JP6769643B1 - イミダゾールジペプチドの精製方法 - Google Patents

イミダゾールジペプチドの精製方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明の目的は、動物性エキスの種類に依らずに、各イミダゾールジペプチドを高純度かつ工業的規模で大量に生産する方法を提供することにある。【解決手段】上記目的は、以下の工程（１）及び（２）を含む、イミダゾールジペプチド精製物の製造方法により解決される。（１）少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを含む動物性エキス処理液を、疎水性吸着樹脂へ接触させる吸着処理に供することにより、イミダゾールジペプチドを疎水性吸着樹脂へ吸着する工程（２）イミダゾールジペプチドが吸着した疎水性吸着樹脂を、水性溶液を用いた溶出処理に供し、前記少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを相互分離して回収することにより、イミダゾールジペプチドを精製する工程【選択図】図１

Description

本発明は、イミダゾールジペプチドの精製方法に関する。
イミダゾールジペプチドは、イミダゾール基を有するヒスチジン又はヒスチジン誘導体とアミノ酸とが結合したジペプチドであり、アンセリン（β−アラニル−１−メチルヒスチジン）、カルノシン（β−アラニルヒスチジン）、バレニン（β−アラニル−３−メチルヒスチジン）、ホモカルノシン（γ−アミノブチリル−Ｌ−ヒスチジン）などが具体例として挙げられる。イミダゾールジペプチドには、抗疲労作用、抗酸化作用、血糖値上昇抑制作用、認知機能改善作用などの生理作用があることが知られており、機能性成分として注目されている。
イミダゾールジペプチドの製造方法としては、Ｌ−ヒスチジン及び３−メチル−Ｌ−ヒスチジンなどを出発原料として、化学的、酵素学的又は微生物学的に合成する方法が知られている。例えば、特許文献１には、イミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物を用いてイミダゾールジペプチドを製造する方法が記載されている。しかし、特許文献１に記載の方法は、出発原料として３−メチル−Ｌ−ヒスチジン及び１−メチル−Ｌ−ヒスチジンを用い、これらの安定供給の観点から、イミダゾールジペプチドを工業的規模で大量に製造するためには依然として課題がある。
それに対して、イミダゾールジペプチドを工業的規模で大量に製造する方法としては、イミダゾールジペプチドを含む、マグロ、カツオ、サケなどの魚類、ウシ、ブタ、クジラなどの哺乳類、ニワトリなどの鳥類といった動物のエキスから取得する方法がある。
動物性エキスからイミダゾールジペプチドを製造する方法として、イオン交換処理を利用した方法がある。例えば、特許文献２には、魚介類のエキスを脱塩処理して得られた脱塩処理液をＨ型弱酸性陽イオン交換樹脂に通液してイミダゾールジペプチドを吸着し、次いで水洗後に塩酸及び／又は食塩水でイミダゾールジペプチドを溶出する方法が記載されている。
特許文献３には、動物性エキスと同じ電気伝導度範囲（１０±２ｍＳ／ｃｍ）及びｐＨ範囲（５．０±０．５）に調整された緩衝液を用いて予めＨ型に平衡化した強酸性陽イオン交換樹脂に、動物性エキスを接触して、イミダゾールジペプチドを吸着し、次いで緩衝液及び純水で洗浄した後、ｐＨ８〜ｐＨ１２の範囲のアルカリ溶液を通液又は混合することによってイミダゾールジペプチドを溶出する方法が記載されている。
特開２０２０−２２４３３号公報 特許第４６１２５４９号 特許第５１４２１２６号
一般的に、動物性エキスは、動物の種類及び部位により、２種類以上のイミダゾールジペプチドが含まれる。しかし、アンセリン、カルノシン、バレニン、ホモカルノシンといったイミダゾールジペプチドは電気的性質が近似することから、特許文献２及び３に記載のイオン交換処理を利用した方法では、２種類以上のイミダゾールジペプチドが個々に分離せずに、動物エキスが本来有する成分比のままで回収される。すなわち、特許文献２及び３に記載のイオン交換処理を利用した方法は、２種類以上のイミダゾールジペプチドの相互分離ができないという問題がある。
また、カルノシンの分子量は２２６であり、ホモカルノシン、アンセリン及びバレニンの分子量は２４０であることから、これらは相互に分子量が類似しており、逆浸透膜、ＮＦ膜などを利用した分子量による膜分画では、２種類以上のイミダゾールジペプチドの相互分離ができないという問題がある。
例えば、鶏由来エキスを用いてイオン交換処理法により得られるイミダゾールジペプチドは、アンセリン及びカルノシンを重量比で２：１〜３：１にて含む混合物となる。鯨由来エキスを用いた場合は、得られるイミダゾールジペプチドは、バレニン及びカルノシンを重量比で４：１〜５：１にて含む混合物となる。そして、これらの混合物から、各イミダゾールジペプチドを工業的に相互分離する方法はこれまでにほとんど知られていない。
一方で、鮭は含有するイミダゾールジペプチドのほとんどがアンセリンであることから、鮭由来エキスをイオン交換処理法に供することにより、高純度のアンセリンが得られる。しかし、単一のイミダゾールジペプチドを有する動物の種類は限定されており、さらに鮭は漁獲量に左右されるという問題がある。
したがって、動物性エキスの種類に依らずに、各イミダゾールジペプチドを高純度かつ工業的規模で大量に生産する方法はこれまでにほとんど無いという問題が依然として存在する。
そこで、本発明は、動物性エキスの種類に依らずに、各イミダゾールジペプチドを高純度かつ工業的規模で大量に生産する方法を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討していく中で、アンセリン及びバレニンは、カルノシンに対して、イミダゾール環にメチル基が１個付与された構造をとることに着眼した。そして、このような構造の違いにより、これら分子種の疎水性の差を利用した相互分離について試行錯誤を繰り返した。
その結果、驚くべきことに、２種類以上のイミダゾールジペプチドを含む動物性エキス処理液を、疎水性吸着樹脂を用いた吸着処理及び特定の溶離剤を用いた溶出処理に供することにより、イミダゾールジペプチドを相互分離することができることを見出した。
このような知見に基づいて、本発明者らは、遂に、少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを含む動物性エキス処理液から、個々のイミダゾールジペプチドを高純度で含む精製イミダゾールジペプチドを製造する方法を創作することに成功した。本発明はこのような知見や成功例に基づいて完成された発明である。
