JP6767377B2 - 高解像度イメージングのためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Description
本願は、2015年2月6日に出願された米国特許出願整理番号第14/615,993号の優先権を合衆国法典第35巻第119条にしたがって主張する。米国特許出願整理番号第14/615,993号は2014年1月23日に出願された米国特許出願整理番号第14/162,375号の一部継続出願であり、米国特許出願整理番号第14/162,375号は、2013年1月24日に出願された米国仮特許出願整理番号第61/756,065号の優先権を合衆国法典第35巻第119条(e)にしたがって請求する。なお、これらの特許は、参照することにより、その全体が本願に援用される。
本発明は、国立画像生物医学・生物工学研究所を通して国立衛生研究所により授与された契約7R15EB012312−02の下に、テキサスがん予防研究所により授与された契約RP120052の下に、およびアメリカ国立科学財団により授与された契約CBET−1253199の下に、政府支援を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
超音波切り替え可能フルオロフォア
一般事項
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係るイメージング方法における使用に対して好適な一連の超音波切り替え可能フルオロフォアまたは造影剤が、環境の影響を受けやすいNIR色素、インドシアニングリーン(ICG)を熱応答性ポリマーナノ粒子(NP)に封入することにより、準備された。NPは、本明細書で記載の生物学的環境などの水性環境に配置され得る。環境の温度が閾値温度(NPのLCSTと呼ばれ得る)より低い場合、NPは親水性を示し、大量の水を吸収する。その結果、NPの平均直径は比較的大きくなる。理論に拘束されることを意図するものではないが、水が極性および非粘性の微環境を提供し、それにより、励起されたICG分子の非放射性減衰速度が大きくなるために、水分を多く含む微環境ではICG分子が弱い蛍光を発するものと考えられる。温度が閾値温度を超えるとNPは疎水性を示し、NPから水が排出され、それに応じて平均NP直径が小さくなる。再び、理論に拘束されることを意図するものではないが、NP内に分散されたICG分子が、次に、水分を多く含む微環境と比較して、比較的低い極性および高い粘性を有する、ポリマーを多く含む微環境に曝露されると考えられる。極性が低く粘性が高い係る微環境は、励起されたICG分子の非放射性減衰速度を抑制し、その結果、ICGの蛍光強度が大きくなると考えられる。オフ状態からオン状態へのこの蛍光切り替え挙動が、可逆性であり、反復可能であることが観察された。特に、高密度焦点式超音波(HIFU)トランスデューサが、トランスデューサの焦点ゾーンの温度をNPのLCSTより高く、または低く、することにより、フルオロフォアをオン状態とオフ状態との間で可逆的および反復的に切り替えるために、使用され得た。
N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)と、アクリルアミド(AAm)と、過硫酸アンモニウム(APS)と、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)と、N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)と、N,N’−メチレンビスアクリルアミド(BIS)と、N−tert−ブチルアクリルアミド(TBAm)と、アスコルビン酸ナトリウムと、ICGと、を、Sigma−Aldrich社(米国ミズーリ州セントルイス)から購入した。全部の薬品は、さらに精製を実施することなく、入荷状態のまま使用した。
ICGを含むPNIPAM・NPは以下のように調製された。他のNPは、適量のTBAmおよび/またはAAmモノマーを追加することを除き、同様の手続きを使用して調製された。加えて、TBAmおよび/またはAAmを、アクリル酸(AAc)およびアリルアミン(AH)の一方または両方で部分的または完全に置換して、P(NIPAM−AAc)、P(TBAm−NIPAM−AAc)、またはP(NIPAM−AH)などの他のコポリマーを形成することも可能であった。
熱応答性ポリマーナノ粒子を使用するイメージング方法
一般事項
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係るイメージング方法は以下のように実施された。最初に、小型シリコーンチューブに(0.69mmの平均直径を有する、米国ペンシルベニア州、InstechLab、BSILT031)、実施例1のICGを含むPNIPAM NP(LCST=31℃)の水性溶液を充填した。次に、シリコーンチューブを一片のブタの筋肉組織に埋め込み、血管をUSFイメージングのターゲットとして模擬した。図8Aでは、イメージングのために使用される組織試料、チューブ、励起光源、蛍光収集ファイバ、およびHIFUトランスデューサの構成が概略的に図示されている。ブタ組織は、およそ8mmの厚さ(図8Aのz軸方向)と、およそ20mmの幅(x軸方向)と、を有した。チューブはy軸方向に沿って組織内に挿入された。チューブの中心から組織の上部表面までの距離はおよそ4mmであった。およそ3mmの直径を有するファイババンドル(米国ニュージャージー州、Edmund Optics、NT39−366)が、レーザから組織の底部まで励起光を送達して、HIFUビームに曝露させることによりオン状態に切り替わるようフルオロフォアを励起するために使用された。第2ファイババンドル(Edmund Optics、NT42−345)が、USF光子を収集するために組織の上部に留置された。2.5MHzHIFUトランスデューサ(米国ワシントン、SonicConcepts、H−108、有効直径:60mm、焦点距離:50mm)が、組織の底部に配置され、チューブ領域に集光された。音響エネルギーを組織に効率的に伝達するために、HIFUトランスデューサ、組織試料の底部表面、および励起光を送達するためのファイババンドルが、水中に沈められた。チューブを2次元的にイメージングするために、HIFUトランスデューサは、x−y平面において走査および平行移動された。
USFイメージングシステムの構成が図8Bに概略的に示されている。このシステムは、4つの主要サブシステム、すなわち、(1)光学サブシステム、(2)超音波サブシステム、(3)温度測定サブシステム、および(4)電子制御サブシステム、を含む。光学サブシステムは、励起光または電磁放射ビームの送達と、放射光の収集と、を実施するための構成要素を含んだ。励起光は、808nmダイオードレーザ(MDL−III−808R)を使用して生成され、上述のファイババンドルを介して試料組織の底部へ送達された。バンドパスフィルタF1(ニューヨーク州、Semrock、FF01−785/62−25。中心波長:785nm、帯域幅:62nm)が、放出フィルタの通過帯域に配置されたダイオードレーザの望ましくない側波帯成分を除去するための励起フィルタとして使用された。レーザは、持続波(CW)モードで動作されたが、試料照射回数および期間は、パルス遅延発生器(カリフォルニア州、ハイランド、PDG、P400)によりトリガされる高速メカニカルシャッタ(ニューヨーク州、UNIBITZ LS3T2)を使用して制御された。シャッタは0.5msの応答時間を有した。代替的に、CWレーザよりもむしろパルスレーザを使用することも可能である。上述の第2ファイババンドルを介して収集された放出済み光子は、1組の放出フィルタへと送達された後に、光電子増倍管(PMT)により受容された。4つの放出フィルタの組み合わせは、励起光子の最大拒否と、蛍光放出光子の通過と、を可能にした。特に、2つのロングパス干渉フィルタ(F2およびF5。米国ニューヨーク州Semrock、BLP01−830R−25。エッジ波長:846nm)と、2つのロングパス吸収ガラスフィルタ(F3およびF4。米国カリフォルニア州アーヴィン、ニューポート、FSR−RG830。カットオン:830nm)が図8Bで示されるように配置された。2つのNIRアクロマティック複レンズ(米国ニュージャージー州、Thorlabs、AC−254−035−B)が、励起光子が干渉フィルタにより最も良好に拒否されるよう蛍光光子をコリメートすることと、フィルタ済み光子を冷却された低ノイズPMT(日本国、浜松、高電圧電源C8137−02により駆動されるH7422P−20)に集光させることと、を実施するために、使用された。信号は、低ノイズ電流前置増幅器(米国カリフォルニア州、StanfordResearchSystems、SR570)により、さらに増幅され、マルチチャンネルオシロスコープ(米国オレゴン州、Tektronix、DPO4102B−L)により取得された。
上述のHIFUトランスデューサは、上述の組織試料における試料チューブを超音波的にイメージングするために使用された。パルサー/レシーバ(米国、Olympus NDT、5073PR)が、トランスデューサの励起および反射された音響エコーの受容の両方を実施するために、使用された。NWMは、トランスデューサとパルサー/レシーバとの間のインピーダンス整合のためにも使用された。反射された音響信号はパルサー/レシーバにより増幅され、コンピュータに接続されたデジタイザ(NI USB5133)により取得された。係る受信された信号は通常、超音波イメージング分野ではAラインと呼ばれ、深さ(z軸)方向に沿った組織音響インピーダンス分布を表す。1つのAラインがxy平面における各場所において取得された。HIFUトランスデューサをxy平面において走査させることにより、一連の3次元(x、y、およびz)データが取得された。各Aラインのエンベロープは、異なる深さにおけるCモード画像を形成するために、計算された。USF画像と比較するために、xy平面における1組の2次元データ(Cモード画像のうちの1つ)が、チューブ位置におけるzの深さを固定することにより、抽出された。図9Bの画像はこのように形成された。
