバクテリウムに対応するタンパク質(酵素)を発現させる。これらの酵素は、生きている宿主菌の代謝生成物により発光反応に必要な基質及び反応に必要な酵素を循環に産生する。したがって、いずれの基質を添加しなくても、生きている宿主菌は発光することができる。本発明のARPの担った自己発光部材は、効率的なトランスポゾンに存在するため、転移部材に伴って効率的に宿主のゲノムにランダムに挿入されることができる。それによって、宿主の遺伝子を破壊できる一方、遺伝子を破壊された宿主菌は自己発光することができ、自己発光という特徴を利用して破壊された宿主遺伝子の機能を効率的に研究することができる。重要なのは、本発明のARPは、サンプルにおける生きている宿主菌を迅速に検出でき、宿主菌の薬物に対する感受性を迅速することができることである。このような診断及び検出は、市販されているBD MGIT 960システムよりも約8日速いとともに、簡単で操作しやすく、直感的に分かりやすく、且つコストが低い。本発明のARPの宿主範囲について、マイコバクテリウムの中に特定の好みがあり、最も重要な宿主菌の1つはマイコバクテリウム・ツベルクローシスである。
前記ファージミドに宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列を含み、前記塩基配列に発光に必要な遺伝子LuxCDABEを含むファージミド。
前記耐性遺伝子は遺伝子LuxCDABEと結合し、LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子断片の両端にプロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーターと記するプロモーターが結合され、プロモーターは、トランスポゾンが宿主ゲノムのあるサイトに転移したときに、該サイトの前後の遺伝子の正常発現を保証するためのものであり、
前記プロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーター断片の両端に、それぞれトランスポゾンシステムにおける2つの逆方向反復配列が結合されることにより、トランスポザーゼの作用でプロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーター断片を宿主ゲノムに転移することを実現する。
ステップ(1):pUCF2プラスミドの構築
SEQ ID NO:2に示されるF0断片を人工合成し、F0断片をpUC19担体に結合することでpUCF0プラスミドを得、制限酵素XbaIでpUCF0プラスミドを消化し、約2.8kbの断片を回収し、XbaIで消化されたハイグロマイシン耐性遺伝子Hygを含む断片と回収された約2.8kbの断片とを結合することにより、約3.9kbのプラスミドpUCF2を得る。
ステップ(2):pUCF3プラスミドの構築
SEQ ID NO:3に示されるF1断片を人工合成し、F1断片をpUC19担体に結合することでpUCF1プラスミドを得、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF1プラスミドを消化し、約2.7kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF2を消化し、約1.3kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4kbのプラスミドpUCF3を得る。
ステップ(3):pUCRLlux2Pプラスミドの構築
制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpUCF3を消化し、約3.9kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpluxOKを消化し、約6.3kbの断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約10.2kbのプラスミドpUCRLlux2Pを得る。
ステップ(4):プラスミドpYUBTの構築
ファージMycoMarT7からトランスポザーゼのトランス遺伝子配列を増幅し、トランス遺伝子の5’端にNcoI酵素消化サイトを増加し、3’端にSpeI酵素消化サイトを増加し、増幅された生成物をNcoI及びSpeIで消化した後、約1kbの断片を回収し、プラスミドpYUB854を制限酵素NcoI及びSpeIで消化した後、約3.8kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドpYUBTを得る。
ステップ(5):プラスミドpYUOKの構築
プラスミドpUCRLlux2Pを制限酵素NcoI及びSpeIで消化し、約7.6kbの断片を回収し、制限酵素NcoI及びXbaIでプラスミドpYUBTを消化し、約2.9kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約10.5kbのプラスミドpYUOKを得る。
ステップ(6):プラスミドp159LARTの構築
SEQ ID NO:4に示される塩基断片を合成し、担体pUC19に結合することでプラスミドp159LRを得、プラスミドp159LRをNheIで消化して回収し、増幅して両端にNheI酵素消化サイトを有するApr遺伝子断片を得、該断片を制限酵素NheIで消化して回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドp159LARTを得る。