したがって、本発明の一態様によれば、以下の［１］〜［９］に示す方法が提供される。
［１］以下の工程（１）及び（２）を含む、イミダゾールジペプチド精製物の製造方法。
（１）少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを含む動物性エキス処理液を、疎水性吸着樹脂へ接触させる吸着処理に供することにより、イミダゾールジペプチドを疎水性吸着樹脂へ吸着する工程
（２）イミダゾールジペプチドが吸着した疎水性吸着樹脂を、水性溶液を用いた溶出処理に供し、前記少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを相互分離して回収することにより、イミダゾールジペプチドを精製する工程
［２］前記少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドは、カルノシンとカルノシン以外のイミダゾールジペプチドとである、［１］に記載の方法。
［３］前記少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドは、カルノシンとアンセリン又はバレニンとである、［１］に記載の方法。
［４］前記疎水性吸着樹脂は、芳香族系疎水性吸着樹脂である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］前記水性溶液は、水、希アルカリ性水溶液及び希有機溶媒水溶液からなる群から選ばれる少なくとも１種の水性溶液である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］前記希アルカリ性水溶液は０．００１Ｍ〜０．００８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液であり、及び前記希有機溶媒水溶液は０．１質量％〜０．８質量％エタノールである、［５］に記載の方法。
［７］前記動物性エキス処理液は、動物性エキスを強酸性陽イオン交換樹脂によるイオン吸着処理及びアルカリ性水溶液を用いた溶出処理に供して得られる、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］前記動物性エキスは、脱塩処理に供した動物性エキスである、［７］に記載の方法。
［９］前記動物性エキスは、ニワトリ、クジラ、ウシ、ブタ、サケ、カツオ及びマグロからなる群から選ばれる少なくとも１種の動物の肉に由来する動物性エキスである、［７］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
本発明の一態様の方法によれば、疎水性吸着樹脂を用いた吸着処理及び特定の溶離液を用いた溶出処理を採用することで、複雑な設備、装置、操作などを用いなくとも、個々のイミダゾールジペプチドを高純度で含むイミダゾールジペプチド精製物を得ることができる。したがって、本発明の一態様の方法は、簡便かつ経済性に優れた、工業的規模での実施が可能である方法である。
本発明の一態様の方法によって得られるイミダゾールジペプチド精製物によれば、各イミダゾールジペプチド、例えば、アンセリン、バレニン又はカルノシンに固有の生理的作用を発現することが期待できる。
図１は、後述する実施例に示すとおりの、アンセリン精製品及びカルノシン精製品の混合物を相互分離して得られた分離例を示した図である。 図２は、後述する実施例に示すとおりの、各種溶離液を用いてアンセリン及びカルノシンを相互分離して得られた分離例を示した図である。 図３は、後述する実施例に示すとおりの、合成吸着樹脂としてダイヤイオンＨＰ２０を用いてアンセリン及びカルノシンを相互分離して得られた分離例を示した図である。 図４は、後述する実施例に示すとおりの、鶏抽出エキス、イオン交換処理液及びイオン交換処理＋ＮＦ膜処理液のＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。 図５は、後述する実施例に示すとおりの、原料として鶏肉を用いた、アンセリン及びカルノシンを相互分離して得られた分離例を示した図である。 図６は、後述する実施例に示すとおりの、粗アンセリン精製液、前半回収画分及び後半回収画分のＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。 図７は、後述する実施例に示すとおりの、クジラ肉抽出エキス、イオン交換処理液及びイオン交換処理＋ＮＦ膜処理液のＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。 図８は、後述する実施例に示すとおりの、原料としてクジラ肉を用いた、アンセリン及びカルノシンを相互分離して得られた分離例を示した図である。 図９は、後述する実施例に示すとおりの、粗バレニン精製液、前半回収画分及び後半回収画分のＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。 図１０は、後述する実施例に示すとおりの、原料としてブタ肉を用いた、カルノシン、アンセリン及びバレニンを相互分離して得られた分離例を示した図である。 図１１は、後述する実施例に示すとおりの、粗カルノシン精製液、前半回収画分及び後半回収画分のＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
以下、本発明の一態様の方法の詳細について説明するが、本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。また、本明細書においてなされている推測及び理論は、本発明者らのこれまでの知見及び経験によってなされたものであることから、本発明はこのような推測及び理論のみによって拘泥されるものではない。
「ＲＶ」は、樹脂量に対する溶媒の流量倍数を表し、例えば、樹脂量に対して２倍の動物性エキスを通液する場合は、ＲＶは２となる。
「ＳＶ」は、空間速度（Ｓｐａｃｅ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ）を表し、１時間当たりに樹脂量（体積）を通過した液量（体積）の樹脂量に対する比率を表す。例えば、１ｍ３の樹脂に１時間当たり５ｍ３の液量が通過した場合、ＳＶは５となる。
「及び／又は」は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
数値範囲の「〜」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％〜１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。なお、本明細書では、「重量％」は「質量％」と同義である。