超音波切り替え可能フルオロフォア
一般事項
本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適な一連の超音波切り替え可能フルオロフォアは、以下のように準備された。フルオロフォアは、(1)線状の熱応答性ポリマー構造に連結されているか、(2)実施例1で上述のNPなどの熱応答性ポリマーNP内に分散されているか、(3)熱応答性ポリマーNPの表面に連結されているか、または、(4)一部が熱応答性ポリマーNP内に分散され且つ一部が熱応答性ポリマーNPの表面に連結されている、複数のFRET供与体種および複数のFRET受容体種を含んだ。構造(1)、(3)、および(4)がそれぞれ図10〜図12に示されている。加えて、様々なフルオロフォアのいくつかの特性が表2および表3に提供されている。表3では、線状の熱応答性ポリマーに基づくフルオロフォアの特性が説明されている。表4では、熱応答性ポリマーナノ粒子に基づくフルオロフォアの特性が説明されている。表3および表4で使用される命名法は、この実施例で以下でさらに説明される命名法に対応する。加えて、表3および表4で報告される測定値は、上記の実質例1および実施例2で説明された方法で得られたものである。
一般に、熱応答性線状ポリマーが最初に合成され、次に、ヒドロキシル部分、カルボキシル部分、および/またはアミン部分などの、ポリマー上の適切な部分と蛍光種との間に共有化学結合を形成することにより、蛍光種がポリマー上にグラフト重合された。いくつかの場合では、例えば、カルボジイミド結合方式が使用された。抱合は他の方法でも実施され得る。一般に、供与体種は、可視領域における短い励起/放出波長を有し、その一方で、受容体種は赤色/NIR放出(長い波長)を有した。蛍光状態へ励起される受容体種がまったく存在しないかまたはほとんど存在しないよう、短波長励起光(供与体種に対する)がシステムを励起するために使用された。熱応答性ポリマーが上述のように球状構造を取ると、供与体種および/または受容体種間の距離が減少し、その結果、供与体種から受容体種へのFRETが生じる。したがって、受容体種の放出(長波長における)が観察され得た。
構造(2)を有するフルオロフォアは実施例1で上述したように準備された。
構造(3)を有するフルオロフォアは、最初に、蛍光種を含めることを除いて実施例1での説明のように熱応答性NPを準備することにより、準備された。次に、蛍光種は、5mgの線状ポリマーよりもむしろ5mLのポリマーNP溶液が使用されたことを除いて、線状熱応答性ポリマーに対して上述した様式に対応する様式で、NPの表面に取り付けられた。構造(3)を有する1つの例示的なフルオロフォアとして、P(NIPAM−AAc200:1)NP−DBD−ED−Sq660aが、2つのアミン含有色素(DBD−EDおよびSq660a)をAAcモノマーにより提供されるカルボキシル部分を通してポリマーNP(P(NIPAM−AAc200:1)NP)の表面に共有結合させることにより、準備された。
構造(4)を有するフルオロフォアは、最初に、熱応答性NPを実施例1で説明したように準備し、次に、構造(3)に対して上述したように蛍光種をNPの表面に抱合させることにより、準備された。構造(4)を有する1つの例示的なフルオロフォアとして、DBD−EDがP(NIPAM−AH86:14)NPの内部に封入され、Sq660は、NHS部分(色素に由来)とアミン部分(AHモノマーに由来)との抱合を介して、NPの表面に取り付けられた。係るフルオロフォアは、一般的な命名法DBD−ED@P(NIPAM−AH86:14)NP−Sq660を使用して示される。ここで、記号「@」に先行する種は、指定されたポリマーに封入され、ハイフン「−」に後続する種はNPの表面に抱合される。
超音波切り替え可能フルオロフォア
一般事項
本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適な一連の超音波切り替え可能フルオロフォアは、以下のように準備された。フルオロフォアは、熱応答性ポリマーと、電磁スペクトルの赤色/NIR部分において放出ピークを有する蛍光物質と、を含んだ。特に、ADPDIシアノけい皮酸色素(ADPDICA)が使用された。ADPDICAの構造が図13で示されている。いくつかのフルオロフォアは、上述の実施例3からの全般的構造(1)を有し、他のフルオロフォアは実施例3からの全般的構造(2)を有し、さらに他のフルオロフォアは実施例3からの全般的構造(3)を有した。
N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)、アクリルアミド(AAm)、過硫酸アンモニウム(APS)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)、N,N’−メチレンビスアクリルアミド(BIS)、アクリル酸(AAc)、N−tert−ブチルアクリルアミド(TBAm)、および、アスコルビン酸ナトリウム、が、Sigma−Aldrich(米国ミズーリ州セントルイス)から購入された。全部の薬品は、さらに精製を実施することなく、入荷状態のまま使用した。
ADPDICAは、Bandiら、“Excitation−Wavelength−Dependent, Ultrafast Photoinduced Electron Transfer in Bisferrocene/BF2−Chelated−Azadipyrromethene/Fullerene Tetrads,” Chem. Eur. J. 2013, 19, 7221−7230、および、Bandiら、“Self−Assembled via Metal−Ligand Coordination AzaBODIPY−Zinc Phthalocyanine and AzaBODIPY−Zinc Naphthalocyanine Conjugates: Synthesis, Structure, and Photoinduced Electron Transfer,” J. Phys. Chem. C 2013, 117, 5638−5649に記載のアザジピロメテン合成手順にしたがって、準備された。簡略には、3−(4−ヒドロキシフェニル)−1−フェニル−2−プロペン−1−オンは、対応する4−ヒドロキシベンズアルデヒド、アセトフェノン、および水酸化カリウムを反応させることにより、準備された。この種は、後に、乾燥エタノール中でニトロメタンおよびジエチルアミンと反応させて、3−(4−ヒドロキシフェニル)−4−ニトロ−1−フェニルブタン−1−オンが得られた。次に、4−{2−[3−(4−ヒドロキシフェニル)−5−フェニル−1H−ピノ−ルイルイミノ]−5−フェニル−2H−ピロール−3−yl}フェノールが、エタノール中で酢酸アンモニウムと反応させることにより、合成された。次に、BF2キレート4−{2−[3−(4−ヒドロキシフェニル)−5−フェニル−1H−ピロール−2イルイミノ]−5−フェニル−2H−ピロール−3−イル}フェノールが、この生成物を、乾燥CH2Cl2中でジイソプロピルエチルアミンおよび三フッ化ホウ素ジエチルエーテルで処理することにより、この生成物から形成された。次に、BF2キレート種は、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCI)の存在下で適切な安息香酸と反応された後、クロマトグラフィ精製が実施された。
上述のフルオロフォアの温度依存性の蛍光特性は、711nm/25nmバンドパス放出フィルタを使用して2つの異なる励起波長(λex=609nmまたは655nm)において評価された。フルオロフォアの温度は、フルオロフォアを温度制御された水槽内に配置することにより、制御された。結果は表5および表6に示されている。表5では、λex=609nmに対するデータが示されている。表6では、λex=655nmに対するデータが示されている。表5および表6において「λex」として標識されたデータは使用された放出フィルタを指し、「lp」はロングパスフィルタを指す。
マイクロバブルを使用するイメージング方法
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係るイメージング方法は以下のように実施された。最初に、マイクロバブルを含む一連のフルオロフォアが準備された。1つの場合では、フルオロフォアは、マイクロバブルの外側表面に取り付けられた複数のFRET受容体種(または「フルオロフォア」種。「F」と略称される)および複数のFRET供与体種(または「クエンチャ」種。「Q」と略称される)を有するTargestar−Bマイクロバブルを含んだ。特に、AlexaFluor(AF)546(供与体またはF)およびAF647(受容体またはQ)がビオチン−ストレプトアビジン結合を介してマイクロバブル表面上に標識された。
超音波切り替え可能フルオロフォア
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る方法における使用に対して好適な追加的な超音波切り替え可能フルオロフォアは、以下を含む。
