JP6796379B2 - Laser microdissection and laser microdissection method - Google Patents
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Description
本発明は微細加工技術に関し、レーザーマイクロダイセクター及びレーザーマイクロダイセクション方法に関する。 The present invention relates to a microfabrication technique and a laser microdissection method and a laser microdissection method.
病理検査は、疾患の診断において信頼度の高い検査方法である。例えば、がんの診断においては、病理診断が必要とされることが多い。病理検査は、組織検査と、細胞診検査と、に分類される。特に組織検査は、組織から様々な情報を得ることができるため、病理検査の中でも有用な検査方法である。組織検査においては、体内から採取した組織を数ミクロンの厚さにスライスして得られた病理切片を顕微鏡下で観察する。しかし、病理切片といえども、大部分が正常細胞や検査対象外の細胞から構成されていることが多い。そのため、病理切片に含まれる、検査対象となる病変細胞はごくわずかである。現状、病変細胞の分析手法は、顕微鏡下での観察が主であるが、病変細胞がごくわずかである場合、病変細胞の分析は困難である。 Pathological examination is a highly reliable examination method in diagnosing a disease. For example, in the diagnosis of cancer, a pathological diagnosis is often required. Pathological examinations are classified into histological examinations and cytological examinations. In particular, tissue examination is a useful examination method among pathological examinations because various information can be obtained from tissues. In a histological examination, a pathological section obtained by slicing a tissue collected from the body to a thickness of several microns is observed under a microscope. However, most of the pathological sections are composed of normal cells and cells not to be examined. Therefore, the number of lesion cells to be examined contained in the pathological section is very small. At present, the method for analyzing lesion cells is mainly observation under a microscope, but it is difficult to analyze lesion cells when the number of lesion cells is very small.
そのため、単に病変細胞を顕微鏡観察するだけではなく、組織から病変細胞を切除、及び採取し、例えば質量分析装置のような分析装置を用いて病変細胞を分析し、疾患を診断する方法が提案されている。 Therefore, a method has been proposed in which not only the lesion cells are observed under a microscope, but also the lesion cells are excised and collected from the tissue, and the lesion cells are analyzed using an analyzer such as a mass spectrometer to diagnose the disease. ing.
組織からの病変細胞の切除及び採取には、レーザーマイクロダイセクション法が用いられる。レーザーマイクロダイセクション法は、顕微鏡に接続したレーザー照射装置を用いて、顕微鏡下で組織切片を観察しながら標的とする病変細胞塊をレーザー光によって切り出し、採取、及び回収するための手法である（例えば、特許文献１から３参照。）。この方法は、複雑に混ざり合った組織標本の中から標的となる細胞群や単一細胞のみを回収することができるため、疾患や生命現象の解明にとって有用である。また、レーザーマイクロダイセクション法は、医療用途に限らず、工業製品等の試料から微小な標的部分を切り出すためにも用いられている。 Laser microdissection is used for excision and collection of diseased cells from tissue. The laser microdissection method is a method for cutting out, collecting, and collecting a target lesion cell mass by laser light while observing a tissue section under a microscope using a laser irradiation device connected to a microscope (). For example, see Patent Documents 1 to 3). This method is useful for elucidating diseases and biological phenomena because only target cell groups or single cells can be recovered from a complex mixed tissue specimen. Further, the laser microdissection method is used not only for medical applications but also for cutting out a minute target portion from a sample of an industrial product or the like.
本発明は、試料の標的部分の周囲を正確に切断可能なレーザーマイクロダイセクター及びレーザーマイクロダイセクション方法を提供することを目的の一つとする。 One object of the present invention is to provide a laser microdissection and a laser microdissection method capable of accurately cutting around a target portion of a sample.
本発明の態様によれば、（ａ）試料が載せられるステージと、（ｂ）試料の三次元画像を取得する顕微鏡と、（ｃ）三次元画像から試料の標的部分の三次元座標を特定する標的部分特定部と、（ｄ）試料を切断する切断レーザー光を発する切断レーザー光源と、（ｅ）標的部分の三次元座標に基づき、試料の標的部分の周囲が切断されるよう、試料に対する切断レーザーの入射位置及び入射角を変化させる位置制御機構と、を備える、レーザーマイクロダイセクターが提供される。 According to the aspect of the present invention, (a) a stage on which the sample is placed, (b) a laser that acquires a three-dimensional image of the sample, and (c) the three-dimensional coordinates of the target portion of the sample are specified from the three-dimensional image. Cutting the sample so that the periphery of the target part of the sample is cut based on the target part identification part, (d) the cutting laser light source that emits the cutting laser light that cuts the sample, and (e) the three-dimensional coordinates of the target part. A laser microdissector is provided that comprises a position control mechanism that changes the incident position and angle of the laser.
上記のレーザーマイクロダイセクターにおいて、三次元画像から得られる、標的部分の断面形状に基づき、試料に対する切断レーザー光の入射角を変化させてもよい。三次元画像から得られる、標的部分の断面形状の輪郭に沿って、試料に対する切断レーザー光の入射角を変化させてもよい。 In the above laser microdissector, the angle of incidence of the cutting laser light on the sample may be changed based on the cross-sectional shape of the target portion obtained from the three-dimensional image. The angle of incidence of the cutting laser beam on the sample may be changed along the contour of the cross-sectional shape of the target portion obtained from the three-dimensional image.
上記のレーザーマイクロダイセクターにおいて、位置制御機構が、切断レーザー光の光学系を駆動して、試料に対する切断レーザー光の入射位置及び入射角を変化させてもよい。位置制御機構が、ステージを傾斜させることにより、試料に対する切断レーザー光の入射角を変化させてもよい。 In the above laser microdissector, the position control mechanism may drive the optical system of the cutting laser light to change the incident position and the incident angle of the cutting laser light with respect to the sample. The position control mechanism may change the angle of incidence of the cutting laser light on the sample by tilting the stage.