「含む」は、含まれるものとして明示されている要素以外の要素を付加できることを意味する（「少なくとも含む」と同義である）が、「からなる」及び「から本質的になる」を包含する。すなわち、「含む」は、明示されている要素及び任意の１種若しくは２種以上の要素を含み、明示されている要素からなり、又は明示されている要素から本質的になることを意味し得る。要素としては、成分、工程、条件、パラメーター等の制限事項等が挙げられる。
整数値の桁数と有効数字の桁数とは一致する。例えば、１の有効数字は１桁であり、１０の有効数字は２桁である。また、小数値は小数点以降の桁数と有効数字の桁数は一致する。例えば、０．１の有効数字は１桁であり、０．１０の有効数字は２桁である。
［本発明の一態様の方法の概要］
本発明の一態様の方法は、動物性エキスをイオン交換処理などに供して得られた、複数種類のイミダゾールジペプチドを含む動物性エキス処理液から、１種類のイミダゾールジペプチドを高純度で含むイミダゾールジペプチド精製物を製造する方法に関する。
例えば、図４に示すとおり、鶏抽出エキスを強酸性陽イオン交換樹脂に吸着し、次いで苛性ソーダでイミダゾールジペプチドを溶出し、次いでＮＦ膜で脱塩処理する場合、クレアチニンが除去された高純度のイミダゾールジペプチドが得られる。しかし、鶏抽出エキス、イオン交換処理液及びイオン交換処理＋ＮＦ膜処理液において、イミダゾールジペプチドの構成比（アンセリン及びカルノシンの含有比率）はほとんど変わらない。
同様に、図７に示すとおり、クジラ肉抽出エキスを用いる場合、得られるイミダゾールジペプチドにおけるバレニン及びカルノシンの含有比率は各処理を経由してもほとんど変わらない。
したがって、動物性エキスをイオン交換処理に供するだけでは、得られる処理物におけるアンセリン、バレニン、カルノシンなどの個々のイミダゾールジペプチドの構成比は、使用する動物性エキスの動物の種類によって決定される。
しかし、本発明の一態様の方法を用いれば、動物性エキスのイオン交換処理液における個々のイミダゾールジペプチドを、動物性エキスの動物の種類に依らずに、相互分離することができる。例えば、鶏抽出エキスのイオン交換処理液を本発明の具体的態様の方法に供した場合の結果を示す図５を参照すると、フラクション番号５〜７を用いれば、カルノシンを高純度で含み、かつアンセリンをほとんど含まないイミダゾールジペプチド精製物が得られる。これとは逆に、後半画分を用いれば、アンセリンを高純度で含み、かつカルノシンをほとんど含まないイミダゾールジペプチド精製物が得られる（図６Ｃを参照）。
別の例として、クジラ肉抽出エキスのイオン交換処理液を本発明の具体的態様の方法に供した場合の結果を示す図８を参照すると、前半画分を用いれば、カルノシンを高純度で含み、かつバレニンをほとんど含まないイミダゾールジペプチド精製物が得られる（図９Ｂを参照）。これとは逆に、後半画分を用いれば、バレニンを高純度で含み、かつカルノシンをほとんど含まないイミダゾールジペプチド精製物が得られる（図９Ｃを参照）。
したがって、本発明の一態様の方法によれば、鶏、クジラといった動物種に限定されずに、動物性エキス処理液から、アンセリン、バレニン、カルノシンといった個々のイミダゾールジペプチドを高純度で含む、イミダゾールジペプチド精製物が得られる。
本発明の一態様の方法は、以下の工程（１）及び（２）を含む。
（１）少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを含む動物性エキス処理液を、疎水性吸着樹脂へ接触させる吸着処理に供することにより、イミダゾールジペプチドを疎水性吸着樹脂へ吸着する工程
（２）イミダゾールジペプチドが吸着した疎水性吸着樹脂を、水性溶液を用いた溶出処理に供し、前記少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを相互分離して回収することにより、イミダゾールジペプチドを精製する工程
イミダゾールジペプチドは、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、イミダゾール基を有するヒスチジン又はヒスチジン誘導体とアミノ酸とが結合したジペプチドであるということができる。イミダゾールジペプチドの具体例としては、アンセリン（β−アラニル−１−メチルヒスチジン）、カルノシン（β−アラニルヒスチジン）、バレニン（β−アラニル−３−メチルヒスチジン）、ホモカルノシン（γ−アミノブチリル−Ｌ−ヒスチジン）などが挙げられる。本発明の一態様の方法は、疎水性吸着樹脂を用いて、イミダゾールジペプチドの疎水性の違いにより吸着処理及び溶出処理を実施することから、相互分離すべきイミダゾールジペプチドは疎水性の差異があるイミダゾールジペプチドであることが好ましく、カルノシンとカルノシン以外のイミダゾールジペプチドとであることがより好ましく、カルノシンとアンセリン又はバレニンとであることがさらに好ましい。
動物性エキスは、魚類、鳥類、哺乳類などの動物の肉などの部位に含まれる成分を、抽出媒体に溶かし出して得られたものであればよい。動物の種類は、肉などの部位にイミダゾールジペプチドを含む動物であれば特に限定されないが、例えば、アンセリンを多く含むカツオ、マグロ、サケ、ウナギ、サメ、ウシ、ニワトリ；カルノシンを多く含むブタ；バレニンを多く含むクジラなどが挙げられる。動物性エキスは、イミダゾールジペプチドの含有量が大きく、資源量として豊富であり、又は飼育が容易であることから、ニワトリ、クジラ、ウシ、ブタなどの畜肉及びサケ、カツオ、マグロなどの魚類の筋肉が好ましい。
動物性エキスの取得方法は特に限定されず、イミダゾールジペプチドが含まれる動物の部位を、水抽出、熱水抽出、超臨界抽出などの公知の抽出方法に供して得られる抽出物を利用してもよいし、市販されているものを利用してもよい。動物性エキスは、上記抽出物から不溶性固形分及び夾雑成分を取り除くために、固液分離処理、濃縮処理、乾燥処理、希釈処理などの加工処理に供したものであることが好ましい。
動物性エキスをイオン交換処理に供する場合、ロス率が下がって樹脂あたりのイミダゾールジペプチドの吸着量が向上し、結果としてイミダゾールジペプチドの純度が向上することから、動物性エキスは脱塩処理に供することが好ましい。動物性エキスの脱塩処理は、例えば、陽イオン交換膜／陰イオン交換膜としてＣＭＶ−Ｎ／ＡＭＶ−Ｎを備えた電気透析脱塩機「ＤＷ−３Ｅ２型」（ＡＧＣエンジニアリング社製）を用いて、イミダゾールジペプチド１質量％あたり目標伝導度は２ｍＳ／ｃｍ〜１４ｍＳ／ｃｍ、好ましくは５ｍＳ／ｃｍ程度の条件で実施することが好ましい。
