JP6798494B2

JP6798494B2 - システイン誘導体及びシステインスルホキシド誘導体の製造方法

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Publication number: JP6798494B2
Application number: JP2017531062A
Authority: JP
Inventors: 山本　英樹; 英樹山本; 誠吾菅原
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2016-06-07
Publication date: 2020-12-09
Anticipated expiration: 2036-06-07
Also published as: WO2017018060A1; JPWO2017018060A1

Description

本発明は、システイン誘導体及びシステインスルホキシド誘導体の製造方法に関する。

システイン誘導体やシステインスルホキシド誘導体は、医薬品の中間体、食品添加物の原材料として期待されており、安価な工業的製法が種々検討されている。システイン誘導体の製造法として、システインデスルフヒドラーゼ（特許文献１、２）、トリプトファンシンターゼ（特許文献３、４）によるＳ−アルキルシステイン又はＳ−アルケニルシステインの製造法の報告があるが、その産生量は十分なものではない。

一方、システインスルホキシド誘導体の製造法として、過酸化水素によるＳ−アルキルシステインスルホキシド又はＳ−アルケニルシステインスルホキシドの製造法が複数報告されているが（非特許文献１、２）、食品に使用する際には残存する過酸化水素の除去が必要となる。

特開昭５０−１３２１７８号公報特開昭５２−１３９７８５号公報特開昭５８−１４６２８７号公報特開２００６−２８８２４２号公報

Bull. Korean Chem. Soc. (2011) Vol.32, No.1 319 Tetrahedron: Asymmetry 24 (2013) pp.990-94

本発明は、医薬品の中間体、食品添加物の原材料として期待されているシステイン誘導体やシステインスルホキシド誘導体、特に、Ｓ−アルキルシステインやＳ−アルケニルシステイン等のシステイン誘導体、及びＳ−アルキルシステインスルホキシドやＳ−アルケニルシステインスルホキシド等のシステインスルホキシド誘導体を、工業的規模で安定的に、且つ食品に使用する際にも安全な方法で製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成すべく、チオール化合物とＬ−セリンから酵素的にシステイン誘導体を製造する方法に着目し、鋭意検討した結果、シスタチオニンβ−シンターゼがその責任酵素となり得ることを見出した。さらに、システイン誘導体を酵素的にシステインスルホキシド誘導体に変換する方法に着目し、鋭意検討した結果、オキシダーゼによって効率よくシステイン誘導体をシステインスルホキシド誘導体に変換する方法を見出した。これらの知見を得て、従来に比べ、より効率よく、安定的にシステイン誘導体及びシステインスルホキシド誘導体を得ることに成功して本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の通りである。
［１］シスタチオニンβ−シンターゼの存在下、式（Ｉ）：

（式中、ＲはＣ_１−６アルキル基又はＣ_２−６アルケニル基を表す）
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させることを特徴とする、式（ＩＩ）：

（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステイン誘導体の製造方法。
［２］各式中、Ｒが１−プロペニル基、プロピル基、メチル基またはアリル基である、上記［１］記載の方法。
［３］前記シスタチオニンβ−シンターゼがシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物由来である、上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］前記微生物が、シスタチオニンβ−シンターゼ活性が増強されている変異株である、上記［３］記載の方法。
［５］前記シスタチオニンβ−シンターゼがＣＹＳ４遺伝子によってコードされる酵素である、上記［４］記載の方法。
［６］前記微生物が、シスタチオニンγ−リアーゼ活性が低減されている変異株である、上記［３］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記シスタチオニンγ−リアーゼがＣＹＳ３遺伝子によってコードされる酵素である、上記［６］記載の方法。
［８］前記微生物が酵母である、上記［３］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記酵母がSaccharomyces属酵母である、上記［８］記載の方法。
［１０］前記Saccharomyces属酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、上記［９］記載の方法。
［１１］シスタチオニンβ−シンターゼの存在下、式（Ｉ）：

（式中、ＲはＣ_１−６アルキル基又はＣ_２−６アルケニル基を表す）
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させて式（ＩＩ）：

（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステイン誘導体を製造する工程（工程１）、及び
工程１で得られたシステイン誘導体と、オキシダーゼ及びその基質とを反応させて式（ＩＩＩ）：

（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステインスルホキシド誘導体を製造する工程（工程２）を含む、該システインスルホキシド誘導体の製造方法。
［１２］オキシダーゼがグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ及びアシルＣｏＡオキシダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、上記［１１］記載の方法。
［１３］各式中、Ｒが１−プロペニル基、プロピル基、メチル基またはアリル基である、上記［１１］又は［１２］記載の方法。
［１４］前記シスタチオニンβ−シンターゼがシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物由来である、上記［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記微生物が、シスタチオニンβ−シンターゼ活性が増強されている変異株である、上記［１４］記載の方法。
［１６］前記シスタチオニンβ−シンターゼがＣＹＳ４遺伝子によってコードされる酵素である、上記［１５］記載の方法。
［１７］前記微生物が、シスタチオニンγ−リアーゼ活性が低減されている変異株である、上記［１４］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記シスタチオニンγ−リアーゼがＣＹＳ３遺伝子によってコードされる酵素である、上記［１７］記載の方法。
［１９］前記微生物が酵母である、上記［１４］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］前記酵母がSaccharomyces属酵母である、上記［１９］記載の方法。
［２１］前記Saccharomyces属酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、上記［２０］記載の方法。
［２２］シスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母を培養し、該酵母の抽出物および／または培養物の存在下、式（Ｉ）：

（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステイン誘導体の製造方法。
［２３］各式中、Ｒが１−プロペニル基、プロピル基、メチル基またはアリル基である、上記［２２］記載の方法。
［２４］シスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母を培養し、該酵母の抽出物および／または培養物の存在下、式（Ｉ）：