マイクロバブルの表面上のドナ−受容体対間でFRETを実装するために、供与体および受容体は、ホリデイジャンクション(HJ)を介してマイクロバプル上に標識され得る。図15では、係るマイクロバブルが概略的に示されている。2つの交差する線はHJの2本のアームを表す。HJは四差路の形の4本のDNA二重らせんからなる。2つの四角形は、(ストレプトアビジン−ビオチン結合を、または、HJの核酸と供与体および受容体に取り付けられたNHSエステルとの間の反応を、介して)2本のアームの2つの端部において標識された1対の供与体種および受容体種を示す。水平方向に向けられた線はマイクロバブルの外殻を示し、その外殻上に、HJの他方の2つの端部が(ビオチン−ストレプトアビジン結合または他の結合方式を介して)取り付けられている。バブルが膨張(収縮)すると、距離Rsは増加(減少)する。その結果、供与体と受容体との間の距離(RDA)が増加(減少)し、(l1/l2)は大きくなり、それに付随して供与体がオン状態(オフ状態)に切り替わる。2本のアーム間の初期角度(θ)は制御可能である。マイクロバブルの表面積か比較的大きいため、多数のF−Q−HJが、顕著に干渉することなく、単一のマイクロバブル上に標識され得る。係る設計は、USF遷移帯を狭め、超音波切り替え効率およびSNRを改善し得る。
他の標識ストラテジーは、供与体−受容体対をDNAヘアピン複合体上に取り付けることである(図16および図17参照)。ヘアピン複合体の一方の端部は、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して、マイクロバブル表面に取り付けられ、他方の端部は、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン結合を介して、はるかに小さい金ナノ粒子(Au−NP、直径は数十nm)に取り付けられる。F−Q(またはD−A)標識されたDNAヘアピン複合体は3つの主要な成分、すなわち、(1)ヘアピン分子(図16における点線領域)、(2)供与体および受容体に取り付けられたオリゴヌクレオチド、および、(3)受容体およびビオチンに取り付けられたオリゴヌクレオチド、からなる。理論に拘束されることを意図するものではないが、供与体をオン状態に切り替えるための原理は、以下のように説明され得る。超音波圧力がマイクロバブル壁部を加速させ、それにより、ヘアピン分子を伸長させることによりAuナノ粒子を加速させる。加速されたAu−NPは、ヘアピン分子上に反対の力を印加する。この力が十分に大きい場合、ヘアピンループが開かれ、それにより供与体−受容体距離が増大し、供与体がオン状態に切り替わる。約18ピコニュートン(pN)の力が、ヘアピンを開放し、供与体放出をオン状態にするために、使用され得る。力が6PNより小さくなると、ヘアピンは閉じられ、供与体はオフ状態に切り替わる。2μmの直径を有するマイクロバブルに印加された150kPaの超音波圧力波を有し、且つ20nmの直径を有するAu−NPに取り付けられた超音波パルスが、ヘアピン分子を伸長させるために約20pNの力を生成し得ることが推定される。したがって超音波的に蛍光をオン状態に切り替えることが可能である。
上記のF−Q−HJマイクロバブルのホリデイジャンクションを上述のDNAヘアピン分子で置き換えることも可能である。2つの端部は2つの相補的なオリゴヌクレオチドにアニールされ得る。一方のオリゴヌクレオチドが、供与体(例えばAF610など)およびビオチンで標識される。同様に、他方のオリゴヌクレオチドが、受容体(例えばAF647など)およびビオチンに取り付けられる。これらのビオチン端部は、ストレプトアビジン標識マイクロバブルに取り付けられ得る。DNA分子の長さが、その持続長(通常は約50nm)よりも短い場合、DNA分子は弾性棒のような挙動を示す。したがって2本のアームは自然に伸長され、マイクロバブル表面に取り付けられる。超音波ビームに対する曝露により負圧サイクルの間にマイクロバブルが伸長されたとき、力がヘアピンアームの両端に印加され、それによりヘアピンが開かれ、上述のように供与体がオン状態に切り替えられる。
蛍光標識された二重鎖(ds)DNA分子を介してマイクロバブルに比較的小さいナノ粒子(数十nm)を取り付けることも可能である。ds−DNAは、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介してマイクロバブル表面に取り付けられる。ds−DNAの他方端は、チオール結合を介して、金ナノ粒子(AuNP)に取り付けられる。通常、ds−DNAは湾曲し、ds−DNAとAuNPとの間の静電気的引力、疎水性相互作用、およびイオン−双極子分散相互作用により、AuNPの表面に平坦に吸収される。AuNPとDNA分子との間の引力により、AuNPは、ds−DNAの一方の端部上に標識された蛍光種に対して近接する。AuNPの表面は、比較的長い距離(約3〜20nm)内の蛍光種をクエンチし得る。超音波圧力波が印加されてマイクロバブルが圧縮されると、加速されたマイクロバブル壁部は、ds−DNA分子を伸長させることにより、AuNPを加速させるであろう。マイクロバブル壁部の加速(超音波圧力強度により制御される)が十分に大きいためDNAとAuNPとの間の静電気的引力およびその他の相互作用により、力が生成された場合、AuNPは、(AuNPの質量のために)同一の加速を経験することができず、その結果、蛍光種がAuNP表面から分離して、クエンチ効果が失われることとなる。
他のFRETベースのフルオロフォアは、CdSe量子ドットなどの半導体量子ドットを供与体として、および、小分子色素を受容体として、使用する。量子ドットは、熱応答性ポリマーから形成された1つまたは複数のリンカーを使用して、1つまたは複数の受容体色素に取り付けられる。例えば、赤色放出量子ドット(Qdot(登録商標)655、Invitrogen社)が供与体として選択され、NIR色素(AlexaFluor750、Invitrogen社)が受容体として選択される。複数の受容体(AF750)が、上述の連結方式を使用して熱応答性ポリマーを介して、単一の供与体(Qdot(登録商標)655)上に取り付けられる。QD供与体は非常に長く寿命(およそ30ns)を有し、受容体AF750は非常に短い寿命(およそ0.7ns)を有する。T<LCSTである場合、熱応答性ポリマーは拡張されたコイル状または鎖状の構造を示し、この構造は比較的長い。したがって供与体と受容体との間の距離は、FRETクエンチ範囲(>40nm)よりも全般に短い。HIFUトランスデューサが、上述のようにLCSTよりも高い温度に熱応答性ポリマーを加熱すると、ポリマーは球状構造に遷移し、それにより、供与体−受容体距離が小さく(<20nm)なる。結果として、FRETエネルギー移動が生じる。したがって供与体(Qdot(登録商標)655)の励起エネルギーの一部が受容体(AF750)に移動され、供与体(AF750)がNIR波長において光子を放出する。これらのFRET関連の光子は、供与体寿命および受容体寿命のうちのより長い寿命に近い寿命(この場合、およそ30ns)を有し得る。したがって放出されたNIR光子は、本明細書で記載の時間ゲーティング検出技術を使用して、高いSNRで容易に検出することが可能である。ロングパス光学フィルタは、QD放出の検出を排除するために使用され得る。
超音波切り替え可能フルオロフォア
一般事項
本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適な一連の超音波切り替え可能フルオロフォアは、以下のように準備された。亜鉛フタロシアニン(ZnPC)誘導体が、本明細書で記載のいくつかの実施形態に係るイメージング方法に対する造影剤として、PluronicF−98ミセルまたはP(NIPA−TBAm)ナノ粒子(NP)に封入された。
亜鉛フタロシアニン(ZnPC)、亜鉛2,9,16,23−テトラ−tert−ブチル−29H,31H−フタロシアニン(ZnPCTTB)、亜鉛1,4,8,11,15,18,22,25−オクタブトキシ−29H,31H−フタロシアニン(ZnPCOB)、亜鉛1,2,3,4,8,9,10,11,15,16,17,18,22,23,24,25−ヘキサデカフルオロ−29H,31H−フタロシアニン(ZnPCHF)、亜鉛2,3,9,10,16,17,23,24−オクタキス(オクチルオキシ)−29H,31H−フタロシアニン(ZnPCOO)、および、亜鉛2,11,20,29−テトラ−tert−ブチル−2,3−ナフタロシアニン(ZnTTBNPC)が、Sigma−Aldrich(米国ミズーリ州セントルイス)から購入された。これらのZnPC誘導体の化学構造が図18Aおよび図18Bに図示されている。テトラブチルアンモニウムヨージド(TBAI)(Sigma−Aldrich)、PluronicF−98(BASF、米国ニュージャージー州フォーハムパーク)、NIPAM、TBAm、BIS、4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)(ACA)、および、SDSも、使用された。
ZnPCが30分間にわたり超音波処理下でテトラブチルアンモニウムヨージドを添加してクロロホルム中に溶解された。一方、PluronicF−98が50mg/mlの濃度の脱イオン化(DI)水(pH8.5)に溶解された。ZnPCクロロホルム溶液が、激しく攪拌(500rpm)しながら、PluronicF−98水溶液に一滴ずつ加えられた。結果的に生成したエマルジョンは、40Wで4分間にわたり超音波プローブ(Qsonica)を用いて(各1分間の実行の後に30秒のパルス)さらに分散された。クロロホルムはドラフト内で一晩にわたり蒸発された。透明な溶液が得られ、その後、その溶液は0.45μm膜を使用して濾過された。
1.3644gのNIPAM、0.1247gのTBAm、0.0131gのBIS、0.070gのACA、および、0.0219gのSDSの混合物が、250mLシュレンク管内で50mLのDI水(pH10.5)に溶解され、引き続き10分間にわたり窒素パージが実施された。ZnPC DMSO溶液(2mL)がシュレンク管に加えられ、次にシュレンク管は真空下に置かれ、その後、窒素でパージされた。ポンプ/パージ手順は、シュレンク管内に窒素雰囲気を提供するために、3回反復された。この反応は70℃で一晩にわたり実行された。次にこの反応は、バルブを弛めて環境を空気に曝露させることにより、停止された。試料は10−kDa分子量のカットオフ膜を使用して3日間にわたりDI水に対して透析され、それにより過剰な界面活性剤および未反応物質が除去された。