上記のレーザーマイクロダイセクターにおいて、試料に対する切断レーザー光の入射角が０°以上９０°以下の範囲で変化してもよい。 In the above laser microdissector, the angle of incidence of the cutting laser light on the sample may change in the range of 0 ° or more and 90 ° or less.
上記のレーザーマイクロダイセクターにおいて、切断レーザー光が深紫外レーザー光であってもよい。切断レーザー光の波長範囲が２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下であってもよい。切断レーザー光の焦点サイズが４００ｎｍ以上１０μｍ以下であってもよい。 In the above laser microdissector, the cutting laser light may be deep ultraviolet laser light. The wavelength range of the cutting laser light may be 200 nm or more and 300 nm or less. The focal size of the cutting laser light may be 400 nm or more and 10 μm or less.
上記のレーザーマイクロダイセクターが、切断レーザー光で単離された標的部分を回収するマニピュレーターをさらに備えていてもよい。マニピュレーターが、標的部分を含む液体が毛細管現象により内部を上昇するキャピラリーを備えていてもよいし、標的部分を採取するカンチレバーを備えていてもよい。マニピュレーターが磁力を用いて標的部分を回収してもよいし、分子間の親和力を用いて標的部分を回収してもよい。 The laser microdisectors described above may further include a manipulator that recovers the target portion isolated by cutting laser light. The manipulator may be provided with a capillary in which the liquid containing the target portion rises inside due to capillarity, or may be provided with a cantilever for collecting the target portion. The manipulator may use magnetic force to recover the target moiety, or intermolecular affinity to recover the target moiety.
上記のレーザーマイクロダイセクターにおいて、顕微鏡が、共焦点レーザー顕微鏡、共焦点ラマン顕微分光装置、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、及び電子顕微鏡からなる群から選択されるいずれかであってもよい。 In the laser microdissector described above, the microscope may be any one selected from the group consisting of a confocal laser microscope, a confocal Raman microscope, an optical microscope, a fluorescence microscope, and an electron microscope.
上記のレーザーマイクロダイセクターにおいて、試料が生体試料であってもよいし、生体組織であってもよい。 In the above laser microdissector, the sample may be a biological sample or a biological tissue.
本発明の態様によれば、（ａ）試料の三次元画像を取得することと、（ｂ）三次元画像から試料の標的部分の三次元座標を特定することと、（ｃ）試料を切断する切断レーザー光を発し、標的部分の三次元座標に基づき、試料の標的部分の周囲が切断されるよう、試料に対する切断レーザーの入射位置及び入射角を変化させることと、を備える、レーザーマイクロダイセクション方法が提供される。 According to the aspect of the present invention, (a) obtaining a three-dimensional image of the sample, (b) specifying the three-dimensional coordinates of the target portion of the sample from the three-dimensional image, and (c) cutting the sample. A laser microdissection that emits a cutting laser beam and changes the incident position and angle of the cutting laser with respect to the sample so that the periphery of the target portion of the sample is cut based on the three-dimensional coordinates of the target portion. A method is provided.
上記のレーザーマイクロダイセクション方法において、三次元画像から得られる、標的部分の断面形状に基づき、試料に対する切断レーザー光の入射角を変化させてもよい。三次元画像から得られる、標的部分の断面形状の輪郭に沿って、試料に対する切断レーザー光の入射角を変化させてもよい。 In the above laser microdissection method, the angle of incidence of the cutting laser light on the sample may be changed based on the cross-sectional shape of the target portion obtained from the three-dimensional image. The angle of incidence of the cutting laser beam on the sample may be changed along the contour of the cross-sectional shape of the target portion obtained from the three-dimensional image.
上記のレーザーマイクロダイセクション方法において、切断レーザー光の光学系を駆動して、試料に対する切断レーザー光の入射位置及び入射角を変化させてもよい。試料が載せられるステージを傾斜させることにより、試料に対する切断レーザー光の入射角を変化させてもよい。 In the above laser microdissection method, the optical system of the cutting laser light may be driven to change the incident position and the incident angle of the cutting laser light with respect to the sample. The angle of incidence of the cutting laser beam on the sample may be changed by inclining the stage on which the sample is placed.
上記のレーザーマイクロダイセクション方法において、試料に対する切断レーザー光の入射角が０°以上９０°以下の範囲で変化してもよい。 In the above laser microdissection method, the angle of incidence of the cutting laser light on the sample may change in the range of 0 ° or more and 90 ° or less.
上記のレーザーマイクロダイセクション方法において、切断レーザー光が深紫外レーザー光であってもよい。切断レーザー光の波長範囲が２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下であってもよい。切断レーザー光の焦点サイズが４００ｎｍ以上１０μｍ以下であってもよい。 In the above laser microdissection method, the cutting laser light may be a deep ultraviolet laser light. The wavelength range of the cutting laser light may be 200 nm or more and 300 nm or less. The focal size of the cutting laser light may be 400 nm or more and 10 μm or less.
上記のレーザーマイクロダイセクション方法が、切断レーザー光で単離された標的部分をマニピュレーターで回収することを更に備えていてもよい。マニピュレーターが、標的部分を含む液体が毛細管現象により内部を上昇するキャピラリーを備えていてもよいし、標的部分を採取するカンチレバーを備えていてもよい。マニピュレーターが磁力を用いて標的部分を回収してもよいし、分子間の親和力を用いて標的部分を回収してもよい。 The laser microdissection method described above may further comprise recovering the target portion isolated by cutting laser light with a manipulator. The manipulator may be provided with a capillary in which the liquid containing the target portion rises inside due to capillarity, or may be provided with a cantilever for collecting the target portion. The manipulator may use magnetic force to recover the target moiety, or intermolecular affinity to recover the target moiety.