（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステインスルホキシド誘導体を製造する工程（工程２）を含む、該システインスルホキシド誘導体の製造方法。
［２５］オキシダーゼがグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ及びアシルＣｏＡオキシダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、上記［２４］記載の方法。
［２６］各式中、Ｒが１−プロペニル基、プロピル基、メチル基またはアリル基である、上記［２４］又は［２５］記載の方法。
［２７］前記酵母が、ＣＹＳ４遺伝子高発現変異株；ＣＹＳ３遺伝子低発現変異株；及びＣＹＳ４遺伝子高発現且つＣＹＳ３遺伝子低発現変異株からなる群より選択される少なくとも１種である、上記［２２］〜［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］前記酵母がSaccharomyces属酵母である、上記［２２］〜［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］前記Saccharomyces属酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、上記［２８］記載の方法。
［３０］該酵母の抽出物および／または培養物のシスタチオニンβ−シンターゼ活性が、抽出物および／または培養物１ｇあたり２５００Ｕ以上、５０００Ｕ以上、１００００Ｕ以上、２００００Ｕ以上、３００００Ｕ以上、又は４００００Ｕ以上である、上記［２２］〜［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］該酵母の抽出物および／または培養物のシスタチオニンβ−シンターゼ活性が、抽出物および／または培養物１ｇあたり１×１０^６Ｕ以下、５×１０^５Ｕ以下、１×１０^５Ｕ以下、又は５×１０^４Ｕ以下である、上記［２２］〜［３０］のいずれかに記載の方法。
［３２］該酵母の抽出物および／または培養物のシスタチオニンγ−リアーゼ活性が、抽出物および／または培養物１ｇあたり１００Ｕ以下、５０Ｕ以下、１０Ｕ以下、１Ｕ以下、又は実質的に含まないかあるいは０Ｕである、上記［２２］〜［３１］のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、より効率よく、且つ安定的にシステイン誘導体及びシステインスルホキシド誘導体を製造することができる。

各種酵素をコードする遺伝子を欠失させた酵母変異株におけるＳ−アリルシステイン（ＡＬＣ）の生成量を測定した結果を示すグラフである。野生株：実験室酵母であるSaccharomyces cerevisiae BY4742、ΔＣＹＳ３：ＣＹＳ３遺伝子欠失変異株、ΔＣＹＳ４：ＣＹＳ４遺伝子欠失変異株、ΔＴＲＰ５：ＴＲＰ５遺伝子欠失変異株、ΔＭＥＴ１７：ＭＥＴ１７遺伝子欠失変異株。縦軸は反応液中のＡＬＣの濃度（ｐｐｍ）を示す。精製シスタチオニンβ−シンターゼ存在下、Ｓ−アリルメルカプタンとＬ−セリンとを反応させて得られるＳ−アリルシステイン（ＡＬＣ）の生成量を経時的に定量した結果を示すグラフである。縦軸は反応液中のＡＬＣの濃度（ｐｐｍ）を示す。横軸は反応時間（ｈｒ）を示す。精製シスタチオニンβ−シンターゼ存在下、Ｓ−メチルメルカプタンとＬ−セリンとを反応させて得られるＳ−メチルシステインの生成量を経時的に定量した結果を示すグラフである。縦軸は反応液中のＳ−メチルシステインの濃度（ｐｐｍ）を示す。横軸は反応時間（ｈｒ）を示す。精製シスタチオニンβ−シンターゼ存在下、Ｓ−プロピルメルカプタンとＬ−セリンとを反応させて得られるＳ−プロピルシステインの生成量を経時的に定量した結果を示すグラフである。縦軸は反応液中のＳ−プロピルシステインの濃度（ｐｐｍ）を示す。横軸は反応時間（ｈｒ）を示す。グルコースオキシダーゼ存在下、あるいは非存在下での、グルコースとＳ−アリルシステインとを反応させて得られるＳ−アリルシステインスルホキシド（ＡＬＣＳＯ）の生成量を経時的に定量した結果を示すグラフである。上段は試験区１の、中段は試験区２の、下段は試験区３の結果をそれぞれ示す。縦軸は反応液中のグルコン酸、ＡＬＣ、ＡＬＣＳＯの濃度（ｐｐｍ）を示す。横軸は反応時間（ｈｒ）を示す。菌株から粗酵素液を調製する方法を示すチャート図である。ＡＬＣ生成試験における各反応条件を示す。各菌株（親株、cys3Δ、CYS4↑、cys3Δ+CYS4↑）のＡＬＣ蓄積能を示したグラフである。縦軸は酵母乾燥重量当たりのＡＬＣ蓄積量（％）を示す。

本明細書中、「Ｃ_１−６アルキル基」とは、炭素数１〜６、好ましくは１〜３の直鎖又は分岐鎖アルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。好ましくは、メチル及びプロピルである。
本明細書中、「Ｃ_２−６アルケニル基」とは、炭素数２〜６、好ましくは２又は３の直鎖又は分岐鎖アルケニル基を意味し、前記アルキル基において、１個又は複数の二重結合を有するもの等が挙げられる。具体的には、ビニル、アリル（２−プロペニル）、１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等が挙げられる。好ましくは１−プロペニル又はアリルである。

１．システイン誘導体の製造方法
本発明は、式（ＩＩ）：

（式中、ＲはＣ_１−６アルキル基又はＣ_２−６アルケニル基を表す）
で表されるシステイン誘導体（以下、単にシステイン誘導体（ＩＩ）とも称する）を酵素的に製造する方法を提供する。
当該方法は、シスタチオニンβ−シンターゼの存在下、式（Ｉ）：

（式中、Ｒの定義は上述の通りである）
で表されるチオール化合物（以下、単にチオール化合物（Ｉ）とも称する）とＬ−セリンとを反応させることを特徴とする。
本発明において、Ｒとして好ましくは、１−プロペニル基、プロピル基、メチル基及びアリル基である。

シスタチオニンβ−シンターゼは、ホモシステインとセリンからシスタチオニンを合成する反応を触媒する酵素をいい、ＥＣ４．２．１．２２に分類される。その構造遺伝子は例えばSaccharomyces cerevisiaeではＣＹＳ４遺伝子（GenBank NM_001181284）として知られている。本発明で用いられるシスタチオニンβ−シンターゼは、チオール化合物（Ｉ）とＬ−セリンとからシステイン誘導体（ＩＩ）を製造できるものであればその由来は特に限定されない。天然物であっても、化学的又は生化学的に合成されたものであってもよく、また、遺伝子工学的に生産されたものであってもよい。好ましくはシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物由来である。シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物は、シスタチオニンβ−シンターゼを細胞内に蓄積できるものであれば特に限定されない。具体的には、酵母、糸状菌、担子菌などが挙げられ、好ましくは酵母である。酵母とは、単細胞の真菌を示し、有胞子酵母、担子菌酵母、不完全酵母などが挙げられる。この中でも例えば、Saccharomyces属、Candida属、Picha属、Hansenula属、Zygosaccharomyces属など有胞子酵母が好ましく、Saccharomyces属、Candida属がより好ましく、Saccharomyces属が最も好ましい。Saccharomyces属酵母には、実験室酵母、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母なども含まれる。より好ましくはSaccharomyces cerevisiae及びCandida utilisであり、最も好ましくはSaccharomyces cerevisiaeである。これらの菌株は商業的に入手が可能であるか、あるいは既知文献に基づいて入手、調製が可能である。例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）では、各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。Saccharomyces cerevisiaeとしては、具体的には、ＢＹ４７４２株(ATCC204508)やＳ２８８Ｃ株(ATCC26108)を用いることができる。また、Candida utilisとしては、具体的には、Candida utilis ATCC22023株を用いることができる。特に好ましくはSaccharomyces cerevisiaeである。

シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物は、野生株であってもよいし、システイン誘導体（ＩＩ）の合成に関与する酵素に変異を有するよう改変されたもの、即ち変異株であってもよい。
シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物における、システイン誘導体（ＩＩ）の合成に関与する酵素としては、後述の実施例で本発明者らが明らかにしているように、正に制御する酵素としてシスタチオニンβ−シンターゼが、負に制御する酵素としてシスタチオニンγ−リアーゼが挙げられる。シスタチオニンγ−リアーゼは、シスタチオニンをシステインとα−ケト酪酸に分解するような反応を触媒する酵素をいい、ＥＣ４．４．１．１に分類される。その構造遺伝子は例えばSaccharomyces cerevisiaeではＣＹＳ３遺伝子（GenBank NM_001178157）として知られている。
ここで、「変異株」とは、野生株もしくは改変前の株（親株）と比較して、該酵素活性が増強されている、あるいは低減されている（活性の完全な消失も含む）株のことを意味する。本発明において好適に用いられる変異株としては、Saccharomyces cerevisiae変異株が挙げられ、特に、シスタチオニンβ−シンターゼをコードする遺伝子を高発現する「ＣＹＳ４遺伝子高発現変異株」やシスタチオニンγ−リアーゼをコードする遺伝子の発現が抑制された「ＣＹＳ３遺伝子低発現変異株」が挙げられる。野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）と比較した場合、「ＣＹＳ４遺伝子高発現変異株」では、ＣＹＳ４遺伝子の発現が有意に増強されており、具体的には、１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上、特に好ましくは５倍以上、最も好ましくは１０倍以上増強されている。野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）と比較した場合、「ＣＹＳ３遺伝子低発現変異株」では、ＣＹＳ３遺伝子の発現が有意に低減されており、具体的には５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下に低減されている。また、シスタチオニンγ−リアーゼ遺伝子の発現が実質的に消失している（即ち、検出限界未満である）のが好ましい。これらの変異株は天然に存在する（自然変異）ものであってもよいし、人為的に作出されたものであってもよい。人為的に作出する方法としては、セルフクローニングによる方法、従来育種法（例えば薬剤変異、交雑）等が挙げられる。後述の「酵素活性が低減されるような改変」あるいは「酵素活性を増強させるような改変」の為の各手法であってもよい。

「酵素活性が低減されている」とは、目的の酵素活性（本発明ではシスタチオニンγ−リアーゼ活性）が野生株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）と比較した場合、シスタチオニンγ−リアーゼ活性は、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下に低減されている。また、シスタチオニンγ−リアーゼ活性は実質的に消失しているのが好ましい。

酵素活性が低減されるような改変は、例えば、突然変異処理又は遺伝子組換え技術により実施することができる。

突然変異処理としては、紫外線照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異処理に通常用いられている変異剤による処理が挙げられる。

遺伝子組換え技術としては、例えば、公知の技術（FEMS Microbiology Letters 165 (1998) 335-340、 JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1995, p7171-7177、Curr Genet 1986; 10(8): 573-578、WO 98/14600等）を利用できる。

また、酵素活性が低減される（酵素活性の完全な消失を含む）ような改変は、例えば、該酵素をコードする遺伝子を破壊することにより実施することができる。遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部を欠失させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる。また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。

「酵素活性が増強されている」とは、目的の酵素活性（本発明ではシスタチオニンβ−シンターゼ活性）が野生株や親株等の非改変株と比較して増強されていることを意味する。シスタチオニンβ−シンターゼ活性は、野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）と比較した場合、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上、特に好ましくは５倍以上、最も好ましくは１０倍以上に増強されている。

酵素活性を増強させるような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を増大させることにより達成できる。遺伝子の発現の増大は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。また、遺伝子の発現の増大は、例えば、染色体上に目的の遺伝子を導入する等して遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。また、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させてもよい。さらに遺伝子のコピー数の増加は、目的遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。また、酵素活性が増強されるような改変は、例えば、目的の酵素の比活性を増大させることによっても達成できる。また、「酵素活性が増強されている」とは、もともと目的の酵素活性を有する微生物において目的の酵素活性を増強させるだけでなく、もともと目的の酵素活性を有さない菌株において目的の酵素活性を付与するよう該酵素をコードする遺伝子を新たに導入し、当該酵素を発現するようになる場合を含む。

目的遺伝子を宿主に導入する場合、宿主は目的遺伝子が由来する菌株と同種であっても異種であってもよい。

目的の酵素活性が増強された、あるいは低減されたことの確認は、同酵素の活性を測定することによって行うことができる。シスタチオニンβ−シンターゼの活性を測定する方法としては、例えばKrausらの方法（Jan P. Kraus, Methods in ENZYMOLOGY 143 (1987) 388-394）及びそれに準じた方法が挙げられる。より具体的には、シスタチオニンβ−シンターゼの活性は、緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ９）中、基質（３ｍＭホモシステイン、３ｍＭセリン、１００μＭピリドキサールリン酸）と４５℃で１時間反応させる方法によって測定することができる。本発明及び本明細書では該反応により１分間に１μｍｏｌのシスタチオニンを生成するのに必要な酵素量を１Ｕと定義する。シスタチオニンγ−リアーゼの活性を測定する方法としては、例えばYamagataらの方法（Journal of Bacteriology,Aug.1993,p.4800-4808）及びそれに準じた方法が挙げられる。より具体的には、シスタチオニンγ−リアーゼの活性は、緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．４）中、基質［３ｍＭシステイン（シスタチオニンを基質とすると、β−リアーゼが共存している場合、その活性が測定値に影響を与える場合があるのでシステインを基質とする）、１００μＭピリドキサールリン酸］と３０℃で１時間反応させる方法によって測定することができる。本発明及び本明細書では該反応により１分間に１μｍｏｌのピルビン酸を生成するのに必要な酵素量を１Ｕと定義する。

目的の酵素活性が増強された、あるいは低減されたことの確認は、目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が増加あるいは減少したことを確認することや、目的の酵素の量が増加あるいは減少したことを確認することにより行うことが出来る。

目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が増加あるいは減少したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。該転写量が減少している場合には、mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に減少していることが好ましい。該転写量が増加している場合には、mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、または１０倍以上に増加していることが好ましい。

目的の酵素の量が増加あるいは減少したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。目的の酵素の量が減少している場合には、その量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に減少していることが好ましい。目的の酵素の量が増加している場合には、その量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、または１０倍以上に増加していることが好ましい。