動物性エキス処理液は、少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを高純度で含むものであることが好ましい。動物性エキスから動物性エキス処理液を得る方法としては、特許文献１に記載の方法、特許文献２に記載の方法、特願２０１９−２３５５３２明細書に記載の方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
動物性エキス処理液におけるイミダゾールジペプチドの含有量は、乾燥質量（固形分）として、７０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上であることがより好ましい。動物性エキスにはクレアチニンが含まれる場合が多いことから、動物性エキス処理液におけるクレアチニンの含有量は、イミダゾールジペプチドの質量あたり、１０質量％以下であることが好ましく、５質量％以下であることがより好ましい。
動物性エキス処理液の好ましい具体例である、イミダゾールジペプチドの含有量が乾燥質量（固形分）として８０質量％以上であり、かつクレアチニンの含有量がイミダゾールジペプチドの質量あたり５質量％以下である動物性エキス処理液は、例えば、特願２０１９−２３５５３２明細書に記載の方法によって得ることができる。したがって、動物性エキス処理液の好ましい具体例は、動物性エキス、好ましくは脱塩処理に供した動物性エキスを、強酸性陽イオン交換樹脂を用いたイオン吸着処理及びアルカリ性水溶液を用いた溶出処理に供して得られる動物性エキス処理液である。
動物性エキス処理液は、個々のイミダゾールジペプチドを相互分離するという観点から、少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを含むものであるが、より高度に精製するという意味では実質的に１種類のイミダゾールジペプチドを含むものであってもよい。
動物性エキス処理液は、吸着処理工程にてイミダゾールジペプチドの疎水性吸着樹脂への吸着を良好にするために、ｐＨが７〜１０であることが好ましく、イミダゾールジペプチドの有効電荷がゼロ付近になることから、ｐＨが７．５〜９．５であることがより好ましく、ｐＨが８．０〜９．０であることがさらに好ましい。動物性エキス処理液のｐＨがこれらの範囲にない場合は、酸又はアルカリを用いてｐＨを調整してもよい。
［工程（１）：吸着処理工程］
工程（１）では、動物性エキス処理液を、疎水性吸着樹脂へ接触させる吸着処理に供することにより、イミダゾールジペプチドを疎水性吸着樹脂へ吸着する。
疎水性吸着樹脂は、イオン交換基を持たずに疎水性の多孔性構造を有する合成樹脂であれば特に限定されないが、好ましくは芳香族系疎水性吸着樹脂である。芳香族系疎水性吸着樹脂は、吸着性置換基としてベンゼン環を有する疎水性吸着樹脂であり、例えば、吸着性置換基として同一の構造又は異なる構造を有する置換基を有してもよいフェニル基又はフェニルアルキル基を有する疎水性吸着樹脂などが挙げられ、好ましくは下記一般式（Ｉ）に示される構造を有する疎水性吸着樹脂である。
（Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択されるハロゲン原子、メチル基、エチル基、メチレン基又はエチレン基であり、ｘは０〜２の整数であり、ｙは０〜２の整数である。）
疎水性吸着樹脂は、公知の方法により製造したものでも、市販されているものでも、どちらでもよい。例えば、市販されている芳香族系疎水性吸着樹脂としては、「セパビーズＳＰ２０７」、「セパビーズＳＰ７０」、「セパビーズＳＰ８５０」、「セパビーズＳＰ８２５Ｌ」、「セパビーズＳＰ７００」、「ダイヤイオンＨＰ２０」、「ダイヤイオンＨＰ２１」（それぞれ三菱ケミカル社製）などが挙げられ、本発明の一態様の方法ではこれらの芳香族系疎水性吸着樹脂を好ましく用いることができる。
動物性エキス処理液と疎水性吸着樹脂とを接触する方法は特に限定されず、これらが接触することにより動物性エキス処理液中のイミダゾールジペプチドが疎水性吸着樹脂へ吸着するようにすればよく、疎水性吸着樹脂を動物性エキス処理液に浸漬するバッチ方式でも、疎水性吸着樹脂を充填したカラムに動物性エキス処理液を通液するカラム方式でもいずれの方式も採用できる。この際、カラム操作に疑似移動床法を採用すれば、イミダゾールジペプチドの回収率が高められる可能性がある。
動物性エキス処理液におけるイミダゾールジペプチドの含有量、動物性エキス処理液の疎水性吸着樹脂への負荷量、吸着温度などのその他の吸着条件は、使用する疎水性吸着樹脂の種類及び量などに基づいて、疎水性吸着樹脂の吸着容量の範囲内で適宜設定すればよい。疎水性吸着樹脂を充填したカラムに動物性エキス処理液を通液する場合において、動物性エキス処理液の疎水性吸着樹脂への接触速度は、動物性エキス処理液中のイミダゾールジペプチドが疎水性吸着樹脂に吸着する限り特に限定されないが、例えば、１０℃〜３０℃下、好ましくは室温（約２０℃）下で、ＳＶが０．５〜１０、好ましくは１〜５となる流速であることが好ましい。
例えば、イミダゾールジペプチド ２ｇを樹脂１Ｌに吸着すると想定すると、イミダゾールジペプチドの含有量が０．０１質量％以上、好ましくは０．０５質量％〜１．０質量％である動物性エキス処理液の１ＲＶ〜１０ＲＶ、好ましくは１ＲＶ〜５ＲＶの量を、ＳＶ１〜ＳＶ３の流速で、１５℃〜２５℃、好ましくは室温にて、疎水性吸着樹脂と接触させることにより、イミダゾールジペプチドを疎水性吸着樹脂へ吸着することができる。
［工程（２）：溶出処理工程］
工程（２）では、イミダゾールジペプチドが吸着した疎水性吸着樹脂を、水性溶液を用いた溶出処理に供する。このような工程（２）を実施することにより、動物性エキス処理液中の複数種類のイミダゾールジペプチドを相互分離して回収することが可能となり、それにより単独のイミダゾールジペプチドを高純度で含有するイミダゾールジペプチド精製物が得られる。
溶離剤として水性溶液を用いることにより、個々のイミダゾールジペプチドの疎水性に応じて、複数種類のイミダゾールジペプチドを相互分離することができる。水性溶液は、水が９５質量％以上であり、かつｐＨが中性〜弱アルカリ性である水溶液であればよい。水性溶液として、水、希アルカリ性水溶液及び希有機溶媒水溶液が好ましい。希アルカリ性水溶液は、アルカリ性物質を含みつつも、ｐＨが８〜１２であるものであればよい。希有機溶媒水溶液は、親水性有機溶媒と水との混合液であればよい。
