BR112017016721B1

BR112017016721B1 - Método de geração de imagem de alta resolução

Info

Publication number: BR112017016721B1
Application number: BR112017016721-2A
Authority: BR
Inventors: Baohong Yuan; Bingbing CHENG; Mingyuan WEI
Original assignee: Board Of Regents, The University Of Texas System
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2016-02-08
Publication date: 2021-07-20
Also published as: JP6767377B2; DK3254087T3; EP3254087A1; CA2975193C; EP3254087A4; EP3254087B1; CN107430074B; MX2017010091A; AU2016215058A1; JP2018513352A; AU2016215058B2; WO2016127158A1; BR112017016721A2; ZA201705951B; CN107430074A; CA2975193A1

Abstract

SISTEMAS E MÉTODOS PARA GERAÇÃO DE IMAGEM DE ALTA RESOLUÇÃO. Num aspecto, métodos de geração de imagem são descritos aqui. Em algumas modalidades, um método de geração de imagem aqui descrito compreende a disposição de um fluoróforo comutável por ultrassom num ambiente; a exposição do ambiente a um feixe de ultrassom para criar uma região de ativação dentro do ambiente; a disposição do fluoróforo dentro da região de ativação para alternar o fluóroforo de um estado desligado para um estado ligado; a exposição do ambiente a um feixe de radiação eletromagnética, excitando assim o fluoróforo; a detecção de um sinal de fotoluminescência numa primeira localização dentro do ambiente, o sinal de fotoluminescência compreendendo pelo menos um sinal de fluorescência de ultrassom emitido pelo fluoróforo e um sinal de fundo; a correlação do sinal de fotoluminescência com um sinal de referência para gerar um coeficiente de correlação para a primeira localização; e multiplicação do sinal de fotoluminescência pelo coeficiente de correlação para a primeira localização para gerar um sinal de fotoluminescência modificado para a primeira localização.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade de acordo com 35 USC § 119 ao Pedido de Patente US N° de Série 14/615.993, depositado em 6 de fevereiro de 2015, que é uma continuação em parte do Pedido de Patente US N° de Série 14/162.375, depositado em 23 de janeiro de 2014, que reivindica a prioridade de acordo com o 35 U.S.C. § 119(e) para o Pedido de Patente Provisória US N° de Série 61/756.065, depositado em 24 de janeiro de 2013, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.

DECLAR AÇÃO SOBRE PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL

[0002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob o contrato 7R15EB012312-02 concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde através do Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia, contrato RP120052 concedido pelo Instituto de Pesquisas e Prevenção de Câncer do Texas e contrato CBET-1253199 concedido pela Fundação Nacional de Ciências. O governo tem certos direitos sobre a invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] Esta invenção refere-se a sistemas e métodos para imagens de alta resolução e, em particular, a imagens usando fluorescência comutável por ultrassom (USF).

FUNDAMENTOS

[0004] A imagem de fluorescência em tecido biológico profundo pode fornecer informações importantes sobre a estrutura, função e disfunção do tecido. No entanto, algumas técnicas de imagem de fluorescência anteriores são limitadas em profundidade de penetração e/ou resolução espacial devido à forte dispersão de luz em tecido profundo. Algumas técnicas anteriores de imagem de fluorescência também são limitadas na relação sinal-ruído (SNR). Como resultado, tais métodos podem ter uma eficácia reduzida para muitas biologias de tecidos e/ou aplicações clínicas.

[0005] Portanto, existe uma necessidade de sistemas e métodos melhorados para imagens de alta resolução, particularmente para imagens de tecido biológico profundo.

SUMÁRIO

[0006] Num aspecto, os métodos de imagem estão aqui descritos que, em alguns casos, podem fornecer uma ou mais vantagens em comparação com outros métodos. Por exemplo, em algumas modalidades, um método aqui descrito pode proporcionar imagens de tecido biológico profundo com uma resolução além do limite de difração acústica e pode exibir ainda uma relação aprimorada de resolução de profundidade para imagem (DRR) e/ou uma relação sinal/ruído melhorada (SNR). Além disso, um fluoróforo de um método aqui descrito, em alguns casos, pode exibir uma grande relação ligado/desligado da intensidade de fluorescência ou vida útil e/ou uma largura de banda de transição estreita entre estados de ativação e desativação. Além disso, um fluoróforo de um método aqui descrito também pode exibir um limite ajustável entre os estados ligado e desligado. Além disso, em alguns casos, um método aqui descrito pode permitir imagens de fluorescência de ultrassom multiplexadas, incluindo a imagem simultânea de vários alvos moleculares, como pode ser desejável para uma ou mais aplicações biomédicas.

[0007] Um método aqui descrito, em algumas modalidades, compreende a disposição de uma população de fluoróforos comutáveis por ultrassom num ambiente biológico, os fluoróforos possuindo um limite de comutação entre um estado desligado e um estado ligado, e expondo o ambiente biológico a um feixe de ultrassom para criar uma região de ativação dentro do ambiente biológico. O método compreende ainda a passagem de pelo menos um dos fluoróforos dentro da região de ativação do estado desligado para o estado ligado, excitando, pelo menos, um fluoróforo com um feixe de radiação eletromagnética e detectando a luz emitida por, pelo menos, um fluoróforo. Em algumas modalidades, a região de ativação tem uma pressão máxima negativa e/ou uma temperatura máxima, e o limite de comutação do pelo menos um fluoróforo é pelo menos cerca de 50 por cento da pressão negativa máxima da região de ativação ou pelo menos cerca de 50 por cento da temperatura máxima da região de ativação. Em alguns casos, por exemplo, os fluoróforos têm um limite de temperatura de comutação entre um estado desligado e um estado ligado e a região de ativação tem uma temperatura máxima maior ou igual ao limite de temperatura de comutação dos fluoróforos.

[0008] Além disso, em algumas modalidades, um método aqui descrito compreende expor o ambiente biológico a uma pluralidade de feixes de ultrassom a partir de uma pluralidade de direções diferentes, em que as zonas focais dos feixes de ultrassom se sobrepõem pelo menos parcialmente. Além disso, em alguns desses casos, o limite de comutação dos fluoróforos é maior do que a temperatura máxima ou pressão negativa máxima fornecida pela zona focal de um dos feixes de ultrassom sozinho.

[0009] Além disso, em alguns casos, um método aqui descrito inclui ainda a exposição do ambiente biológico a um feixe pulsado de radiação eletromagnética antes de expor o ambiente biológico ao feixe de ultrassom, o feixe pulsado com uma duração de pulso não superior a 100 picosegundos (ps), em que a duração do pulso é definida como a largura total ao meio máximo da potência óptica do pulso ao longo do tempo.

[0010] Adicionalmente, em alguns casos, um método aqui descrito compreende (a) descartar um primeiro fluoróforo com permutador de ultrassom em um ambiente, como um ambiente biológico, (b) expor o ambiente a um feixe de ultrassom para criar uma região de ativação dentro do ambiente, (c) descartar o primeiro fluoróforo dentro da região de ativação para alternar o primeiro fluoróforo de um estado fora para um estado em estado, e (d) expor o ambiente a um feixe de radiação eletromagnética, provocando assim o primeiro fluoróforo. Em alguns casos, a exposição do meio ambiente ao feixe de radiação eletromagnética também provoca pelo menos uma espécie de fundo fotoluminescente presente no meio ambiente. Além disso, um método descrito também pode incluir (e) detectar um primeiro sinal de fotoluminescência numa primeira localização dentro do ambiente, o primeiro sinal de fotoluminescência compreendendo pelo menos um dentre um primeiro sinal de fluorescência de ultrassom emitido pelo primeiro fluoróforo e um primeiro sinal de fundo. Em alguns casos, o primeiro sinal de fundo compreende um primeiro sinal de fotoluminescência de fundo emitido por, pelo menos, uma espécie de fundo fotoluminescente. Além disso, em algumas modalidades, o método compreende ainda (f) correlação do primeiro sinal de fotoluminescência com um primeiro sinal de referência para gerar um primeiro coeficiente de correlação para a primeira localização e (g) multiplicação do primeiro sinal de fotoluminescência pelo coeficiente de correlação para a primeira localização para gerar um primeiro sinal de fotoluminescência modificado para o primeiro local. O primeiro sinal de referência de um método aqui descrito, em alguns casos, corresponde ao primeiro sinal de fluorescência de ultrassom do primeiro fluoróforo. Ainda, em alguns casos, a correlação do primeiro sinal de fotoluminescência com o primeiro sinal de referência compreende a comparação de um perfil de decaimento de intensidade temporal do primeiro sinal de fotoluminescência com um perfil de decaimento de intensidade temporal do primeiro sinal de referência.