尚、シスタチオニンβ−シンターゼの酵素反応の生成物であるシスタチオニンはシスタチオニンγ−リアーゼにより分解される為、シスタチオニンγ−リアーゼ共存下では、上記測定法によるシスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子の発現量における変動の程度と上記測定法によるシスタチオニンβ−シンターゼ活性における変動の程度とは必ずしも一致しない。シスタチオニンγ−リアーゼ共存下では、シスタチオニンβ−シンターゼ活性はシスタチオニンγ−リアーゼが存在しない場合に比べて低い値となる。シスタチオニンγ−リアーゼ共存下でシスタチオニンβ−シンターゼ活性を測定する場合には予めシスタチオニンγ−リアーゼ活性によるシスタチオニンの消費量を算出し補正しておくことが好ましい。

本発明において好ましく用いられるシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物としては、（Ａ）シスタチオニンβ−シンターゼ活性が増強されている変異株、（Ｂ）シスタチオニンγ−リアーゼ活性が低減されている変異株、あるいは（Ｃ）シスタチオニンβ−シンターゼ活性が増強され且つシスタチオニンγ−リアーゼ活性が低減されている変異株であり、より好ましくは（Ｄ）ＣＹＳ４遺伝子高発現変異株、（Ｅ）ＣＹＳ３遺伝子低発現変異株、あるいは（Ｆ）ＣＹＳ４遺伝子高発現且つＣＹＳ３遺伝子低発現変異株酵母である。
変異株（Ｅ）の好ましい一実施態様としては、ＣＹＳ３遺伝子破壊変異株（Ｅ’）が挙げられる。変異株（Ｆ）の好ましい一実施態様としては、ＣＹＳ４遺伝子高発現且つＣＹＳ３遺伝子破壊変異株（Ｆ’）が挙げられる。

本発明で用いるシスタチオニンβ−シンターゼは、これを産生する微生物（例えば、シスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母、当該酵母のＣＹＳ４遺伝子高発現及び／又はＣＹＳ３遺伝子破壊変異株）を培養して得られる微生物の培養物から調製することができる。例えば、シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物の培養方法を以下に示す。

シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物を培養するための培地としては、使用するシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物の種類によって適宜選択される。炭素源、窒素源、無機物および必要に応じて少量の微量栄養素を含むものであれば、合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用する炭素源および窒素源は使用する微生物の利用可能なものならばいずれの種類を用いてもよい。炭素源としては、グルコ−ス、グリセロール、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜など種々の炭水化物が使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類、または肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆粕あるいはその消化物などの天然有機窒素源が使用可能である。天然有機窒素源の多くの場合は窒素源であるとともに炭素源にもなり得る。無機物としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄などが必要に応じて使用できる。例えば、実施例に記載したＹＰＤ培地を好適に利用することができる。

培養は、振とう培養あるいは通気撹拌深部培養などの好気的条件下で行う。培養温度は好ましくは２０〜５０℃、特に好ましくは２８〜３７℃の範囲である。培養中の培地のｐＨは微生物の生育に応じて適宜調整すればよく、例えばｐＨ５〜７が挙げられる。培養時間は通常１２時間〜１０日間、より好ましくは２４時間〜５日間、さらに好ましくは３６時間〜３日間である。

前記のようにして得られる微生物等を含む培養物からシスタチオニンβ−シンターゼを回収する。本発明で使用されるシスタチオニンβ−シンターゼはその酵素活性が維持されている限り必ずしも単離精製されている必要はない。すなわち、シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物（好ましくはシスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母）をそのまま、あるいは該微生物の培養物、該培養物から遠心分離などの方法によって採取した生菌体、その乾燥菌体を本発明の方法に用いることができる。あるいはシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物（好ましくはシスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母）の生菌体あるいはその乾燥菌体を破砕、自己消化、超音波などで処理することによって得られる抽出物（菌体処理物とも称する）を本発明の方法に用いることができる。さらに該菌体処理物から得られるシスタチオニンβ−シンターゼを含む粗精製物を本発明の方法に用いることができる。また、これらの固定化酵素または固定化菌体を本発明の製造方法に用いることもできる。

本発明の方法において、シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物（好ましくはシスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母）の抽出物および／または培養物をシスタチオニンβ−シンターゼとして用いる場合、該抽出物および／または培養物の酵素活性は、１ｇあたり、通常２５００Ｕ以上であり、好ましくは５０００Ｕ以上、１００００Ｕ以上、２００００Ｕ以上、３００００Ｕ以上、又は４００００Ｕ以上である。酵素活性が低すぎると十分な酵素反応が得られない。一方、操作性やコストの観点から、該抽出物および／または培養物の酵素活性は、１ｇあたり、通常１×１０^６Ｕ以下、好ましくは５×１０^５Ｕ以下、１×１０^５Ｕ以下、又は５×１０^４Ｕ以下である。
本発明の方法において、シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物（好ましくはシスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母）の抽出物および／または培養物をシスタチオニンβ−シンターゼとして用いる場合、該抽出物および／または培養物はシスタチオニンγ−リアーゼ活性が低いものであることが好ましい。従って、該抽出物および／または培養物のシスタチオニンγ−リアーゼ活性は、通常１ｇあたり１００Ｕ以下、５０Ｕ以下、１０Ｕ以下、１Ｕ以下、又は実質的に含まないかあるいは０Ｕである。

チオール化合物（Ｉ）とＬ−セリンとを前記のシスタチオニンβ−シンターゼの存在下で反応させることにより、システイン誘導体（ＩＩ）を製造することができる。原料である、Ｌ−セリン及びチオール化合物（Ｉ）はいずれも市販されており容易に入手可能である。

チオール化合物（Ｉ）とＬ−セリンとの反応は、通常、水性溶媒中で行われる。水性溶媒としては、酵素反応を阻害しない限り特に限定されないが、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙げることができる。

反応液中のＬ−セリンの濃度は特に限定されないが、好ましくは１〜２０重量％、特に好ましくは１〜１０重量％である。

反応液中のチオール化合物（Ｉ）の濃度は、用いる化合物の種類によっても異なり、酵素反応を阻害しない範囲であれば特に制限されないが、好ましくは１０重量％以下の濃度で使用される。なお、反応中に酵素反応を阻害しない濃度範囲になるように、チオール化合物（Ｉ）を逐次添加してもよい。また、反応に際して、基質の他に補酵素であるピリドキサールリン酸を０．１〜１００ｐｐｍの範囲で添加することが好ましい。