希アルカリ性水溶液におけるアルカリ性物質の種類は特に限定されないが、希アルカリ性水溶液は、例えば、水酸化ナトリウム水溶液及び水酸化カリウム水溶液などのアルカリ金属塩水酸化物水溶液、アンモニア水溶液といった無機アルカリ性水溶液などが挙げられ、溶出効率及びイミダゾールジペプチドの回収率の観点から、アルカリ金属塩水酸化物水溶液が好ましく、水酸化ナトリウム水溶液がより好ましい。例えば、希アルカリ性水溶液は、０．００１Ｍ〜０．０１Ｍのアルカリ金属塩水酸化物水溶液であることが好ましく、０．００１Ｍ〜０．００８Ｍのアルカリ金属塩水酸化物水溶液であることがより好ましく、０．００２Ｍ〜０．００７Ｍのアルカリ金属塩水酸化物水溶液であることがさらに好ましい。
希有機溶媒水溶液に用いる親水性有機溶媒は特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコールなどの炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトンなどの低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられるが、好ましくはメタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール及びアセトンである。例えば、希有機溶媒水溶液は、０．０１質量％〜１．０質量％の希有機溶媒水溶液であることが好ましく、０．１質量％〜０．８質量％の希有機溶媒水溶液であることがより好ましく、０．２質量％〜０．７質量％の希有機溶媒水溶液であることがさらに好ましい。
溶離剤の使用量は特に限定されないが、例えば、芳香族系疎水性吸着樹脂 ２Ｌを充填したカラムに動物性エキス処理液を通液した場合、０．００３Ｍ〜０．００６Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液を、２ＲＶ〜２０ＲＶ、好ましくは５ＲＶ〜１０ＲＶの量及びＳＶ１．０〜ＳＶ３．０の流速で、１５℃〜２５℃、好ましくは室温にて通液することにより、疎水性吸着樹脂に吸着した複数種類のイミダゾールジペプチドを効率良く相互分離することができる。
溶出処理は、カラム内に疎水性吸着樹脂が充填及び保持された状態で、撹拌機により、又は気体を吹き込むことにより、疎水性吸着樹脂を撹拌しつつ、溶離剤を徐々に加えていくことで撹拌してもよい。
工程（１）及び工程（２）を経由することにより、動物性エキス処理液中の複数種類のイミダゾールジペプチドを相互分離して回収し、単独のイミダゾールジペプチドを高純度で含有するイミダゾールジペプチド精製物を得ることができる。イミダゾールジペプチド精製物は、工程（１）及び工程（２）を経由して得られるものであれば、イミダゾールジペプチドの純度は特に限定されないが、例えば、イミダゾールジペプチドの全量に対して、特定の単独のイミダゾールジペプチドの含有量が７５質量％以上であり、好ましくは８５質量％以上であり、より好ましくは９０質量％以上であり、さらに好ましくは９５質量％以上であるイミダゾールジペプチド精製物である。
イミダゾールジペプチド精製物の具体例として、動物性エキスとしてニワトリ胸肉の熱水抽出物を用いた場合は、イミダゾールジペプチド（アンセリン、カルノシン、バレニン）の全量に対してアンセリンの含有量が７５質量％以上であり、好ましくは８０質量％以上であり、より好ましくは９０質量％以上であり、さらに好ましくは９５質量％以上であり、なおさらに好ましくは９７質量％以上であるイミダゾールジペプチド精製物などが挙げられる。この場合、イミダゾールジペプチドの全量に対してカルノシンの含有量は２５質量％以下であり、好ましくは２０質量％以下であり、より好ましくは１０質量％以下であり、さらに好ましくは５質量％以下である。また、この場合、アンセリンの収率は、動物性エキス処理液におけるアンセリンの量を基準にすると、５０％以上にすることが可能である。
別のイミダゾールジペプチド精製物の具体例として、動物性エキスとしてクジラ肉の熱水抽出物を用いた場合は、イミダゾールジペプチド（バレニン、カルノシン、アンセリン）の全量に対してバレニンの含有量が８５質量％以上であり、好ましくは９０質量％以上であり、より好ましくは９５質量％以上であり、さらに好ましくは９７質量％以上であるイミダゾールジペプチド精製物などが挙げられる。この場合、イミダゾールジペプチドの全量に対してカルノシンの含有量は２０質量％以下であり、好ましくは２５質量％以下であり、より好ましくは１０質量％以下であり、さらに好ましくは５質量％以下である。また、この場合、バレニンの収率は、動物性エキス処理液におけるバレニンの量を基準にすると、７０％以上にすることが可能である。
アンセリン、バレニン及びカルノシンの含有量は、後述する実施例に記載の方法によって測定される。
工程（１）及び工程（２）を経て得られたイミダゾールジペプチド精製物は、食品素材として用いるために、ｐＨ調整処理、脱色処理、脱臭処理、固液分離処理、脱塩処理、濃縮処理、無菌処理、乾燥処理などの各処理に供してもよい。例えば、工程（２）で得られたイミダゾールジペプチド精製物を、塩酸などの酸を用いてｐＨ６〜８、好ましくは７付近に調整するｐＨ調整処理に供すること、活性炭及び強塩基性イオン交換樹脂などの着色成分及び／又は臭気成分を吸着する材料を用いた脱色処理及び／又は脱臭処理に供すること、セラミックフィルターを用いたろ過処理などの固液分離処理に供すること、電気透析膜又はナノろ過膜を用いた脱塩処理に供すること、エバポレーターなどを用いた濃縮処理に供すること、メンブレンフィルターなどを用いた無菌処理に供すること、スプレイドライヤーなどによる乾燥処理及びこれらの２種以上の処理を順次行うことなどが挙げられる。各処理は、イミダゾールジペプチドの損失が大きくならない限り、その条件、手順などの方法については特に限定されず、公知の方法を採用できる。
例えば、イミダゾールジペプチド精製物の脱塩処理は、ｐＨ８．０以下の条件で、分画分子量が５００以下である、及び／又は食塩阻止率（食塩が膜上に保持される率）が５０％以下であるナノろ過膜を用いて実施できる。このようなナノろ過膜については、特許文献３の表３に記載がある。イミダゾールジペプチド精製物を脱塩処理に供する場合、脱塩後の塩濃度は、例えば、イミダゾールジペプチドの質量あたり、ナトリウム量として、５質量％以下であることが好ましく、２質量％以下であることがより好ましい。
本発明の一態様の方法は、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程途中に、種々の工程や操作を加入することができる。ただし、本発明の一態様の方法は、イミダゾールジペプチドの精製工程として、（１）少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを含む動物性エキス処理液を、疎水性吸着樹脂へ接触させる吸着処理に供することにより、イミダゾールジペプチドを疎水性吸着樹脂へ吸着する工程と、（２）イミダゾールジペプチドが吸着した疎水性吸着樹脂を、水性溶液を用いた溶出処理に供し、前記少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを相互分離して回収することにより、イミダゾールジペプチドを精製する工程とからなることが好ましい。