上記のフルオロフォアに関する温度依存性の蛍光特性が、λex=609nmの励起波長において、711nm/25nmのバンドパス放出フィルタを使用して(より長い放出ピーク波長を有するZnTTBPCについては、例外として、765nm/62nmのバンドパスフィルタを使用した)、評価された。その結果を表7および図19A〜図19Fに示す。
ZnPC封入されたP(NIPAM−TBAm)NPの蛍光強度を図20Aおよび図20Bに示す。IOn/IOff比は、ZnPCおよびP(NIPAM−TBAm)含有NPに対して、およそ1.8であった。オフ状態(T<LCST)にあるNP内部に封入された色素(A)の蛍光寿命は、およそ3nsであった(図20A)。
超音波切り替え可能フルオロフォア
一般事項
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る一連の超音波切り替え可能フルオロフォアは、以下のように準備された。特に、二種類のNIR色素、すなわちアザBODIPY誘導体および亜鉛フタロシアニン(ZnPC)誘導体が、フルオロフォアを準備するために使用された。PluronicF−127、PluronicF−98、およびPEGとのこれらのコポリマーの感熱性ポリマーが、異なる切り替え閾値を有する色素に対するナノカプセルを合成するために使用された。ナノカプセルの直径は、透過電子顕微鏡法(TEM)により測定に基づいて、約20nm〜約70nmの範囲であった。上記の2つの色素種類から、ADPDICAおよびZnPC(TTB)がフルオロフォアを形成するために使用された。これらのフルオロフォアの切り替え特性を表8にまとめた。
ADPDICAは、上述の実施例4と同様にBandiらに記載の技術にしたがって合成された。ADPDICAの化学構造を図13で示す。ZnPC(TTB)はSigma−Aldrich(米国ミズーリ州セントルイス)から購入した。ZnPC(TTB)の化学構造を図18Aで示す。PluronicF−127およびF−98はBASF(米国、ニュージャージー州、フォーハムパーク)から購入した。メトキシルPEGカルボン酸生成物(MW=20,000、30,000、および40,000g/mol)はNanocs社(米国ニューヨーク州ニューヨーク)から購入した。全部の薬品は、さらに精製を実施することなく、直接的に使用した。TBAIも使用した。
PluronicF−127またはF−98(所望の準備に応じて)がDI水(pH8)に溶解された。色素/TBAI(モル比=1/6)が、クロロホルム中に溶解され、30分間にわたり超音波処理状態に保たれた。色素/TBAIクロロホルム溶液は、溶液を攪拌しつつ、Pluronic水溶液中に一滴ずつ加えられた。溶液は、20Wで動作する超音波発生装置(米国コネチカット州ニュートン、Qsonica有限責任会社)を使用して4分間にわたり、さらに分散された。結果的に生成された溶液は、クロロホルムが完全に蒸発するまで、ドラフト下で攪拌し続けた。結果的に生成した透明な溶液は、1.2μmの膜(米国ペンシルベニア州ピッツバーグ、FisherScientific)およびAmiconUltra遠心濾過器(10,000分子量カットオフ、米国マサチューセッツ州ビルリカ、Millipore)を通して濾過された。
USFイメージングシステム
本明細書で記載のイメージング方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適なUSFイメージングシステムが提供される。特に、以下の3つのUSFイメージングシステム、すなわち、(1)持続波(CW)モードシステム、(2)周波数領域(FD)モードシステム、および、(3)時間領域(TD)モードシステムが、テストされた。これらのシステムに関するシステム構成および時間系列を図21A〜図21Gに示す。
改善されたSNRを提供するイメージング方法
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係るイメージング方法は以下のように実施された。最初に、一連の超音波切り替え可能フルオロフォアは、上述の実施例7にしたがって準備された。フルオロフォアは、(1)PluronicF127ポリマーから形成されたナノカプセルまたはミセルに封入されたADPDICAを含むフルオロフォア、および、(2)PNIPAMナノ粒子に封入されたICGを含むフルオロフォアを含んだ。これらのフルオロフォアは、上述の実施例7および実施例8での記載と同様に準備された。2つの異なるフルオロフォアのピーク放出波長は、それぞれおよそ710nmおよび810nmであった。加えて、これらのフルオロフォアのUSF信号の動的な挙動は互いに異なり、図22で示されるノイズからも異なるものであった。特に図22Aでは、ADPDICA含有フルオロフォアのUSF信号の時間的減衰プロファイルが示されている。図22Bでは、ADPDICA含有フルオロフォアを使用するイメージング実験に対するバックグラウンド信号またはノイズ信号の時間的減衰プロファイルが示されている。同様に図22Eでは、ICG含有フルオロフォアのUSF信号の時間的減衰プロファイルが示されている。図22Fでは、ICG含有フルオロフォアを使用するイメージング実験に対するバックグラウンド信号またはノイズ信号の時間的減衰プロファイルが示されている。2つのフルオロフォアの時間的減衰プロファイルが異なるのは、理論に拘束されることを意図するものではないが、(1)蛍光色素の異なる環境的感度、(2)フルオロフォアの異なる構造(例えば、ミセル対ナノ粒子)、および、(3)フルオロフォアを形成するために使用された異なる感熱性ポリマー、のうちの1つまたは複数に起因するものと考えられる。異なる超音波切り替え可能フルオロフォアの異なる放出プロファイルは、多重USFイメージングを可能にし得る。
多重化イメージング方法
本明細書で記載の一実施形態に係る多重化イメージング方法は、以下のように実施された。最初に、ADPDICA含有超音波切り替え可能フルオロフォアおよびICG含有超音波切り替え可能フルオロフォアが、実施例10で上述したように準備された。次に、前述のフルオロフォアが、実施例2で上述したのと同様のイメージングシステムを使用して、撮像された。励起光源は、671nmの励起波長を有するダイオードレーザ(MLL−FN−671)であった。1つの673/11バンドパスフィルタ(中心波長:673nm、帯域幅:11nm)が励起フィルタとして適用され、3つのロングパスフィルタ(エッジ波長:715nm)および2つのロングパス吸収フィルタ(エッジ波長:690nm)が放出フィルタとして使用された。
複数の超音波トランスデューサを使用するイメージング方法
本明細書で記載の一実施形態に係る複数の超音波トランスデューサを使用するイメージング方法は以下のように実施された。複数の超音波トランスデューサを使用することに加えて、以下の方法は、USFイメージングおよび超音波(US:Ultrasound)イメージングの組み合わせを使用するデュアルモダリティイメージングを含んだ。
ソースモジュールは、3つのサブモジュール、すなわち、(1)超音波モジュール、(2)デュアル高密度焦点式超音波モジュール、および(3)励起レーザモジュールにさらに区画化され得る。これらのサブモジュールの各サブモジュールについて、以下でさらに説明する。
超音波モジュールは、走査の間における各場所におけるAラインを取得するために使用される。なお走査は、任意の所望のライン、平面、または3D平面に沿って実施され得、平行移動モジュールを使用して規制される。超音波の高解像度イメージングを達成するために、10MHz(10MHz、V315、米国マサチューセッツ州ウォルサム、オリンパス)周波数の集光超音波トランスデューサ(UST)が使用された。ここでは、単一要素超音波トランスデューサが設計の簡略化のために選択された。一方、所望により、単一要素超音波トランスデューサは、超音波トランスデューサのアレイで置き換えることも可能である。ここでは電子的集光が、多段深度セクタイメージングを実施するため、および、より微細な解像度を達成するために、実施され得る。USTの焦点距離はおよそ34mm(約1.34インチ)であり、直径は19mm(約0.75インチ)である。パルスエコー法が超音波イメージングのために用いられ、したがって、パルス生成器/受信器(米国マサチューセッツ州ウォルサム、OlympusNDT、5077RP)により駆動される。なおこのパルス生成器/受信器は、2チャンネル型ファンクションジェネレータ(FG−1、米国テキサス州、Tektronix、AFG3252)の第1チャンネルによりトリガされる。各走査場所におけるFG−1のチャンネル1からの各バーストにおける複数のパルスサイクルにより達成される複合トリガは、平均処理(さらなる詳細については、この実施例のデータ処理セクションにおいて討論する)により、ノイズ低減ために用いられる。