ステップ(7):プラスミドpYUOKLARTの構築
制限酵素PacIでプラスミドpYUOKを消化し、約10.5kbの断片を回収し、制限酵素PacIでプラスミドp159LARTを消化し、約2kb断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約12.5kbのプラスミドpYUOKLARTを得る。
ステップ(8):SEQ ID NO:1に示される塩基断片の取得
制限酵素SmaIでプラスミドpYUOKLARTを回収し、酵素消化された大断片生成物を回収することにより、SEQ ID NO:1に示される塩基断片を得る。
ファージを含む液体を検出されるサンプルに加えるステップ(1)と、
36.5〜42℃で35min以上培養し、蛍光照度計により発光を検出するステップ(2)と、
陰性対照群と比較した結果、顕著な蛍光を発した場合に、サンプルに大量の生きているマイコバクテリウムを含むことを示す一方、発した蛍光の強度がファージを加えていない陰性対照群の蛍光強度の120%よりも低い場合に、ファージを死滅させる試薬SKを加えることにより、ゲノムにおける、マイコバクテリウムに入っていない前記ファージを死滅させるステップ(3)であって、前記試薬SKは、過硫酸アンモニウム、硫酸第一鉄、硫酸アンモニア、硫酸第一鉄アンモニウムから選択される少なくとも1種であるステップ(3)と、
中和剤SNを加えて過剰な試薬SKを中和し、指示菌を加え、20〜32℃で12h以上培養するステップ(4)であって、前記中和剤SNは、MgSO4、重クロム酸カリウム、CaCl2、MnCl2から選択される少なくとも1種であるステップ(4)と、
蛍光照度計により指示菌を加えた後のサンプルの発光を検出した結果、サンプルが発光した場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していたことを示す一方、サンプルが発光しなかった場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していなかったことを示すステップ(5)と、
を含む。
好ましくは、上記ステップ(2)において、培養温度は36.5〜37.5℃である。
好ましくは、上記ステップ(4) において、培養温度は29〜31℃である。
ファージと宿主細菌とを混合すると同時に、一定濃度の検出される薬物を添加するステップ(1)と、
36.5〜42℃で少なくとも2h培養した後、蛍光照度計により発光を検出するステップ(2)と、
検出されたサンプルの発光値と薬物を添加していないサンプルの発光値との間に顕著な差異がある場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して敏感であることを示す一方、顕著な差異がない場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して薬剤耐性を有することを示すステップ(3)と、
を含む。
以下の実施例において、PCR反応に使用されるDNAポリメラーゼ、dNTP及び関連する試薬は、全て北京全式金生物有限公司から購入されるものである。大腸菌コンピテントセルDH5αは、広州東盛生物科技有限公司から購入されるもの(型番:C1042)である、DNA結合反応は、Takara宝生物公司のT4DNA結合キット(型番:D6020A)を採用する。プラスミド小型キット(P1001)、大型プラスミド抽出キット(P1151-02)、ゲルDNA回収キット(D2111)、PCR生成物回収キット(D2120/D2121)は、広州美基生物公司から購入される。本発明に係る制限酵素は、全てTakara宝生物公司から購入される。アンピシリン及びアプラマイシン抗生物質は、広州威佳生物科技有限公司から購入される。係るハイグロマイシンは、LJ公司から購入される。
ファージミドp159OKの構築フローチャートを図3〜6に示す。ファージミドp159OKには、phAE159ファージ骨格、マイコバクテリウムの強力なプロモーター(Hsp60)、発光に必要な酵素遺伝子(LuxCDABE)、ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg)、トランスポザーゼ遺伝子(Trans)、逆方向反復配列IR-L及びIR-R、プロモーターMop及びG13。が含まれる。各部材の機能は以下の通りである。
Hsp60:マイコバクテリウムの強力なプロモーターであり、後続の遺伝子の強発現を起動することができる。
LuxCDABE:発光に必要な酵素遺伝子であり、該遺伝子の発現により宿主菌が自己発光できるようになる(Hakkila K,Maksimow M,Karp M,Virta M(2002)Reporter genes lucFF,luxCDABE,gfp,and dsred have different characteristics in whole-cell bacterial sensors.Analytical biochemistry 301:235-242)。
ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg):Hygは、選択的標識であり、スクリーニングにより目的菌株を得るために用いられる。ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg)は、マイコバクテリウム及び大腸菌で発現した後、宿主をハイグロマイシンに対する耐性を獲得させることができ、つまり、ハイグロマイシン抗生物質を含む培地で増殖することができる。ハイグロマイシン(hygromycin,略称:Hyg)は、よく使われる耐性スクリーニング薬物であり、マイコバクテリウムに使用されるHygの濃度が50μg/mLであり、大腸菌に使用されるHygの濃度が200μg/mLである。
トランスポザーゼ遺伝子(Trans):転移機能を実行する酵素の遺伝子である。
逆方向反復配列(IR-L及びIR-R):トランスポゾンの両端に位置し、トランスポゾンの構成成分である。
プロモーター(Mop及びG13):トランスポゾンがゲノムあるサイトに転移したときに、該位点の前後の遺伝子の正常発現を保証できる。
1.プラスミドpUCF2の構築
出発プラスミドpUCF0は、上海捷瑞公司で合成したF0断片(例えば、SEQ ID NO:2に示される)と担体pUC19とを結合したプラスミドであり (図3;F0断片にプロモーターG13、逆方向反復配列IR-R等を含む)、それを制限酵素XbaIで消化し、ゲルDNA回収キットにより約2.8kbの断片を回収し、pTYdHmプラスミドは、本実験で構築したものであり (図3;具体的な構築方法は、文献Piuri,M.,,W.R.J.J.,and,G.F.H.Fluoromycobacteriophages for Rapid,Specific,and Sensitive Antibiotic Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.PLoS One.2009,4,e487を参照)、それを制限酵素XbaIで消化し、約1kbのハイグロマイシン耐性遺伝子Hygを含む断片を回収し、上記2つの断片を結合することで、約3.9kbのプラスミドpUCF2を得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取りLB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出し、制限酵素Sall及びPstIで酵素消化を行い、Hygの挿入方向を確認した。正確なプラスミドpUCF2は、800bpと3kbの2つのバンドを切り出せる。
出発プラスミドpUCF1は、是由上海捷瑞公司で合成したF1断片(SEQ ID NO:3に示される) と担体pUC19とを結合したプラスミドであり(図3;F1断片にプロモーターMop、逆方向反復配列IR-L等を含む)、KpnI及びEcoRIでプラスミドpUCF1を消化し、ゲルDNA回収キットにより約2.7kbの断片を回収した。構築された上記プラスミドpUCF2を制限酵素KpnI及びEcoRIで消化し、ゲルDNA回収キットにより1.3kbの断片を回収した。上記2つの機能断片を結合して約4kbのプラスミドpUCF3を得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取りLB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドpUCF3を実験の次のステップに用いる。
図3に示すように、構築された上記プラスミドpUCF3を制限酵素KpnI及びXhoIで消化し、約3.9kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpluxOK(Eric Nuermberger教授(Johns Hopkins University)からの贈り物;具体的な構築方法は、Forti F,Mauri V,Deho G,Ghisotti D.Isolation of conditional expression mutants in Mycobacterium tuberculosis by transposon mutagenesis.Tuberculosis.2011;91(6):569-578.を参照) を消化し、約6.3kbの機能断片KpnI-Hsp60-luxCDABE-XhoIを回収した。上記2つの断片を結合することで約10.2kbのプラスミドpUCRLlux2Pを得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取りLB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドを実験の次のステップに用いる。
1)プライマーZZf(SEQ ID NO:5に示される)及びZZr(SEQ ID NO:6に示される)によりファージMycoMarT7からトランスポザーゼトランス遺伝子配列(SEQ ID NO:9に示される) を増幅し、増幅際に、トランス遺伝子の5’端にNcoI酵素消化サイト、3’端にSpeI酵素消化サイトを増加し、増幅した生成物をNcoI及びSpeI一晩消化して回収した。
2)制限酵素NcoI及びSpeIでプラスミドpUCF2を消化し、2.7kbの断片を回収し、上記回収された2つの断片を結合して3.7kbのプラスミドpUCF4(図4)を得、シーケンシングに供した。
3)トランス遺伝子シーケンシングが正確なプラスミドpUCF4をNcoI及びSpeIで消化し、約1kbの断片(図4)を回収した。
4)プラスミドpYUB854を制限酵素NcoI及びSpeIで消化し、約3.8kbの断片(図4)を回収した。