以下に、動物性エキス処理液の取得方法を含むイミダゾールジペプチド精製物の製造方法の具体的態様を説明するが、本発明の方法は以下のものに限定されない。
強酸性陽イオン交換樹脂を充填したカラムに、酸を通液して樹脂のイオン交換基をＨ型とした後、水を通液し、さらにアルカリ金属塩水溶液を通液して、樹脂のイオン交換基をＮａ型に変換する。次いで、水を通液して、余分なアルカリ金属塩水溶液を洗浄する。
イミダゾールジペプチドを含有する動物の部位を水に加えたものを、８０℃〜９５℃にて、数十分間〜数時間の熱水抽出処理に供する。得られた熱水抽出物をそのまま、又は電気透析膜又はナノろ過膜を用いた脱塩処理に供した後に、濃縮処理及び固液分離処理に供して、イミダゾールジペプチドが０．１質量％〜１．０質量％であり、Ｂｒｉｘが１．０％〜１０．０％であり、かつｐＨが５．６〜８．０である動物性エキスを得る。
動物性エキスを、１〜１０ＲＶ、ＳＶ１〜３でＮａ型に変換した強酸性陽イオン交換樹脂を充填したカラムへ通液し、次いで０．５〜５ＲＶの水を通液して、動物性エキス中のイミダゾールジペプチドを強酸性陽イオン交換樹脂へ吸着する。この吸着処理後のカラム内のｐＨは５．６〜８．０である。
次いで０．１Ｎ〜１．０Ｎアルカリ金属塩水酸化物水溶液を、１〜５ＲＶ、ＳＶ１〜５でカラムへ通液して、溶出液（動物性エキス処理液）として高純度イミダゾールジペプチドを得る。溶出処理後のカラム内のｐＨは８．５〜１４．０である。
得られた動物性エキス処理液を、酸を加えてｐＨ８〜９に調整し、１０℃〜３０℃、１〜１０ＲＶ、ＳＶ１〜５で芳香族系疎水性吸着樹脂を充填したカラムへ通液して、動物性エキス処理液中のイミダゾールジペプチドを芳香族系疎水性吸着樹脂へ吸着する。この吸着処理後のカラム内のｐＨは、使用した動物性エキス処理液と同様に、８〜９である。
次いで希アルカリ性水溶液として、０．００１Ｍ〜０．０１Ｍのアルカリ金属塩水酸化物水溶液を、１０℃〜３０℃、１〜１０ＲＶ、ＳＶ１〜５でカラムへ通液して、複数種類のイミダゾールジペプチドが相互分離し、適当量ごとにフラクション回収して、イミダゾールジペプチドを精製することにより、個々のイミダゾールジペプチドが高純度で含まれるイミダゾールジペプチド精製物を得る。なお、溶出処理後のカラム内のｐＨは、使用した希アルカリ性水溶液と同様に、８〜１２である。
イミダゾールジペプチド精製物を、酸を用いて中性付近に調整するｐＨ調整処理、電気透析膜又はナノろ過膜を用いた脱塩処理、エバポレーターを用いた濃縮処理、及び孔径０．２０μｍ〜０．４５μｍのメンブレンフィルターを用いた無菌ろ過処理に順次供して、イミダゾールジペプチド高度精製物を得てもよい。
本発明の一態様の方法によって得られるイミダゾールジペプチド精製物の剤形は特に限定されず、液体状であっても、固体状であっても、どちらでもよい。長期の保存に適したものとするために、液体状のイミダゾールジペプチド精製物を、風乾、減圧乾燥、凍結乾燥、スプレードライなどの乾燥処理に供して、粉末状とすることが好ましい。
本発明の一態様の方法で得られたイミダゾールジペプチド精製物の用途は特に限定されない。イミダゾールジペプチド精製物は、特定のイミダゾールジペプチドの含有量が大きく、かつ他のイミダゾールジペプチドの含有量が小さい。例えば、イミダゾールジペプチド精製物は、アンセリン、バレニン、カルノシンを高純度で含有するものとして、これら個々の物質が有する抗疲労作用、抗酸化作用、血糖値上昇抑制作用、認知機能改善作用などの生理活性を期待して、飲食品、医薬品といった経口用組成物、化粧品といった外用組成物などの各組成物の原料又は該組成物そのものとして利用することができる。
飲食品及び化粧品におけるイミダゾールジペプチド精製物の含有量は特に限定されないが、例えば、飲食品及び化粧品の全量に対し、イミダゾールジペプチドが乾燥質量として０．００１質量％以上となるような量であることが好ましく、０．１質量％〜９９質量％となるような量であることがより好ましい。
飲食品の剤形は特に限定されないが、例えば、液剤、散剤、錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、ゼリー、チュアブル、ペーストなどが挙げられる。
飲食品の具体的な形態としては、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、果実飲料、野菜ジュース、乳酸菌飲料、乳飲料、豆乳、ミネラルウォーター、茶系飲料、コーヒー飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、ゼリー飲料などの飲料類；トマトピューレ、キノコ缶詰、乾燥野菜、漬物などの野菜加工品；乾燥果実、ジャム、フルーツピューレ、果実缶詰などの果実加工品；カレー粉、わさび、ショウガ、スパイスブレンド、シーズニング粉などの香辛料；パスタ、うどん、そば、ラーメン、マカロニなどの麺類（生麺、乾燥麺含む）；食パン、菓子パン、調理パン、ドーナツなどのパン類；アルファー化米、オートミール、麩、バッター粉などの粉類製品；焼菓子、ビスケット、米菓子、キャンデー、チョコレート、チューイングガム、スナック菓子、冷菓、砂糖漬け菓子、和生菓子、洋生菓子、半生菓子、プリン、アイスクリームなどの菓子類；小豆、豆腐、納豆、きな粉、湯葉、煮豆、ピーナッツなどの豆類製品、；蜂蜜、ローヤルゼリーなどの加工食品；ハム、ソーセージ、ベーコンなどの肉製品；ヨーグルト、プリン、練乳、チーズ、発酵乳、バター、アイスクリームなどの酪農製品；加工卵製品；干物、蒲鉾、ちくわ、魚肉ソーセージなどの加工魚；乾燥わかめ、昆布、佃煮などの加工海藻；タラコ、数の子、イクラ、からすみなどの加工魚卵；だしの素、醤油、酢、みりん、コンソメベース、中華ベース、濃縮出汁、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、味噌などの調味料；サラダ油、ゴマ油、リノール油、ジアシルグリセロール、べにばな油などの食用油脂；スープ（粉末、液体含む）、惣菜、レトルト食品、チルド食品、半調理食品（例えば、炊き込みご飯の素、カニ玉の素）などの調理済み食品などが挙げられるが、これらに限定されない。
