JP6799863B2

JP6799863B2 - 心疾患または筋疾患の診断薬

Info

Publication number: JP6799863B2
Application number: JP2017554174A
Authority: JP
Inventors: 裕大澤; 芳秀砂田
Original assignee: Kawasaki Gakuen Educational Foundation
Current assignee: Kawasaki Gakuen Educational Foundation
Priority date: 2015-12-01
Filing date: 2016-12-01
Publication date: 2020-12-16
Anticipated expiration: 2036-12-01
Also published as: JPWO2017094837A1; WO2017094837A1

Description

本発明は、心疾患または筋疾患の診断薬に関する。
本発明は、生体由来の測定対象物の蛋白質を特異的に測定することを特徴とする測定方法、該測定法を利用した判定方法、並びに該測定に利用する測定用キットに関する。さらに詳しくは、該測定対象物を特異的に捕捉する物質が免疫学的測定法、例えば、電気泳動法、ウェスタンブロット法、サンドウィッチ法などによる測定手段を利用することを特徴とする測定対象物の定性的、更には定量的測定法に関する。さらに本発明の蛋白質の測定方法を用いることを特徴とする、心疾患または筋疾患の早期診断の分野に関する判定及び診断する方法に関するものである。

筋疾患と心疾患の早期診断とその活動性の評価は、患者の治療方針の選択と予後判定に重要な役割を果たす(非特許文献１)。とりわけ心筋梗塞に至る虚血性心疾患の迅速診断は生命予後を左右する(非特許文献２)。

クレアチンキナーゼ(creatine kinase：CK)は、心筋と骨格筋の収縮時のエネルギー供給をつかさどるクレアチンのリン酸基転移酵素である(非特許文献３)。CKは心筋と骨格筋が障害を受けた際に血中に流出する「筋逸脱」酵素とされ、心疾患と筋疾患のバイオマーカーとして、これまで50年以上にわたり広く使われてきた(非特許文献４)。しかし、血中CK値は、心筋、骨格筋疾患以外の、甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、てんかん重積、悪性腫瘍など、様々な病態においても上昇するため、その骨格筋疾患・心筋疾患のバイオマーカーとしての特異性には問題がある。また1980年代にRowlandのグループが提唱した原因不明の高CK血症（idiopathic hyperCKemia)については、その後もなぜ血中CK値が上昇するかについての分子機構は十分には解明されていない(非特許文献５)。さらに心筋梗塞では、冠動脈の閉塞から高CK血症発症までに数時間のtime lagがあることが、超早期診断と迅速な治療選択の障壁となっている(非特許文献６)。

カベオリンは、細胞膜の細胞質側へのフラスコ状の特殊陥入構造物であるカベオラの主要構成蛋白質であり、21-24 kDaの膜蛋白質として単離された(非特許文献７)。カベオリンには異なる遺伝子によってコードされる3種類のアイソフォーム（カベオリン1、2、3)があり、このうちカベオリン3は主に骨格筋と心筋に特異的に発現している。カベオリンは、オリゴマーを形成してカベオラの形態を形成する(非特許文献８)だけでなく、一酸化窒素合成酵素（nitric oxide synthase：NOS)、G-protein、H-Ras、c-Srcなどシグナル分子と結合して、その分子活性を制御することによって細胞内シグナル伝達を調整する足場蛋白質(scaffolding protein)としての役割も担っている(非特許文献９)。またカベオリンはコレステロールなど脂質の細胞内小胞輸送にも関与している(非特許文献１０)。

1998年イタリアのMinettiらによって、常染色体優性の遺伝形式をとり、カベオリン３遺伝子のミスセンス変異による肢帯型筋ジストロフィー(limb-girdle muscular dystrophy：LGMD)の2家系が報告され、LGMD1Cと命名された(非特許文献１１)。この疾患では、骨格筋と心筋のカベオリン３蛋白質は著減し、筋ジストロフィーだけでなく肥大型心筋症も発症する(非特許文献１２)。本発明者らは、独自にLGMD1C患者で認められたミスセンス変異を導入した疾患モデルマウス(CAV3^P104L)を作出し(非特許文献１２)、これまでに骨格筋で神経型NOS活性と骨格筋萎縮作用のあるマイオスタチン活性が上昇すること、心筋で血管内皮型NOS活性が上昇することが骨格筋萎縮と心筋肥大の分子病態に関与することを、世界に先駆け解明してきた（非特許文献１３−１６)。一方、興味深いことに筋ジストロフィーの代表的な病型であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)では、骨格筋と心筋のカベオリン３蛋白質が著増することも報告されている(非特許文献１７、１８)。また、カベオリン３を過剰発現させたトランスジェニックマウスでは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー類似の病変が発現するとともに、血清CK 値が上昇することが報告されている（非特許文献１９）。他方、カベオリン３高発現マウスでは実験的心筋梗塞や実験的心肥大が抑制される(非特許文献２０、２１)。

筋ジストロフィーを診断するために、組織試料中のカベオリン３タンパクの発現レベルを測定する方法が知られている（特許文献１）。該文献の［0032］には「組織試料は、典型的には、例えば生検試料の形態の筋組織試料である。しかしながら、個体内の筋線維が変性するため、速筋ミオシン及びカベオリン−３は、筋ジストロフィーを有する個体の血液内にも見出される場合があると考えられる。」との記述があり、血中のカベオリン３が筋ジストロフィーのバイオマーカーとなり得ることが示唆されている。しかし、該文献には血中のカベオリン３のデータはなく、実際のヒト筋ジストロフィー患者での血液マーカーに関する開示も示唆もない。

特表2012-525576号公報

Silvestri NJ, Wolfe GI. Muscle Nerve. 2013; 47(6): 805-15 Lippi G, Cervellin G, Plebani M. N Engl J Med. 2010; 362(13): 1242 Okinaka S, Kumagai H, Ebashi S, Sugita H, Momoi H, Toyokura Y, Fujie Y. Arch Neurol. 1961; 4: 520-5 Sugita H, Takeda S. Proc Jpn Acad Ser B Phys BiolSci.2010; 86(7): 748-56 Rowland LP, Willner J, DiMauro S, Miranda A. Approaches to the membrane theory of Duchenne muscular dystrophy. In: Angelini C, Danieli GA, Fontanari D, editors. Muscular dystrophy-advances and new trends. Amsterdam, The Netherlands: Excerpta Medica; 1980. pp. 3-13 Stubbs P, Collinson P. N Engl J Med. 1997; 336(17): 1257-8 Rothberg KG, Heuser JE, Donzell WC, Ying YS, Glenney JR, Anderson RG. Cell. 1992; 68(4): 673-82 Galbiati F, Razani B, Lisanti MP.Cell 2001; 106(4): 403-11 Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP. J Biol Chem. 1997; 272(10): 6525-33 Parton RG, del Pozo MA. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013;14(2):98-112 Minetti C, Sotgia F, Bruno C, Scartezzini P, Broda P, Bado M, Masetti E, Mazzocco M, Egeo A, Donati MA, Volonte D, Galbiati F, Cordone G, Bricarelli FD, Lisanti MP, Zara F. Nat Genet. 1998; 18(4): 365-8 Hayashi T, Arimura T, Ueda K, Shibata H, Hohda S, Takahashi M, Hori H, Koga Y, Oka N, Imaizumi T, Yasunami M, Kimura A. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 313(1): 178-84 Sunada Y, Ohi H, Hase A, Ohi H, Hosono T, Arata S, Higuchi S, Matsumura K, Shimizu T. Hum Mol Genet. 2001; 10(3): 173-8 Ohsawa Y, Toko H, Katsura M, Morimoto K, Yamada H, Ichikawa Y, Murakami T, Ohkuma S, Komuro I, Sunada Y. Hum Mol Genet. 2004; 13(2): 151-7 Ohsawa Y, Hagiwara H, Nakatani M, Yasue A, Moriyama K, Murakami T, Tsuchida K, Noji S, Sunada Y. J Clin Invest. 2006; 116(11): 2924-34 Ohsawa Y, Okada T, Nishimatsu S, Ishizaki M, Suga T, Fujino M, Murakami T, Uchino M, Tsuchida K, Noji S, Hinohara A, Shimizu T, Shimizu K, Sunada Y. Lab Invest. 2012; 92(8): 1100-14 Vaghy PL, Fang J, Wu W, Vaghy LP.FEBS Lett. 1998;431(1): 125-7 Repetto, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 261: 547-550 Galbiati, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 9689-9694 Horikawa YT, Patel HH, Tsutsumi YM, Jennings MM, Kidd MW, Hagiwara Y, Ishikawa Y, Insel PA, Roth DM. J Mol Cell Cardiol. 2008; 44(1): 123-30 Horikawa YT, Panneerselvam M, Kawaraguchi Y, Tsutsumi YM, Ali SS, Balijepalli RC, Murray F, Head BP, Niesman IR, Rieg T, Vallon V, Insel PA, Patel HH, Roth DM. J Am Coll Cardiol. 2011; 57(22): 2273-83