デュアル高強度集光超音波モジュールに対して、2チャンネル型ファンクションジェネレータ(FG−1)の第2チャンネルは、第2ファンクションジェネレータ(FG−2)に対するゲーティングトリガとして使用される。なおFG−2は、カスタム注文のデュアル高密度焦点式超音波(デュアルHIFU)トランスデューサ(HIFU、SU−109、米国ワシントン州ボセル、SonicConceptsLtd)を駆動する。デュアルHIFUトランスデューサは、2つの9MHz周波数HIFUトランスデューサ(直径=23mm、焦点距離=35mm)がその基部に対しておよそ45度で、互いに対して90度の角度で、互いに対して対向し、およそ5cm離間された状態で取り付けられるよう、設計される。デュアルHIFU間の分離エリアは、完全中空の円形間隙を有するよう設計される。この間隙は、31.75mmの直径を有し、その直径が2cmである超音波トランスデューサを配列するための十分な空間を有し、それにより、両側におよそ0.5cmの自由な動きが可能となるよう、カスタマイズされる。デュアルHIFUの予備試験の間、HIFUの性能仕様がわずかに変動することが観察された。したがってそれぞれのHIFU焦点において略同一のピーク圧力を達成するために、2つのHIFUは異なる電圧で駆動される。デュアルHIFUは、2チャンネル型ファンクションジェネレータ(FG−2、米国イリノイ州シカゴ、Aglilent33500B)からの、それぞれの振幅(ピーク間電圧、Vpp)の正弦波信号を使用して駆動される。2つチャンネルの各チャンネルは、個々がデュアルHIFU構成にあるそれぞれの9MHzのHIFUトランスデューサを駆動するための、それぞれの専用のパワー増幅器に接続される。かくして、増幅された駆動パワーは、それぞれの焦点において、より高いピーク圧力を生成する。このようにして、デュアルHIFUーUSTユニットは、上向き(光学テーブルに対して垂直)になるようグループ化および配置される。ここで、USTは、所望の試料または組織に対向するカスタム設計のデュアルHIFUの中央に配置される。グループ化されたユニットが、所望のライン、平面、または、カスタムプログラムされたMATLAB GUIを使用する3次元的走査のための3次元平行移動台システム(3D−TS、米国ニューヨーク州、Velmex、VXMモータ駆動Xスライド組立体)上に取り付けられる。FG−1の第2チャンネルからのゲーティング信号の期間はHIFU曝露の期間を制御する。HIFU曝露の期間は、FG−2からの所望の駆動電圧と組み合わされて、研究対象の試料または組織内における超音波に誘導された温度変動を制御するための間接的方法を提供する。
励起レーザモジュールは第3サブモジュールである。第3サブモジュールはフルオロフォア励起源として持続波レーザを含む。励起源は、光バンドル(OB−1およびOB−2、米国ニュージャージー州バリントン、EdmundOptics、モデル#39366)により、研究対象の所望の試料または組織を照射するために使用される。これは、研究のために使用される色素/対照液に応じて、808nm(中国JL、DragonLasers、MGL−II−808−2W)または671nm(米国ユタ州ミッドベール、Optoengine有限責任会社、MLL−FN−671−500mW)のいずれかを使用することにより、達成される。808nmレーザ光源の場合、このレーザのビームプロファイルは長方形である。係るビームプロファイルに対して、平凸NIRレンズ(L1およびL2、米国ニュージャージー州ニュートン、Thorlabs、モデル#AC254−035−B)を有する簡単な構成が、長方形ビームを光バンドル(OB−1、モデル#39366)の一方の端部上に集光させるために用いられる。他のレーザ(671nmのCWレーザ)に関しては、ビームプロファイルの断面が光バンドルの開放端部に対して同等であるため、レンズは不要である。両方の構成において、励起波長範囲を制限するために、フィルタがレーザヘッドの前方に配置される。なお、785/62nm(米国ニューヨーク州ロチェスター、Semrock、FF01−785/62−25)および671/11nm(米国ニューヨーク州ロチェスター、Semrock、FF01−673/11−25)が、それぞれ用いられる。光バンドルの他方の端部は、放出されるレーザが、図25で図示するように超音波ユニットが集光される水中の組織の同一側面を照射するよう、配置される。発散レーザ照射を出力するともに、光バンドルを、試料から許容可能な距離に、光学テーブルに対して約45度の角度で、配置することにより、研究対象の試料/組織の所望以上の領域に対する均質な照射が確実に行われることとなる。周波数依存の蛍光イメージングがこの研究に対して選択されたため、レーザはファンクションジェネレータ(FG−3、米国イリノイ州シカゴ、Agilent、33220A)を使用して1KHz周波数で駆動される。FG−3ファンクションジェネレータのトリガ出力は、1KHzの光信号のみが観察および記録され、それにより、所望の光信号に対するシステムの感度が向上するよう、ロックイン増幅器に対する基準入力として使用される。
試料モジュールは、試料または組織のプレパラート、および色素/造影剤のプレパラートからなる。デュアルHIFU−USモジュールに関する試料プレパラートが図26で示されており、図26は、超音波および試料のモジュール構成を強調する、実験ブロック図の最小化バージョンを示す。Input−1:デュアルHIFUトランスデューサ(9MHzのHIFU、デュアル:HIFU−1およびHIFU−2)、Input−2:超音波トランスデューサ(UST)に対する駆動信号、UST:10MHzの超音波トランスデューサ、ST:試料(S)中に埋め込まれたシリコーンチューブ、なお1、2、および3は、チューブ1、チューブ2、およびチューブ3を表す、3D−TS:3次元平行移動台、W:デュアルHIFU−USTモジュールを浸漬するための水タンク。
物質:N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)、N−tert−ブチルアクリルアミド(TBAm)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、N,N’−メチレンビスアクリルアミド(BIS)、N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)、過硫酸アンモニウム(APS)、テトラブチルアンモニウムヨージド(TBAI)、N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)、および、ICGは、Sigma−Aldrich(米国ミズーリ州セントルイス)から購入された。PluronicF98はBASF(米国ニュージャージー州フォーハムパーク)から購入された。全部の薬品は、入荷状態のまま使用した。
(1)ICG・NP。ICG封入PNIPAM・NPは上述のように合成された。(2)ADP(OH)2(底部)ナノカプセル。これらのナノカプセルは前述のように準備された。完結には、PluronicF98は50mg/mLの濃度で脱イオン化水中に溶解された。色素/TBAI(モル比=1:6)が、クロロホルム中に溶解され、30分間にわたり超音波処理状態に保たれた。次に、色素溶液は攪拌しながらPluronic水溶液中に滴下され、次に4分間にわたり超音波発生装置を用いて分散された。クロロホルムが蒸発されて、色素が、Pluronicナノカプセルの疎水性コアに封入された。自由色素は、AmiconUltra遠心濾過器(10000分子量カットオフ、米国マサチューセッツ州ビレリカ、MilliPore)を使用して除去された。
検出モジュールは3つのサブモジュール、すなわち(1)コリメーションチューブフィルタセットモジュール、(2)光センサモジュール、および、(3)ポスト光センサハードウェアモジュール、に分類される。
3つのVelmex線形平行移動モータ駆動台が、設計システム(3D−TS)に対する3D走査能力を有するよう、構成される。3D−TSはコンピュータに接続され、カスタム構築されたGUI・MATLABインターフェースを使用して制御される。GUIは、3D−TSモジュールの様々な側面(例えばステップサイズ、加速度、走査速度、走査面、走査面内の走査場所の個数、その他)を制御するようプログラムされている。走査プランは、前方向(X、Y、およびZ方向)に沿った1D、2D、および3D面走査能力を含む。デュアルHIFU−USTモジュールは、組織試料内のターゲットの走査を実施するために、この3D−TSモジュール上に取り付けられる。試料台の他の全部の構成要素は、走査の実施時は比較的静止状態にある。
実験は、励起レーザ波長と、ターゲット(シリコーンチューブ)とともに使用される色素溶液に相互依存する漏出波長を最小化または拒否するための、そのフィルタセットと、に応じて、2セットの走査に分割される。これらのチューブには1〜3の番号が付されている。チューブ1はADPを含み、チューブ3はICG色素溶液を含む。チューブ2はICGおよびADPの混合物(3:2の比)を含む。HIFU−USモジュールは、試料研究に対して垂直に配置されるべきである。USおよびUSF十字焦点の焦点は、デュアルHIFUモジュールに対するUSトランスデューサの物理的制限調節により、深さに沿っておよそ1.5mmおよび横方向に沿っておよそ0.2mmの領域である。デュアルHIFU−USモジュールは、デュアルHIFUの交差焦点が、試料の中央であるチューブ2に集光されるよう、調整される。
パルス遅延発生器(米国カリフォルニア州サニーベール、StanfordResearch、DG645)を使用するマスタートリガ(MT)が、ファンクションジェネレータ(FG−1)およびデータ取得カード(NI−DAQ)の両方をトリガするために使用される。マスタートリガは、それぞれのゲーティングパルス列を送信するよう、ファンクションジェネレータFG−1の2つのチャンネルを起動する。FG−1のチャンネル1は、単位トリガあたり8〜16パルスを有する1Khzパルス列に設定される。1Khzパルス列の各パルスは、超音波取得のためのパルスエコー法を実装するためのパルス生成器/受信器(パルサー、米国マサチューセッツ州ウォルサム、Olympus、5077PR)に対する外部トリガとして作用する。超音波パルスエコーの取得速度およびデータ伝達が一緒に数十マイクロ秒の時間を要するため、1Khzパルス周波数(パルス間に約1マイクロ秒)は、超音波Aラインデータを取得および記録するにあたり十分である。パルサーにより受容された超音波信号(Aライン)は、パルサーによりトリガされるデジタイザ(米国テキサス州ダラス、NationalInstruments、NI−USB 5133)を使用して記録され、単位トリガあたり複数のパルスが、単一走査場所における複数のAラインを記録する。これらのAラインを平均し、それによりノイズを低減させることが実施され、各走査場所に対する結果が、コンピュータ内の所望の場所に行列ファイルとして格納される。一方、FG−1ファンクションジェネレータのチャンネル2は、デュアルHIFUを駆動するために使用されるファンクションジェネレータFG−2のゲーティング処理のために使用される。チャンネル2は、US取得が完了するために十分な時間が与えられるよう、500マイクロ秒の遅延を有するよう設定される。FG−2ファンクションジェネレータを使用することにより、使用された定義済み駆動電圧と組み合わせてFG−1を使用して、チャンネル2パルス幅の期間と、単位トリガあたりのパルス個数と、を制御することにより、デュアルHIFUは、所望の駆動パワーで「オン状態」および「オフ状態」に切り替えられることが可能である。かくして、組織または試料内の温度を管理することに関する間接的制御が達成される。