化粧品に配合して使用する場合は、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、パック剤などの様々な形態で使用することが可能である。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
［例１．アンセリン及びカルノシンの相互分離評価］
Ｌ−アンセリン（鮭由来アンセリン精製品、東海物産社製）及びＬ−カルノシン（浜理薬品社製）をそれぞれ２００μｍｏｌ含有した混合液１００ｍｌを調製した。得られた混合液を、芳香族系合成吸着樹脂（「セパビーズＳＰ２０７」；三菱ケミカル社製）５０ｍｌが入ったカラム（φ２０ｍｍ、高さ３００ｍｍ）に２０℃でＳＶ２にて通液して、アンセリン及びカルノシンを樹脂に吸着させた。次いでカラムに０．００５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を６ＲＶでＳＶ２にて２０℃で通液し、溶離液を１０ｍｌずつフラクション回収するようにして、アンセリン及びカルノシンを溶出した。
得られたフラクションにおけるアンセリン及びカルノシンの濃度を、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣは、カラムとして「ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（粒子径５μｍ、φ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）」（ＧＬサイエンス社製）を用い、展開溶媒として１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）添加の水を用い、ＨＰＬＣとして「ＰＵ−２０８９」（日本分光社製；流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２５℃、インジェクション容量５μｌ、検出波長２１０ｎｍ）を用いた。
分離例を図１に示す。図１に示すとおり、カルノシンが初めに溶出し、次いでアンセリンが溶出することが確認された。カルノシン及びアンセリンは溶離ピークが異なって溶出するため、回収のタイミングをずらしてカルノシンが溶出し終わった後の溶離液を回収することで、アンセリン高含有画分が得られることが確認された。
［例２．相互分離に用いる溶離液の評価］
例１で使用したアンセリン及びカルノシンを含む混合液を用いて、例１と同様にして、カルノシン及びアンセリンの吸着、溶出を確認した。
ただし、溶離剤としては、蒸留水、０．５質量％エタノール、０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液及び０．００５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いた。
分離例を図２に示す。図２に示すとおり、使用した溶離剤を用いた場合、カルノシン及びアンセリンは溶離ピークが異なって溶出することが確認された。
［例３．相互分離に用いる合成吸着樹脂の評価］
Ｌ−アンセリン（鮭由来アンセリン精製品、東海物産社製）及びＬ−カルノシン（浜理薬品社製）をそれぞれ５０μｍｏｌ含有した混合液（各０．５ｍＭ）１００ｍｌを調製した。得られた混合液を、芳香族系合成吸着樹脂（「ダイヤイオンＨＰ２０」；三菱ケミカル社製）５０ｍｌが入ったカラム（φ２０ｍｍ、高さ３００ｍｍ）に２０℃でＳＶ２にて通液して、アンセリン及びカルノシンを樹脂に吸着させた。次いでカラムに蒸留水をＲＶ３でＳＶ２にて２０℃で通液し、溶離液を１０ｍｌずつフラクション回収するようにして、アンセリン及びカルノシンを溶出した。
得られたフラクションにおけるアンセリン及びカルノシンの濃度を、例１と同様にしてＨＰＬＣにより測定した。
分離例を図３に示す。図３に示すとおり、異なる芳香族系合成吸着樹脂を用いても、カルノシン及びアンセリンを相互分離することができることがわかった。
［例４．鶏肉を用いたカルノシン及びアンセリンの相互分離評価］
鶏の胸肉を熱水抽出して鶏抽出エキスを得た。得られた鶏抽出エキスを、珪藻土ろ過処理に供し、次いで水で希釈してＢｒｉｘ７．５％、アンセリン０．５３質量％及びカルノシンが０．２２質量％である鶏肉粗抽出液を得た。得られた鶏肉粗抽出液を、予め１０％ＮａＣｌでＮａ型とした強酸性陽イオン交換樹脂（「ダイヤイオン ＳＫ１Ｂ」；三菱ケミカル社製）１，０００ｍｌを充填したカラムに４ＲＶで２ＳＶにて通液し、イミダゾールジペプチドを吸着させた。吸着処理後、カラムに１ＲＶのＲＯ水をＳＶ２で通液し、次いで０．４Ｍ水酸化ナトリウム溶液を２ＲＶ、ＳＶ２で通液して、樹脂に吸着したイミダゾールジペプチドを溶出して、鶏由来の粗アンセリン精製液（イオン交換処理液）を得た。なお、参考として、別途用意した鶏抽出エキス及びイオン交換処理液、並びにイオン交換処理液を、分画分子量が５００以下であり、かつ食塩阻止率が５０％以下であるナノろ過膜を用いて処理して得たろ過液（イオン交換処理＋ＮＦ膜処理液）について、例１と同様にして測定した結果を図４及び表１に示す。
芳香族系合成吸着樹脂（「セパビーズＳＰ２０７」；三菱ケミカル社製）１，０００ｍｌを充填したカラム（φ５５０ｍｍ、高さ１，０００ｍｍ）に、鶏由来の粗アンセリン精製液（アンセリン２００２ｍｇ、カルノシン７５７ｍｇ）を２ＲＶでＳＶ２にて通液することにより、吸着処理を行った。
次いで、カラムに０．００５Ｍ水酸化ナトリウムを６ＲＶでＳＶ２にて通液して、溶出処理を行った。溶離液は４００ｍｌずつフラクション回収し、例１と同様にしてＨＰＬＣでアンセリン及びカルノシンを測定した。分離例を図５に示す。
図５に示すとおり、カルノシンが先に溶出し、遅れてアンセリンが溶出することが確認された。それぞれの溶離ピークが相互に分離しているため、カルノシンが溶出しきった後にアンセリンを回収することにより、アンセリン比率の高い溶離液を得ることができる。
溶離液をカルノシン／アンセリンの質量比率が１０％を下回った点を境に２分割し、前半画分及び後半画分として回収した。各画分のＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示し、アンセリン、カルノシン及びバレニンの回収率及び組成比率を表２に示す。
図６及び表２が示すとおり、負荷量に対するアンセリン回収率は前半画分で２９重量％及び後半画分で５６重量％であった。イミダゾールジペプチドの組成比率は、重量％で、前半画分はアンセリン：カルノシン＝４７．１：５２．９であり、後半画分はアンセリン：カルノシン＝９７．１：２．９であった。
したがって、後半画分では、イミダゾールジペプチドのうち、アンセリンを９０重量％以上で含有する高アンセリン含有物を得ることができた。
［例５．クジラ肉を用いたカルノシン及びバレニンの相互分離評価］