反応に用いるシスタチオニンβ−シンターゼの量は、基質濃度、反応時間、その他の条件によって適宜調整し得るが、好ましくは反応液１ｇ当たり０．１Ｕ〜１０００Ｕ、好ましくは１Ｕ〜５００Ｕ、より好ましくは１０Ｕ〜２５０Ｕの範囲で添加する。

反応はｐＨ７〜９．５、好ましくはｐＨ８〜９の範囲で実施される。反応温度は通常、４℃〜６０℃で実施されるが、酵素の安定性と反応速度の点で、好ましくは２０℃〜５５℃、より好ましくは３５℃〜５０℃で実施される。反応時間は所望のシステイン誘導体（ＩＩ）の合成量に応じて適宜設定されるが、通常、０．５〜２４時間、好ましくは１〜１０時間、特に好ましくは１〜５時間、最も好ましくは１〜３時間である。

前記の反応で得られる反応液からシステイン誘導体（ＩＩ）を分離し、回収する方法は、公知のあらゆる方法が使用可能である。一例をあげればトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿法、限外濾過濃縮法、硫安沈殿法（塩析）、有機溶媒（例、アセトン、エタノール、プロパノール、メタノール等）沈殿法、水溶性ポリマー（例、ポリエチレングリコール、デキストラン等）沈殿法、酸性沈殿法、等電点沈殿法等が挙げられる。

システイン誘導体（ＩＩ）を分離、回収することなく、該システイン誘導体（ＩＩ）と、オキシダーゼ及びその基質とを反応させることによってシステインスルホキシド誘導体（ＩＩＩ）を製造することもできる。

２．システインスルホキシド誘導体の製造方法
本発明は、式（ＩＩＩ）

（式中、ＲはＣ_１−６アルキル基又はＣ_２−６アルケニル基を表す）
で表されるシステインスルホキシド誘導体（以下、単にシステインスルホキシド誘導体（ＩＩＩ）とも称する）を酵素的に製造する方法を提供する。
当該方法は、システイン誘導体（ＩＩ）と、オキシダーゼ及びその基質とを反応させることを特徴とする。オキシダーゼとその基質とが反応することにより産生される過酸化水素によりシステイン誘導体（ＩＩ）がシステインスルホキシド誘導体（ＩＩＩ）に変換される。
本発明において、Ｒとして好ましくは、１−プロペニル基、プロピル基、メチル基及びアリル基である。

当該方法において使用するオキシダーゼは基質と反応することにより過酸化水素を産生するものであれば特に限定されない。具体的には、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ等が挙げられる。これらの酵素の少なくとも1種が使用される。好ましくはグルコースオキシダーゼである。

グルコースオキシダーゼは、二量体のタンパク質でＥＣ１．１．３．４に分類される。グルコースオキシダーゼは、グルコースを基質として、酸素存在下、グルコノラクトン（グルコノラクトンは、非酵素的にグルコン酸へと加水分解される）と過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。本発明で用いられるグルコースオキシダーゼは、上記酵素作用を有するものであればその由来は特に限定されない。天然物であっても、化学的又は生化学的に合成されたものであってもよく、また、遺伝子工学的に生産されたものであってもよい。本発明では、商業的に入手可能なものが好適に利用できる。例えば、「スミチームＰＧＯ」という商品名で新日本化学工業（株）より市販されている微生物由来のグルコースオキシダーゼが挙げられる。
グルコースオキシダーゼの活性は、生成した過酸化水素にアミノアンチピリン及びフェノール存在下でペルオキシダーゼを作用させることでキノンイミン色素を生成させる反応を用いて測定することができる。生成したキノンイミン色素の量を検量線より求め酵素活性を算出する。本発明及び本明細書では１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化するのに必要な酵素量を１Ｕと定義する。

ガラクトースオキシダーゼは、ＥＣ１．１．３．９に分類され、Ｄ−ガラクトースを基質として酸素存在下、Ｄ−ガラクト−ヘキソジアルドースと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。

ウリカーゼは、ＥＣ１．７．３．３に分類され、尿酸を基質として酸素存在下、アラントインと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。

コレステロールオキシダーゼは、ＥＣ１．１．３．６に分類され、３β−ヒドロキシステロイドを基質として酸素存在下、３−オキソステロイドと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。

コリンオキシダーゼは、ＥＣ１．１．３．１７に分類される酵素である。コリンオキシダーゼは、コリンを基質として酸素存在下、ベタインアルデヒドと過酸化水素を生成する反応（第一反応）と、ベタインアルデヒドを基質として酸素存在下、ベタインと過酸化水素を生成する反応（第二反応）とを触媒する酵素である。

アシルＣｏＡオキシダーゼは、ＥＣ１．３．３．６に分類され、アシルＣｏＡを基質として酸素存在下、トランス−２、３−デヒドロアシルＣｏＡと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。

本発明で用いられるガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼは、上記酵素作用を有するものであればその由来は特に限定されない。天然物であっても、化学的又は生化学的に合成されたものであってもよく、また、遺伝子工学的に生産されたものであってもよい。本発明では、商業的に入手可能なものが好適に利用できる。

原料である、システイン誘導体（ＩＩ）は、いかなる方法によって調製されたものであってもよいが、好ましくは、上記１．のシステイン誘導体の製造方法により調製された化合物である。

以下、オキシダーゼがグルコースオキシダーゼである場合を例に詳述する。
システイン誘導体（ＩＩ）と基質であるグルコースとの反応は、通常、水性溶媒中、酸素の存在下で実施される。好ましくは反応容器中に空気を流通させて実施される。水性溶媒としては、酵素反応を阻害しない限り特に限定されないが、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙げることができる。

反応液中のグルコースの濃度は特に限定されないが、通常、０．１〜１０重量％、好ましくは０．１〜１重量％である。所望によりグルコースを反応の途中で追加することもでき、また、追加することが好ましい。

反応液中のシステイン誘導体（ＩＩ）の濃度は、用いる化合物の種類によって異なるが、酵素反応を阻害しない範囲であれば特に制限されない。通常、０．１〜１０重量％、好ましくは０．１〜１重量％である。

反応に用いるグルコースオキシダーゼの量は、基質濃度、反応時間、その他の条件によって適宜調整し得るが、好ましくは反応液１ｇ当たり０．００１Ｕ〜１００Ｕ、好ましくは０．０１Ｕ〜５０Ｕ、より好ましくは０．１Ｕ〜１０Ｕの範囲で添加する。

反応はｐＨ５〜７、好ましくは５．５〜６．５で実施される。反応は好ましくは４℃〜６０℃で行われるが、酵素の安定性と反応速度の点で、特に好ましくは、３０℃〜５０℃、より好ましくは３５〜４５℃で実施される。反応時間は所望のシステインスルホキシド誘導体（ＩＩＩ）の合成量に応じて適宜設定されるが、通常、０．５〜２４時間、好ましくは１〜１０時間、さらに好ましくは１〜５時間である。