[0011] Além disso, as etapas anteriores (e)-(g) de detecção e processamento de um sinal de fotoluminescência em uma primeira localização dentro do ambiente podem ser repetidas qualquer número de vezes desejado para gerar uma pluralidade de sinais de fotoluminescência modificados para uma pluralidade de locais dentro do meio ambiente. Por exemplo, em alguns casos, um método aqui descrito compreende ainda (e2) detectando um segundo sinal de fotoluminescência em uma segunda localização dentro do ambiente, o segundo sinal de fotoluminescência compreendendo pelo menos um de um segundo sinal de fluorescência de ultrassom emitido pelo primeiro fluoróforo e um segundo sinal de fundo, (f2) correlacionando o segundo sinal de fotoluminescência com o primeiro sinal de referência para gerar um coeficiente de correlação para a segunda localização, e (g2) multiplicando o segundo sinal de fotoluminescência pelo coeficiente de correlação para a segunda localização para gerar um segundo sinal de fotoluminescência modificado para a segunda localização. Geralmente mais, os sinais de fotoluminescência modificados n podem ser gerados a partir dos sinais de fotoluminescência n na localização n dentro do ambiente e de coeficientes de correlação n para a localização n, em que n pode ser qualquer inteiro desejado, como um número inteiro entre 2 e 1000. Desta maneira, pode ser obtido um plot ou perfil espacial da fluorescência de ultrassom emitida pelo primeiro fluoróforo dentro do ambiente, conforme descrito mais adiante.

[0012] Além disso, em alguns casos, um método aqui descrito pode incluir o uso simultâneo de mais de um fluoróforo comutável por ultrassom. Assim, um método aqui descrito, em alguns casos, pode permitir ou fornecer imagens de fluorescência de ultrassom multiplexadas, incluindo imagens de imagens multiplexadas usando uma pluralidade de diferentes fluoróforos comutáveis por ultrassom.

[0013] Além disso, em modalidades, um método de imagem multiplexada aqui descrito compreende (a) disposição de um primeiro fluoróforo comutável por ultrassom e um segundo fluoróforo comutável por ultrassom em um ambiente, (b) exposição do ambiente a um feixe de ultrassom para criar uma região de ativação dentro do ambiente, (c) descartando o primeiro fluoróforo dentro da região de ativação para alternar o primeiro fluoróforo de um estado desligado para um estado ligado e/ou descartando o segundo fluoróforo dentro da região de ativação para alternar o segundo fluoróforo de um estado desligado para um estado ligado (d) expondo o ambiente a um feixe de radiação eletromagnética, excitando assim o primeiro fluoróforo e/ou o segundo fluoróforo, (e) a detecção de um primeiro sinal de fotoluminescência em uma primeira localização dentro do ambiente, o primeiro sinal de fotoluminescência compreendendo pelo menos um dos primeiros sinais de fluorescência de ultrassom emitidos pelo primeiro fluoróforo e um primeiro sinal de fluorescência de ultrassom emitido pelo Segundo fluoróforo e (f) decomposição ortogonal do primeiro sinal de fotoluminescência em um primeiro vetor de base correspondente a um sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do primeiro fluoróforo e um segundo vetor de base correspondente a um sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do segundo fluoróforo. Adicionalmente, em alguns casos, um método aqui descrito compreende ainda (g1) determinando um coeficiente de vetor de base a para o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do primeiro fluoróforo na primeira localização e (g2) determinando um coeficiente de vetor de base b para o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do segundo fluoróforo na primeira localização. Um método aqui descrito também pode compreender (h1) multiplicando o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do primeiro fluoróforo pelo coeficiente a para gerar um sinal de fluorescência de ultrassom separado do primeiro fluoróforo na primeira localização, e (h2) multiplicando o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do segundo fluoróforo pelo coeficiente b para gerar um sinal de fluorescência de ultrassom separado do segundo fluoróforo na primeira localização. Além disso, como se descreve mais adiante, o processo anterior das etapas (e)-(h) pode ser repetido qualquer número desejado de vezes para gerar sinais de fluorescência de ultrassom separados do primeiro e/ou segundo fluoróforos em qualquer número desejado de localizações adicionais dentro do meio ambiente.

[0014] Além disso, também é possível gerar parcelas espaciais separadas de fluorescência de ultrassom emitidas pelo primeiro e segundo fluoróforos dentro do ambiente, inclusive por (i1) combinando o sinal de fluorescência de ultrassom separado do primeiro fluoróforo na primeira localização com sinais adicionais de fluorescência de ultrassom separados n do primeiro fluoróforo nas localizações adicionais n para gerar um plot espacial da fluorescência de ultrassom emitida pelo primeiro fluoróforo no ambiente, e (i2) combinando o sinal de fluorescência de ultrassom separado do segundo fluoróforo na primeira localização com sinais adicionais de fluorescência de ultrassom separados n do segundo fluoróforo nas localizações adicionais n para gerar um plot espacial da fluorescência de ultrassom emitida pelo segundo fluoróforo dentro do ambiente. Além disso, uma vez separados sinais de fluorescência de ultrassom do primeiro e segundo fluoróforos são obtidos para uma ou mais localizações no ambiente, é possível, se desejado, melhorar o SNR desses sinais de uma maneira descrita acima.

[0015] Em algumas modalidades, um fluoróforo comutável por ultrassons usado no método aqui descrito compreende uma espécie de doador de transferência de energia de ressonância de Forster (FRET) e uma espécie aceitadora de FRET. Em alguns desses casos, a distância entre as espécies doadoras FRET e as espécies aceitantes FRET do fluoróforo é alterada pela presença de um feixe de ultrassom. Por exemplo, em algumas modalidades, um fluoróforo compreende uma microbolha compreendendo uma ou mais espécies doadoras de FRET e uma ou mais espécies aceitadoras FRET ligadas à superfície da microbolha. Nos outros casos, um fluoróforo comutável por ultrassom usado no método aqui descrito compreende um polímero termorresistente. Adicionalmente, em alguns casos, um polímero termorresistente de um fluoróforo aqui descrito compreende uma ou mais frações fluorescentes ou é conjugado com uma ou mais espécies fluorescentes, tais como uma ou mais moléculas de corantes fluorescentes. Em outros casos, um fluoróforo aqui descrito compreende um material fluorescente disperso e/ou ligado à superfície de uma nanopartícula de polímero termorresistente. Além disso, em algumas modalidades, um fluoróforo comutável por ultrassom, descrito aqui exibe um perfil de emissão de fluorescência no infravermelho próximo (NIR), uma relação ligado-ao-desligado na intensidade de fluorescência (ILigado/IDesligado) de pelo menos cerca de 2, uma relação ligado-ao-desligado no tempo de vida de fluorescência (TLigado/TDesligado) de pelo menos cerca de 1,5, e/ou uma largura de banda de transição entre estados ligado e desligado (TBW) não superior a cerca de 10° C.

[0016] Além disso, em algumas modalidades, o ambiente biológico de um método aqui descrito compreende tecido profundo. Em alguns casos, o ambiente biológico compreende vasculatura tumoral. Além disso, em alguns casos, um método aqui descrito exibe uma relação de profundidade/resolução de penetração de pelo menos cerca de 100.

[0017] Estas e outras modalidades são descritas em mais detalhes na descrição detalhada que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0018] A FIG. 1 ilustra um processo de fluorescência comutável por ultrassom de acordo com uma modalidade de um método aqui descrito.

[0019] A FIG. 2 ilustra um processo de fluorescência comutável por ultrassom de acordo com uma modalidade de um método aqui descrito.

[0020] A FIG. 3 ilustra plots da intensidade de fluorescência e tempo de vida de fluorescência de um fluoróforo dependente da temperatura adequado para uso em algumas modalidades dos métodos aqui descritos.

[0021] A FIG. 4 ilustra as estruturas de componentes de fluoróforos adequados para utilização em algumas modalidades dos métodos aqui descritos.

[0022] A FIG. 5 ilustra curvas de comutação de fluorescência de fluoróforos adequados para utilização em algumas modalidades dos métodos aqui descritos.

[0023] A FIG. 6 ilustra dados de fluorescência para um fluoróforo adequado para utilização em algumas modalidades dos métodos aqui descritos.

[0024] A FIG. 7 ilustra um sistema usado para medir as características de fluorescência de fluoróforos adequados para utilização em algumas modalidades dos métodos aqui descritos.

[0025] A FIG. 8A ilustra componentes e etapas de um método de imagem de acordo com uma modalidade aqui descrita. A FIG. 8B ilustra componentes e etapas de um método de imagem de acordo com uma modalidade aqui descrita. A FIG. 8C ilustra etapas de um método de imagem de acordo com uma modalidade aqui descrita.