本発明の目的は、心疾患または筋疾患の早期診断と活動性評価をする血液中の物質の検出によって、患者の治療方針と予後判定に重要な役割を果たす早期かつ信頼性のある診断手段を提供することにある。

カベオリン３は、正常な骨格筋と心筋の機能維持に本質的な役割を担っているものと推定できる。本発明者らは、まず筋ジストロフィーをはじめとする骨格筋疾患、心筋梗塞、てんかん重積の患者血清で、カベオリン３をはじめとする筋ジストロフィーの原因遺伝子産物が出現するかについてウエスタンブロット法によって解析した。次いで、血中に認められたカベオリン３蛋白質と血中CK値を比較することによって血中カベオリン３が心疾患または筋疾患の新たなバイオマーカーとなり得るかについて検討を加え、本発明を完成するに至った。

本発明は、以下のものを提供する。
〔１〕心疾患または筋疾患を診断するための、抗カベオリン３抗体を含有する診断薬。
〔２〕心疾患が急性冠症候群を含む心筋疾患より選ばれる、〔１〕に記載の診断薬。
〔３〕急性冠症候群が急性心筋梗塞であり、心筋梗塞が疑われる被験者由来の発症後超急性期の血液試料を測定対象とするものである、〔２〕に記載の診断薬。
〔４〕被験者由来の血液試料中のカベオリン３レベルに基づき心疾患または筋疾患を判定するための、抗カベオリン３抗体を含有する診断キット。
〔５〕心疾患が急性冠症候群を含む心筋疾患より選ばれる、〔４〕に記載のキット。
〔６〕心疾患が急性心筋梗塞であり、心筋梗塞が疑われる被験者由来の発症後超急性期の血液試料を測定対象とするものである、〔５〕に記載のキット。
〔７〕下記の工程：
（１）被験者由来の血液試料を抗カベオリン３抗体と接触させ、カベオリン３と抗体との複合体を形成させる工程；および
（２）工程（１）で形成された複合体中のカベオリン３を検出する工程；
を含む、心筋または骨格筋由来のカベオリン３の検出方法。
〔８〕工程（２）の後に、
（３）工程（２）で検出されたカベオリン３のレベルと、正常対照のカベオリン３のレベルとを比較する工程；および
（４）工程（３）の比較結果に基づき、被験者が心筋疾患または筋疾患に罹患しているか否かを判定する工程；
をさらに含む、〔７〕に記載の検出方法。
〔９〕筋疾患が、
ミオトニア症候群、先天性ミオパチー、甲状腺中毒性ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、薬剤性ミオパチー、ステロイドミオパチー、アルコール性ミオパチー、中毒性ミオパチー、周期性四肢麻痺、炎症性ミオパチー、内分泌疾患に伴うミオパチー、代謝性ミオパチー、膠原病に伴うミオパチー、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、脂肪酸代謝障害、感染性筋炎、ミオグロビン尿症、HIV関連ミオパチー、てんかん重積、および外傷、虚血、クランプのいずれかによる骨格筋の損傷からなる群より選ばれる、〔８〕に記載の検出方法。
〔１０〕心筋疾患が心筋梗塞および不安定狭心症を含む虚血性心疾患；
心筋症および心筋炎；ならびに
リウマチ熱に伴う心炎からなる群より選ばれる、〔８〕に記載の検出方法。
〔１１〕急性心筋疾患を判定するための被験者の血液試料の検査方法である、〔７〕、〔８〕、〔１０〕のいずれかに記載の検出方法。
〔１２〕急性心筋疾患が急性心筋梗塞であり、心筋梗塞が疑われる被験者由来の発症後超急性期の血液試料を測定対象とするものである、〔７〕、〔８〕、〔１０〕、〔１１〕のいずれかに記載の検出方法。

筋疾患および心疾患のマーカーとしては従来、血清クレアチンキナーゼが用いられてきたが、甲状腺機能低下症、悪性腫瘍などのさまざまな病態においても上昇するためその疾患特異性には問題があった。さらに心疾患の虚血性心疾患、特に心筋梗塞においては冠動脈閉塞からクレアチンキナーゼが血液中に逸脱し検出されるまでには時間の遅れが生じ、超急性期診断の障壁になっている。今回、本発明者らが発見した診断マーカーである血液中のカベオリン３を測定することにより、筋疾患または心疾患の早期診断と活動性評価をすることが可能であることが確認された。とりわけ、心筋梗塞においては、患者血清中のクレアチンキナーゼに先駆け上昇することを見出し、超急性期診断マーカーとして利用できることを確認した。
本発明の診断薬および診断キットによれば、心疾患または筋疾患の罹患の有無を早期かつ簡便に判定することができる。本発明の検出方法によれば、心疾患または筋疾患の罹患の有無、治療効果の有無、予後の良不良を単独で、あるいは他の診断方法と組み合わせて適切に判定することができる。
心筋梗塞等の急性心疾患においては、これまで超早期の診断が困難であったが、本発明により早期診断の確立に寄与することができる。

骨格筋疾患(VLCAD)およびてんかん重積(SE)患者の血清中に出現する筋ジストロフィーの原因遺伝子産物をウエスタンブロットで解析した結果を示す。骨格筋疾患(VLCAD)およびてんかん重積(SE)患者の血清中検出されたカベオリン３のウエスタンブロットを定量的に解析した結果を示す。骨格筋疾患(VLCAD)およびてんかん重積(SE)患者の血清中でカベオリン３が検出されることをウエスタンブロットで解析した結果を示す。心筋梗塞を発症した患者由来の血液を経時的に採取し、血清中にカベオリン３が検出されることをウエスタンブロットで解析した結果を示す。心筋梗塞を発症した患者由来の血液を経時的に採取し血清中に検出されたカベオリン３のウエスタンブロットを定量的に解析した結果を示す。カベオリン３をELISAで定量するための検量線の一例を示す。