前記の反応で得られる反応液からシステインスルホキシド誘導体（ＩＩＩ）を分離し、回収する方法は、公知の方法が使用可能である。一例をあげればトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿法、限外濾過濃縮法、硫安沈殿法（塩析）、有機溶媒（例、アセトン、エタノール、プロパノール、メタノール等）沈殿法、水溶性ポリマー（例、ポリエチレングリコール、デキストラン等）沈殿法、酸性沈殿法、等電点沈殿法等が挙げられる。

以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：Ｓ−アリルシステイン（ＡＬＣ）生成に関与する酵素の同定
表１に示す酵母の各酵素の遺伝子破壊株を用いてＳ−アリルシステイン生成量を測定し、チオール化合物及びＬ−セリンからのＳ−アリルシステインの生成に寄与する酵素を調べた。

（１）菌株作成
野生株として実験室酵母であるSaccharomyces cerevisiae BY4742を用い、ＣＹＳ３遺伝子、ＣＹＳ４遺伝子、ＴＲＰ５遺伝子又はＭＥＴ１７遺伝子を欠失させた変異株（それぞれ、ΔＣＹＳ３、ΔＣＹＳ４、ΔＴＲＰ５、ΔＭＥＴ１７）を用いた。各変異株はThermo Scientific社製の市販品（Yeast Knockout Clones and Collections）を使用した。
（２）培養／反応
野生株（ＢＹ４７４２）及び各変異株（ΔＣＹＳ３、ΔＣＹＳ４、ΔＴＲＰ５、ΔＭＥＴ１７）をそれぞれ１白金耳ずつ、５ｍＬのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）に接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで７２時間振盪培養した。該培養液の全量を１００ｍＬのＹＰＤ培地（０．６％酵母エキス、０．５％ペプトン、３％グルコース）に移し、さらに３０℃、１２０ｒｐｍで４８時間振盪培養した。得られた培養液を１０分間遠心分離（４℃、９０００ｒｐｍ）して沈殿物を菌体として回収した。菌体を１ｍＬのプロテアーゼ阻害剤を含有する抽出用バッファー中でビーズ破砕（４６００ｒｐｍ、氷上）し、遠心分離した。
得られた上清を用いてＳ−アリルメルカプタンからのＡＬＣの生成量を測定した。反応バッファーには５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用い、基質としてはＳ−アリルメルカプタン及び硫安・ピルビン酸を用いた。生成したＡＬＣは１０％ＴＣＡで沈殿させ、ＬＣ／ＭＳにより定量した。
（３）結果
２時間反応後のＡＬＣ生成量の結果を図１に示す。ΔＣＹＳ４変異株ではＡＬＣが生成しなかった。ΔＣＹＳ３変異株でＡＬＣ生成量が有意に増加した。これらの結果よりＣＹＳ４遺伝子がＡＬＣ生成に関与する酵素をコードする遺伝子であると考えられた。さらに、ＣＹＳ３遺伝子がＡＬＣ分解に関与する酵素をコードする遺伝子であるか、あるいはＣＹＳ４発現へ負の影響を及ぼす可能性が考えられた。

実施例２：精製シスタチオニンβ−シンターゼによるＳ−アリルシステイン生成
実施例１で、ＣＹＳ４遺伝子がＡＬＣ生成に関与する酵素をコードする遺伝子であると推定されたので、本実施例では、ＣＹＳ４遺伝子高発現変異株から得られた精製シスタチオニンβ−シンターゼにより、Ｓ−アリルシステインが生成するか検証した。
１．精製シスタチオニンβ−シンターゼの調製
まず、以下に示す手法により、ＣＹＳ４を高発現するSaccharomyces cerevisiae株を作製した。
菌株作製法
遺伝子発現を増強する親株としてはSaccharomyces cerevisiae BY4742を用い、ＣＹＳ３遺伝子破壊株BY4742 cys3Δ含め、Thermo Scientific社製、Yeast Knockout Clones and Collectionsより入手した。ＣＹＳ４遺伝子増強にはインテグレーションタイププラスミドを導入することにより作製した。インテグレーションプラスミドの作成法は以下の方法にて行った。
ＣＹＳ４遺伝子を高発現させるためのインテグレーションタイププラスミドは、まず構成的高発現プロモーターであるＴＤＨ３遺伝子(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)プロモーター（ＴＤＨ３ｐ）からＣＹＳ４遺伝子を発現するマルチコピープラスミドを作製し、そのプラスミドを鋳型として増幅したＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４断片をｐＵＣ１９プラスミド（インビトロジェン）にクローン化することにより作製した。プラスミド作製の過程でE.coliコンピテント細胞としてＤＨ５−αもしくはＪＭ１０９株（タカラバイオ）を用いた。
（マルチコピープラスミドの作製）
まず、SmaI制限酵素認識配列を有する配列番号１で示されるプライマーおよびXbaI制限酵素認識配列を有する配列番号２で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC 204508)のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＴＤＨ３プロモーターを有するＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は、変性(94℃, 10 sec)、アニーリング(60℃, 10 sec)、伸長(72℃, 4 min)、２５サイクルとした。次に、このＤＮＡ断片をｐＹＥＳ２のSmaI-XbaI部位にクローン化し、プラスミドｐＹＥＳ２−ＴＤＨ３ｐを得た（本実施例で使用した制限酵素は全てタカラバイオ社より入手した）。
続いて配列番号３で示されるプライマーおよび６コピーのヒスチジンをコードする塩基配列を付加した配列番号４で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC 204508)のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲし、遺伝子のＣ末端に６コピーのHis-tagを有するＣＹＳ４ＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は、変性(94℃, 10 sec)、アニーリング(60℃, 10 sec)、伸長(72℃, 4 min)、２５サイクルとした。次に、このＤＮＡ断片を、制限酵素XbaIで消化し、線状にしたｐＹＥＳ２−ＴＤＨ３ｐにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法(Clontech社、In-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit)によりプラスミドｐＹＥＳ２−ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４＿６ｘＨｉｓを得た。
（インテグレーションタイププラスミドの作製）
SmaI制限酵素認識配列を有する配列番号５で示されるプライマーおよびAatII制限酵素認識配列を有する配列番号６で示されるプライマーを用い、S288CのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲし、ＵＲＡ３ＤＮＡ断片を得た。続いてｐＵＣ１９のSmaI-AatII部位にＵＲＡ３断片をクローン化し、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３プラスミドを作製した。続いて、配列番号７で示されるプライマーおよび配列番号８で示されるプライマーでｐＹＥＳ２−ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４＿６ｘＨｉｓプラスミドを鋳型とし、ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４＿６ｘＨｉｓ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３のSphI-EcoRI部位にｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法により導入し、インテグレーションタイププラスミド、ｐＵＣ１９−ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４−ＵＲＡ３を作製した。
（ＣＹＳ４遺伝子高発現プラスミドを有する株（ＣＹＳ４遺伝子高発現株）の作製）
ＣＹＳ４遺伝子高発現用インテグレーションタイププラスミドｐＵＣ１９−ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４−ＵＲＡ３をBglIIで消化することにより線状化し、ウラシル要求性株であるBY4742あるいはＢY4742 cys3Δを形質転換することによりＣＹＳ４遺伝子高発現株を作製した。形質転換はFrozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research社）を使用して行い、ウラシルを含まない平板培地上で菌体を生育させることによりインテグレーションプラスミドが導入された菌を選択した。
配列番号１
5’ATACCCGGGAATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCGAGT 3’
配列番号２
5’ ATATCTAGATTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC 3’
配列番号３
5’GTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAATGACTAAATCTGAGCAGC 3’
配列番号４
5’ GCGTGACATAACTAATTACATGATTTAATGATGATGATGATGATGTGCTAAGTAGCTCAG 3’
配列番号５
5’ATACCCGGGGATAAGGAGAATCCATACAAG 3’
配列番号６
5’ATAGACGTCTTAGTTTTGCTGGCCGCATC 3’
配列番号７
5’GACCATGATTACGCCAAGCTTGCTATTTTCGAGGACCTTGTC 3’
配列番号８
5’GATCCATGAGATGATGAACGAATTATGCTAAGTAGCTCAG 3’
得られたＣＹＳ４遺伝子高発現株を培養し、培養物からＣＹＳ４遺伝子に付されたＨｉｓタグによりシスタチオニンβ−シンターゼを精製した。
２．反応
得られた精製シスタチオニンβ−シンターゼ（２．６４ｍｇ／ｍＬ；２００μＬ）を用いてＳ−アリルメルカプタンからのＡＬＣの生成量を測定した。酵素液２００μＬ、セリン溶液（０．１５８ｇ／１０ｍＬ、１７６０μＬ）、１０ｍＭピリドキサールリン酸（２０μＬ）及びＳ−アリルメルカプタン（２０μＬ）を３０℃、５０ｒｐｍで反応させた。反応バッファーには５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。ここで、シスタチオニンβ−シンターゼ活性は、反応液１ｇあたり１０９Ｕであった。反応直後（０ｈｒ）、１時間後（１ｈｒ）、２時間後（２ｈｒ）及び３時間後（３ｈｒ）のＡＬＣの生成量を評価した。生成したＡＬＣは１０％ＴＣＡを添加して反応を止め、ＬＣ／ＭＳで定量した。
３．結果
結果を図２に示す。シスタチオニンβ−シンターゼにより、Ｓ−アリルメルカプタン及びＬ−セリンからＳ−アリルシステインが生成することが確認された。