[0026] A FIG. 9A ilustra uma imagem USF obtida por um método de acordo com uma modalidade aqui descrita. A FIG. 9B ilustra uma imagem comparativa correspondente à imagem de FIG. 9A. A FIG. 9C ilustra um perfil de fluorescência obtido por um método de acordo com uma modalidade aqui descrita. A FIG. 9D ilustra um perfil de fluorescência obtido por um método de acordo com uma modalidade aqui descrita.

[0027] A FIG. 10 ilustra um processo de fluorescência comutável por ultrassom de acordo com uma modalidade de um método aqui descrito.

[0028] A FIG. 11 ilustra um processo de fluorescência comutável por ultrassom de acordo com uma modalidade de um método aqui descrito.

[0029] A FIG. 12 ilustra um processo de fluorescência comutável por ultrassom de acordo com uma modalidade de um método aqui descrito.

[0030] A FIG. 13 ilustra a estrutura de um componente de um fluoróforo adequado para utilização em algumas modalidades dos métodos aqui descritos.

[0031] A FIG. 14 ilustra um plot de resolução de imagem versus limite de comutação de fluoróforo para algumas modalidades dos métodos aqui descritos.

[0032] A FIG. 15 ilustra um processo de fluorescência comutável por ultrassom de acordo com uma modalidade de um método aqui descrito.

[0033] A FIG. 16 ilustra um processo de fluorescência comutável por ultrassom de acordo com uma modalidade de um método aqui descrito.

[0034] A FIG. 17 ilustra um processo de fluorescência comutável por ultrassom de acordo com uma modalidade de um método aqui descrito.

[0035] A FIG. 18A e FIG. 18B cada uma ilustra a estrutura de materiais fluorescentes adequados para utilização em fluoróforos permutáveis por ultrassons de acordo com algumas modalidades aqui descritas.

[0036] A FIG. 19A-19F cada uma ilustra perfis de emissão de fluoróforos permutáveis por ultrassons de acordo com algumas modalidades aqui descritas.

[0037] A FIG. 20A e FIG. 20B cada uma ilustra perfis de emissão de fluoróforos permutáveis por ultrassons de acordo com algumas modalidades aqui descritas.

[0038] A FIG. 21A ilustra componentes e etapas de um método de imagem de acordo com uma modalidade aqui descrita. A FIG. 21B ilustra etapas de um método de imagem correspondente aos componentes de FIG. 21A. A FIG. 21C ilustra componentes e etapas de um método de imagem de acordo com uma modalidade aqui descrita. A FIG. 21D ilustra componentes e etapas de um método de imagem de acordo com uma modalidade aqui descrita. A FIG. 21E ilustra etapas de métodos de imagem correspondentes aos componentes de FIG. 21C e FIG. 21D. A FIG. 21F ilustra componentes e etapas de um método de imagem de acordo com uma modalidade aqui descrita. A FIG. 21G ilustra etapas de um método de imagem correspondente aos componentes de FIG. 21F.

[0039] A FIG. 22A ilustra o perfil de emissão de um fluoróforo comutável por ultrassom de acordo com uma modalidade aqui descrita. A FIG. 22B ilustra o perfil de emissão de um sinal de fundo associado ao fluoróforo da FIG. 22A. A FIG. 22C e FIG. 22D cada uma ilustra um perfil de emissão de fluorescência de ultrassom para o fluoróforo da FIG. 22A. A FIG. 22E ilustra o perfil de emissão de um fluoróforo comutável por ultrassom de acordo com uma modalidade aqui descrita. A FIG. 22F ilustra o perfil de emissão de um sinal de fundo associado ao fluoróforo da FIG. 22E. A FIG. 22G e FIG. 22H cada uma ilustra um perfil de emissão de fluorescência de ultrassom para o fluoróforo de FIG. 22E.

[0040] As FIGS. 23A-23D cada uma ilustra um perfil de emissão de fluorescência de ultrassom de um fluoróforo comutável por ultrassom de acordo com algumas modalidades aqui descritas.

[0041] A FIG. 24A e FIG. 24B cada uma ilustra um perfil de emissão de fluorescência de ultrassom de um fluoróforo comutável por ultrassom de acordo com uma modalidade aqui descrita. A FIG. 24C ilustra um sinal de fotoluminescência total detectado de acordo com uma modalidade aqui descrita.

[0042] A FIG. 25 ilustra componentes e etapas de um método de imagem de acordo com uma modalidade aqui descrita.

[0043] A FIG. 26 ilustra componentes e etapas de um método de imagem de acordo com uma modalidade aqui descrita.

[0044] A FIG. 27 ilustra componentes e etapas de um método de imagem de acordo com uma modalidade aqui descrita.

[0045] A FIG. 28 ilustra componentes e etapas de um método de imagem de acordo com uma modalidade aqui descrita.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0046] As modalidades aqui descritas podem ser entendidas mais facilmente por referência à descrição detalhada, exemplos e figuras a seguir. Os elementos, aparelhos e métodos aqui descritos, no entanto, não estão limitados às modalidades específicas apresentadas na descrição detalhada, exemplos e figuras. Deve ser reconhecido que estas modalidades são meramente ilustrativas dos princípios da presente invenção. Numerosas modificações e adaptações serão facilmente evidentes para os versados na técnica sem se afastarem do sentido e do alcance da invenção.

[0047] Além disso, todas as gamas aqui descritas devem ser entendidas como abrangendo todas e quaisquer subconjuntos subsumidos no mesmo. Por exemplo, um intervalo declarado de "1,0 a 10,0" deve ser considerado para incluir qualquer e todos os subconjuntos começando com um valor mínimo de 1,0 ou mais e terminando com um valor máximo de 10,0 ou menos, por exemplo, 1,0 a 5,3 ou 4,7 para 10,0 ou 3,6 a 7,9.

[0048] Todos os intervalos aqui divulgados também devem ser considerados para incluir os pontos finais do intervalo, a menos que expressamente indicado o contrário. Por exemplo, um intervalo de "entre 5 e 10" geralmente deve ser considerado para incluir os pontos finais 5 e 10.

[0049] Além disso, quando a frase "até" é utilizada em conexão com uma quantidade ou quantidade, deve entender-se que a quantidade é pelo menos uma quantidade ou quantidade detectável. Por exemplo, um material presente numa quantidade "até"uma quantidade especificada pode estar presente de uma quantidade detectável e até e incluindo a quantidade especificada.

[0050] Num aspecto, métodos de geração de imagem são descritos aqui. Em algumas modalidades, um método de formação de imagens compreende a disposição de uma população de fluoróforos comutáveis por ultrassom num ambiente biológico, os fluoróforos possuindo um limite de comutação entre um estado desligado e um estado ligado; e expondo o ambiente biológico a um feixe de ultrassom para criar uma região de ativação dentro do ambiente biológico, a região de ativação com uma pressão negativa máxima e uma temperatura máxima, em que o limite de comutação de pelo menos um fluoróforo é pelo menos cerca de 50 por cento da pressão negativa máxima ou pelo menos cerca de 50 por cento da temperatura máxima da região de ativação. O método compreende ainda a passagem de pelo menos um dos fluoróforos dentro da região de ativação do estado desligado para o estado ligado; excitando, pelo menos, um fluoróforo com um feixe de radiação eletromagnética e detectando a luz emitida por, pelo menos, um fluoróforo. Em algumas modalidades, o limite de comutação do pelo menos um fluoróforo é pelo menos cerca de 60 por cento ou pelo menos cerca de 70 por cento da pressão negativa máxima ou temperatura máxima da região de ativação. Em alguns casos, o limite de comutação do pelo menos um fluoróforo está entre cerca de 60 por cento e cerca de 100 por cento, entre cerca de 60 por cento e cerca de 90 por cento, entre cerca de 70 por cento e cerca de 100 por cento, entre cerca de 70 por cento e cerca de 95 por cento, ou entre cerca de 70 por cento e cerca de 90 por cento da pressão negativa máxima ou temperatura máxima da região de ativação. Conforme descrito mais adiante, a seleção de um tal limite de comutação, em alguns casos, pode permitir uma resolução de imagem melhorada, reduzindo efetivamente o volume da região de ativação para um tamanho abaixo do tamanho da zona focal do feixe ultrassônico usado para formar a região de ativação.