USF画像処理
超音波切り替え可能蛍光イメージングは、周波数領域蛍光イメージング技術を使用して実施される。係るイメージング技術では、励起レーザ光源は所望の(1KHz正弦波)波形で変調され、検出される蛍光も、励起源変調周波数で変調するであろう。このように、1KHz蛍光信号のみが処理されるべき望ましい信号であり、他の全部の光信号は拒否され得る。検出される蛍光信号は、冷却PMTを使用して記録され、蛍光信号に対する感度および特異度を増加させるために、LIAに提供される。したがって、検出される蛍光は、PMTおよびLIAから出力される2つの出力信号を有する。両方の信号は、NI−DAQ取得モジュールの2つのチャンネルにより記録される。
ソースセクションで記載したように、LIAモジュールは、LIAの感度および特異度を決定する2つの主要なパラメータ設定を有する。なお、このパラメータ設定とは(1)時定数および(2)感度である。時定数は1KHz変調光信号に対して300ミリ秒に設定される。このことは、時間に対して1KHz振幅信号を変化させることに対するより低速な累積応答を、LIAに与える。その結果として、信号対バックグラウンド比は、より高くなる。Ni−DAQデータ取得モジュールの開始と、USF信号を生成するデュアルHIFUモジュールの開始と、の間にも0.5秒の遅延が存在する。したがって初期データ取得のおよそ約0.5秒間は、USF信号を有さず、したがってベースラインまたはバックグラウンド信号として使用され得る。USFデータは、デュアルHIFU駆動(「オン状態」)の期間(約250マイクロ秒)に応じて、約4〜6秒間にわたり記録される。このデュアルHIFU駆動期間は、研究対象の試料または組織内で温度が誘導される期間を間接的に制御する。デュアルHIFUが駆動される期間および振幅(デュアルHIFUに供給されるパワーに対応する)の組み合わせが組織内の温度上昇を決定することに注目すべきである。デュアルHIFUが活性化される期間、または「オン状態」である期間に対して徐々に温度が上昇し、デュアルHIFUが不活性化されると、または「オフ状態」に切り替えられると温度が徐々に低下する点も、考慮すべきである。HIFUに誘導される蛍光信号の増加および減少の比率は異なり、後者の場合では、より低速である。温度上昇のこの比率および変化量も、それにより蛍光応答も、組織の本質的な物理的特性および熱的特性と、デュアルHIFUの機械的仕様および電気的仕様と、に依存する。
2D・USF画像が生成されると、信号対バックグラウンドノイズ比が比較的低い値であることがただちに観察された。USF画像のSNRを高めるため、カスタマイズされた特徴抽出アルゴリズムが採用される。特徴抽出アルゴリズムは、2つの部分(相関行列の生成、および、べき関数を使用するグレースケールマッピング)に分類される。処理された相関行列を元の2DUSF画像に乗算すると、所望の特徴が改善され、それによりUSF画像(処理済みUSF画像と呼ばれる)のSNRが向上する。
組織試料に梅これまたチューブ内のICG色素またはADP色素の蛍光信号の典型的な動的応答は基準信号であると考えられる。一般的なMATLAB相関関数が、USF画像内の全走査点のうちの各走査点に対応する全信号のうちの各信号に適用されると、−1〜1の範囲の相関値が得られる。ここで、負の相関値は基準信号に対する逆の関係に対応し、0は相関性が存在しないことに対応し、正の相関値は基準信号に対する高い相関性に対応する。相関関数は、次の相互相関式により支配される。
オリジナルのUSF・2D画像の相関行列または相関画像が形成されると、特徴抽出アルゴリズムが2D相関画像上に実装される。特徴抽出アルゴリズムは次のべき乗公式により支配される。
グレースケールマッピングが施された相関行列が生成されて、この相関行列がオリジナルのUSF・2D画像に乗算されると、USF・2D画像は処理済みUSF画像となり、その結果として生成されたこの処理済みUSF画像は、高濃度の蛍光領域が強調表示されるという特徴を有する。
デジタイザは、その高いサンプリングレート(最高サンプリングレートは100MS/秒である)に対する超音波Aライン信号を記録するために使用される。デジタイザはMATLABを使用することにより制御される。MATLABにより、デジタイザは、トリガに対する20マイクロ秒の遅延後に60マイクロ秒のデータを記録するよう設定される。このことにより、USTの表面および水からの高エコー振幅信号を含むUSエコー信号の最初の20マイクロ秒は、確実に拒否される。水中の平均超音波速度が1480毎秒メートルであるとすると、60マイクロ秒の記録は、およそ4.4cmの深さの情報が記録されることに対応する。
各走査点におけるAラインが記録され、座標情報(例えば、絶対位置、および軸方向ならびに横方向の両方に沿った走査点間の距離など)とともに格納される記録されたAラインは振幅エコー情報を有するため、ベースラインシフトを除去した後に上方エンベロープ情報に変換される。各深さに沿って、Aラインのエンベロープ(エンベロープUS信号と呼ばれる)は、行列において列方向に積み重ねられ、次に、これが2D画像として格納される。これは、Bモード画像または輝度モードUS画像を意味する。Bモード画像または輝度モードUS画像では、グレースケール強度値は、より高い音響インピーダンス不整合境界面に対応し、それにより、ROIの構造的情報が強調される。
カスタマイズされたテンプレート照合アルゴリズムは、相関法に基づいて開発されたものである。超音波(US)Bモード画像におけるチューブ構造は、その寸法がシリコーンチューブの断面直径(OD=0.64mm)と0.4mmとの合計となり、それによりチューブ全体が確実に考慮されるテンプレートとして、選択される。次にオリジナルのUS・Bモード画像およびテンプレートをMATLABのビルトイン関数「normxcorr2」に与えると、相関行列が生成される。次に、0.7の相関値におけるカットオフを有する閾値化が適用されると、負、ゼロ、またはより低い相関値がゼロに抑えられる。したがって生成された処理済み相関行例は、考慮対象の組織試料内に埋め込まれた3本のチューブの位置に対応する3つの領域を含む。
処理済みUSF画像のオリジナルのUS・Bモード画像上への直接的重ね合わせ
処理済みUSF・2D画像は、透明性を使用するが軽微な変更を有する、画像重ね合わせの直接的方法を使用して、グレースケール化されたUS・Bモード画像上にカラー画像として重ね合わせるために使用される。重ね合わせコードは、処理済みUSF画像強度値と、透明性の度合いと、の制御閾値化を有するよう、変更される。制御閾値化は、USF画像における末尾部を最小化または除去し、より高濃度蛍光領域を示すために、2つの方法に分類される。
2つ以上のターゲット(本研究では、ICGまたはADPのいずれかの色素溶液で充填されたシリコーンチューブ)を有する処理済みUSF画像に対する形態学的操作は、チューブの位置と一致しない領域をもたらすこともあった。理論に拘束されることを意図するものではないが、2つの隣接するチューブの末尾領域が互いに対して近接するかまたは重なり合い、その結果、高濃度領域のエリアよりも大きいエリアが形成される場合があると考えられる。したがって上記のアルゴリズムは、偶然に、これらの末尾重ね合わせ領域を、USF画像における最大の2つの領域のうちの1つであると選択する。この懸念事項は、蛍光濃度領域がチューブの位置に基づいて選択されるなら、克服され得る。
US・Bモード画像に対してテンプレート照合アルゴリズムを実装することにより、チューブの位置または領域がもたらされた。このように得られた処理された相関済みUS・Bモード画像は2値画像に変換される。US・Bモード相関行列のこの2値画像は基準画像として使用され、USF画像の2値画像は、カスタム開発されたMATLAB関数に対する入力画像として使用される。この関数は、入力画像と基準画像との間で互いに交差する領域を選択し、交差しない他の領域は除外または拒否する。このようにして得られた2値画像は、処理済みUSF画像に対して乗算するために使用される。このように、チューブ位置に配置されるUSF蛍光濃度領域が、選択され、次に、重ね合わせ画像プログラムにおいて使用される。
単一ターゲットのためのUSFイメージング
ブタ組織試料実験内で埋め込まれた単一ターゲット(単一チューブ)に対して、予備実験に対して使用されたブタ組織の厚さは約4〜5mmであり、使用された色素溶液はADPであり、ターゲットシリコーンチューブの仕様は以下の通りである。ID:0.31mmおよびOD:0.64mm。