5)ステップ3)及びステップ4)における2つの断片を結合して約4.8kbのプラスミドpYUBT(図4)を得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取り、LB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドは実験の次のステップに使用され得る。
プラスミドpUCRLlux2Pを制限酵素NcoI及びSpeIで消化し、約7.6kbの断片を回収し、制限酵素NcoI及びXbaIでプラスミドpYUBTを消化し、約2.9kbの断片を回収した。XbaI及びSpeIはアイソカウドマー(Isocaudomer)である。上記2つの断片を結合して約10.5kbのプラスミドpYUOKを得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取り、LB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドは実験の次のステップに使用され得る。
担体pUC19にプラスミドphAE159の2つの同じ組換え断片159L、159Rを含む塩基断片(例えば、SEQ ID NO:4に示される)を合成してプラスミドp159LR(図5)を得た。プラスミドp159LRを制限酵素NheIで消化した後回収し、プライマーAprF(SEQ ID NO:7)及びAprR(SEQ ID NO:8)によりプラスミドpMH94A(本実験室)から増幅してApr遺伝子断片を得た。増幅際に、Apr遺伝子にNheIの酵素消化サイトを増加した。PCR生成物を回収した後、制限酵素NheIで一晩消化し、そのままPCR回収キットにより回収した。上記2つの断片を結合して約4.8kbのプラスミドp159LART(図5)を得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、アプラマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取り、LB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドは実験の次のステップに使用され得る。
図5に示すように、制限酵素PacIでプラスミドpYUOKを消化し、約10.5kbの断片を回収し、制限酵素PacIでプラスミドp159LARTを消化し、約2kbの断片を回収し、上記2つの機能断片を結合して約12.6kbのプラスミドpYUOKLARTを得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、アプラマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取り、LB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドは実験の次のステップに使用され得る。
図6に示すように、制限酵素PacIでファージミドphAE159(Howard Hughes Medical Instituteからの贈り物)を消化し、エタノール沈殿法により酵素消化の生成物を回収し、制限酵素SmaIでプラスミドpYUOKLARTを消化し、エタノール沈殿法により酵素消化の生成物を回収し、この2つの生成物を混合して大腸菌BJ5183コンピテントセルに導入することで、57kbのファージミドp159OKを得た。ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、発光を検出した後、モノクローンを取り、LB液体培地で培養した後、発光を検出し、発光菌液からプラスミドを抽出し、制限酵素PacIで鑑定した。正確なファージミドp159OKは、10.5kb及び2.1kbのバンドを切り出せる。
本実施例で使用される7H9培地、ツイーン80は、広州華奇盛生物公司から購入され、寒天粉末は、広州康龍生物公司から購入され、Biorad電気変換器(Biorad GenePμLser Xcell)及び電気変換カップは、Biorad公司から購入される。
1)マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium.smegmatis MC?2155,Msm);从中国普通微生物菌種寄託管理中心から入手;寄託番号:1.2621
2) 上層寒天:0.6%の寒天
3)MP緩衝液:50mL 1M Tris-HCL(pH 7.5)、8.766g NaCl(最終濃度150mM)、2.46g硫酸マグネシウム七水和物(最終濃度10mM)、0.222g無水塩化カルシウム(最終濃度2mM)を蒸留水に加え、1Lまで蒸留水を添加し、ろ過滅菌した。
電気変換によるファージの製造方法
1)標識された0.2cmの電気変換カップにそれぞれ10μLの濃縮されたプラスミドP159OK及び200μLのMsmコンピテントセルを加えた。柔らかく吹吸することにより十分に混合した後、氷で10分間放置し、電気変換カップ上の水分を拭き除いてから電気変換器に入れた。
2)電気変換器を用いて、電圧2.5KV、電気抵抗1000Ω、静電容量25μFの条件下でパルス波により電気変換を行った。プラスミドを添加していない細菌陰性対照のパルス時間は19〜21秒であり、該時間範囲は、変換される細菌が良好な状態にあることを示す。コンピテントセルが十分に洗浄されないか、又はプラスミドに多くの塩が含まれると、爆発する恐れがある。
3)電気変換液に2mLの7H9(ツイーン80を含まない)培地を加え、50mL遠心管に移転し、37℃のインキュベータで3時間インキュベートした。