[0051] Em outras modalidades, um método de imagem compreende a disposição de uma população de fluoróforos comutáveis por ultrassom num ambiente biológico, os fluoróforos possuindo um limite de comutação entre um estado desligado e um estado ligado; e expondo o ambiente biológico a uma pluralidade de feixes de ultrassom a partir de uma pluralidade de direções diferentes para criar uma região de ativação dentro do ambiente biológico, as zonas focais dos feixes de ultrassom pelo menos parcialmente sobrepostas. Em alguns casos, por exemplo, são utilizados dois feixes de ultrassom ortogonal. Além disso, em alguns casos, o limite de comutação dos fluoróforos é maior do que a pressão negativa máxima ou a temperatura máxima proporcionada pela zona focal de um dos feixes de ultrassom sozinhos. O método compreende ainda a passagem de pelo menos um dos fluoróforos dentro da região de ativação do estado desligado para o estado ligado; excitando, pelo menos, um fluoróforo com um feixe de radiação eletromagnética e detectando a luz emitida por, pelo menos, um fluoróforo. Conforme descrito mais adiante, o uso de múltiplos feixes de ultrassom de uma maneira aqui descrita pode permitir uma resolução de imagem melhorada, reduzindo o tamanho da região de ativação.

[0052] Ainda noutras modalidades, um método de imagem compreende a disposição de uma população de fluoróforos comutáveis por ultrassom num ambiente biológico, os fluoróforos possuindo um limite de comutação entre um estado desligado e um estado ligado; e expondo o ambiente biológico a um feixe pulsado de radiação eletromagnética, o feixe pulsado com uma duração de pulso não superior a 100 ps, com base no FWHM da potência óptica do feixe pulsado ao longo do tempo. O método compreende ainda a exposição do ambiente biológico a um feixe de ultrassom para criar uma região de ativação dentro do ambiente biológico; alternando pelo menos um dos fluoróforos dentro da região de ativação do estado desligado para o estado ligado; excitando pelo menos um fluoróforo com um segundo feixe de radiação eletromagnética; e detectando a luz emitida pelo menos um fluoróforo. Além disso, em alguns casos, o feixe pulsado tem uma duração de impulso não superior a cerca de 50 ps ou não superior a cerca de 10 ps. Em algumas modalidades, o feixe pulsado tem uma duração de impulso entre cerca de 1 ps e cerca de 100 ps, entre cerca de 1 ps e cerca de 10 ps, entre cerca de 1 ps e cerca de 50 ps, entre cerca de 10 ps e cerca de 100 ps, ou entre cerca de 10 ps e cerca de 50 ps. Conforme descrito adicionalmente a seguir, a exposição do ambiente biológico a um feixe pulsado de radiação eletromagnética de uma maneira aqui descrita, em algumas modalidades, pode melhorar a relação sinal- ruído (SNR) do método, permitindo a separação temporal da detecção da emissão de fluoróforo, em comparação com a emissão de outras espécies presentes no ambiente biológico. Assim, em alguns casos, a etapa de detecção de luz emitida por, pelo menos, um fluoróforo é realizado após um atraso correspondente ao tempo de vida de fluorescência de tais outras espécies. Além disso, em algumas modalidades, o comprimento de onda do feixe pulsado é selecionado para se sobrepor substancialmente com o perfil de absorção de uma ou mais espécies presentes no ambiente biológico.

[0053] Ainda noutras modalidades, um método de imagem compreende (a) disposição de um primeiro fluoróforo comutável por ultrassom ou uma primeira população de fluoróforos comutáveis por ultrassom num ambiente, como um ambiente biológico, (b) expor o ambiente a um feixe de ultrassom para criar uma região de ativação dentro do ambiente, (c) descartar o primeiro fluoróforo dentro da região de ativação para alternar o primeiro fluoróforo de um estado fora para um estado em estado, e (d) expor o ambiente a um feixe de radiação eletromagnética, provocando assim o primeiro fluoróforo. Em alguns casos, a exposição do meio ambiente ao feixe de radiação eletromagnética também provoca pelo menos uma espécie de fundo fotoluminescente presente no meio ambiente. Além disso, o método compreende ainda (e) detectar um primeiro sinal de fotoluminescência numa primeira localização dentro do ambiente, o primeiro sinal de fotoluminescência compreendendo pelo menos um dentre um primeiro sinal de fluorescência de ultrassom emitido pelo primeiro fluoróforo e um primeiro sinal de fundo. Em alguns casos, o primeiro sinal de fundo compreende um primeiro sinal de fotoluminescência de fundo emitido por, pelo menos, uma espécie de fundo fotoluminescente. Além disso, em algumas modalidades, um método aqui descrito também compreende (f) correlação do primeiro sinal de fotoluminescência com um primeiro sinal de referência para gerar um primeiro coeficiente de correlação para a primeira localização. Em alguns casos, o primeiro sinal de referência corresponde ao primeiro sinal de fluorescência de ultrassom do primeiro fluoróforo. Além disso, um método aqui descrito também pode incluir (g) multiplicar o primeiro sinal de fotoluminescência pelo coeficiente de correlação para a primeira localização para gerar um primeiro sinal de fotoluminescência modificado para a primeira localização.

[0054] Além disso, deve ser entendido que as etapas anteriores (e)- (g) de detectar e processar um sinal de fotoluminescência em uma primeira localização dentro do ambiente podem ser repetidas qualquer número de vezes desejado para gerar uma pluralidade de sinais de fotoluminescência modificados para uma pluralidade de localizações dentro do meio ambiente. Por exemplo, em alguns casos, um método aqui descrito compreende ainda (e2) detectando um segundo sinal de fotoluminescência em uma segunda localização dentro do ambiente, o segundo sinal de fotoluminescência compreendendo pelo menos um de um segundo sinal de fluorescência de ultrassom emitido pelo primeiro fluoróforo e um segundo sinal de fundo, (f2) correlacionando o segundo sinal de fotoluminescência com o primeiro sinal de referência para gerar um coeficiente de correlação para a segunda localização, e (g2) multiplicando o segundo sinal de fotoluminescência pelo coeficiente de correlação para a segunda localização para gerar um segundo sinal de fotoluminescência modificado para a segunda localização.

[0055] Da mesma forma, o mesmo processo de etapas (e) - (g) ou (e2) - (g2) pode ser repetido para gerar um terceiro sinal de fotoluminescência modificado a partir de um terceiro sinal de fotoluminescência em uma terceira localização dentro do ambiente e um coeficiente de correlação para a terceira localização. Geralmente mais, os sinais de fotoluminescência modificados n podem ser gerados a partir dos sinais de fotoluminescência n nas localizações dentro do ambiente n e de coeficientes de correlação n para a localização n, em que n pode ser qualquer inteiro desejado, como um número inteiro entre 2 e 1000, entre 2 e 500, entre 2 e 100, entre 2 e 50, entre 2 e 30, ou entre 2 e 20. Em alguns casos, n pode ser superior a 1000. Além disso, as localizações n podem ser qualquer conjunto de localizações desejados dentro do ambiente, incluindo localizações que são contíguos ou não contíguos em uma ou mais direções dentro do ambiente. Além disso, uma localização dentro de um ambiente aqui descrito, em algumas modalidades, pode ser um voxel dentro do ambiente e/ou uma localização identificada por uma ou mais de uma coordenada x, uma coordenada y e uma coordenada z. Em alguns casos, por exemplo, um local é um voxel centrado em um valor de coordenada xy ou em um par ordenado (x, y) do ambiente ou um valor de coordenada xyz (x, y, z), como podem ser identificados para uma varredura raster das localizações dentro do ambiente. Desta maneira, pode ser obtido um plot ou perfil espacial da fluorescência de ultrassom emitida pelo primeiro fluoróforo dentro do ambiente. Adicionalmente, como descrito mais adiante, uma tal parcela pode ter um SNR melhorado, incluindo em comparação com um plot de outra forma similar gerado sem realizar as etapas de correlação e multiplicação descritas acima.

[0056] Assim, em algumas modalidades, um método de imagem descrita aqui ainda compreende (en) detectando sinais adicionais de fotoluminescência n a localizações adicionais n com o meio ambiente, os sinais adicionais de fotoluminescência n compreendendo a pelo menos um sinal adicional de fluorescência de ultrassom num n° emitido pelo primeiro fluoróforo e um sinal de fundamento adicional n°, (fn) correlacionado os sinais de fotoluminescência adicionais n o primeiro sinal de referência para gerar os ccoeficientes de correlação adicional n para as localizações adicionais n, e (gn) multiplicando os sinais adicionais de fotoluminescência n pelos coeficientes de correlação adicionais n para gerar os sinais de fotoluminescência modificados adicionais n para as localizações adicionais n, em que né um inteiro entre 1 e 1000. Além disso, esse método também pode compreender (h) combinar o primeiro sinal de fotoluminescência modificado para a primeira localização, o segundo sinal de fotoluminescência modificado para a segunda localização e os sinais fotoluminescentes modificados adicionais n para as localizações adicionais n para gerar um plot espacial de fluorescência de ultrassom emitida pelo primeiro fluoróforo dentro do ambiente.