上記のレーザーマイクロダイセクション方法において、試料の画像を取得する顕微鏡が、共焦点レーザー顕微鏡、共焦点ラマン顕微分光装置、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、及び電子顕微鏡からなる群から選択されるいずれかであってもよい。 In the above laser microdissection method, the microscope for acquiring an image of a sample is selected from the group consisting of a confocal laser microscope, a confocal Raman microscope, an optical microscope, a fluorescence microscope, and an electron microscope. You may.
上記のレーザーマイクロダイセクション方法において、試料が生体試料であってもよいし、生体組織であってもよい。 In the above laser microdissection method, the sample may be a biological sample or a biological tissue.
本発明によれば、試料の標的部分の周囲を正確に切断可能なレーザーマイクロダイセクター及びレーザーマイクロダイセクション方法を提供可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a laser microdissection and a laser microdissection method capable of accurately cutting around a target portion of a sample.
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。 Embodiments of the present invention will be described below. In the description of the drawings below, the same or similar parts are represented by the same or similar reference numerals. However, the drawings are schematic. Therefore, the specific dimensions and the like should be determined in light of the following explanations. In addition, it goes without saying that the drawings include parts having different dimensional relationships and ratios from each other.
（第１の実施の形態）
本発明の第１の実施の形態に係るレーザーマイクロダイセクターは、図１に示すように、試料１が載せられるステージ１０と、試料１の三次元画像を取得する顕微鏡２０と、三次元画像から試料１の標的部分の三次元座標を特定する標的部分特定部３０１と、試料１を切断する切断レーザー光を発する切断レーザー光源４１と、標的部分の三次元座標に基づき、試料１の標的部分の周囲が切断されるよう、試料１に対する切断レーザーの入射位置及び入射角を変化させる位置制御機構４７と、を備える。
(First Embodiment)
As shown in FIG. 1, the laser microdissector according to the first embodiment of the present invention is composed of a stage 10 on which the sample 1 is placed, a microscope 20 for acquiring a three-dimensional image of the sample 1, and a three-dimensional image. Based on the target part identification part 301 that specifies the three-dimensional coordinates of the target part of the sample 1, the cutting laser light source 41 that emits the cutting laser light that cuts the sample 1, and the three-dimensional coordinates of the target part, the target part of the sample 1 A position control mechanism 47 for changing the incident position and incident angle of the cutting laser with respect to the sample 1 is provided so that the surroundings are cut.
試料は、例えば、培養細胞及びスライスされた生体組織等の生体試料である。ステージ１０には、例えば、ステージ１０を移動させるステージ駆動機構が接続される。ステージ駆動機構は、ステージ１０を、ステージ１０表面と平行方向（ｘ方向及びｙ方向）に移動させたり、ステージ１０表面に対して垂直方向（ｚ方向）に移動させたりする。さらに、ステージ駆動装置は、ステージ１０を、ｚ方向を軸として傾斜させる。 The sample is, for example, a biological sample such as cultured cells and sliced biological tissue. For example, a stage drive mechanism for moving the stage 10 is connected to the stage 10. The stage drive mechanism moves the stage 10 in the direction parallel to the surface of the stage 10 (x direction and y direction), or moves the stage 10 in the direction perpendicular to the surface of the stage 10 (z direction). Further, the stage drive device tilts the stage 10 about the z direction.
顕微鏡２０としては、例えば共焦点ラマン顕微分光装置が使用可能である。顕微鏡２０は、励起光源２１を備える。励起光源２１は、ラマン散乱光を励起するレーザー光を照射するレーザーである。ラマン散乱光を励起するレーザー光の波長は、例えば５３２ｎｍ、６３３ｎｍ、及び７８５ｎｍであるが、これらに限定されない。励起光源２１から発せられた励起レーザー光は、例えば、ラインフィルター２２を通過する。 As the microscope 20, for example, a confocal Raman microspectroscopic apparatus can be used. The microscope 20 includes an excitation light source 21. The excitation light source 21 is a laser that irradiates a laser beam that excites Raman scattered light. The wavelengths of the laser light that excite the Raman scattered light are, for example, 532 nm, 633 nm, and 785 nm, but are not limited thereto. The excitation laser light emitted from the excitation light source 21 passes through, for example, the line filter 22.
顕微鏡２０は、試料１に対して励起レーザー光を下方から照射するための倒立型の励起光光路と、試料１に対して励起レーザー光を上方から照射するための透過型の励起光光路と、の両方を備えていてもよい。 The microscope 20 includes an inverted excitation light path for irradiating the sample 1 with the excitation laser light from below, and a transmission type excitation light path for irradiating the sample 1 with the excitation laser light from above. It may have both of.
倒立型の励起光光路において、例えば、励起レーザー光は、反射鏡２３で、ステージ１０に対して垂直方向下側に反射され、さらに反射鏡２４で、ステージ１０と略平行方向に反射される。反射鏡２４で反射された励起レーザー光は、レンズ２５で集光される。レンズ２５で集光された励起レーザー光は、励起レーザー光を反射し、ラマン散乱光を透過させるハーフミラー２６で、ステージ１０に向けて反射され、対物レンズ２７を経てステージ１０上の試料１に集光される。 In the inverted excitation optical path, for example, the excitation laser light is reflected by the reflecting mirror 23 downward in the direction perpendicular to the stage 10, and further reflected by the reflecting mirror 24 in a direction substantially parallel to the stage 10. The excitation laser light reflected by the reflector 24 is focused by the lens 25. The excitation laser light focused by the lens 25 is reflected toward the stage 10 by the half mirror 26 that reflects the excitation laser light and transmits the Raman scattered light, and is reflected on the sample 1 on the stage 10 via the objective lens 27. It is focused.