実施例３：精製シスタチオニンβ−シンターゼによるＳ−メチルシステイン生成
実施例２で得られた精製シスタチオニンβ−シンターゼ（０．２３ｍｇ／ｍＬ；１００μＬ）を用いてＳ−メチルメルカプタンからのＳ−メチルシステインの生成量を測定した。酵素液１００μＬ、セリン溶液（０．１５８ｇ／１０ｍＬ、１７６０μＬ）、１０ｍＭピリドキサールリン酸（２０μＬ）及び１５％メチルメルカプタン（１２０μＬ）を３０℃、５０ｒｐｍで反応させた。反応バッファーには５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。ここで、シスタチオニンβ−シンターゼ活性は、反応液１ｇあたり１９Ｕであった。反応直後（０ｈｒ）、１時間後（１ｈｒ）、２時間後（２ｈｒ）及び３時間後（３ｈｒ）のＳ−メチルシステインの生成量を評価した。生成したＳ−メチルシステインは１０％ＴＣＡを添加して反応を止め、ＬＣ／ＭＳで定量した。
結果を図３に示す。シスタチオニンβ―シンターゼにより、Ｓ−メチルメルカプタン及びＬ−セリンからＳ−メチルシステインが生成することが確認された。

実施例４：精製シスタチオニンβ−シンターゼによるＳ−プロピルシステイン生成
実施例２で得られた精製シスタチオニンβ−シンターゼ（０．２３ｍｇ／ｍＬ；１００μＬ）を用いてＳ−プロピルメルカプタンからのＳ−プロピルシステインの生成量を測定した。酵素液１００μＬ、セリン溶液（０．１５８ｇ／１０ｍＬ、１７６０μＬ）、１０ｍＭピリドキサールリン酸（２０μＬ）及びプロピルメルカプタン（２０μＬ）を３０℃、５０ｒｐｍで反応させた。反応バッファーには５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。ここで、シスタチオニンβ−シンターゼ活性は、反応液１ｇあたり１９Ｕであった。反応直後（０ｈｒ）、１時間後（１ｈｒ）、２時間後（２ｈｒ）及び３時間後（３ｈｒ）のＳ−プロピルシステインの生成量を評価した。生成したＳ−プロピルシステインは１０％ＴＣＡを添加して反応を止め、ＬＣ／ＭＳで定量した。
結果を図４に示す。シスタチオニンβ―シンターゼにより、Ｓ−プロピルメルカプタン及びＬ−セリンからＳ−プロピルシステインが生成することが確認された。

実施例５：グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）によるＳ−アリルシステインスルホキシド（ＡＬＣＳＯ）の生成
グルコース及びＳ−アリルシステイン（ＡＬＣ）からＡＬＣＳＯを生成する反応を、表２に記載の３つの試験区について調べた。ＡＬＣとしては実施例１で調製したものを用いた。ＧＯとしては、食品添加物「スミチームＰＧＯ」（新日本化学（株））を用いた。
反応は、４０℃、ｐＨ６．０（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液）、３００ｒｐｍで５時間行った。
さらに反応容器中、空気流量１０００ｍＬ／分でノズル径１０〜５０μｍのノズルから空気を通気（エアレーション）した。

試験区１では、ＧＯを添加せずエアレーションのみ行った。
試験区２では、ＧＯを添加した。
試験区３では、反応１時間後にＧＯを０．２３％、とグルコースを、０．１６％追加した。
結果を図５に示す。
ＧＯを添加しなかった試験区１ではほとんどＡＬＣＳＯを生成しなかった。ＧＯを添加した試験区２ではグルコン酸の生成が見られたが、反応１時間でプラトーに達した。同様の傾向がＡＬＣ消費、ＡＬＣＳＯ生成にも見られた。反応性の低下による過酸化水素供給の減少が影響していると推定された。しかしながら、反応１時間後にＧＯ及びグルコースを追加する（試験区３）ことにより、ＡＬＣからＡＬＣＳＯの変換は再度進行し、終了させることができた。