4)遠心分離により上澄みを除去し、150μLの7H9(ツイーン80を含まない)培地で再懸濁した後、10μL又は100μLの菌液を取って3.5mLの42℃に冷却した上層寒天に加え、LB固体培地平板に敷き、30℃のインキュベータでインキュベートした。48時間後に溶菌斑が認められ、大きな溶菌斑が48時間以内に認められる。
5)各平板に2mLのMP緩衝液を加え、4℃で数時間振盪した後、MP緩衝液で溶出された液体を取り、0.4umフィルターによりろ過した後、4℃で保存し、ファージを得た。
1)マイコバクテリウムを50mLの7H9(含0.1%tween 80)を含む液体培地を入れた三角フラスコに加え、37℃でODが0.8-1.0に達するまで揺動培養した。
2)45mLの培養菌液を取り、同体積のMP緩衝液で洗浄し、6000rpmで5分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
3)5mLのMP緩衝液で再懸濁し、200μLを対照として取った。
4)約1011個の上記製造されたファージを(又はMP緩衝液を対照として)加え、37℃で4-12時間インキュベートした。なお、ファージの体積が2mL未満であることが好ましい。
5)ハイグロマイシン耐性を有する7H11固体培地の表面に敷き、37℃で3日前後(低速マイコバクテリウムの場合、3-4周) インキュベートして、コロニーが認められ、発光のコロニーを得た。トランスポゾンが挿入突然変異した自己発光可能なマイコバクテリウムコロニーを得た。
方法:サンプルにおける生きているマイコバクテリウム(例えばMtb)の検出方法;検出原理を図7に示す。
1)ファージ(以下、ARP)を含む液体を検出されるサンプルに加えた。
2)37℃で35min以上培養し、蛍光照度計により発光を検出した。該ステップにおいて、培養温度は36.5〜42℃であり得る。
3) 顕著な蛍光を発した場合に、サンプルに大量の生きているマイコバクテリウムを含むことを示す一方、発した蛍光の強度がファージを加えていない陰性対照群の蛍光強度の120%よりも低い場合に、ファージを死滅させる試薬SKを加えることにより、ゲノムにおける、マイコバクテリウムに入っていないARPを死滅させた。前記試薬SKは、過硫酸アンモニウム、硫酸第一鉄、硫酸アンモニア、硫酸第一鉄アンモニウムから選択される少なくとも1種であり、Sigma公司から購入される。
4)次に、中和剤SNを加えて過剰なSKを中和し、指示菌(Msm)を加え、30℃(該培養温度は20〜32℃であり得る)で12h以上培養した。この間に、サンプルのマイコバクテリウム内部に侵入したファージは宿主を溶解して解放された後、指示菌を大量に感染し、侵入、宿主溶解の過程を繰り返して発生することができる。十分に多くのARPが十分に多くの指示菌に侵入した後、サンプルが発光することにより、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在することを推測できる。
前記中和剤SNは、MgSO4、重クロム酸カリウム、CaCl2、MnCl2から選択される少なくとも1種であり、Sigma公司から購入される。
5) 蛍光照度計により指示菌を加えた後のサンプルの発光を検出した結果、サンプルが発光した場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していたことを示す一方、サンプルが発光しなかった場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していなかったことを示す。
方法:宿主菌株(例えば、Mtb)の薬剤感受性の検出方法;検出原理を図11に示す。
1)本発明で製造されたファージARPと1.5mL透明小管(又は96ウェルプレート)に含まれる目的生菌(例えば、Mtb)とを混合し、一定濃度の検出される薬物を添加する。
2)37℃で少なくとも2h培養した後(培養温度:36.5〜42℃)、蛍光照度計により発光を検出する。
3) 検出されたサンプルの発光値と薬物を添加していないサンプルの発光値との間に顕著な差異がある場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して敏感であることを示す一方、顕著な差異がない場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して薬剤耐性を有することを示す。
Claims (21)
- 宿主細菌を自己発光させることができるファージミドであって、
前記ファージミドに宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列を含み、前記塩基配列に発光に必要な遺伝子LuxCDABEを含み、
前記宿主細菌は結核菌(Mtb)であり、
前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、トランスポゾンシステム、耐性遺伝子及びプロモーターをさらに含み、
前記耐性遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子Hygであり、
前記プロモーターは、強力なプロモーターHsp60、及びプロモーターMop、G13を含み、