より厚い(約10〜12mmの厚さ)ブタ組織試料内の一連の同様のターゲット(シリコーンチューブ)のUSF画像はUS画像とともに得られた。特に、BモードUS画像は3つのターゲットの形状および位置に関する構造的情報を与え、USF画像は、シリコーンチューブ内に分散された色素溶液の濃度に比例する、根底をなす生理学的情報を与える。複数ターゲット実験に対して、3本のチューブが考慮され、試料準備セクションで論じられるように配列される。ここで表される結果は、その対応するADPフィルタセット(830LP、ロングパスフィルタ+RG780、吸収フィルタ)とともに808nmレーザ励起を使用した。ADPベースのUSF画像のSNRが顕著に高いため、特徴抽出アルゴリズム(相関プラスグレースケールマッピング)は適用されず、したがってオリジナルの未処理データが重ね合わせに使用される。ICGの場合、特徴抽出アルゴリズムが、ICGベースのUSF画像の低濃度領域を強調表示するために適用される。
形態学的操作は、USF画像を2値画像に変換し、次に、US・Bモードチューブ位置と重なる2値画像のこれらの領域を選択することを含む。形態学的操作の利点は、低閾値カットオフが選択可能であることである。USF画像に対する係る操作が、さらに低い蛍光強度領域を有したとしても、これらの全領域は後に除去または拒否され、それにより、USF蛍光情報の大部分が維持されるであろう。
この選択方法は、2値画像における全領域を別個にそれ自身の2値画像のそれぞれに分割することを含み、各領域内の面積も計算する。次に、これらの領域は、面積に応じて、ソートされる。最大の2つの領域と、それらのそれぞれの2値画像と、が選択され、互いに加算され、これらの残りはただ無視される。結果として生成された2値画像またはマスクは、ICG溶液で充填された2つのチューブ位置において正確に配置された2つの領域のみを含む。これらの2値画像が区分的にUSF画像と乗算されると、US・Bモード画像上に重ね合わされる。全般的形態学的方法の1つの欠点は、最大の2つの領域のうちの一方がチューブの位置と重なり合わない可能性が存在することである。このシナリオは、2つの隣接するチューブの末尾領域が重なり合って、チューブ2の蛍光十字中心領域よりも大きい領域を形成するとき、観察される。したがって、USF蛍光領域選択に対してチューブの位置を組み込む変更が必要である。
US画像のデータ処理セクションで説明したテンプレート照合アルゴリズムを使用することにより、ターゲットチューブの位置を正確に得ることが可能である。次にこの画像は、オリジナルUSF画像のサイズに修正され、次に、2値画像に変換される。結果的に生成された2値US処理済み画像は、所望の対象領域を選択するための形態学的操作アルゴリズムに対する基準画像として使用される。領域の選択は、2値US処理済み画像と2値USF処理済み画像との間の交差領域を単に見出すことにより、なされる。
処理のブタ組織試料に対して、2セットのデータが記録される。第1セットのデータは、ADPフィルタセット(715LP+RG695)を用いる671nmレーザ励起を有し、第2セットデータは、ICGフィルタセット(830LP+RG780)を用いる808nmレーザ励起を有する。実験モジュールの残りは変更されない。上述の画像処理はADP・USFデータセットにも適用され、それにより、同様の結果が得られた。以下のセクションでは、US・Bモード画像上に重ね合わされたICGおよびADP・USF処理済み画像に関する。2セットのUSFイメージングに対してデュアルHIFU・USTモジュールおよびブタ組織試料の位置を変化させないよう細心の注意が払われた。両方のUSF画像が正規化され、0.5の閾値が両方のUSF画像に適用される。
Claims (18)
- (a)環境内に、超音波切り替え可能な第1フルオロフォアを配置する工程と、
(b)前記環境を超音波ビームに曝露させて、前記環境内に活性化領域を形成する工程と、
(c)前記第1フルオロフォアを前記活性化領域内に配置して、前記第1フルオロフォアをオフ状態からオン状態に切り替える工程と、
(d)前記環境を電磁放射ビームに曝露させ、それにより前記第1フルオロフォアを励起させる工程と、
(e)前記第1フルオロフォアにより放出された第1超音波蛍光信号と第1バックグラウンド信号を含む第1フォトルミネセンス信号を前記環境内の第1場所において検出する工程と、
(f)前記第1フォトルミネセンス信号と第1基準信号との相関関係を算定して、前記第1場所に対する第1相関係数を生成する工程であって、前記第1基準信号は前記第1フルオロフォアの前記第1超音波蛍光信号に対応し、前記第1フォトルミネセンス信号と前記第1基準信号との相関関係を算定する工程が、前記第1フォトルミネセンス信号の時間強度減衰プロファイルと、前記第1基準信号の時間強度減衰プロファイルと、を比較する工程を含む、工程と、
(g)前記第1フォトルミネセンス信号と前記第1場所に対する前記相関係数とを乗算して、前記第1場所に対する第1修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
を含む、イメージング方法。 - 前記環境を前記電磁放射ビームに曝露させることは、前記環境内に存在する少なくとも1つのフォトルミネセンスバックグラウンド種も励起させる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1バックグラウンド信号は、前記少なくとも1つのフォトルミネセンスバックグラウンド種により放出される第1バックグラウンドフォトルミネセンス信号を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記第1場所に対する前記相関係数はビン分割された相関係数である、請求項1に記載の方法。
- (en)前記第1フルオロフォアにより放出された第n追加的超音波蛍光信号と第n追加的バックグラウンド信号とのうちの少なくとも一方を含むn個の追加的フォトルミネセンス信号を前記環境内のn個の追加的場所において検出する工程と、
(fn)前記n個の追加的フォトルミネセンス信号と前記第1基準信号との相関関係を算定して、前記n個の追加的場所に対するn個の追加的相関係数を生成する工程と、
(gn)前記n個の追加的フォトルミネセンス信号と前記n個の追加的相関係数とを乗算して、前記n個の追加的場所に対するn個の追加的修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
をさらに含み、
nは1〜1000の整数である、
請求項1に記載の方法。 - (h)前記第1場所に対する前記第1修正済みフォトルミネセンス信号と、第2場所に対する第2修正済みフォトルミネセンス信号と、前記n個の追加的場所に対する前記n個の追加的修正済みフォトルミネセンス信号と、を組み合わせて、前記環境内の前記第1フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成する工程、
をさらに含む、請求項6に記載の方法。 - (a)環境内に、超音波切り替え可能な第1フルオロフォアおよび超音波切り替え可能な第2フルオロフォアを配置する工程と、
(b)前記環境を超音波ビームに曝露させて、前記環境内に活性化領域を形成する工程と、
(c)前記第1フルオロフォアを前記活性化領域内に配置して、前記第1フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替える工程、および/または、前記第2フルオロフォアを前記活性化領域内に配置して、前記第2フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替える工程と、
(d)前記環境を電磁放射ビームに曝露させ、それにより前記第1フルオロフォアおよび/または前記第2フルオロフォアを励起させる工程と、
(e)前記第1フルオロフォアにより放出された第1超音波蛍光信号と、前記第2フルオロフォアにより放出された第1蛍光信号と、第1バックグラウンド信号と、のうちの少なくとも1つを含む第1フォトルミネセンス信号を前記環境内の第1場所において検出する工程と、
(f)前記第1フォトルミネセンス信号と第1基準信号との相関関係を算定して、前記第1場所に対する第1相関係数を生成する工程と、
(g)前記第1フォトルミネセンス信号と前記第1場所に対する前記第1相関係数とを乗算して、前記第1場所に対する第1修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
を含む、イメージング方法。 - (f2)前記第1フォトルミネセンス信号と第2基準信号との相関関係を算定して、前記第1場所に対する第2相関係数を生成する工程と、
(g2)前記前記第1フォトルミネセンス信号と前記第1場所に対する前記第2相関係数とを乗算して、前記第1場所に対する第2修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
をさらに含み、
前記第1基準信号は前記第1フルオロフォアの前記第1超音波蛍光信号に対応し、
前記第2基準信号は前記第2フルオロフォアの前記第1超音波蛍光信号に対応する、
請求項8に記載の方法。 - (en)前記第1フルオロフォアにより放出された第n追加的超音波蛍光信号と、前記第2フルオロフォアにより放出された第n追加的超音波蛍光信号と、第n追加的バックグラウンド信号とのうちの少なくとも1つを含むn個の追加的フォトルミネセンス信号を前記環境内のn個の追加的場所において検出する工程と、
(f1n)前記n個の追加的フォトルミネセンス信号と前記第1基準信号との相関関係を算定して、前記n個の追加的場所に対するn個の追加的第1相関係数を生成する工程と、
(g1n)前記n個の追加的フォトルミネセンス信号と前記n個の追加的場所に対する前記n個の追加的第1相関係数とを乗算して、前記n個の追加的場所に対するn個の追加的第1修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
(f2n)前記n個の追加的フォトルミネセンス信号と前記第2基準信号との相関関係を算定して、前記n個の追加的場所に対するn個の追加的第2相関係数を生成する工程と、