[0057] Conforme descrito adicionalmente a seguir, gerar um plot espacial da fluorescência de ultrassom emitida por um fluoróforo comutável por ultrassom dentro de um ambiente de uma maneira aqui descrita, em algumas modalidades, pode melhorar o SNR do método, reduzindo a intensidade de qualquer fotoluminescência de fundo que possa ser presente, como a fluorescência de fundo emitida por uma espécie de fundo fluorescente. Deve ser entendido que uma espécie de "fundo", para fins de referência aqui, é uma espécie diferente de um fluoróforo com permutável por ultrassom presente no ambiente. Mais particularmente, uma espécie de fundo pode ser uma espécie que não é um analito de imagem do método. Em alguns casos, uma espécie de fundo pode compreender, consistir ou consistir essencialmente em tecido biológico presente num ambiente biológico formado, de modo que o sinal de fundo compreende, consiste, ou consiste essencialmente em autofluorescência de tecido.

[0058] Além disso, em alguns casos, um método aqui descrito pode incluir o uso simultâneo de mais de um fluoróforo comutável por ultrassom. Assim, um método aqui descrito, em alguns casos, pode permitir ou fornecer imagens de fluorescência de ultrassom multiplexadas, incluindo imagens de imagens multiplexadas usando uma pluralidade de diferentes fluoróforos comutáveis por ultrassom. Por exemplo, em algumas modalidades, um método aqui descrito compreende (a) disposição de um primeiro fluoróforo comutável por ultrassom e um segundo fluoróforo comutável por ultrassom em um ambiente, (b) exposição do ambiente a um feixe de ultrassom para criar uma região de ativação dentro do ambiente, (c) descartando o primeiro fluoróforo dentro da região de ativação para alternar o primeiro fluoróforo de um estado desligado para um estado ligado e/ou descartando o segundo fluoróforo dentro da região de ativação para alternar o segundo fluoróforo de um estado desligado para um estado ligado (d) expondo o ambiente a um feixe de radiação eletromagnética, excitando assim o primeiro fluoróforo e/ou o segundo fluoróforo, e (e) detectar um primeiro sinal de fotoluminescência em uma primeira localização dentro do ambiente. O primeiro sinal de fotoluminescência pode compreender pelo menos um de um primeiro sinal de fluorescência de ultrassom emitido pelo primeiro fluoróforo, um primeiro sinal de fluorescência emitido pelo segundo fluoróforo e um primeiro sinal de fundo. Além disso, o método pode compreender ainda (f) correlação do primeiro sinal de fotoluminescência com um primeiro sinal de referência para gerar um primeiro coeficiente de correlação para a primeira localização e (g) multiplicação do primeiro sinal de fotoluminescência pelo primeiro coeficiente de correlação para a primeira localização para gerar um primeiro sinal de fotoluminescência modificado para o primeiro local.

[0059] Além disso, em tal método, a detecção, correlação e outras etapas de processamento de sinal (e) - (g) podem ser realizadas da mesma maneira e/ou repetidas como aqui descritas para modalidades usando apenas um fluoróforo ou população fluorada com ultrassom de fluoróforos intercambiáveis por ultrassom. Por exemplo, em alguns casos, um coeficiente de correlação é determinado da maneira aqui descrita para um fluoróforocomutável por ultrassom. Além disso, em algumas modalidades, um método descrito aqui ainda compreende (en) detectar sinais de fotoluminescência adicionais n nas localizações adicionais n dentro do ambiente, em que os sinais de fotoluminescência adicionais n compreendendo pelo menos um dentre um sinal de fluorescência de ultrassom adicional n emitido pelo fluoróforo e um sinal de fluorescência de ultrassom adicional nth emitido pelo segundo fluoróforo, e um sinal de fundo adicional nth. Um tal método pode também compreender a etapa de (fn) correlacionando os sinais de fotoluminescência adicionais n com o primeiro sinal de referência para gerar n primeiros coeficientes de correlação adicionais para a localização adicionais n e (gn) multiplicando os sinais adicionais de fotoluminescência n pelos primeiros coeficientes de correlação adicionais n para gerar sinais de fotoluminescência modificados adicionais n para as localizações adicionais n, em que né um número inteiro entre 1 e 1000.

[0060] Assim, como descrito acima para o usando um fluoróforo comutável por ultrassom, um método aqui descrito pode ser usado para gerar um perfil espacial ou plot de fluorescência de ultrassom emitido por um fluoróforo comutável por ultrassom presente no meio ambiente. Além disso, deve ser entendido que o fluoróforo associado a um plot espacial específico pode ser determinado pela escolha do sinal de referência. Por exemplo, em alguns casos, o primeiro sinal de referência corresponde ao primeiro sinal de fluorescência de ultrassom do primeiro fluoróforo. Em tais casos, um método aqui descrito pode ainda compreender (h) combinar o primeiro sinal de fotoluminescência modificado para a primeira localização e os sinais fotoluminescentes modificados adicionais n para as localizações adicionais n para gerar um plot espacial da fluorescência de ultrassom emitida pelo primeiro fluoróforo dentro do ambiente. Além disso, também é possível gerar um plot espacial da fluorescência de ultrassom emitida pelo segundo fluoróforo dentro do ambiente. Para gerar tal plot, o sinal de referência pode ser escolhido para corresponder ao primeiro sinal de fluorescência de ultrassom do segundo fluoróforo, em vez do primeiro fluoróforo.

[0061] Além disso, em algumas modalidades aqui descritas, uma pluralidade de sinais de referência diferentes pode ser utilizada para correlacionar um sinal de fotoluminescência aqui descrito, incluindo de forma sequencial. Por exemplo, em alguns casos, um método aqui descrito pode ainda compreender (f2) correlacionando o primeiro sinal de fotoluminescência com um segundo sinal de referência para gerar um segundo coeficiente de correlação para a primeira localização, e (g2) multiplicando o primeiro sinal de fotoluminescência pelo segundo coeficiente de correlação para a primeira localização para gerar um segundo sinal de fotoluminescência modificado para a primeira localização. Em alguns casos, o primeiro sinal de referência corresponde ao primeiro sinal de fluorescência de ultrassom do primeiro fluoróforo e o segundo sinal de referência corresponde ao primeiro sinal de fluorescência de ultrassom do segundo fluoróforo.

[0062] Não pretendendo ser ligado pela teoria, acredita-se que tais sinais de referência diferentes podem ser usados para obter imagens de imagem multiplexadas devido aos perfis de emissão de fotoluminescência únicos de fluoróforos com permutadores de ultrassom, incluindo fluoróforos comutáveis por ultrassom aqui descritos. Esses fluoróforos intercambiáveis por ultrassom podem ter sinais únicos de fluorescência de ultrassom. Além disso, os sinais de fluorescência de ultrassom podem ser únicos em um domínio de comprimento de onda e/ou num domínio temporal ou temporário. Assim, em algumas modalidades aqui descritas, um primeiro fluoróforo comutável por ultrassom e um segundo fluoróforo comutável por ultrassom podem ter diferentes perfis de emissão de fluorescência de ultrassom. Por exemplo, em alguns casos, os comprimentos de onda de pico dos perfis diferem, de modo que os fluoróforos emitem cores diferentes de radiação eletromagnética. Em alguns casos, os fluoróforos têm diferentes perfis de decadência da intensidade temporal. Mais geralmente, em algumas modalidades de um método aqui descrito, os perfis de emissão de fluorescência de ultrassom do primeiro e segundo fluoróforos são matematicamente ortogonais ou não correlacionados ou fracamente correlacionados. Em tais casos, quando um sinal que consiste essencialmente na emissão de fluorescência de ultrassom de um fluoróforo é correlacionado com um sinal de referência com base na emissão de fluorescência de ultrassom do outro fluoróforo, será obtido um pequeno coeficiente de correlação. Por exemplo, em alguns casos, a correlação de um primeiro sinal de fluorescência de ultrassom de um primeiro fluoróforo usando um sinal de referência correspondente ao sinal de fluorescência de ultrassom de um segundo fluoróforo resultará em um pequeno coeficiente de correlação, como um coeficiente de correlação inferior a 0,3, e vice- versa.