前記トランスポゾンシステムは、トランスポザーゼ遺伝子Trans及び逆方向反復配列IR−L及びIR−Rを含むことを特徴とするファージミド。 - 前記トランスポゾンシステムは、宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列を宿主ゲノムに転移することを特徴とする請求項1に記載のファージミド。
- 前記トランスポゾンシステムは、Himar1 mariner、TnAファミリーから選択される1種であることを特徴とする請求項1又は2に記載のファージミド。
- 前記プロモーターは、宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列が宿主ゲノムのあるサイトに転移したときに、該サイトの前後の遺伝子の正常発現を保証するためのものであることを特徴とする請求項1に記載のファージミド。
- 前記耐性遺伝子は遺伝子LuxCDABEと結合し、LuxCDABE遺伝子−耐性遺伝子断片の両端にプロモーター−LuxCDABE遺伝子−耐性遺伝子−プロモーターと記するプロモーターが結合され、プロモーターは、トランスポゾンが宿主ゲノムのあるサイトに転移したときに、該サイトの前後の遺伝子の正常発現を保証するためのものであり、
前記プロモーター−LuxCDABE遺伝子−耐性遺伝子−プロモーター断片の両端に、それぞれトランスポゾンシステムにおける2つの逆方向反復配列が結合されることにより、トランスポザーゼの作用でプロモーター−LuxCDABE遺伝子−耐性遺伝子−プロモーター断片を宿主ゲノムに転移することを実現することを特徴とする請求項1、2又は4に記載のファージミド。 - 前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、大腸菌内で複製可能な複製開始点をさらに含むことにより、前記塩基配列は、プラスミド又はファージミド内で大量に複製することができることを特徴とする請求項1、2、3又は4に記載のファージミド。
- 前記複製開始点はoriEであることを特徴とする請求項6に記載のファージミド。
- 前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、CosAサイトをさらに含むことを特徴とする請求項1、2、3、4又は7に記載のファージミド。
- 前記宿主細菌を自己発光させることができる目的塩基配列に、ファージミド骨格と相同組換えすることができる組換えサイトをさらに含むことにより、前記塩基配列をファージミド骨格内に結合することができることを特徴とする請求項1、2、3、4又は7に記載のファージミド。
- 前記ファージミド骨格は、ファージミドphAE159に由来することを特徴とする請求項9に記載のファージミド。
- 前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列は、SEQ ID NO:1に示されることを特徴とする請求項9に記載のファージミド。
- 前記ファージミドに、phAE159骨格をさらに含み、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列は、phAE159骨格の2つの組換えサイトの間に位置することを特徴とする請求項1、2、3、4、7、10又は11に記載のファージミド。
- 遺伝子LuxCDABEを含む目的断片と組換えできるようにファージミド骨格を線状配列に酵素消化し、酵素消化されたファージミド骨格と遺伝子LuxCDABEを含む目的断片とを混合して共に大腸菌コンピテントセルに導入し、大腸菌内で組換え、増幅を行い、陽性組換え大腸菌のプラスミドを抽出することにより、ファージミドを得ることを特徴とする請求項1〜12の何れか1項に記載のファージミドの製造方法。
- 制限酵素PacIでファージミド骨格phAE159を消化し、酵素消化された大断片生成物を回収し、回収された生成物とSEQ ID NO:1に示される塩基断片とを混合して共に大腸菌コンピテントセルに導入し、陽性組換え大腸菌のプラスミドを抽出することにより、ファージミドを得ることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- SEQ ID NO:1に示される塩基断片の製造方法は、以下のステップ(1)〜(8)を含み、
ステップ(1):pUCF2プラスミドの構築
SEQ ID NO:2に示されるF0断片を人工合成し、F0断片をpUC19担体に結合することでpUCF0プラスミドを得、制限酵素XbaIでpUCF0プラスミドを消化し、約2.8kbの断片を回収し、XbaIで消化されたハイグロマイシン耐性遺伝子Hygを含む断片と回収された約2.8kbの断片とを結合することにより、約3.9kbのプラスミドpUCF2を得、
ステップ(2):pUCF3プラスミドの構築
SEQ ID NO:3に示されるF1断片を人工合成し、F1断片をpUC19担体に結合することでpUCF1プラスミドを得、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF1プラスミドを消化し、約2.7kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF2を消化し、約1.3kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4kbのプラスミドpUCF3を得、
ステップ(3):pUCRLlux2Pプラスミドの構築