(g2n)前記n個の追加的フォトルミネセンス信号と前記n個の追加的場所に対する前記n個の追加的第2相関係数とを乗算して、前記n個の追加的場所に対するn個の追加的第2修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
をさらに含み、
nは1〜1000の整数である、
請求項9に記載の方法。 - (h1)前記第1場所に対する前記第1修正済みフォトルミネセンス信号と、前記n個の追加的場所に対する前記n個の追加的第1修正済みフォトルミネセンス信号と、を組み合わせて、前記環境内の前記第1フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成する工程と、
(h2)前記第1場所に対する前記第2修正済みフォトルミネセンス信号と、前記n個の追加的場所に対する前記n個の追加的第2修正済みフォトルミネセンス信号と、を組み合わせて、前記環境内の前記第2フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成する工程、
をさらに含む、請求項10に記載の方法。 - (a)環境内に、超音波切り替え可能な第1フルオロフォアおよび超音波切り替え可能な第2フルオロフォアを配置する工程と、
(b)前記環境を超音波ビームに曝露させて、前記環境内に活性化領域を形成する工程と、
(c)前記第1フルオロフォアを前記活性化領域内に配置して、前記第1フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替える工程、および/または、前記第2フルオロフォアを前記活性化領域内に配置して、前記第2フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替える工程と、
(d)前記環境を電磁放射ビームに曝露させ、それにより前記第1フルオロフォアおよび/または前記第2フルオロフォアを励起させる工程と、
(e)前記第1フルオロフォアにより放出された第1超音波蛍光信号と前記第2フルオロフォアにより放出された第2超音波蛍光信号とのうちの少なくとも一方を含む第1フォトルミネセンス信号を前記環境内の第1場所において検出する工程と、
(f)前記第1フォトルミネセンス信号を、前記第1フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応する第1基底ベクトルと、前記第2フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応する第2基底ベクトルと、に直交分解する工程と、
を含む、イメージング方法。 - (g1)前記第1場所における前記第1フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号に対する基底ベクトル係数aを判定する工程と、
(g2)前記第1場所における前記第2フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号に対する基底ベクトル係数bを判定する工程と、
をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - (h1)前記第1フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号と前記係数aとを乗算して、前記第1場所における前記第1フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
(h2)前記第2フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号と前記係数bとを乗算して、前記第1場所における前記第2フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
をさらに含む、請求項13に記載の方法。 - (en)前記第1フルオロフォアにより放出された第n追加的超音波蛍光信号と、前記第2フルオロフォアにより放出された第n追加的超音波蛍光信号と、のうちの少なくとも一方を含むn個の追加的フォトルミネセンス信号を前記環境内のn個の追加的場所において検出する工程と、
(fn)前記n個の追加的フォトルミネセンス信号を、前記第1フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応するn個の追加的第1基底ベクトルと、前記第2フルオロフォアの正規化された超音波信号に対応するn個の追加的第2基底ベクトルと、に直交分解する工程と、
(g1n)前記n個の追加的場所における前記第1フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号に対するn個の追加的基底ベクトル係数anを判定する工程と、
(g2n)前記n個の追加的場所における前記第2フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号に対するn個の追加的基底ベクトル係数bnを判定する工程と、
(h1n)前記第1フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号と前記n個の追加的係数anとを乗算して、前記n個の追加的場所における前記第1フルオロフォアのn個の追加的分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
(h2n)前記第2フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号と前記n個の追加的係数bnとを乗算して、前記n個の追加的場所における前記第2フルオロフォアのn個の追加的分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
をさらに含み、
nは1〜1000の整数である、
請求項14に記載の方法。 - (i1)前記第1場所における前記第1フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と、前記n個の追加的場所における前記第1フルオロフォアの前記n個の追加的分離された超音波蛍光信号と、を組み合わせて、前記環境内の前記第1フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成する工程と、
(i2)前記第1場所における前記第2フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と、前記n個の追加的場所における前記第2フルオロフォアの前記n個の追加的分離された超音波蛍光信号と、を組み合わせて、前記環境内の前記第2フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成する工程と、
をさらに含む、請求項15に記載の方法。 - (j1)前記第1フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と第1基準信号との相関関係を算定して、前記第1場所に対する前記第1基準信号に対する第1相関係数を生成する工程と、
(k1)前記第1フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と前記第1基準信号に対する前記第1相関係数とを乗算して、前記第1場所に対する前記第1フルオロフォアの第1修正済み分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
(j2)前記第2フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と第2基準信号との相関関係を算定して、前記第1場所に対する前記第2基準信号に対する第1相関係数を生成する工程と、
(k2)前記第2フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と前記第2基準信号に対する前記第1相関係数とを乗算して、前記第1場所に対する前記第2フルオロフォアの第1修正済み分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
をさらに含み、
前記第1基準信号は前記第1フルオロフォアの前記第1超音波蛍光信号に対応し、
前記第2基準信号は前記第2フルオロフォアの前記第1超音波蛍光信号に対応する、
請求項14に記載の方法。 - (j1n)前記第1フルオロフォアの前記n個の追加的分離された超音波蛍光信号と第1基準信号との相関関係を算定して、前記n個の追加的場所に対する前記第1基準信号に対するn個の追加的相関係数を生成する工程と、
(k1n)前記第1フルオロフォアの前記n個の追加的分離された超音波蛍光信号と前記第1基準信号に対する前記n個の追加的相関係数とを乗算して、前記n個の追加的場所に対する前記第1フルオロフォアのn個の追加的修正済み分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
(j2n)前記第2フルオロフォアの前記n個の追加的分離された超音波蛍光信号と第2基準信号との相関関係を算定して、前記n個の追加的場所に対する前記第2基準信号に対するn個の追加的相関係数を生成する工程と、
(k2n)前記第2フルオロフォアの前記n個の追加的分離された超音波蛍光信号と前記第2基準信号に対する前記n個の追加的相関係数とを乗算して、前記n個の追加的場所に対する前記第2フルオロフォアのn個の追加的修正済み分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
をさらに含み、
前記第1基準信号は前記第1フルオロフォアの前記第1超音波蛍光信号に対応し、
前記第2基準信号は前記第2フルオロフォアの前記第1超音波蛍光信号に対応する、
請求項15に記載の方法。
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