透過型の励起光光路において、例えば、励起レーザー光は、反射鏡２３で、ステージ１０に対して垂直方向上側に反射され、さらに反射鏡４４で、ステージ１０と平行方向に反射される。励起レーザー光は、ｘｙθアパーチャー４５を経て、レンズ４６で集光され、例えばガルバノスキャナーを備える位置制御機構４７を経て、対物レンズ４８に入射し、試料１に集光される。後述するように、透過型の励起光光路は、切断レーザー光の光路と少なくとも一部重複していてもよい。 In the transmission type excitation optical path, for example, the excitation laser light is reflected upward in the direction perpendicular to the stage 10 by the reflecting mirror 23, and is further reflected in the direction parallel to the stage 10 by the reflecting mirror 44. The excitation laser light passes through the xyθ aperture 45, is focused by the lens 46, enters the objective lens 48 via the position control mechanism 47 including, for example, a galvano scanner, and is focused on the sample 1. As will be described later, the transmission type excitation optical path may at least partially overlap the optical path of the cutting laser light.
励起レーザー光を照射された試料１で生じたラマン散乱光は、対物レンズ２７を経てハーフミラー２６を透過し、反射鏡２８でステージ１０と平行方向に反射される。反射鏡２８で反射されたラマン散乱光は、レイリー散乱光を除去するバンドパスフィルタ２９を透過し、レンズ３０で集光されて、ラマン分光器５０に入射する。 The Raman scattered light generated in the sample 1 irradiated with the excitation laser light passes through the half mirror 26 through the objective lens 27 and is reflected by the reflecting mirror 28 in the direction parallel to the stage 10. The Raman scattered light reflected by the reflector 28 passes through a bandpass filter 29 that removes Rayleigh scattered light, is collected by the lens 30, and is incident on the Raman spectroscope 50.
ラマン分光器５０において、ラマン散乱光はレンズ５１で集光され、対物レンズ２７の焦点で生じたラマン散乱光のみがピンホール５２を通過する。さらにラマン散乱光は反射鏡５３で反射され、凹面反射鏡５４で平行光にされる。平行光にされたラマン散乱光は回折格子５５で分光され、分光されたラマン散乱光は凹面反射鏡５６で集光される。集光されたラマン散乱光は、分光したラマン散乱光を波長ごとに検出可能なＣＣＤ（電荷結合素子）イメージセンサ等の検出器５７で受光される。検出器５７は、受光したラマン散乱光を光電変換し、電気信号を出力する。 In the Raman spectroscope 50, the Raman scattered light is focused by the lens 51, and only the Raman scattered light generated at the focal point of the objective lens 27 passes through the pinhole 52. Further, the Raman scattered light is reflected by the reflecting mirror 53 and made into parallel light by the concave reflecting mirror 54. The Raman scattered light made into parallel light is separated by the diffraction grating 55, and the dispersed Raman scattered light is collected by the concave reflecting mirror 56. The condensed Raman scattered light is received by a detector 57 such as a CCD (charge-coupled device) image sensor that can detect the dispersed Raman scattered light for each wavelength. The detector 57 photoelectrically converts the received Raman scattered light and outputs an electric signal.
ラマン分光器５０の検出器５７は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）３００に接続されている。ＣＰＵ３００は、画像生成部３０２を備える。画像生成部３０２は、検出器５７から電気信号を受け取り、試料１の三次元画像を生成する。試料１の三次元画像は、三次元座標（ｘ，ｙ，ｚ）情報を含んでいる。ＣＰＵ３００には、表示装置４０１が接続されている。表示装置４０１は、試料１の三次元画像を表示する。 The detector 57 of the Raman spectrometer 50 is connected to a central processing unit (CPU) 300. The CPU 300 includes an image generation unit 302. The image generation unit 302 receives an electric signal from the detector 57 and generates a three-dimensional image of the sample 1. The three-dimensional image of sample 1 contains three-dimensional coordinate (x, y, z) information. A display device 401 is connected to the CPU 300. The display device 401 displays a three-dimensional image of the sample 1.
ＣＰＵ３００には、さらに入力装置４０２が接続されている。使用者は、マウス等の入力装置４０２を用いて、表示装置４０１に表示された試料１の三次元画像の任意の標的部分の輪郭をマウスポインタでなぞり、標的部分を三次元形状で取り囲む。ＣＰＵ３００に含まれる標的部分特定部３０１は、マウスポインタの軌跡である三次元形状の三次元座標を特定し、試料１の標的部分の輪郭の三次元座標として、記憶装置４０３に保存する。あるいは、標的部分特定部３０１は、パターン認識、及び明度の判別等により、標的部分の輪郭の三次元座標を自動的に抽出してもよい。 An input device 402 is further connected to the CPU 300. Using an input device 402 such as a mouse, the user traces the outline of an arbitrary target portion of the three-dimensional image of the sample 1 displayed on the display device 401 with the mouse pointer, and surrounds the target portion with a three-dimensional shape. The target portion specifying unit 301 included in the CPU 300 identifies the three-dimensional coordinates of the three-dimensional shape that is the locus of the mouse pointer, and stores the three-dimensional coordinates of the contour of the target portion of the sample 1 in the storage device 403. Alternatively, the target portion specifying unit 301 may automatically extract the three-dimensional coordinates of the contour of the target portion by pattern recognition, determination of brightness, and the like.