制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpUCF3を消化し、約3.9kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpluxOKを消化し、約6.3kbの断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約10.2kbのプラスミドpUCRLlux2Pを得、
ステップ(4):プラスミドpYUBTの構築
ファージMycoMarT7からトランスポザーゼのトランス遺伝子配列を増幅し、トランス遺伝子の5'端にNcoI酵素消化サイトを増加し、3'端にSpeI酵素消化サイトを増加し、増幅された生成物をNcoI及びSpeIで消化した後、約1kbの断片を回収し、プラスミドpYUB854を制限酵素NcoI及びSpeIで消化した後、約3.8kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドpYUBTを得、
ステップ(5):プラスミドpYUOKの構築
プラスミドpUCRLlux2Pを制限酵素NcoI及びSpeIで消化し、約7.6kbの断片を回収し、制限酵素NcoI及びXbaIでプラスミドpYUBTを消化し、約2.9kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約10.5kbのプラスミドpYUOKを得、
ステップ(6):プラスミドp159LARTの構築
SEQ ID NO:4に示される塩基断片を合成し、担体pUC19に結合することでプラスミドp159LRを得、プラスミドp159LRをNheIで消化して回収し、増幅して両端にNheI酵素消化サイトを有するApr遺伝子断片を得、該断片を制限酵素NheIで消化して回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドp159LARTを得、
ステップ(7):プラスミドpYUOKLARTの構築
制限酵素PacIでプラスミドpYUOKを消化し、約10.5kbの断片を回収し、制限酵素PacIでプラスミドp159LARTを消化し、約2kb断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約12.5kbのプラスミドpYUOKLARTを得、
ステップ(8):SEQ ID NO:1に示される塩基断片の取得
制限酵素SmaIでプラスミドpYUOKLARTを回収し、酵素消化された大断片生成物を回収することにより、SEQ ID NO:1に示される塩基断片を得ることを特徴とする請求項14に記載の方法。 - 請求項1〜12の何れか1項に記載のファージミドを含むことを特徴とする自己発光部材を送達可能なファージ。
- 請求項1〜12の何れか1項に記載のファージミドの、宿主細菌検出及び/又は薬剤感受性検出における使用。
- 請求項16に記載のファージの、宿主細菌検出及び/又は薬剤感受性検出における使用。
- ファージを含む液体を検出されるサンプルに加えるステップ(1)と、
36.5〜42℃で35min以上培養し、蛍光照度計により発光を検出するステップ(2)と、
陰性対照群と比較した結果、顕著な蛍光を発した場合に、サンプルに大量の生きているマイコバクテリウムを含むことを示す一方、発した蛍光の強度がファージを加えていない陰性対照群の蛍光強度の120%よりも低い場合に、ファージを死滅させる試薬SKを加えることにより、ゲノムにおける、マイコバクテリウムに入っていない前記ファージを死滅させるステップ(3)であって、前記試薬SKは、過硫酸アンモニウム、硫酸第一鉄、硫酸アンモニア、硫酸第一鉄アンモニウムから選択される少なくとも1種であるステップ(3)と、
中和剤SNを加えて過剰な試薬SKを中和し、指示菌を加え、20〜32℃で12h以上培養するステップ(4)であって、前記中和剤SNは、MgSO4、重クロム酸カリウム、CaCl2、MnCl2から選択される少なくとも1種であるステップ(4)と、
蛍光照度計により指示菌を加えた後のサンプルの発光を検出した結果、サンプルが発光した場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していたことを示す一方、サンプルが発光しなかった場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していなかったことを示すステップ(5)と、
を含むことを特徴とする請求項16に記載のファージによる宿主細菌の検出方法。 - 前記指示菌は、請求項16に記載のファージの宿主であり、前記ファージは該宿主内で増幅し続け、細胞を溶解することができることを特徴とする請求項19に記載の方法。
- ファージと宿主細菌とを混合すると同時に、一定濃度の検出される薬物を添加するステップ(1)と、
36.5〜42℃で少なくとも2h培養した後、蛍光照度計により発光を検出するステップ(2)と、
検出されたサンプルの発光値と薬物を添加していないサンプルの発光値との間に顕著な差異がある場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して敏感であることを示す一方、顕著な差異がない場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して薬剤耐性を有することを示すステップ(3)と、
を含むことを特徴とする請求項16に記載のファージによる、宿主細菌の薬剤感受性の検出方法。
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