定義
本発明において、カベオリンとは、細胞膜の細胞質側へのフラスコ状の特殊陥入構造物であるカベオラの主要構成蛋白質であり、21-24 kDaの膜蛋白質である。カベオリンには異なる遺伝子によってコードされる3種類のアイソフォーム（カベオリン１、２および３)があり、本発明においては、カベオリン３を対象とする。カベオリンは、オリゴマーを形成してカベオラの形態を形成するだけでなく、一酸化窒素合成酵素（NOS)、G-protein、H-Ras、c-Srcなどシグナル分子と結合して、その分子活性を制御することによって細胞内シグナル伝達を調整する足場蛋白質(scaffolding protein)としての役割も担っている。また、カベオリンは、コレステロールなど脂質の細胞内小胞輸送にも関与している。

カベオリン３は、主に骨格筋と心筋に特異的に発現している蛋白質である。カベオリン３のアミノ酸配列およびこれをコードするヌクレオチド配列は、数種の動物において公表されており、自体公知の方法により単離することができる。ヒトのカベオリン３の代表的なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、NCBIに以下の通りに登録されている。
ヒトカベオリン３のトランスクリプトバリアント１
ヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_033337（バージョンNM_033337.2））（配列番号１）
アミノ酸配列（アクセッション番号NP_203123（バージョンNP_203123.1））（配列番号２）
ヒトカベオリン３のトランスクリプトバリアント２
ヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_001234（バージョンNM_001234.4））（配列番号３）
アミノ酸配列（アクセッション番号NP_001225（バージョンNP_001225.1））（アミノ酸配列はトランスクリプトバリアント１と同一である）（配列番号４）

ヒト以外の動物由来のカベオリン３のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列も、各種動物のゲノムデータベースを検索することにより、容易に配列情報を入手することが可能であり、当該情報に基づいて自体公知の方法により単離することができる。
マウスカベオリン３の代表的なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、NCBIに以下の通りに登録されている。
ヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_007617（バージョンNM_007617.3））（配列番号５）
アミノ酸配列（アクセッション番号NP_031643（バージョンNP_031643.1））（配列番号６）
ラットカベオリン３の代表的なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、NCBIに以下の通りに登録されている。
ヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_019155（バージョンNM_019155.2））（配列番号７）
アミノ酸配列（アクセッション番号NP_062028（バージョンNP_062028.1））（配列番号８）
サル（カニクイザル）カベオリン３の代表的なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、NCBIに以下の通りに登録されている。
ヌクレオチド配列（アクセッション番号XM_005547688（バージョンXM_005547688.1））（配列番号９）
アミノ酸配列（アクセッション番号XP_005547745（バージョンXP_005547745.1））（配列番号１０）

本発明においてカベオリン３レベルとは、一定量の試料中のカベオリン３の含有量を表す。カベオリン３レベルは、後述の測定手法に応じて当業者に公知の様式で表すことができ、例えば、カベオリン３の濃度として表現してもよく、また標準試料の測定値を基準とする相対値として表現してもよい。

本発明において抗体とは、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラス、抗体の機能的断片の形態も含む意であり、当該抗体には、天然型抗体の他に、遺伝子組換技術を用いて製造され得る抗体、抗体断片、およびこれらの結合性断片も含まれるが、これらに限定されない。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれるが、ポリクローナル抗体とは異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物であり、モノクローナル抗体とは実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。また結合性断片とは、前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv(variable fragment of antibody)、scFv(single chain Fv)、dsFv(disulphide stabilized Fv)、sdAb(single domain antibody)等が挙げられる(Exp. Opin.Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996)。

本発明において心疾患とは、心臓に起こる病気の総称をいい、世界保健機構 WHOが定義した(ICD-10, Ver. 2010: http://apps.who.int/classifications/icd10/browse/2010/en)心疾患を範疇とする。心疾患の大部分を占めているのが「虚血性心疾患」である。虚血性心疾患とは、心筋へ血液を送る冠動脈の血流が悪くなって、心筋が酸素不足および栄養不足に陥るものをいう。本発明が主対象とする心疾患は心筋疾患であり、急性冠症候群を代表例として含む。急性冠症候群とは、冠動脈のプラーク破綻を起因として急速に血栓形成および閉塞が進行しつつある疾患をいう。
急性冠症候群は、心筋梗塞および不安定狭心症を含み、心筋梗塞および不安定狭心症は、虚血性心疾患(Acute myocardial infarction, White HD, Chew DP. Lancet. 2008;372:570-84. /S0140-6736(08)61237-4. Review.）とも称される。
心疾患は、心筋症および心筋炎（Richardson P, et al. Report of the 1995 World Health Organization/International Society and Federation of Cardiology task force on the definition and classification of cardiomyopathies. Circulation 1996;93:841-842.）、リウマチ熱に伴う心炎も含む。
早期診断が予後に大きく影響する急性心疾患、具体的には心筋梗塞、特に、急性心筋梗塞（発症から６時間以内、あるいは発症から３時間以内の超急性期）、とりわけ、早期治療が患者の予後に最も大きく影響するST上昇型急性心筋梗塞症を対象とすることが望ましい。

本発明において筋疾患とは、筋肉自体が障害される疾患の総称であり、世界保健機構 WHOが定義した(ICD-10, Ver.2010: http://apps.who.int/classifications/icd10/browse/2010/en) 筋疾患を範疇とし、一般的にはミオパチーと呼ばれる。筋疾患の代表例は、デュシェンヌ型、ベッカー型、肢帯型、顔面肩甲上腕型、眼筋咽頭型、エメリ・ドレフィス型、先天性、遠位型、筋強直性等の様々な病型からなる遺伝性難病である筋ジストロフィーであるが、本発明においては、筋ジストロフィーを除くミオパチーを対象とする。具体的には、ミオトニア症候群、中心コア病などの先天性ミオパチー、甲状腺中毒性ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、薬剤性ミオパチー、ステロイドミオパチー、アルコール性ミオパチー、中毒性ミオパチー、周期性四肢麻痺、炎症性ミオパチー、内分泌疾患に伴うミオパチー、糖原病や脂質蓄積病などによる代謝性ミオパチー、関節リウマチなど膠原病に伴うミオパチー、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、CPTII欠損や極長鎖アシルCoA脱水素酵素（VLCAD）欠損症などの脂肪酸代謝障害、感染性筋炎、ミオグロビン尿症、HIV関連ミオパチー、てんかん重積、外傷・虚血・クランプなどによる骨格筋の損傷を含む。

本発明において疾患の罹患の有無を判定するとは、一定の基準に照らした評価、検査を行なうことを含む意であり、本発明単独で、あるいは別の検査と組み合わせて総合的に判定することも含む。

１．心疾患または筋疾患の診断薬
本発明の診断薬に有効成分として含まれる「抗カベオリン３抗体」は、蛋白質カベオリン３を検出可能な抗体である限り特に限定されるものではなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する前記抗体の一部が包含される。例えば、市販の抗体として、BD-610420 （モノクローナル抗体、BD Transduction Lab社）、sc-5310、sc-55518（モノクローナル抗体、サンタクルズ社）ALX‐210‐241（ポリクローナル抗体、Enzo社）、PA1-066 (ポリクローナル抗体、Thermo Sci社）、sc-7665、sc-28828、sc-30752、sc-30753（ポリクローナル抗体、サンタクルズ社）などが挙げられる。また、抗カベオリン３抗体は、カベオリン３またはその一部を抗原として用い、自体公知の方法によって調製することができる。

ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、既知の一般的な製造方法によって製造することができる。例えば、カベオリン３またはその一部を免疫原として用い、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、例えばポリクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマまたはウシ等、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギに、モノクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスターに免疫する。

一実施態様において、例えば、配列番号２のアミノ酸配列またはその一部を含むペプチドをコードするヌクレオチドを他のタンパク質（例、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））をコードするヌクレオチドと連結した発現ベクターを用いて、常法により他のタンパク質との融合タンパク質として宿主で発現させ、精製したものを免疫原として用いることができる。

ポリクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、免疫原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギ、好ましくはヤギ、ウマまたはウサギ、より好ましくはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜５回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から血清が取得される。

血清をポリクローナル抗体として用いることも可能であるが、好ましくは、限外ろ過、硫安分画、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（DEAEまたはDE52等）、抗イムノグロブリンカラムもしくはプロテインＡ/Ｇカラム、免疫原を架橋させたカラム等を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーにより単離および／または精製される。

モノクローナル抗体は、上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた免疫原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。

モノクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、免疫原を、マウス、ラットまたはハムスター（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内もしくは腹腔内に１〜数回注射するか、または移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞を取得する。

モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature, Vol.256, p.495-497, 1975）およびそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄または扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合により調製される。

細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（653；ATCC No.CRL1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14（Sp2/0、Sp2）、PAI、F0またはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11またはCEM-T15を使用することができる。

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。

前記ハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎仔血清を含むDMEM）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、上述のポリクローナル抗体と同様に、単離および／または精製されることが好ましい。

キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）, Vol.6, No.10, 1988」、特公平3-73280号公報等を参考に製造することができる。一本鎖抗体は、前記のようにして得たモノクローナル抗体をコードするDNAを遺伝子組換え技術により一本鎖抗体として発現するように連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、産生させることにより得られる。

ファージディスプレイによる抗体作製は、抗体スクリーニング用に作製されたファージライブラリーから、例えば、バイオパニングにより抗原に親和性を有するファージを回収、濃縮することにより、Fab等の抗体等を容易に得ることができる。

F(ab')₂およびFab'は、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素であるペプシンまたはパパインで処理することによりそれぞれ製造することができる。Fabは、Fab発現ファージライブラリーを上記ファージディスプレイによる抗体作製法と同様にスクリーニングすることにより、製造することができる。

本発明の診断薬は、上記抗体のみからなるものであってもよいし、医薬的に許容される担体を含んでいてもよい。医薬的に許容される担体としては、本発明の診断薬を液剤として調製する場合、製剤素材として慣用されている各種担体、例えば希釈剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤などを含んでいてもよい。さらに抗体の凝集を防ぐために、Tween20（登録商標）、Tween80（登録商標）などの界面活性剤を添加するのが好ましい。
希釈剤としては、水、生理用食塩水などが挙げられる。
溶剤としては、水、生理用食塩水、エタノールなどが挙げられる。
溶解補助剤としては、シクロデキストリン類などが挙げられる。
懸濁化剤としては、アラビアゴム、カルメロースなどが挙げられる。
等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの無機塩類、グリセリン、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物などが挙げられる。
緩衝剤としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられる。
これらの担体の配合比は、当業者が適宜決定することができる。

本発明の診断薬を用いて、後述する本発明の検出方法により被験者の血液試料を検査することで、より容易に心疾患または筋疾患の罹患の有無を判定することが可能となる。

２．心疾患または筋疾患の診断キット
本発明の診断キットに含まれる抗カベオリン３抗体は、「１．心疾患または筋疾患の診断薬」に記載の抗体と同様である。

本発明の診断キットには、上記抗体に加えて他の抗体または試薬等が含まれていてもよく、これらの抗体または試薬等は、あらかじめ上記抗体と一緒になっていてもよいし、別々の容器に格納されていてもよい。抗体または試薬などとしては、二次抗体、基質剤、標識物質（例、蛍光色素、酵素）、固相、反応容器の他に、処理液や抗体を希釈するための緩衝液、陽性対照（例、組換えカベオリン３）、陰性対照、プロトコールを記載した指示書などが挙げられる。これらの要素は、必要に応じてあらかじめ混合しておくこともできる。

本発明の診断キットにおいては、抗体はあらかじめ固相化されていてもよく、該抗体はあらかじめ標識されていてもよい。本発明の診断キットにおいて用いることができる固相としては特に限定されず、例えば、ポリスチレンなどのポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、ガラスフィルターなどの不溶性担体を挙げることができる。好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いるマイクロプレートである。

本発明の診断キットの形態も特に限定されないが、簡便に診断を行なうことを目的として、本発明の診断キットの構成成分が一体となった一体型の診断キットとすることができる。一体型の診断キットの形態としては、例えば、イムノクロマトグラフィー法を用いるカセット型が挙げられる。

本発明の診断キットの使用により、心疾患または筋疾患の罹患の有無の判定がより簡便に実施できるようになる。

３．心筋または骨格筋由来のカベオリン３の検出方法
本発明の心筋または骨格筋由来のカベオリン３の検出方法は、下記工程：
（１）被験者由来の血液試料と抗カベオリン３抗体とを接触させ、カベオリン３と抗体との複合体を形成させる工程；および
（２）工程（１）で形成された複合体中のカベオリン３を検出する（好ましくは定量的に検出する）工程；
を含むことを特徴とする（以下、本発明の検出方法ともいう）。

本発明の検出方法は、上記工程（２）の後に、
（３）工程（２）で検出されたカベオリン３のレベルと、正常対照のカベオリン３のレベルとを比較する工程；および
（４）工程（３）の比較結果に基づき、被験者が心疾患または筋疾患に罹患しているか否かを判定する工程；
を含むことが好ましい。

本発明の検出方法における被験者は、ヒトを始めとする哺乳動物であれば特に限定されるものではない。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができる。被験者は、心疾患または筋疾患が疑われるヒトが好ましい。

本発明の検出方法が測定対象とする生体試料は、哺乳動物、好ましくはヒトから採取可能なものであれば特に限定されるものではなく、血液、リンパ液、尿などの体液試料、心臓、骨格筋などの組織のバイオプシーが挙げられる。被験者への負担も小さいことから、好ましくは血液試料であり、血液試料としては、全血、血漿、血清などが挙げられるが、より好ましくは血清である。

カベオリン３蛋白質を検出するため、常法に従い、蛋白質を生体試料から単離することができる。蛋白質を抽出するための一般的な方法が、当技術分野において周知されており、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)など、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。なお、製造業者から入手した精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼインヒビターを用いて、製造業者の指示に従って蛋白質の単離を行うことができる。臨床現場において迅速な検出を目的とする場合は、血液試料中のカベオリン３蛋白質を対象とすることが好ましい。この場合、血液試料（好ましくは血清）から蛋白質を単離する代わりに、夾雑するアルブミンまたは免疫グロブリン等の蛋白質を除去してもよい。また、簡易検査を目的とする場合は、生体から採取した血液（好ましくは、血清）を前処理することなく、適宜希釈したサンプルをそのまま検出方法に供してもよい。