切断レーザー光源４１は、例えば、波長範囲が２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下である深紫外（ＤＵＶ）レーザー光を切断レーザー光として発する。切断レーザー光源４１から発せられた切断レーザー光は、例えば、ラインフィルター４２を通過する。切断レーザー光は、反射鏡４３で、ステージ１０に対して垂直方向上側に反射され、さらに反射鏡４４で、ステージ１０と平行方向に反射される。切断レーザー光は、ｘｙθアパーチャー４５を経て、レンズ４６で集光され、例えばガルバノスキャナーを備える位置制御機構４７を経て、対物レンズ４８に入射し、試料１の切断位置で集光される。 The cutting laser light source 41 emits, for example, deep ultraviolet (DUV) laser light having a wavelength range of 200 nm or more and 300 nm or less as the cutting laser light. The cutting laser light emitted from the cutting laser light source 41 passes through, for example, the line filter 42. The cutting laser light is reflected by the reflecting mirror 43 upward in the direction perpendicular to the stage 10, and further reflected by the reflecting mirror 44 in the direction parallel to the stage 10. The cutting laser light passes through the xyθ aperture 45, is focused by the lens 46, enters the objective lens 48 via a position control mechanism 47 including, for example, a galvano scanner, and is focused at the cutting position of the sample 1.
切断レーザー光がＤＵＶ光である場合、レンズ４６等で、切断レーザー光の焦点サイズ（直径）は、例えば４００ｎｍ以上１０μｍ以下に集束される。これにより、試料をより正確に切断することが可能となる。なお、切断レーザー光の焦点サイズは、標的部分の大きさに応じて変化させてもよい。 When the cutting laser light is DUV light, the focal size (diameter) of the cutting laser light is focused to, for example, 400 nm or more and 10 μm or less by the lens 46 or the like. This makes it possible to cut the sample more accurately. The focal size of the cutting laser beam may be changed according to the size of the target portion.
位置制御機構４７は、試料１の三次元画像から得られる標的部分の断面形状に基づき、例えばガルバノスキャナーを駆動して、試料１に対する切断レーザーの入射位置及び入射角を変化させる。例えば、位置制御機構４７は、記憶装置４０３から、試料１の標的部分の輪郭の三次元座標の情報を読み取り、切断レーザー光の焦点が試料１の標的部分の輪郭に沿って移動するよう、ガルバノミラー等を駆動する。ここで、試料１の標的部分の断面形状の輪郭がステージ１０の表面に対して垂直であれば、位置制御機構４７は、切断レーザー光を試料１に対して垂直に入射させる。また、試料１の標的部分の断面形状の輪郭がステージ１０の表面に対して傾斜していれば、位置制御機構４７は、切断レーザー光を試料１に対して斜めに入射させる。 The position control mechanism 47 drives, for example, a galvano scanner to change the incident position and the incident angle of the cutting laser with respect to the sample 1 based on the cross-sectional shape of the target portion obtained from the three-dimensional image of the sample 1. For example, the position control mechanism 47 reads the information on the three-dimensional coordinates of the contour of the target portion of the sample 1 from the storage device 403, and galvanos so that the focus of the cutting laser light moves along the contour of the target portion of the sample 1. Drives mirrors, etc. Here, if the contour of the cross-sectional shape of the target portion of the sample 1 is perpendicular to the surface of the stage 10, the position control mechanism 47 incidents the cutting laser light perpendicularly to the sample 1. Further, if the contour of the cross-sectional shape of the target portion of the sample 1 is inclined with respect to the surface of the stage 10, the position control mechanism 47 causes the cutting laser light to be obliquely incident on the sample 1.
ステージ１０を移動させるステージ駆動機構が位置制御機構４７に含まれていてもよい。図２に示すように、ステージ駆動機構がステージ１０を傾斜させることによっても、試料１に対する切断レーザー光の入射角を変化させることが可能である。ステージ１０とステージ駆動機構の組み合わせとしては、ゴニオステージ等が使用可能である。ガルバノスキャナーとステージ駆動機構が協調して、試料１に対する切断レーザーの入射位置及び入射角を変化させてもよい。試料１に対する切断レーザー光の入射角は、例えば０°以上９０°以下の範囲で変化する。 The position control mechanism 47 may include a stage drive mechanism for moving the stage 10. As shown in FIG. 2, it is also possible to change the incident angle of the cutting laser light with respect to the sample 1 by inclining the stage 10 by the stage driving mechanism. As a combination of the stage 10 and the stage drive mechanism, a goniometer stage or the like can be used. The galvano scanner and the stage drive mechanism may cooperate to change the incident position and the incident angle of the cutting laser with respect to the sample 1. The angle of incidence of the cutting laser light on the sample 1 varies, for example, in the range of 0 ° or more and 90 ° or less.
例えば、図３に示すように、試料の二次元上面画像で観察された標的部分の輪郭が、試料の深さ方向において変化する場合がある。試料の深さ方向において、標的部分の輪郭が大きくなる場合、試料の二次元上面画像で観察された標的部分の輪郭に沿って試料を切断すると、深さ方向において輪郭が大きくなった部分を採取できない。 For example, as shown in FIG. 3, the contour of the target portion observed in the two-dimensional top image of the sample may change in the depth direction of the sample. When the contour of the target part becomes large in the depth direction of the sample, when the sample is cut along the contour of the target part observed in the two-dimensional top image of the sample, the part with the large contour in the depth direction is collected. Can not.
また、試料の二次元上面画像で観察された標的部分の輪郭からマージンをとって、周囲の部分を幅広く含むように試料を切断すると、採取された標的部分の周囲に、標的部分ではない不要な部分が付着する。例えば標的部分が正常細胞に囲まれた異常細胞である場合、採取された異常細胞に正常細胞が付着していると、異常細胞に含まれるタンパク質や核酸について分析する際に、正常細胞からのタンパク質や核酸が混在し、異常細胞のタンパク質や核酸を正確に分析することができない。 In addition, when the sample is cut so as to include a wide range of the surrounding part by taking a margin from the outline of the target part observed in the two-dimensional upper surface image of the sample, unnecessary parts that are not the target part are unnecessary around the collected target part. The part adheres. For example, when the target part is an abnormal cell surrounded by normal cells, if the collected abnormal cell is attached to the normal cell, the protein from the normal cell is analyzed when analyzing the protein or nucleic acid contained in the abnormal cell. And nucleic acids are mixed, and it is not possible to accurately analyze proteins and nucleic acids of abnormal cells.