[0063] Além disso, deve ser entendido que as etapas anteriores (e)- (g) de detecção e processamento de um sinal de fotoluminescência em uma primeira localização dentro do ambiente podem ser repetidas qualquer número de vezes desejado para gerar uma pluralidade de sinais de fotoluminescência modificados para uma pluralidade de localizações dentro do meio ambiente. Por exemplo, em algumas modalidades, um método aqui descrito que utiliza uma pluralidade de fluoróforos com permutadores de ultrassons pode ainda compreender (en) detectando sinais de fotoluminescência adicionais n nas localizações adicionais n dentro do ambiente, em que os sinais de fotoluminescência adicionais n compreendendo pelo menos um dentre um sinal de fluorescência de ultrassom adicional n° emitido pelo primeiro fluoróforo e um sinal de fluorescência de ultrassom adicional n° emitido pelo segundo fluoróforo, e um sinal de fundo adicional n°. O método também pode compreender (f1n) correlacionando os sinais adicionais de fotoluminescência n com o primeiro sinal de referência para gerar os primeiros coeficientes de correlação adicionais n para as localizações adicionais n, (g1n) multiplicando os sinais adicionais de fotoluminescência n pelos primeiros coeficientes de correlação adicionais n para as localizações adicionais n para gerar os primeiros sinais de fotoluminescência modificados n para as localizações adicionais n, (f2n) correlacionando os sinais adicionais de fotoluminescência n com o segundo sinal de referência para gerar n segundo coeficiente de correlação adicional para as localizações adicionais n, e (g2n) multiplicando os sinais adicionais de fotoluminescência n pelos segundos coeficientes de correlação adicional n para as localizações adicionais n para gerar sinais adicionais de fotoluminescência modificados segundo n para as localizações adicionais n, em que né um número inteiro descrito acima, como um número inteiro entre 1 e 1000.

[0064] Além disso, como descrito acima para a utilização de um único fluoróforo comutável por ultrassom, um método aqui descrito pode ser usado para gerar um plot espacial de emissão de fluorescência de ultrassom para mais de um fluoróforo. Em tais casos, um método aqui descrito pode ainda compreender (h1) combinando o primeiro sinal de fotoluminescência modificado para uma primeira localização com os primeiros sinais fotoluminescentes modificados adicionais n para as localizações adicionais n para gerar um plot espacial da fluorescência de ultrassom emitida pelo primeiro fluoróforo dentro do ambiente. Além disso, esse método também pode compreender (h2) combinando um segundo sinal de fotoluminescência modificado para a primeira localização com os sinais adicionais fotoluminescentes modificados adicionais n para as localizações adicionais n para gerar um plot espacial da fluorescência de ultrassom emitida pelo segundo fluoróforo dentro do ambiente.

[0065] Além disso, deve ser entendido que o mesmo processo descrito acima para dois fluoróforos comutáveis por ultrassons diferentes também pode ser usado para imagens multiplexadas utilizando mais de dois fluoróforos diferentes. Em geral, qualquer número desejado de diferentes fluoróforos comutáveis por ultrassom pode ser usado. Por exemplo, em algumas modalidades, podem ser utilizados três, quatro ou cinco diferentes fluoróforos comutáveis por ultrassons. Além disso, em tais casos, um método aqui descrito pode compreender a realização de três, quatro ou cinco etapas de correlação e multiplicação (tais como as descritas nas etapas (f1n), (g1n), (f2n), e (g2n)) com três, quatro ou cinco sinais de referência correspondentes aos três, quatro ou cinco fluoróforos, respectivamente. Em geral, até n podem ser utilizados diferentes fluoróforos comutáveis por ultrassons, em que n pode ser 5, 10, 20, 50 ou 100.

[0066] Os métodos da imagem de USF multiplexada descrita acima podem ser particularmente úteis quando nenhuma localização dentro do ambiente de imagem contém mais do que uma das m de diferentes fluoróforos intercambiáveis por ultrassom. No entanto, também é possível, em alguns casos, gerar uma pluralidade de plots espaciais de fluorescência de ultrassom emitidos por uma pluralidade de diferentes fluoróforos permutáveis por ultrassons, mesmo quando os diferentes fluoróforos estão presentes ou possivelmente presentes em um voxel comum dentro do ambiente. Por exemplo, em algumas modalidades, um método aqui descrito compreende (a) disposição de um primeiro fluoróforo comutável por ultrassom e um segundo fluoróforo comutável por ultrassom em um ambiente, (b) exposição do ambiente a um feixe de ultrassom para criar uma região de ativação dentro do ambiente, (c) descartando o primeiro fluoróforo dentro da região de ativação para alternar o primeiro fluoróforo de um estado desligado para um estado ligado e/ou descartando o segundo fluoróforo dentro da região de ativação para alternar o segundo fluoróforo de um estado desligado para um estado ligado e (d) expondo o ambiente a um feixe de radiação eletromagnética, excitando assim o primeiro fluoróforo e/ou o segundo fluoróforo. O método pode ainda compreender (e) detectar um primeiro sinal de fotoluminescência numa primeira localização dentro do ambiente, em que o primeiro sinal de fotoluminescência compreendendo pelo menos um dentre um primeiro sinal de fluorescência de ultrassom emitido pelo primeiro fluoróforo e um primeiro sinal de fluorescência de ultrassom emitido pelo segundo fluoróforo. Além disso, em alguns casos, um método aqui descrito também compreende (f) decomposição ortogonal do primeiro sinal de fotoluminescência em um primeiro vetor de base correspondente a um sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do primeiro fluoróforo e um segundo vetor de base correspondente a um sinal de ultrassom normalizado do segundo fluoróforo. Adicionalmente, em alguns casos, um método aqui descrito compreende ainda (g1) determinando um coeficiente de vetor de base a para o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do primeiro fluoróforo na primeira localização e (g2) determinando um coeficiente de vetor de base b para o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do segundo fluoróforo na primeira localização. Além disso, o método pode compreender (h1) multiplicando o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do primeiro fluoróforo pelo coeficiente a para gerar um sinal de fluorescência de ultrassom separado do primeiro fluoróforo na primeira localização, e (h2) multiplicando o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do segundo fluoróforo pelo coeficiente b para gerar um sinal de fluorescência de ultrassom separado do segundo fluoróforo na primeira localização. Um sinal de fluorescência de ultrassom "separado", para fins de referência aqui, pode se referir a um sinal de fluorescência de ultrassom que foi removido, dissociado ou desambiguado de um sinal mais complexo detectado por uma experiência de imagem de USF, tal como um sinal de fotoluminescência detectado descrito aqui que pode incluir uma combinação de sinais, incluindo uma combinação de diferentes sinais de fluorescência de ultrassom. Por conseguinte, a realização de um método de uma maneira aqui descrita pode permitir que os sinais de mais de um fluoróforo dentro de um ambiente de imagem sejam distinguidos uns dos outros, mesmo que os fluoróforos estejam presentes dentro da mesma localização geral dentro do ambiente, como dentro do mesmo voxel.

[0067] Além disso, o processo anterior das etapas (e)-(h) pode ser repetido qualquer número desejado de vezes para gerar sinais de fluorescência de ultrassom separados do primeiro e/ou segundo fluoróforos em qualquer número desejado de localizações adicionais dentro do meio ambiente. Além disso, em alguns casos, um método descrito aqui ainda compreende (en) detectando sinais de fotoluminescência adicionais n em localizações adicionais n dentro do ambiente, em que os sinais de fotoluminescência adicionais n compreendendo pelo menos um dentre um sinal de fluorescência de ultrassom adicional n° emitido pelo primeiro fluoróforo e um sinal de fluorescência de ultrassom adicional n° emitido pelo segundo fluoróforo. Tal método também pode compreender (fn) decomposição ortogonal sinais adicionais de fotoluminescência n nos vetores de primeira base adicionais n correspondentes a um sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do primeiro fluoróforo e vetores de segunda base adicionais n correspondentes a um sinal de ultrassonografia normalizado do segundo fluoróforo. Além disso, o método pode ainda incluir (g1n) determinando Coeficientes vetoriais base adicionais an n para o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do primeiro fluoróforo nas localizações adicionais n, (g2n) determinando coeficientes vetoriais base adicionais bn n para o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do segundo fluoróforo nas localizações adicionais n, (h1n) multiplicando o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do primeiro fluoróforo pelos coeficientes adicionais an n para gerar sinais adicionais de fluorescência de ultrassom separados do primeiro fluoróforo nas localizações adicionais n, e (h2n) multiplicando o sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do segundo fluoróforo pelos coeficientes adicionais bn n para gerar sinais separados de fluorescência de ultrassom separados n do segundo fluoróforo nas localizações adicionais n. Como descrito acima, n pode ser qualquer inteiro desejado, como um número inteiro entre 1 e 1000.

[0068] Além disso, como descrito acima, também é possível gerar parcelas espaciais separadas de fluorescência de ultrassom emitidas pelo primeiro e segundo fluoróforos dentro do ambiente. Por exemplo, em algumas modalidades, um método aqui descrito compreende ainda (i1) combinando o sinal de fluorescência de ultrassom separado do primeiro fluoróforo na primeira localização com os sinais adicionais de fluorescência de ultrassomn separados do primeiro fluoróforo nas localizações adicionais n para gerar um plot espacial da fluorescência de ultrassom emitida pelo primeiro fluoróforo no ambiente e (i2) combinando o sinal de fluorescência de ultrassom separado do segundo fluoróforo na primeira localização com os sinais adicionais de fluorescência de ultrassom n separados do segundo fluoróforo nas localidades adicionais n para gerar um plot espacial da fluorescência de ultrassom emitida pelo segundo fluoróforo dentro do ambiente.