実施例６：ＣＹＳ４遺伝子高発現酵母変異株を用いたＳ−アリルシステインスルホキシド
（ＡＬＣＳＯ）の生成
実施例２で作成したＣＹＳ４遺伝子高発現変異株を用いて、実施例１（２）と同様にして培養する。培養後、菌体を集めて（集菌）、菌体を破砕し抽出液を調製する。この抽出液（酵母エキス：酵素源）にＬ−セリン及びＳ−アリルメルカプタン等の基質を添加してＡＬＣを生産させる（工程Ｉ）。
反応液にグルコースオキシダーゼを添加してグルコースを酸化処理し、ＡＬＣをＡＬＣＳＯに変換する（工程ＩＩ）ことによってＡＬＣＳＯを含む酵母エキスを得る。

実施例７：ＣＹＳ３遺伝子活性が低減した変異株を用いたＳ−アリルシステインスルホキシド（ＡＬＣＳＯ）の生成
シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物の野生株に紫外線を照射して変異処理をして、得られた変異株の中からシステイン要求性株をスクリーニングすることによりＣＹＳ３遺伝子活性が低減した変異株を取得する。得られた変異株を用いて実施例６同様、工程Ｉ及び工程ＩＩを実施することによって、ＡＬＣＳＯを含む酵母エキスを得る。

実施例８：各遺伝子破壊株、高発現株のＡＬＣ蓄積能の評価
BY4742を親株として、ＣＹＳ３遺伝子の破壊（cys3Δと略す）、ＣＹＳ４遺伝子の高発現（CYS4↑と略す）、ＣＹＳ３遺伝子の破壊かつＣＹＳ４遺伝子の高発現（cys3Δ+CYS4↑と略す）の効果を検証した。親株及び各変異株は、それぞれThermo Scientific社製、Yeast Knockout Clones and Collectionsより入手するか、あるいは実施例２と同様にして作製した。
図６に示した方法にて各菌株から粗酵素液を調製し、図７に示した反応条件にてＡＬＣ生成試験を実施した。各菌株の粗酵素液のシスタチオニンβ−シンターゼ活性（酵母エキス固形分１ｇ当たり）はいずれも２５００Ｕ以上であり、特にＣＹＳ４遺伝子高発現変異株では５０００Ｕ以上でありさらにＣＹＳ３遺伝子が破壊された、ＣＹＳ４遺伝子高発現且つＣＹＳ３遺伝子低発現の変異株では、シスタチオニンβ−シンターゼ活性（酵母エキス固形分１ｇ当たり）は２３３１２Ｕであった。
また、ＣＹＳ３遺伝子が破壊された変異株では、シスタチオニンγ−リアーゼ活性（酵母エキス固形分１ｇ当たり）が０Ｕであることが確認された。
使用した酵母乾燥重量当たりのＡＬＣ蓄積量を測定した。乾燥重量（ＤＭと略す）の測定法は以下の通り。
（測定法）
秤量瓶（＃６−７４３−０１）の空重量を電子天秤にて測定し、酵母菌体懸濁液１ｍｌを秤量瓶に入れた後の重量を電子天秤にて測定。その後オーブン（ＤＮ６００ＹＡＭＡＴＯ）にて１０５℃１時間乾燥後の重量を測定した。オーブン乾燥前後の重量割合からＤＭ（％）を測定する。
各菌株のＡＬＣ蓄積能を図８に示す。親株と比較して、ＣＹＳ３遺伝子破壊あるいはＣＹＳ４遺伝子高発現によりＡＬＣが有意に蓄積した。また、ＣＹＳ３遺伝子破壊かつＣＹＳ４遺伝子高発現によりＡＬＣの蓄積が顕著に増加した。

本発明の方法によれば、医薬品の中間体、食品添加物の原材料として期待されているシステイン誘導体及びシステインスルホキシド誘導体を、より効率よく且つ安定的に製造することができる。
本出願は、日本で出願された特願２０１５−１４７９３６（出願日２０１５年７月２７日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。

配列番号１：ＰＣＲプライマー
配列番号２：ＰＣＲプライマー
配列番号３：ＰＣＲプライマー
配列番号４：ＰＣＲプライマー
配列番号５：ＰＣＲプライマー
配列番号６：ＰＣＲプライマー
配列番号７：ＰＣＲプライマー
配列番号８：ＰＣＲプライマー

Claims

シスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母を培養し、該酵母の抽出物および／または培養物の存在下、式（Ｉ）：

（式中、ＲはＣ_１−６アルキル基又はＣ_２−６アルケニル基を表す）
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させることを特徴とする、式（ＩＩ）：

（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステイン誘導体の製造方法であって、前記酵母が、ＣＹＳ４遺伝子高発現且つＣＹＳ３遺伝子低発現の変異株である、方法。
各式中、Ｒが１−プロペニル基、プロピル基、メチル基またはアリル基である、請求項１記載の方法。
シスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母を培養し、該酵母の抽出物および／または培養物の存在下、式（Ｉ）：

（式中、ＲはＣ_１−６アルキル基又はＣ_２−６アルケニル基を表す）
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させて式（ＩＩ）：

（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステイン誘導体を製造する工程（工程１）、及び
工程１で得られたシステイン誘導体と、オキシダーゼ及びその基質とを反応させて式（ＩＩＩ）：

（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステインスルホキシド誘導体を製造する工程（工程２）を含む、該システインスルホキシド誘導体の製造方法であって、前記酵母が、ＣＹＳ４遺伝子高発現且つＣＹＳ３遺伝子低発現の変異株である、方法。
前記オキシダーゼがグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ及びアシルＣｏＡオキシダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３記載の方法。
各式中、Ｒが１−プロペニル基、プロピル基、メチル基またはアリル基である、請求項３又は４記載の方法。
前記酵母がSaccharomyces属酵母である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記Saccharomyces属酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項６記載の方法。
該酵母の抽出物および／または培養物のシスタチオニンβ−シンターゼ活性が、抽出物および／または培養物１ｇあたり２５００Ｕ以上である、請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
該酵母の抽出物および／または培養物のシスタチオニンβ−シンターゼ活性が、抽出物および／または培養物１ｇあたり１×１０^６Ｕ以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
該酵母の抽出物および／または培養物のシスタチオニンγ−リアーゼ活性が、抽出物および／または培養物１ｇあたり１００Ｕ以下である、請求項１〜９のいずれか1項に記載の方法。