これに対し、図４に示すように、標的部分の深さ方向においても、標的の輪郭に沿って試料を切断レーザー光で切断することにより、試料から標的部分を正確に切り出すことが可能となる。 On the other hand, as shown in FIG. 4, even in the depth direction of the target portion, the target portion can be accurately cut out from the sample by cutting the sample along the contour of the target with a cutting laser beam. ..
また、例えば、図５に示すように、標的部分が試料の断面方向に埋もれている場合も、切断レーザー光で試料を垂直に切断すると、図６に示すように、標的部分の上下に、標的部分以外の試料が付着する。これに対し、図７に示すように、ステージを傾斜させたり、図８に示すように、切断レーザー光の光学系を駆動させたりすることにより、標的部分の深さ方向の輪郭に沿って試料を切断レーザー光で切断して、試料から標的部分を正確に切り出すことが可能となる。 Further, for example, even when the target portion is buried in the cross-sectional direction of the sample as shown in FIG. 5, when the sample is vertically cut with a cutting laser beam, the target is placed above and below the target portion as shown in FIG. Samples other than the part adhere. On the other hand, as shown in FIG. 7, the stage is tilted, and as shown in FIG. 8, the optical system of the cutting laser light is driven to drive the sample along the contour of the target portion in the depth direction. It is possible to accurately cut out the target portion from the sample by cutting with a laser beam.
以上説明したように、第１の実施の形態に係るレーザーマイクロダイセクターによれば、標的部分の深さ方向において、標的の輪郭が四角のみならず、円や三角、多角形状であっても、正確に試料を切断することが可能となる。 As described above, according to the laser microdie sector according to the first embodiment, the contour of the target is not only a square but also a circle, a triangle, or a polygon in the depth direction of the target portion. It is possible to cut the sample accurately.
また、切断レーザー光として、波長が３５５ｎｍの紫外（ＵＶ）光を用いると、切断レーザー光を照射された試料の部分の温度が上昇し、高温により試料内の分子間結合が破壊され、試料が切断される。これに対し、切断レーザー光として、波長が２６６ｎｍ等のＤＵＶ光を用いると、試料内の分子間結合がＤＵＶ光によって直接切断される。そのため、ＤＵＶ光による切断部位は、ＵＶ光による切断部位と比較して、発熱が抑制され、切削空間分解能が向上する。また、ＵＶ光により試料を切断する場合は、発熱を伴うため、パラフィン等により試料を固定する必要があるが、ＤＵＶ光により試料を切断する場合は、試料を固定しなくともよい。 When ultraviolet (UV) light having a wavelength of 355 nm is used as the cutting laser light, the temperature of the portion of the sample irradiated with the cutting laser light rises, and the high temperature breaks the molecular bonds in the sample, resulting in the sample. Be disconnected. On the other hand, when DUV light having a wavelength of 266 nm or the like is used as the cutting laser light, the intermolecular bonds in the sample are directly cut by the DUV light. Therefore, the cut portion by DUV light suppresses heat generation and improves the cutting space resolution as compared with the cut portion by UV light. Further, when cutting the sample with UV light, it is necessary to fix the sample with paraffin or the like because heat is generated, but when cutting the sample with DUV light, it is not necessary to fix the sample.
（第２の実施の形態）
第１の実施の形態では、図１に示すように、顕微鏡２０として共焦点ラマン顕微分光装置を使用する例を説明した。これに対し、第２の実施の形態に係るレーザーマイクロダイセクターでは、図９に示すように、顕微鏡２０として共焦点顕微鏡ではない三次元画像を取得可能な光学顕微鏡を用いてもよい。
(Second Embodiment)
In the first embodiment, as shown in FIG. 1, an example in which a confocal Raman microspectroscopy device is used as the microscope 20 has been described. On the other hand, in the laser microdissector according to the second embodiment, as shown in FIG. 9, an optical microscope capable of acquiring a three-dimensional image other than a confocal microscope may be used as the microscope 20.
光源１２１は、レーザー光又は白色光等の照明光を照射するレーザー又はハロゲンランプである。照明光は、例えば、対物レンズ４８を経て、試料１に照射される。試料１を透過した透過照明光は、対物レンズ１２７を経て、反射鏡１２８でステージ１０と平行方向に反射される。反射鏡１２８で反射された透過照明光は、レンズ１３０で集光されて、検出器１３１で受光される。検出器１３１は、受光した透過照明光を光電変換し、電気信号を出力する。 The light source 121 is a laser or halogen lamp that irradiates illumination light such as laser light or white light. The illumination light irradiates the sample 1 through, for example, the objective lens 48. The transmitted illumination light transmitted through the sample 1 passes through the objective lens 127 and is reflected by the reflector 128 in the direction parallel to the stage 10. The transmitted illumination light reflected by the reflector 128 is collected by the lens 130 and received by the detector 131. The detector 131 photoelectrically converts the received transmitted illumination light and outputs an electric signal.
第２の実施の形態において、画像生成部３０２は、検出器１３１から電気信号を受け取り、試料１の二次元画像をまず生成する。さらに、画像生成部３０２は、デコンボリューション法等により、試料１の二次元画像から、試料１の三次元画像を生成する。ここで、デコンボリューション法とは、非焦点面以外で生じる光の拡散から、点像分布関数（ＰＳＦ）を用いた数学的な演算により、二次元画像から三次元画像を生成する手法である。ＰＳＦは、例えばビーズ等の形状の分かっている物体の二次元画像を取得し、二次元画像における光のぼけ具合から得ることができる。 In the second embodiment, the image generation unit 302 receives an electric signal from the detector 131 and first generates a two-dimensional image of the sample 1. Further, the image generation unit 302 generates a three-dimensional image of the sample 1 from the two-dimensional image of the sample 1 by a deconvolution method or the like. Here, the deconvolution method is a method of generating a three-dimensional image from a two-dimensional image by a mathematical calculation using a point spread function (PSF) from the diffusion of light generated on a plane other than the non-focal plane. The PSF can obtain a two-dimensional image of an object having a known shape, such as beads, and obtain it from the degree of light blur in the two-dimensional image.