被験者由来の生体試料を抗カベオリン３抗体と接触させ、カベオリン３と抗体との複合体を形成させる。以下、血液試料（好ましくは、血清）を用いた態様について説明する。

前記抗体は、直接的または間接的に標識物質により標識されていてもよい。標識物質としては、蛍光物質（例、FITC、ローダミン）、放射性物質（例、³²P、³⁵S、¹⁴C、³H）、酵素（例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ）、着色粒子（例、金属コロイド粒子、着色ラテックス）、ビオチンなどが挙げられる。

また、前記抗体は、他に何も結合していない可溶性の状態で用いることも可能であるが、固相に結合していてもよい。「固相」としては、プレート（例、マイクロウェルプレート）、チューブ、ビーズ（例、プラスチックビーズ、磁気ビーズ）、クロマトグラフィー用担体（例、濾紙、ニトロセルロースメンブレンなどの吸水性基材、Sepharose）、メンブレン（例、ニトロセルロースメンブレン、PVDF膜）、ゲル（例、ポリアクリルアミドゲル）、金属膜（例、金膜）などが挙げられる。なかでも、プレート、ビーズ、クロマトグラフィー用担体およびメンブレンが好ましく用いられ、取り扱いの簡便性からプレートが最も好ましく用いられる。上記結合としては、共有結合、イオン結合、物理的吸着などが挙げられ、特に限定されないが、共有結合および／または物理的吸着が十分な結合強度を得られるため好ましい。また固相への結合は、固相に直接結合してもよいし、自体公知の物質を利用して間接的に固相に結合していてもよい。

また、非特異的吸着や非特異的反応を抑制するために牛血清アルブミン（BSA）や牛ミルク蛋白などのリン酸緩衝溶液を固相と接触させ、抗体によってコートされなかった固相表面部分を前記BSAや牛ミルク蛋白等などでブロッキングすることが一般に行われる。

抗カベオリン３抗体と被験者由来の生体試料との接触は、これらの抗体と生体試料中のカベオリン３等が相互作用できる方法であれば、態様、順序、具体的方法などは特に限定されない。接触は、例えば抗カベオリン３抗体が固相化されたプレートに生体試料を添加することでなされ得る。また例えば、生体試料をSDS-PAGEなどの手段によって分離し、メンブレンに移して固定した後、抗体と接触させることによってもなされ得る。

なお、かかる接触を保つ時間は、前記抗体と、被験者由来の生体試料中に含まれるカベオリン３等とが結合して複合体を形成するのに十分な時間であれば特に限定されないが、通常、数秒〜十数時間である。また、接触を行なう温度条件としては、通常4℃〜50℃であり、4℃〜37℃が好ましく、15℃〜30℃程度の室温が最も好ましい。さらに、反応を行なうｐＨ条件は、5.0〜9.0が好ましく、特に6.0〜8.0の中性域が好ましい。

工程（２）は、上記工程（１）で形成された複合体中のカベオリン３を検出する工程である。

上記検出には、カベオリン３を検出可能な任意の方法を用いることができ、例えばカベオリン３をその分子量に基づき検出する方法や、抗体を利用して検出する方法を用いる。

カベオリン３をその分子量に基づき検出する方法としては、ゲル電気泳動（例、SDS-PAGEなど）、各種の分離精製法（例、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、および質量分析計（例、二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計（TOF MS）、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）による測定、並びにそれらを組み合わせる方法などに供し、所定のマーカーペプチドの分子量と比較し、目的とする分子量のバンド、スポット、またはピークを検出することにより行うことができるが、これらに限定されない。

カベオリン３の検出の前に、工程（１）の反応液から上記複合体を単離してもよい。このような単離は、例えばヘパリンとの親和性を利用した単離法、または免疫沈降法などにより行なうことができ、工程（１）で用いる抗体に付加した適当な標識（例えばビオチンなど）を利用してもよい。

上記検出は、複合体が形成された状態で行なってもよい。あるいは、形成された複合体を試料から単離し、該複合体を解離させることによりカベオリン３を遊離させた状態で行なってもよい。

工程（２）でカベオリン３が検出された場合、被験者は心疾患または筋疾患を罹患している蓋然性が高いと判定することができる。カベオリン３が検出されないか検出限界以下の場合、被験者は心疾患または筋疾患に罹患していない蓋然性が低いと判定することができる。

カベオリン３を抗体を利用して検出する方法を採用する場合、本発明の工程（２）は、工程（１）で形成された複合体を、複合体のまま、または複合体を解離させカベオリン３が遊離した状態で、抗体と接触させることができる。抗体の標識、カベオリン３との接触方法および接触条件についての説明は、上記工程（１）における抗体の標識、生体試料との接触方法および接触条件についての対応する記載を適用することができる。

検出は、複合体に含まれるカベオリン３または工程（１）で使用した抗カベオリン３抗体を検出することによりなされる。このような検出は、複合体のまま、または複合体を解離させカベオリン３が遊離した状態で、行なうことができる。

上記検出は、酵素免疫測定法（EIA法）、蛍光免疫測定法（FIA）、イムノクロマトグラフィー法、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイなどにより行うことができ、これらの分析方法は当業者に周知である。

工程（２）の検出方法として、EIA法を選択した場合、本発明の検出方法を、工程（１）で用いる抗カベオリン３抗体とカベオリン３を認識する別の抗体とを用いたサンドイッチELISA法により実施することが好ましい。このようなサンドイッチELISA法は、抗原に対する特異性が高いため、本発明の実施に適している。

サンドイッチELISA法は、例えば次のように行なう。まず、工程（１）の抗体をELISA用プレートのウェル表面に固相化する。次いでウェル表面への非特異的な吸着を防ぐためにブロッキングを行なった後、生体試料を添加し、試料中のカベオリン３を該抗体と接触させて複合体を形成させる。該抗体と結合しなかった蛋白質を洗浄により除去した後、標識した別の抗カベオリン３抗体をウェルに加え、カベオリン３に接触させて複合体を形成させ、該標識により検出・定量を行なう。

サンドイッチELISA法には酵素標識抗体を使用することができる。標識に利用される酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが例示される。酵素の検出に用いられる基質剤としては、選択した標識酵素に応じて適当なものが選ばれる。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを選択した場合には、ｏ−フェニレンジアミン（OPD）、テトラメチルベンジジン（TMB）などが使用され、アルカリホスファターゼを選択した場合においては、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（PNPP）などが使用される。また、反応停止液、基質溶解液についても、選択した酵素に応じて、従来公知のものを特に制限なく適宜使用することができる。

サンドイッチELISA法の一種としてアビジン−ビオチン反応を利用した方法が適用可能である。この方法では、例えば試料中のカベオリン３を、固相化した工程（１）で用いる抗カベオリン３抗体でもって捕捉し、捕捉されたカベオリン３とビオチンで標識した別の抗カベオリン３抗体との間で抗原抗体反応を行なわせる。次に酵素標識ストレプトアビジンを加えて、アビジン−ビオチン反応を行わせる。次いでこの酵素を検出することで、カベオリン３を検出する。

上記のビオチンで標識した抗カベオリン３抗体は、ビオチンと、抗カベオリン３抗体とを自体公知の方法により結合させることにより製造することができる。このような標識は、例えば、市販のビオチン標識化キットを使用して行なうことができる。酵素標識ストレプトアビジンは、市販のものを使用することもできる。

