JP6779558B2 - 凍結させる生物学的試料における氷核形成を制御する装置 - Google Patents
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Description
・ストロー(典型的には直径2mm〜4mm、長さ140mmまでの薄壁チューブであり、容量は0.2ml〜0.5mlである);
・クライオバイアル(cryovial)(より広い直径(典型的に直径12.5mm)の短いチューブであり、容量は0.5ml〜5.0mlである);
・バッグ(5ml〜1000mlの容量を備えた、種々の可撓性バッグは、大容量の凍結保存に利用できる);そして
・マルチウェルプレート、マトリックスチューブ、およびロボット工学、ハイスループットスクリーニング等にて使用されるその他のSBS(Society for Biomolecular Sciences)フォーマット。
1.凍結および解凍後の試料中の一定数の生存細胞を保証する企業は、生存率の範囲を補償するために試料を過剰充填しなければならない。仮に細胞のばらつきを減少させることができる場合、より少ない細胞量を必要とすることになり、それでも生存可能な最小数が保証される。これにより、コストが大幅に削減される。
3.凍結および解凍された接着細胞でのマルチウェルプレート(例えば、96ウェルプレートおよび384ウェルプレート)を使用するハイスループットスクリーニングは、関心のある細胞の種類(肝細胞、筋細胞、幹細胞株など)の多くでは不可能である。細胞のバックグラウンドでのばらつきは、有意な試験結果を同定するにはあまりにも多くの「ノイズ」を引き起こす。これにより、企業は、接着細胞で調製された「新鮮な」(すなわち、凍結されていない)マルチウェルプレートを使用するか、単一の凍結した供給源からマルチウェルプレートをシーディングすることを強いられる。いずれの選択肢も、マルチウェルテストのロジスティクスを複雑にすると同時に、時間とコストが大幅に増加する。
1)均質な氷核形成は、水体(body of the water)内のランダムな密度変動によって簡単に生じ、そのような分子クラスターの成長および崩壊の動力学および氷の結晶化のための核として作用する同分子クラスターの能力については十分に記載されている。
1)「シーディング(seeding)」。哺乳動物組織培養の基本的な低温生物学の初期の研究において、細胞およびのちのIVF試料は、過冷却された試料への小さな氷結晶の物理的導入によってシーディングされていた。この手順に伴う汚染の可能性を取り除くために、閉じた冷凍容器の外側にコールドスポットを手動で生成することによって試料中に氷核形成を誘発することが現在では一般的に行われており、これはいまでも誤って「シーディング」と呼ばれている。
好ましくは、第1の層および第2の層は、キャビティ内に氷核形成材料を封入するために、ハウジングの縁部であってキャビティを囲む縁部にて少なくとも互いに結合される。
好ましくは、ハウジング本体は、同ハウジング本体の表面に凹部を備え、凹部はキャビティを形成し、透過性ハウジング壁は凹部を覆って設けられ、キャビティ内に氷核形成材料を封入するために、ハウジング本体の表面に結合される。
少なくとも1つのハウジングは複数のハウジングからなり、各ハウジングは足部内に設けられ、各ハウジングはキャビティと少なくとも1つの透過性ハウジング壁とを含む。
本発明の第4の態様によれば、氷を核形成する方法が提供され、同方法は凍結させる生物学的試料を含む容器に本明細書に記載の装置を挿入するステップを含む。
概して言えば、本技法の実施形態は、凍結保存および凍結乾燥のプロセス時等において、氷形成を制御するための装置を提供する。特に、同装置は、氷核形成剤が試料内の生物学的物質に接触することなく、または生物学的物質を汚染することなく、保存されるべき生物学的試料に氷核形成材料を送達するための機構を提供する。有利なことに、装置の実施形態は、バイアル、チューブ、マルチウェルプレートなどの既存の広く使用される実験装置との互換性を備えて製造されてもよい。装置のさらなる利点は、試料の凍結および引き続く解凍の後の細胞生存率の増加である。
用語「氷核形成材料」は、本明細書では、用語「氷核剤」、「核形成剤」、および「凍結剤」と互換的に使用される。
「試料」は、以下でより詳細に説明するように、容器内に含まれていてもよい。「容器」という用語は、本明細書では、用語「容器(vessel)」、「試料容器」、「試験管」、「バイアル」、「ストロー」、「マルチウェルプレート」、「ウェル」、「バッグ」と互換的に使用される。