[0069] Além disso, uma vez separados sinais de fluorescência de ultrassom do primeiro e segundo fluoróforos são obtidos para uma ou mais localizações no ambiente, é possível, se desejado, melhorar o SNR desses sinais de uma maneira descrita acima. Por exemplo, em alguns casos, um método aqui descrito compreende ainda (j1) correlacionando o sinal de fluorescência de ultrassom separado do primeiro fluoróforo com um primeiro sinal de referência para gerar um primeiro coeficiente de correlação para o primeiro sinal de referência para a primeira localização (k1) multiplicando o sinal de fluorescência de ultrassom separado do primeiro fluoróforo pelo primeiro coeficiente de correlação para o primeiro sinal de referência para gerar um primeiro sinal de fluorescência de ultrassom separado modificado do primeiro fluoróforo para a primeira localização, (j2) correlacionando o sinal de fluorescência de ultrassom separado do segundo fluoróforo com um segundo sinal de referência para gerar um primeiro coeficiente de correlação para o segundo sinal de referência para a primeira localização e (k2) multiplicando o sinal de fluorescência de ultrassom separado do segundo fluoróforo pelo primeiro coeficiente de correlação para o segundo sinal de referência para gerar um primeiro sinal de fluorescência de ultrassom separado modificado do segundo fluoróforo para a primeira localização. Além disso, em tais modalidades, o primeiro sinal de referência pode corresponder ao primeiro sinal de fluorescência de ultrassom do primeiro fluoróforo e o segundo sinal de referência pode corresponder ao primeiro sinal de fluorescência de ultrassom do segundo fluoróforo.

[0070] Além disso, deve ser entendido que tal correlação e modificação de sinais de fluorescência de ultrassom separados podem ser realizadas para qualquer número desejado de localizações dentro de um ambiente de imagem. Por exemplo, em algumas modalidades, um método aqui descrito pode compreender (j1n) correlacionando sinais separados de fluorescência de ultrassom separados n do primeiro fluoróforo com um primeiro sinal de referência para gerar coeficientes de correlação adicionais n para o primeiro sinal de referência para as localizações adicionais n, (k1n) multiplicando os sinais separados de fluorescência de ultrassom separados n do primeiro fluoróforo pelos coeficientes de correlação adicionais n para o primeiro sinal de referência para gerar sinais de fluorescência de ultrassom separados modificados n do primeiro fluoróforo para as localizações adicionais n, (j2n) correlacioando sinais separados de fluorescência de ultrassom separados n do segundo fluoróforo com um segundo sinal de referência para gerar coeficientes de correlação adicionais n para segundo sinal de referência para as localizações adicionais n, e (k2n) multiplicando os sinais separados de fluorescência de ultrassom separados n do segundo fluoróforo pelos coeficientes de correlação adicionais n para o segundo sinal de referência para gerar sinais de fluorescência de ultrassom separados modificados adicionais n do segundo fluoróforo para as localizações adicionais n, em que o primeiro sinal de referência corresponde ao primeiro sinal de fluorescência de ultrassom do primeiro fluoróforo e o segundo sinal de referência corresponde ao primeiro sinal de fluorescência de ultrassom do segundo fluoróforo.

[0071] Além disso, se desejado, tais sinais de fluorescência de ultrassom separados modificados para uma pluralidade de localizações podem ser usados para gerar um plot espacial de fluorescência de ultrassom emitida por um fluoróforo no ambiente, como descrito nas etapas (i1) ou (i2) acima. Além disso, deve ser entendido que um sinal de fluorescência de ultrassom "modificado" pode se referir a um sinal de fluorescência de ultrassom que foi modificado através de uma ou mais etapas de processamento de sinal, tais como uma ou mais etapas de multiplicação aqui descritas.

[0072] Além disso, deve ser entendido que o mesmo processo descrito acima para dois fluoróforos comutáveis por ultrassons diferentes também pode ser usado para imagens multiplexadas utilizando mais de dois fluoróforos diferentes. Em geral, qualquer número desejado de diferentes fluoróforos comutáveis por ultrassom pode ser usado. Por exemplo, em algumas modalidades, podem ser utilizados três, quatro ou cinco diferentes fluoróforos comutáveis por ultrassons. Além disso, em tais casos, um método aqui descrito pode compreender a realização de três, quatro ou cinco etapas de correlação e multiplicação (tais como as descritas nas etapas (f1n), (g1n), (f2n), e (g2n)) com três, quatro ou cinco sinais de referência correspondentes aos três, quatro ou cinco fluoróforos, respectivamente. Em geral, até m podem ser utilizados diferentes fluoróforos comutáveis por ultrassons, em que m pode ser 5, 10, 20, 50 ou 100. No entanto, como aqui descrito mais adiante, para essa imagem multiplexada dentro de um único voxel, deve ser entendido que é preferido para os perfis de emissão de fluorescência de ultrassom m dos diferentes fluoróforos intercambiáveis por ultrassom m para serem matematicamente ortogonais, não correlacionados ou fracamente correlacionados.

[0073] Passando agora a etapas específicas de métodos, os métodos de imagem aqui descritos compreendem a disposição de um fluoróforo comutável por ultrassom ou uma população de fluoróforos comutáveis por ultrassom em um ambiente. Qualquer ambiente que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção pode ser utilizado. Em algumas modalidades, o meio ambiente é um meio biológico. Um ambiente de um método aqui descrito também pode ser um ambiente não biológico. Em alguns casos, por exemplo, um ambiente biológico é um ambiente in vivo, como um tecido, órgão, vaso sanguíneo ou outra parte de um organismo vivo. Em algumas modalidades, o ambiente biológico compreende uma vasculatura tumoral ou tumoral. Em outros casos, um ambiente biológico compreende um ambiente in vitro, como uma cultura de tecidos. O ambiente biológico de um método aqui descrito também pode compreender ou ser substituído por um material fantasma biológico ou material fantasma imitador de tecido, tal como um gel agar, silicone, álcool polivinílico (PVA), gel de poliacrilamida (PAA) ou uma dispersão de um óleo em gelatina. Outros materiais fantasmas também podem ser usados.

[0074] Além disso, em algumas modalidades, um ambiente biológico compreende tecido profundo. O tecido "profundo", para fins de referência aqui, compreende tecido (ou, no caso de um material fantasma, uma região interior do material fantasma) que está localizado pelo menos cerca de 1 cm abaixo da superfície externa do organismo, cultura de tecidos, ou outra estrutura maior associada ao ambiente biológico (como, no caso de um material fantasma, a superfície externa do material fantasma). Em algumas modalidades, por exemplo, o tecido profundo está localizado entre cerca de 1 cm e cerca de 10 cm ou entre cerca de 1 cm e cerca de 5 cm abaixo de uma superfície externa. Em alguns casos, o tecido profundo está localizado a mais de 10 cm abaixo de uma superfície externa. Além disso, uma superfície externa, em algumas modalidades, compreende a superfície da pele de um organismo.

[0075] Além disso, qualquer fluoróforo comutável por ultrassom ou combinação de diferentes fluoróforos comutáveis por ultrassons que não sejam inconsistentes com os objetivos da presente invenção pode ser usado. Um fluoróforo "comutável por ultrassom", para fins de referência aqui, compreende um fluoróforo operável para alternar entre um estado ligado e um estado desligado em resposta à exposição a um feixe de ultrassom. O feixe de ultrassom pode ser direta ou indiretamente responsável pela resposta de comutação do fluoróforo. Por exemplo, em alguns casos, o feixe de ultrassons interage diretamente com o fluoróforo, resultando em um interruptor entre os estados de fluorescência do fluoróforo. Em outros casos, o feixe de ultrassons interage diretamente com o ambiente imediato ou o microambiente do fluoróforo e muda pelo menos uma propriedade do microambiente do fluoróforo. Nesses casos, o fluoróforo pode alternar entre estados de fluorescência e desativação em resposta à mudança ambiental induzida pelo feixe de ultrassom. Assim, o fluoróforo pode ser indiretamente comutável em resposta à exposição a um feixe de ultrassom.