上記の方法の他に、二次抗体を利用した方法も適用可能である。この方法では、工程（１）で用いる抗体と、当該抗体のIgドメインを認識する二次抗体との間で複合体を形成させる。二次抗体は酵素標識したものを用い、この酵素を検出することで、複合体中のカベオリン３の存在が判別される。酵素標識二次抗体は、市販のものを使用することができる。このような二次抗体を用いる方法は、本発明の検出方法の感度を増強し得る。

工程（２）の検出方法として、FIA法を選択した場合、上記EIA法において標識として用いた酵素を蛍光物質と置換することで、上記のサンドイッチELISA法と同様の方法により、カベオリン３の検出を行なうことができる。
蛍光物質としては、APC、PE、Cy2、Cy3、Cy5、ECD、FITC、PerCP、Alexa（登録商標）Fluor、フルオレセイン、ローダミンなどの化学物質を好ましく利用することができる。これらの化学物質による標識は、自体公知の方法で行なうことができる。
蛍光は、市販の測定機器、蛍光顕微鏡などを用いて検出することができる。

工程（２）の検出方法として、イムノクロマトグラフィー法を選択した場合、例えば、ニトロセルロースメンブレンなどの吸水性基材にライン状に固相化された工程（２）の抗体、メンブレン上に展開させた生体試料、および標識した工程（１）の抗体の三者間で複合体を形成させる。標識した工程（１）の抗体は、生体試料とあらかじめ混合してもよく、あるいは生体試料が工程（２）で用いる抗体に接触する前に、生体試料と接触するよう、吸水性基材上に供給しておいてもよい。複合体の形成は、標識に応じた手法により検出することができる。例えば、標識として金コロイド粒子を用いる場合、標識した抗体が集積した領域は赤色を呈するため、これにより検出する。

工程（２）の検出方法として、ウエスタンブロット法を選択することもできる。ウエスタンブロット法（イムノブロット法とも呼ばれる）は、試料中の特定の蛋白質を検出する方法である。変性条件下において蛋白質をポリペプチドの長さによって、または非変性条件下において蛋白質の三次元構造によって分離するために、ゲル電気泳動を行なう。次いで蛋白質をメンブレン（典型的にはニトロセルロースまたはPVDF）に移し、固定した後、標的蛋白質を、特異的抗体を使用して検出する。

本発明における検出工程は、カベオリン３を定量的に検出する工程であることが好ましい。定量は、用いた標識に基づき検出した生体試料についてのシグナルを、カベオリン３の標準試料を使用して作成した検量線を利用して数値化することなど、自体公知の方法により行なうことができる。カベオリン３の標準試料は、生体試料から調製したカベオリン３でもよく、またカベオリン３をコードする遺伝子情報に基づき自体公知の遺伝子工学的技術により調製することもできる。

（３）工程（２）で検出されたカベオリン３のレベルと、正常対照のカベオリン３のレベルとを比較する工程
検出工程（２）により得られた結果を利用して、工程（２）で検出されたカベオリン３のレベルと、正常対照のカベオリン３のレベルとを比較することができる。比較対象のカベオリン３のレベルは、健常または正常対照の試料中のカベオリン３の濃度範囲（統計学的研究により調べることができる）と比較することにより行なうことができる。また同一の被験者について、以前に測定したレベルと比較することもできる。

基準となるカベオリン３レベル（カットオフ値）は、目的に応じて設定される適切な基準である。カットオフ値は、その値を基準として疾患の判定をした場合に、高い診断感度（有病正診率）および高い診断特異度（無病正診率）の両方を満足できる値である。例えば、心疾患または筋疾患を発症した個体で高い陽性率を示し、かつ、心疾患または筋疾患を発症していない個体で高い陰性率を示す値をカットオフ値として設定することができる。カベオリン３は、健常人であっても運動による骨格筋の損傷により量的な増加が認められ得るので、例えば、健常人の「平均値＋２標準偏差」をカットオフ値と設定することができる。被験者の生体試料中のカベオリン３レベルを設定したカットオフ値と比較し、カットオフ値を上回るか否かを決定する。

イムノクロマト法などの簡易検査を行った場合、目視観察したシグナル（発色等）の有無により、生体試料中のカベオリン３の存否を決定することができる。

（４）工程（３）の比較結果に基づき、被験者が心疾患または筋疾患に罹患しているか否かを判定する工程
工程（３）の比較結果により被験者の生体試料中のカベオリン３レベルがカットオフ値を上回る場合、被験者は「心疾患または筋疾患に罹患している」可能性が高いと判定される。カットオフ値以下の場合、被験者は「心疾患または筋疾患に罹患している」可能性が低いと判定される。

また本発明の方法を用いて、心疾患または筋疾患を治療中の患者について、治療の効果を評価することもできる。このような患者から、治療前、治療中および／または治療後に生体試料を採取し、カベオリン３の濃度の変化を調べることで治療の効果を知ることができる。例えば、後の生体試料中のカベオリン３の濃度が先の生体試料中のものよりも低ければ、その治療を有効であると評価することができる。また、筋疾患の患者においては、心疾患を併発しているか併発する可能性のある場合も知られており、本発明の方法を用いて、ある患者の筋疾患および心疾患の病態を簡潔に総合的に把握することも可能である。

イムノクロマト法などの簡易検査を行った場合、シグナル（発色等）が目視観察により確認された場合、被験者は「心疾患または筋疾患に罹患している」蓋然性が高いと判定され、さらに他の診断方法を組み合わせて、心疾患または筋疾患の罹患の有無を判断することができる。

さらに本発明は、公知の心疾患または筋疾患の診断と併用することができる。本発明以外の心疾患の診断としては、非観血的検査（胸部Ｘ線検査、心電図検査、心エコー図検査（心臓超音波検査）、核医学検査等）、血液生化学検査（クレアチンキナーゼ、トロポニンT、トロポニンI、H-FABP、AST、CPK、LDH等の測定等）、観血的検査（冠動脈造影、左室造影、CT検査等）などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明以外の筋疾患の診断としては、血液生化学検査（クレアチンキナーゼ、トロポニンT、トロポニンＩ、ミオグロビン等の測定等）などが挙げられるが、これらに限定されない

本発明は、心疾患の診断として従来から用いられている血液生化学検査に比べて、早期（発症から６時間以内、好ましくは発症から３時間以内）に血液試料中で検出可能なカベオリン３をバイオマーカーとしているため、超急性期の心筋梗塞の有無を判定することができる。本発明を利用することで、重篤な心筋梗塞への移行または心筋梗塞の再発を防止し、心筋梗塞の予後の向上にも資することができる。

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。

（実施例１）ウエスタンブロット解析による測定
(1)患者血清分離とアルブミンおよびIgG除去
患者血液を肘静脈から採取し、遠心(700 x g, 10分)によって血清を分離した。この血清を、抗ヒトアルブミン抗体/プロテインG-レジンカラム(VIVASCIENCE社、Anti-HSA/IgG Kit)(www.fishersci.com/ecomm)で処理して、アルブミンとIgGを除去した血清を得た。
患者血液の取り扱いについては、川崎医科大学での倫理規定に従った。