第1のハウジング壁前駆体および第2のハウジング壁前駆体(挿入プレートの足部に氷核形成材料を封入するために使用される)は、好ましくは、複数のハウジング壁セグメントを含むシート材料であり、同セグメントは正しい位置に配置され、同セグメントが打ち抜かれ、レーザ切断され、そうでなければシートから除去されて足部に適用されることを可能にするサイズを有する。有利なことに、これにより、複数の足部の第1のハウジング壁を、単一の製造ステップで各足部に結合することが可能になる(そして、各足部の第2のハウジング壁に対しても同様に)。ハウジング壁セグメントは、ヒートシールされる前にハウジング壁セグメントを各足部に位置合わせさせるのに役立つ特定のパターンの穿孔によって取り囲まれてもよい。
生物学的試料では、凍結プロセス中に細胞を保護するためにDMSOまたはグリセロールなどの凍結保護剤がしばしば使用される。凍結保護剤は、典型的には凍結される試料の5%を構成するであろう。
・融解潜熱からのエネルギー放出を吸収するために、理論凝固点より数度低い保持時間。例えば、理論凝固点が−3℃の場合、−10℃で8分間の保持期間が凍結プログラムに含まれることがある。
試料は、好ましくは、生物学的試料を保護するのに十分な速度で解凍する。典型的には、凍結試料は10分以内に完全に解凍されるべきである。
1.容器内に収容された氷を核形成する材料を含有するデバイスであって、容器のいくつかの壁は水に対して透過性である。デバイス内の氷核剤は、細胞を取り囲む溶液と接触しているが、生物学的材料が粒子で汚染されることを回避する。
a.その中に穴を有する分割バリア
b.その中に一連の穴を有する分割バリア
c.ウィッキング材料またはスポンジ材料から全体的または部分的に作製される分割バリア
d.フィルタまたは膜材料から全体的にまたは部分的に作製される分割バリア
e.親水性フィルタまたは膜材料から全体的にまたは部分的に作製される分割バリア、によって試料溶液と接触して保持される項1に記載のデバイス。
5.凍結剤を試料容器から分離することができる項1に記載のデバイス。
6.試料容器が試験管、バイアル、ストロー、マルチウェルプレートまたはバッグであり得る、項1に記載のデバイス。
8.試料の最も冷却している部分の近くに氷核剤が保持される項7に記載のデバイス。
10.チャンバが試料容器とは別個の部分であり、取り出すことができる上記した項に記載されたデバイス。
上述の記載は、最良の態様であると考えられるもの、および本技術を実施するための他の適切な態様を記載しているが、本技術は、好ましい実施形態のこの記載に開示された特定の構成および方法に限定されるべきではないことを当業者であれば理解するであろう。当業者であれば、本技術は広範囲の用途を有し、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の概念から逸脱することなく実施形態が広範囲の変更をとることができることを認識するであろう。
Claims (6)
- 氷核形成を実施するための装置であって、前記装置はマルチウェルプレートを含み、前記マルチウェルプレートは、
複数のウェルと、
複数の一体化ハウジングと、
を含み、前記複数の一体化ハウジングのうちの1つの一体化ハウジングは複数のウェルのうちの1つのウェルに一体化され、
前記一体化ハウジングは、
一体化ハウジング壁と、
一体化透過性ハウジング壁と、
前記一体化ハウジング壁と前記一体化透過性ハウジング壁との間の一体化キャビティと、
を含み、氷核形成材料が前記一体化キャビティ内に封入されている、装置。 - 前記一体化ハウジング壁は、前記ウェルの側壁の少なくとも一部から形成されている請求項1に記載の装置。
- 前記一体化ハウジング壁は、前記ウェルの少なくとも底壁から形成されている請求項1に記載の装置。
- 前記ウェルの底壁は内面に一体化キャビティを形成する凹部を含み、前記一体化透過性ハウジング壁は前記凹部を覆って設けられるとともに前記一体化キャビティ内に氷核形成材料を封入するべく前記底壁の前記内面に結合されている請求項3に記載の装置。
- 前記一体化透過性ハウジング壁は、透過性材料、1つまたは複数の穴を含む材料、スポンジ材料、スポンジ材料を含む材料、ウィッキング材料、フィルタプレート、フィルタ材料、メッシュ材料、透過性膜、親水性フィルタおよび親水性膜材料のうちのいずれか1つから形成される請求項1乃至3のいずれか一項に記載の装置。
- 前記氷核形成材料は、グラム陰性菌、シュードモナス・シリンガエ、結晶コレステロール、封入されたヨウ化銀、および長石のうちのいずれか1つである請求項1乃至5のいずれか一項に記載の装置。
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