第２の実施の形態に係るレーザーマイクロダイセクターのその他の構成要素は、第１の実施の形態と同様である。共焦点顕微鏡の照明光又は励起光よりも、共焦点顕微鏡ではない顕微鏡の照明光又は励起光は、エネルギーが弱い傾向にある。そのため、試料１の三次元画像を取得する際に、共焦点顕微鏡ではない顕微鏡を用いれば、試料１へのダメージを抑制することが可能となる。 Other components of the laser microdissector according to the second embodiment are the same as those of the first embodiment. The energy of the illumination light or excitation light of a microscope that is not a confocal microscope tends to be weaker than that of the illumination light or excitation light of a confocal microscope. Therefore, if a microscope other than a confocal microscope is used when acquiring a three-dimensional image of the sample 1, damage to the sample 1 can be suppressed.
（第３の実施の形態）
第３の実施の形態に係るレーザーマイクロダイセクターは、図１０に示すように、切断レーザー光で単離された標的部分を採取及び回収するマニピュレーター６０をさらに備える。マニピュレーター６０は、例えば図１１に示すように、標的部分を含む液体が毛細管現象により内部を上昇するキャピラリー６１を備える。キャピラリー６１は、例えば、アクリル樹脂、及びポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等の透明材料からなる。
(Third Embodiment)
The laser microdissector according to the third embodiment further comprises a manipulator 60 for collecting and recovering a target portion isolated by cutting laser light, as shown in FIG. The manipulator 60 includes, for example, as shown in FIG. 11, a capillary 61 in which a liquid containing a target portion rises inside due to a capillary phenomenon. The capillary 61 is made of, for example, an acrylic resin and a transparent material such as polyethylene terephthalate (PET).
標的部分がキャピラリー６１の内壁に付着しないよう、キャピラリー６１の内壁は親水性であることが好ましい。例えば、図１２に示すように、キャピラリー６１の内壁に微細な凹凸を設けたり、粗面化したりすることにより、キャピラリー６１の内壁を親水性にすることができる。あるいは、プラズマ処理及び化学蒸着（ＣＶＤ）等によりキャピラリー６１の内壁を親水性にしてもよい。また、親水性の程度を、キャピラリー６１の導入口から奥に向けて上昇させることにより、標的部分を含む液体が毛細管現象によりキャピラリー６１内部の奥深くまで上昇することが可能となる。 The inner wall of the capillary 61 is preferably hydrophilic so that the target portion does not adhere to the inner wall of the capillary 61. For example, as shown in FIG. 12, the inner wall of the capillary 61 can be made hydrophilic by providing fine irregularities or roughening the inner wall of the capillary 61. Alternatively, the inner wall of the capillary 61 may be made hydrophilic by plasma treatment, chemical vapor deposition (CVD), or the like. Further, by increasing the degree of hydrophilicity from the introduction port of the capillary 61 toward the back, the liquid including the target portion can rise deep inside the capillary 61 due to the capillary phenomenon.
図１３に示すように、マニピュレーター６０は、例えば、図１０に示す記憶装置４０３から試料１の標的部分の輪郭の三次元座標の情報を読み取り、標的部分の近傍に図１３に示すキャピラリー６１の導入口を近づけてもよい。第３の実施の形態に係るレーザーマイクロダイセクターのその他の構成要素は、第１又は第２の実施の形態と同様である。 As shown in FIG. 13, the manipulator 60 reads, for example, information on the three-dimensional coordinates of the contour of the target portion of the sample 1 from the storage device 403 shown in FIG. 10, and introduces the capillary 61 shown in FIG. 13 in the vicinity of the target portion. You may bring your mouth closer. Other components of the laser microdissector according to the third embodiment are the same as those of the first or second embodiment.
（第４の実施の形態）
第４の実施の形態に係るレーザーマイクロダイセクターは、図１４に示すように、切断レーザー光で単離された標的部分を採取及び回収するマニピュレーター６０が、図１５に示すカンチレバー６２を備える。カンチレバー６２としては、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で使用されるカンチレバーが使用可能である。
(Fourth Embodiment)
In the laser microdissector according to the fourth embodiment, as shown in FIG. 14, the manipulator 60 for collecting and recovering the target portion isolated by the cutting laser light includes the cantilever 62 shown in FIG. As the cantilever 62, a cantilever used in an atomic force microscope (AFM) can be used.
例えば、標的部分と特異的に結合する分子でカンチレバー６２のチップを修飾することにより、分子間の親和力を用いて標的部分を回収することが可能である。例えば、予め、標的部分をビオチンで修飾し、カンチレバー６２のチップをアビジンで修飾して、標的部分にカンチレバー６２のチップを近づけることにより、ビオチン−アビジン結合により、標的部分を採取及び回収することが可能である。標的部分を採取及び回収には、その他のタンパク質相互作用、及び核酸相互作用等を用いてもよい。また、あるいは、標的部分を磁性粒子で修飾し、磁性を付与されたカンチレバー６２のチップで標的部分を採取及び回収してもよい。 For example, by modifying the tip of the cantilever 62 with a molecule that specifically binds to the target moiety, the target moiety can be recovered using the intermolecular affinity. For example, the target portion can be previously modified with biotin, the tip of the cantilever 62 can be modified with avidin, and the tip of the cantilever 62 can be brought close to the target portion to collect and recover the target portion by biotin-avidin binding. It is possible. Other protein interactions, nucleic acid interactions, and the like may be used to collect and recover the target portion. Alternatively, the target portion may be modified with magnetic particles, and the target portion may be collected and recovered with the tip of the cantilever 62 imparted with magnetism.