(2）ウエスタンブロット解析
得られた血清(総蛋白量：20 mg)を、4-12%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して、PVDFメンブレンへトランスファーした。このメンブレンをメタノール処理して5%スキムミルク/0.1%Tween20含有50mM Tris緩衝液で1時間ブロッキングした。次いで、抗カベオリン3マウスモノクローナル抗体(サンタクルズ社、sc-5310)、抗カベオリン3ウサギポリクローナル抗体(Enzo社、ALX-210-241)、抗CKヤギポリクローナル抗体(サンタクルズ社、sc-15161)、抗トロポニンTウサギポリクローナル抗体(abcam社、ab89221)、抗トロポニンIウサギポリクローナル抗体(Cell Signaling 社、4002S)、抗ジストロフィンマウスモノクローナル抗体(NCL社、Dys-2)、抗β-ジストログリカンマウスモノクローナル抗体(NCL社、β-DG)、抗α-サルコグリカンマウスモノクローナル抗体(NCL社、α-SG)、抗ジスフェルリンマウスモノクローナル抗体(NCL社、Hamlet)によるウエスタンブロット解析をおこなった。化学発光により検出したバンドの輝度を、光学密度計測 (ルミノ・イメージアナライザー：GEヘルスケア社）によって定量した。

(3）血清CK値
血清中のクレアチンキナーゼの酵素活性は、クレアチンリン酸基質・テトラゾリウム塩法により測定した。結果をIU/L単位で示す。

結果
（1）カベオリン3蛋白質が筋疾患患者血中に出現
正常対照（レーン1-4）、筋疾患（レーン6：VLCAD欠損症）とてんかん重積（レーン 5:Status epilepticus)患者の血中（アルブミン/IgG除去血清）の筋ジストロフィー原因遺伝子産物と関連蛋白質についてウエスタンブロット法で解析した。ヒト骨格筋粗分画（* Muscle homogenate）を陽性コントロールとするとジストロフィン（デュシェンヌ型筋ジストロフィー産物）、カベオリン３ (LGMD1C産物)、α-サルコグリカン(LGMD2D産物)、β-ジストログリカン(ジストロフィン結合蛋白質)、ジスフェルリン(LGMD2B産物)はいずれも陰性であった(図１)。一方、カベオリン3は筋疾患とてんかん重積患者の血清で出現となった(図１、２)。血清CK値がより高値のてんかん重積患者でより蛋白量が高い傾向が認められた(図１、２)。この傾向は別のカベオリン3抗体でも一貫していた（図３）。

後述する通り、カベオリン3が、CKに先立ち超急性期から心筋梗塞患者の血中で上昇することから、この結果は、筋疾患とてんかん重積症では、CKの放出とは異なる「筋逸脱」の機構が存在することを示唆している。また、筋疾患およびてんかん重積の患者では、筋ジストロフィーの筋細胞膜障害の主役とされる構造蛋白質であるジストロフィン、α-サルコグリカン、β-ジストログリカンは、血中に出現しておらず、筋細胞膜障害の修復蛋白質であるジスフェルリンおよびMG53(Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Bansal D, Miyake K, Vogel SS, Groh S, Chen CC, Williamson R, McNeil PL, Campbell KP. Nature. 2003 May 8; 423(6936): 168-72、MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Cai C, Masumiya H, Weisleder N, Matsuda N, Nishi M, Hwang M, Ko JK, Lin P, Thornton A, Zhao X, Pan Z, Komazaki S, Brotto M, Takeshima H, Ma J. Nat Cell Biol. 2009 Jan; 11(1): 56-64)も血中に出現しないことから、カベオリン3は、筋ジストロフィーの筋細胞膜障害とは異なる筋疾患やてんかん重積患者に特有の筋細胞障害の筋逸脱機構を反映していることを示唆している。期せずして、カベオリン3は、骨格筋以外の筋疾患のマーカーとしても有用であることが明らかとなった。

(2）カベオリン3蛋白質は心筋梗塞患者血中でCKより早い超急性期に出現
95歳男性心筋梗塞(Myocardial infarction)患者の血中（アルブミン/IgG除去血清）カベオリン3について経時的にウエスタンブロット解析をおこなった。カベオリン3は心筋梗塞発症3時間（3 h)の超急性期から出現し経時的に減少していた。一方、CKは発症6時間の急性期（6 h)から遅れて出現し、最大値（max CK)となる発症後9時間でピークとなった（図４、５）。

この結果は、カベオリン３が、従来汎用されているCKよりも超急性期の心筋梗塞症を判定できるマーカーとして有用であることを示している。

（実施例２）ELISA測定系の構築
（1）固相化抗カベオリン3抗体の調製
50mM炭酸塩緩衝液(pH9.6)によって5μg/ml濃度に希釈した抗ヒトカベオリン3ポリクローナル抗体(sc-7665：サンタクルズ社)を、ELISAマイクロプレートに100μlずつ加え、4℃で一晩放置し吸着させた。
(2) 洗浄
0.05% Tween20含有PBS溶液(以下、洗浄用緩衝液)で3回洗浄を行った。
(3) ブロッキング処理
4%ブロックエース溶液(大日本製薬株式会社)を、マイクロプレートに300μLずつ加え、室温にて2時間ブロッキングを行い、その後、洗浄用緩衝液によって3回洗浄を行った。
(4) 検体と固相抗体の接触
0.1%牛血清アルブミン含有PBS溶液にて希釈したヒトカベオリン3蛋白ペプチド（アブカム社）を5〜5000μg/mLに調整した溶液100μLをマイクロプレートに入れ、これを室温で2時間振とう反応させ、その後、洗浄用緩衝液で3回洗浄を行った。
(5) 1次抗体の反応
抗ヒトカベオリン3モノクローナル抗体(sc-55518：サンタクルズ社)を、0.1%牛血清アルブミン含有PBS溶液によって1,000倍に希釈した。これを、マイクロプレートに100μLずつ加え、室温で1時間振とう反応させた。その後、洗浄用緩衝液で3回洗浄を行った。
(6) 標識化抗体
ヤギ抗マウス-HRP標識抗体 (アブカム社)を、0.1%牛血清アルブミン含有PBS溶液によって10,000倍に希釈した。これを、マイクロプレートに100μLずつ加え、室温で1時間振とう反応させた。その後、洗浄用緩衝液で3回洗浄を行った。
(7) 測定
TMB Substrate(DAKO社)を、マイクロプレートに100μLずつ加えて発色させ、30分後に0.5N硫酸100μlを加えて反応を停止させた。そして、450nmによって吸光度を測定した。
(8)検量線
以上の系を使い、合成したカベオリン3を標準品とした典型的な検量線を得た(図６)。図６は横軸にカベオリン3濃度（ng/mL）、縦軸に450nmの吸光度を示した。
これにより、カベオリン3の定量的な測定が可能であることが確認できた。カベオリン3の測定レンジは、50〜5000ng/mLであった。