ミンククジラの胸肉（アイスランド産）１，５００ｇに対し、市水３，０００ｇを加えて９０℃で６０分間熱水抽出して、クジラ肉抽出エキスを得た。クジラ肉抽出エキスの全量を珪藻土ろ過して、Ｂｒｉｘが１．７％であり、バレニンが０．４８質量％であり、かつカルノシンが０．０９質量％であるクジラ粗抽出液を２，８００ｇ得た。このクジラ粗抽出液を、例４と同様の方法でイオン交換処理し、クジラ由来の粗バレニン精製液（イオン交換処理）を得た。なお、参考として、別途用意したクジラ抽出エキス及びイオン交換処理液、並びにイオン交換処理液を、例４で用いたナノろ過膜を用いて処理して得たろ過液（イオン交換処理＋ＮＦ膜処理）について、例１と同様にして測定した結果を図７及び表３に示す。
クジラ由来の粗バレニン精製液（バレニン２，００１ｍｇ、カルノシン３５９ｍｇ、アンセリン１９ｍｇ）を用いて、例４と同様に吸着処理及び溶出処理を行った。溶離液は４００ｍｌずつフラクション回収し、例１と同様にしてＨＰＬＣでバレニン、カルノシン及びアンセリンを定量した。分離例を図８に示す。
図８に示すとおり、カルノシンが先に溶出し、遅れてバレニンが溶出することが確認された。それぞれの溶離ピークが相互に分離しているため、カルノシンが溶出しきった後にバレニンを回収することにより、バレニン比率の高い溶離液を得ることができる。
溶離液をカルノシン／バレニンの質量比率が１０％を下回った点を境に２分割し、前半画分及び後半画分として回収した。各画分のＨＰＬＣクロマトグラムを図９に示し、アンセリン、カルノシン及びバレニンの回収率及び組成比率を表４に示す。
図９及び表４に示すとおり、負荷量に対するバレニン回収率は前半画分で４重量％及び後半画分で８１重量％であった。イミダゾールジペプチドの組成比率は、重量％で、前半画分はバレニン：カルノシン：アンセリン＝１９．０：７８．８：２．２であり、後半画分はバレニン：カルノシン：アンセリン＝９７．７：１．５：０．８であった。
したがって、後半画分では、イミダゾールジペプチドのうち、バレニンを９０重量％以上で含有する高バレニン含有物を得ることができた。
［例６．ブタ肉を用いたカルノシン、アンセリン及びバレニンの相互分離評価］
ブタもも肉（国産）２，０００ｇに対し、市水２，０００ｇを加えて９０℃で６０分間熱水抽出して、ブタ肉抽出エキスを得た。ブタ肉抽出エキスの全量を珪藻土ろ過して、Ｂｒｉｘが１．９％であり、カルノシンが０．１６質量％であり、かつアンセリンが０．０１質量％であり、バレニンが０．０１質量％であるブタ肉粗抽出液を２４５０ｇ得た。このブタ肉粗抽出液を、例４と同様の方法でイオン交換処理し、ブタ由来粗カルノシン精製液（イオン交換処理）を得た。
ブタ由来の粗カルノシン精製液（カルノシン１，７８６ｍｇ、アンセリン１１６ｍｇ、バレニン１３２ｍｇ）を用いて、例４と同様に吸着処理及び溶出処理を行った。溶離液は４００ｍｌずつフラクション回収し、例１と同様にしてＨＰＬＣでカルノシン、アンセリン及びバレニンを定量した。分離例を図１０に示す。
図１０に示すとおり、カルノシンが先に溶出し、遅れてアンセリン及びバレニンが溶出することが確認された。それぞれの溶離ピークが相互に分離しているため、アンセリン及びバレニンが溶出する前にカルノシンを回収することにより、カルノシン比率の高い溶離液を得ることができる。
溶離液を（アンセリン＋バレニン）／カルノシンの質量比率が１％を上回った点を境に２分割し、前半画分及び後半画分として回収した。各画分のＨＰＬＣクロマトグラムを図１１に示し、カルノシン、アンセリン及びバレニンの回収率及び組成比率を表５に示す。
図１１及び表５に示すとおり、負荷量に対するカルノシン回収率は前半画分で６８重量％及び後半画分で３２重量％であった。イミダゾールジペプチドの組成比率は、重量％で、前半画分はカルノシン：アンセリン：バレニン＝１００：０：０であり、後半画分はカルノシン：アンセリン：バレニン＝７６．０：１１．７：１２．３であった。
したがって、前半画分では、イミダゾールジペプチドのうち、カルノシンを９５重量％以上で含有する高カルノシン含有物を得ることができた。
本発明は、飲食品、医薬品、化粧品、医薬部外品などの分野で有用であり、特に抗疲労用組成物、抗酸化用組成物、血糖値上昇抑制用組成物、認知機能改善用組成物又はこれらの組成物の原料を製造できる点で有用である。

Claims (6)

  1. 以下の工程（１）及び（２）を含む、イミダゾールジペプチド精製物の製造方法。
    （１）少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを含む動物性エキス処理液を、疎水性吸着樹脂へ接触させる吸着処理に供することにより、イミダゾールジペプチドを疎水性吸着樹脂へ吸着する工程であって、前記少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドはカルノシンとアンセリン又はバレニンとであり、かつ前記疎水性吸着樹脂は芳香族系疎水性吸着樹脂である、前記工程
    （２）イミダゾールジペプチドが吸着した疎水性吸着樹脂を、水性溶液を用いた溶出処理に供し、前記少なくとも２種類のイミダゾールジペプチドを相互分離して回収することにより、イミダゾールジペプチドを精製する工程
  2. 前記水性溶液は、水、希アルカリ性水溶液及び希有機溶媒水溶液からなる群から選ばれる少なくとも１種の水性溶液である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記希アルカリ性水溶液は０．００１Ｍ〜０．００８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液であり、及び前記希有機溶媒水溶液は０．１質量％〜０．８質量％エタノールである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記動物性エキス処理液は、動物性エキスを強酸性陽イオン交換樹脂を用いたイオン吸着処理及びアルカリ性水溶液を用いた溶出処理に供して得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記動物性エキスは、脱塩処理に供した動物性エキスである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記動物性エキスは、ニワトリ、クジラ、ウシ、ブタ、サケ、カツオ及びマグロからなる群から選ばれる少なくとも１種の動物の肉に由来する動物性エキスである、請求項４〜５のいずれか１項に記載の方法。
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