図１４に示すマニピュレーター６０は、例えば、記憶装置４０３から試料１の標的部分の輪郭の三次元座標の情報を読み取り、標的部分の近傍に図１５に示すカンチレバー６２のチップを近づけてもよい。第４の実施の形態に係るレーザーマイクロダイセクターのその他の構成要素は、第１又は第２の実施の形態と同様である。 The manipulator 60 shown in FIG. 14 may read, for example, information on the three-dimensional coordinates of the contour of the target portion of the sample 1 from the storage device 403, and bring the tip of the cantilever 62 shown in FIG. 15 close to the target portion. Other components of the laser microdissector according to the fourth embodiment are the same as those of the first or second embodiment.
（その他の実施の形態）
上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、第１の実施の形態では、顕微鏡として共焦点ラマン顕微分光装置を用いた例を示したが、三次元画像を取得可能な共焦点レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、及び電子顕微鏡等を用いてもよい。例えば、標的物質を蛍光物質や色素で染色すると、試料の三次元画像において、標的部分の表面のみが光って観察される。例えば、三次元画像を、明度に関して所定の値を基準にして二値化し、明るい部分のみを抽出することによって、標的部分の三次元座標を得ることが可能となる。また、試料は、生体試料以外の人工物であってもよい。さらに、例えば、図１６に示すように、標的部分を磁性粒子で修飾し、マニピュレーターとしての電磁石６３で標的物質を回収してもよい。試料から複数単離された標的物質を、幅広の電磁石６３で一度に回収してもよい。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。
(Other embodiments)
Although the present invention has been described according to embodiments as described above, the descriptions and drawings that form part of this disclosure should not be understood to limit the invention. This disclosure should reveal to those skilled in the art various alternative embodiments, examples and operational techniques. For example, in the first embodiment, an example in which a confocal Raman microscope microscope is used as a microscope is shown, but a confocal laser microscope, a fluorescence microscope, an electron microscope, or the like capable of acquiring a three-dimensional image may also be used. Good. For example, when the target substance is stained with a fluorescent substance or a dye, only the surface of the target portion is observed to shine in the three-dimensional image of the sample. For example, it is possible to obtain the three-dimensional coordinates of the target portion by binarizing the three-dimensional image with respect to a predetermined value with respect to the brightness and extracting only the bright portion. Further, the sample may be an artificial object other than the biological sample. Further, for example, as shown in FIG. 16, the target portion may be modified with magnetic particles, and the target substance may be recovered by an electromagnet 63 as a manipulator. A plurality of target substances isolated from the sample may be recovered at one time by a wide electromagnet 63. As described above, it should be understood that the present invention includes various embodiments not described here.
１ 試料
１０ ステージ
２０ 顕微鏡
２１ 励起光源
２２ ラインフィルター
２３、２４、２８、４３、４４、５３ 反射鏡
２５、３０、４６、５１ レンズ
２６ ハーフミラー
２７、４８ 対物レンズ
２９ バンドパスフィルタ
４１ 切断レーザー光源
４２ ラインフィルター
４５ アパーチャー
４７ 位置制御機構
５０ ラマン分光器
５２ ピンホール
５４、５６ 凹面反射鏡
５５ 回折格子
５７ 検出器
６０ マニピュレーター
６１ キャピラリー
６２ カンチレバー
６３ 電磁石
１２１ 光源
１２７ 対物レンズ
１２８ 反射鏡
１３０ レンズ
１３１ 検出器
３０１ 標的部分特定部
３０２ 画像生成部
４０１ 表示装置
４０２ 入力装置
４０３ 記憶装置
1 Sample 10 Stage 20 Microscope 21 Excitation light source 22 Line filter 23, 24, 28, 43, 44, 53 Reflector 25, 30, 46, 51 Lens 26 Half mirror 27, 48 Objective lens 29 Band pass filter 41 Cutting laser light source 42 Line filter 45 Aperture 47 Position control mechanism 50 Raman spectroscope 52 Pinhole 54, 56 Concave reflector 55 Diffraction lattice 57 Detector 60 Manipulator 61 Capillary 62 Cantilever 63 Electromagnet 121 Light source 127 Objective lens 128 Reflector 130 Lens 131 Detector 301 Target Part identification unit 302 Image generation unit 401 Display device 402 Input device 403 Storage device
Claims (13)
前記三次元画像から前記生体試料の標的部分の三次元座標を特定することと、
前記生体試料を切断する深紫外レーザー光である切断レーザー光を発し、前記標的部分の三次元座標に基づき、前記生体試料の標的部分の周囲が切断されるよう、前記生体試料に対する前記切断レーザー光の入射位置及び入射角を変化させることと、
前記切断レーザー光で単離された標的部分をマニピュレーターで回収することと、
を備え、
前記マニピュレーターが、前記標的部分を含む液体が毛細管現象により内部を上昇するキャピラリーを備え、
前記キャピラリーの内壁が親水性である、
レーザーマイクロダイセクション方法。 Acquiring a three-dimensional image of an unfixed biological sample and
Identifying the three-dimensional coordinates of the target portion of the biological sample from the three-dimensional image,
The cutting laser light for the biological sample is emitted so that the periphery of the target portion of the biological sample is cut based on the three-dimensional coordinates of the target portion by emitting a cutting laser light which is a deep ultraviolet laser light for cutting the biological sample. By changing the incident position and angle of incidence of
The target portion isolated by the cutting laser light is recovered by a manipulator, and
With
The manipulator comprises a capillary in which the liquid containing the target portion rises inside due to capillarity.
The inner wall of the capillary is hydrophilic,
Laser microdissection method.
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