考察
これまでに血中CK以外の骨格筋・心筋疾患のバイオマーカーの候補として、ミオグロビン、CK-MB、H-FABP、トロポニンＴ，トロポニンＩなどが利用されてきた（Sensitive cardiac troponin T assay. Lippi G, Cervellin G, Plebani M. N Engl J Med. 2010; 362(13): 1242、Myoglobin is a sensitive marker of increased muscle membrane vulnerability. Driessen-Kletter MF, Amelink GJ, Bar PR, van Gijn J. J Neurol. 1990; 237(4): 234-8、Cardiac-specific troponin I levels to predict the risk of mortality in patients with acute coronary syndromes. Antman EM, Tanasijevic MJ, Thompson B, Schactman M, McCabe CH, Cannon CP, Fischer GA, Fung AY, Thompson C, Wybenga D, Braunwald E. N Engl J Med. 1996; 335(18): 1342-9、The prognostic value of serum troponin T in unstable angina. Hamm CW, Ravkilde J, Gerhardt W, Jorgensen P, Peheim E, Ljungdahl L, Goldmann B, Katus HA. N Engl J Med. 1992 Jul 16; 327(3): 146-50、Evaluation of high-sensitivity assays for cardiac troponin. Morrow DA, Antman EM. Clin Chem. 2009; 55(1): 5-8.生物試料分析2004;27(5)):321-327）。しかしながら、従来から診断に用いられているCK、ミオグロビン、CK-MB、H-FABPなどのマーカーは、いずれも心筋特異性が低く、それ単独での判定では的確性を欠いている(例えば、生物試料分析 2004;27(5)):321-327.参照)。しかも、骨格筋・心筋疾患の中で最も的確かつ早期の確定診断が要求されるのは急性冠症候群であり、とりわけ、ST上昇型-急性心筋梗塞は速やかに経皮的冠動脈インターベンション（PCI）などの再灌流療法を行うことで患者の予後改善につながることがわかっているにもかかわらず、近年、高感度測定方法が開発され、他のマーカーよりも心筋特異性の高いマーカーとして急性冠症候群の診断に用いられているトロポニンＴ、トロポニンＩですら、心不全、腎不全、心筋炎、急性肺血栓塞栓症、敗血症など虚血以外の原因による心筋傷害や、測定方法が高感度ゆえに微小筋障害でも検出されるため、その特異性には疑問があり、急性心筋梗塞の判定には注意が必要とされている(例えば、ST上昇型急性心筋梗塞の診療に関するガイドライン（2013年改訂版）:18-19(一般社団法人日本循環器学会 WEB公開、http://www.j-circ.or.jp/guideline/参照)。さらに、トロポニンは前記の疾患発症後も長期間血中に存在するため発症直後の病態を反映しているかどうかも単回の測定では判断しにくいため、超急性期の心筋梗塞の判定には他のマーカーとの併用やそのピークの検出が必要とされており、依然として、超急性期の心筋梗塞の判定に有用なマーカーが求められている。
前記マーカー類に比して、本発明のカベオリン3は、トロポニン同様心筋特異性が高く、心筋疾患のバイオマーカーとして有用であることは明らかである。
しかも、本発明のカベオリン3は、図4及び図5から明らかなように、心筋梗塞の超急性期に血中に出現し、発症後３時間以内にそのピークを迎え、その後急速に減少することから、超早期の急性心筋梗塞症の病態を明確に反映しているマーカーとして、単独で、ST上昇型急性心筋梗塞の判別を可能とするものであり、CK等の従来のマーカーと併用すれば、さらにその精度を向上することが可能となるので、急性心筋梗塞の超早期診断マーカーとして極めて有用と考えられる
一方、図4から明らかなように、トロポニンＴ、トロポニンＩ発症後３時間以内にはウエスタン解析では血中出現が確認できない。

本発明の診断薬および診断キットによれば、心疾患または筋疾患の罹患の有無を早期かつ簡便に判定することができる。本発明の検出方法によれば、心疾患または筋疾患の罹患の有無、治療効果の有無を単独で、あるいは他の診断方法と組み合わせて適切に判定することができる。
心筋梗塞等の急性心疾患においては、これまで超早期の正確な確定診断が困難であったが、本発明はバイオマーカーによる早期診断の確立に寄与することができる。
本出願は、日本で出願された特願２０１５−２３４７１４（出願日：平成２７年１２月１日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正および変更も、すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。

Claims

発症から６時間以内の急性心筋梗塞を診断するための、抗カベオリン３抗体を含有する診断薬。
発症から６時間以内の急性心筋梗塞がＳＴ上昇型急性心筋梗塞症である、請求項１に記載の診断薬。
急性心筋梗塞が疑われる被験者由来の発症後６時間以内の血液試料を測定対象とするものである、請求項１または２に記載の診断薬。
発症から６時間以内の急性心筋梗塞を判定するための、抗カベオリン３抗体を含有する診断キット。
発症から６時間以内の急性心筋梗塞がＳＴ上昇型急性心筋梗塞症である、請求項４に記載のキット。
急性心筋梗塞が疑われる被験者由来の発症後６時間以内の血液試料を測定対象とするものである、請求項４または５に記載のキット。
下記の工程：
（１）急性心筋梗塞が疑われる被験者由来の発症後６時間以内の血液試料を抗カベオリン３抗体と接触させ、カベオリン３と抗体との複合体を形成させる工程；および
（２）工程（１）で形成された複合体中のカベオリン３を検出する工程；
を含む、発症から６時間以内の急性心筋梗塞を判定するためのカベオリン３の検出方法。
急性心筋梗塞がＳＴ上昇型急性心筋梗塞症である、請求項７に記載の検出方法。
ミオトニア症候群、先天性ミオパチー、甲状腺中毒性ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、薬剤性ミオパチー、ステロイドミオパチー、アルコール性ミオパチー、中毒性ミオパチー、周期性四肢麻痺、炎症性ミオパチー、内分泌疾患に伴うミオパチー、代謝性ミオパチー、膠原病に伴うミオパチー、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、脂肪酸代謝障害、感染性筋炎、ミオグロビン尿症、ＨＩＶ関連ミオパチー、てんかん重積、および外傷、虚血、クランプのいずれかによる骨格筋の損傷からなる群より選ばれる筋疾患を診断するための、抗カベオリン３抗体を含有する診断薬。
ミオトニア症候群、先天性ミオパチー、甲状腺中毒性ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、薬剤性ミオパチー、ステロイドミオパチー、アルコール性ミオパチー、中毒性ミオパチー、周期性四肢麻痺、炎症性ミオパチー、内分泌疾患に伴うミオパチー、代謝性ミオパチー、膠原病に伴うミオパチー、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、脂肪酸代謝障害、感染性筋炎、ミオグロビン尿症、ＨＩＶ関連ミオパチー、てんかん重積、および外傷、虚血、クランプのいずれかによる骨格筋の損傷からなる群より選ばれる筋疾患を判定するための、抗カベオリン３抗体を含有する診断キット。
下記の工程：
（１）ミオトニア症候群、先天性ミオパチー、甲状腺中毒性ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、薬剤性ミオパチー、ステロイドミオパチー、アルコール性ミオパチー、中毒性ミオパチー、周期性四肢麻痺、炎症性ミオパチー、内分泌疾患に伴うミオパチー、代謝性ミオパチー、膠原病に伴うミオパチー、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、脂肪酸代謝障害、感染性筋炎、ミオグロビン尿症、ＨＩＶ関連ミオパチー、てんかん重積、および外傷、虚血、クランプのいずれかによる骨格筋の損傷からなる群より選ばれる筋疾患が疑われる被験者由来の血液試料を抗カベオリン３抗体と接触させ、カベオリン３と抗体との複合体を形成させる工程；および
（２）工程（１）で形成された複合体中のカベオリン３を検出する工程；
を含む、筋疾患を判定するためのカベオリン３の検出方法。