[0076] O estado "ligado" de um fluoróforo, para fins de referência aqui, compreende (1) um estado em que a intensidade de fluorescência do fluoróforo é relativamente alta em comparação com o estado "desligado" do fluoróforo, no qual a intensidade de fluorescência é relativamente baixo; ou (2) um estado em que a vida útil da fluorescência do fluoróforo é relativamente longa em comparação com o estado "desligado" do fluoróforo, no qual a vida útil da fluorescência é relativamente curta. Além disso, em ambos os casos, os estados ligados e desligados definem substancialmente uma função de etapa na intensidade de fluorescência ou no perfil de vida útil quando plotada como uma função de um parâmetro crítico de comutação, como temperatura ou pressão negativa. Um fluoróforo que tenha uma vida útil mais longa num estado ligado do que um estado desligado pode ser particularmente adequado para utilização nos métodos aqui descritos, utilizando a detecção temporizada ou retardada de fótons emitidos a partir de fluoróforos, como a detecção temporizada na qual apenas esses fótons recebidos após um atraso relativamente longo após a excitação são contados pelo detector como parte do sinal USF. Em alguns casos, o estado de um fluoróforo exibe pelo menos cerca de 70 por cento, pelo menos cerca de 80 por cento, ou pelo menos cerca de 90 por cento da intensidade de fluorescência máxima teórica do fluoróforo, e o estado de desligamento do fluoróforo não exibe mais do que cerca de 50 por cento, não mais do que cerca de 30 por cento, não mais do que cerca de 10 por cento, ou não mais de cerca de 5 por cento da intensidade de fluorescência máxima teórica do fluoróforo.

[0077] A causa física da existência de um estado ligado contra um estado desligado pode variar. Por exemplo, em alguns casos, a intensidade de fluorescência ou o tempo de vida de fluorescência de um fluoróforo alteram as taxas para uma mudança conformacional ou química do fluoróforo em resposta a uma mudança nas condições ambientais, tais como exibidas por alguns polímeros termorresistentes, espécies químicas sensíveis ao pH, ou materiais sensíveis à pressão. Em alguns casos, a intensidade de fluorescência ou vida útil de fluorescência de um fluoróforo muda em resposta à extinção de fluorescência interna, em que tal extinção pode ser direta ou indiretamente induzida pela presença de ultrassom.

[0078] Por exemplo, em algumas modalidades, um fluoróforo aqui descrito compreende uma espécie doadora FRET e uma espécie aceitadora de FRET, e a distância entre as espécies doadoras FRET e as espécies aceitadoras FRET é alterada pela presença de um feixe de ultrassom. As espécies doadoras FRET podem ser uma primeira espécie fluorescente ou outro cromóforo, e as espécies aceitadoras FRET podem ser uma segunda espécie fluorescente ou outro cromóforo. Em tais casos, conforme entendido por um versado na técnica, a transferência de energia FRET entre as espécies doadoras e as espécies aceitadoras pode resultar na extinção da fluorescência das espécies doadoras. Assim, as espécies aceitadoras podem ser consideradas como uma espécie de extinção de fluorescência do fluoróforo. Qualquer par doador-aceitador não incompatível com os objetivos da presente invenção pode ser utilizado em fluoróforos à base de FRET aqui descritos. Por exemplo, em alguns casos, a espécie doadora compreende Alexa Fluor 546 e as espécies aceitadoras compreendem Alexa Fluor 647. Outras combinações de espécies aceitantes e espécies doadoras também são possíveis.

[0079] Em algumas modalidades, um fluoróforo aqui descrito compreende uma microbolha compreendendo uma ou mais espécies doadoras de FRET e uma ou mais espécies aceitadoras de FRET ligadas à superfície exterior da microbolha, em que a microbolha é operável para mudar de tamanho em resposta à presença de um feixe de ultrassom. A mudança de tamanho pode aumentar ou diminuir a distância entre as espécies doadoras FRET e as espécies aceitadoras FRET, reduzindo ou aumentando a eficiência da transferência de energia FRET. Como resultado, a extinção de fluorescência e a intensidade de fluorescência global da microbolha podem variar de acordo com o tamanho da microbolha.

[0080] Uma microbolha aqui descrita pode ter qualquer tamanho e ser formada de qualquer espécie química que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em alguns casos, uma microbolha tem um diâmetro entre cerca de 1 μm e cerca de 10 μm ou entre cerca de 1 μm e cerca de 5 μm. Outros tamanhos de microbolhas também podem ser usados. Além disso, em algumas modalidades, uma microbolha aqui descrita compreende um núcleo de gás rodeado por um invólucro formado a partir de um material polimérico, tal como um material polimérico orgânico. Em outros casos, o shell é formado a partir de um material lipídico. Em algumas modalidades, uma microbolha compreende um invólucro formado a partir de um ou mais de albumina, galactose, lipídio e hexafluoreto de enxofre. Além disso, o núcleo de gás de uma microbolha aqui descrita pode compreender um ou mais de ar, nitrogênio e um perfluorocarbono tal como octafluoropropano. Além disso, em alguns casos, uma microbolha aqui descrita é formada a partir de uma microbolha comercialmente disponível, como um SonoVueTM, OptisonTM, ImagentTM, DefiniçãoTM, ou TargestarTM microbolha. Uma espécie doadora e/ou aceitadora FRET aqui descrita pode ser anexada à superfície de uma tal microbolha de qualquer maneira que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em alguns casos, por exemplo, uma espécie doadora e/ou aceitadora é anexada à superfície exterior de uma microbolha comercialmente disponível usando um ou mais de um esquema de acoplamento carbodi-imida, maleimida ou biotina-estreptavidina.

[0081] Além disso, em algumas modalidades, um fluoróforo aqui descrito compreende um polímero termorresistente. Um polímero "termorreutível", para fins de referência aqui, compreende um polímero com uma propriedade física ou química que muda de uma maneira dependente da temperatura, em que a mudança é uma mudança descontínua ou binária. Por exemplo, em alguns casos, a conformação física ou a polaridade de um polímero termorresistente muda de uma maneira dependente da temperatura, e o polímero termorresistente exibe uma primeira conformação abaixo de uma temperatura limite e uma segunda conformação substancialmente diferente acima da temperatura limite. Em algumas modalidades, por exemplo, um polímero termorresistente exibe uma confirmação de bobina ou corrente expandida abaixo de uma temperatura limite e exibe uma conformação compacta ou globular acima da temperatura limite. Em alguns desses casos, a temperatura limite pode ser referida como a "temperatura de solução crítica mais baixa" (LCST) do polímero.

[0082] Qualquer polímero termoresponsável que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção pode ser utilizado. Em algumas modalidades, um polímero termorresistente compreende uma poli (N-isopropilacrilamida) ou um copolímero de N-isopropilacrilamida com uma ou mais de acrilamida, N-terc-butilacrilamida, ácido acrílico e alilamina. Noutros casos, um polímero termorresistente compreende uma poli (N- vinilcaprolacatam) (PVCL) ou um poloxâmero, tal como um polímero Pluronic. Outros polímeros termoresponsáveis também podem ser usados.

[0083] Adicionalmente, em alguns casos, um polímero termorresistente de um fluoróforo aqui descrito compreende uma ou mais frações fluorescentes ou é conjugado com uma ou mais espécies fluorescentes, tais como uma ou mais moléculas de corantes fluorescentes. O polímero termorresistente pode ser conjugado com as espécies fluorescentes de qualquer maneira que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção. Por exemplo, em alguns casos, um polímero termorresistente é acoplado a uma espécie fluorescente através de uma ou mais ligações covalentes tais como uma ou mais ligações éster ou uma ou mais ligações amida.

[0084] A FIG. 1 ilustra esquematicamente um processo de fluorescência com ultrassom que usa um fluoróforo termoresponsável de acordo com uma modalidade aqui descrita. Conforme ilustrado na FIG. 1, um polímero termoresponsável é conjugado com uma espécie fluorescente para fornecer um fluoróforo. O fluoróforo tem uma conformação de corrente e uma conformação globular descrita acima e a conformação depende da temperatura. Além disso, a transição de uma conformação para a outra resulta em uma mudança na intensidade de fluorescência ou vida útil das espécies fluorescentes. Conforme descrito adiante, a mudança na intensidade de fluorescência ou na vida útil pode ser devido a diferenças no microambiente das espécies fluorescentes quando o polímero está na conformação da cadeia em comparação com a conformação globular. Por exemplo, em alguns casos, a polaridade e/ou a viscosidade do ambiente polimérico experimentado pelo fluoróforo muda dependendo se o polímero está na conformação da corrente ou a conformação globular.

[0085] Além disso, em algumas modalidades, um fluoróforo aqui descrito compreende um material fluorescente disperso e/ou ligado à superfície de uma nanopartícula de polímero termorresistente. Além disso, as propriedades de fluorescência do material fluorescente podem ser dependentes de uma alteração da conformação, polaridade ou outra propriedade física ou química da nanopartícula de polímero. Além disso, a mudança de propriedade pode ser uma mudança dependente da temperatura. Desta forma, uma alteração na temperatura da nanopartícula de polímero termorresistente pode resultar em uma alteração na intensidade de fluorescência e/ou no tempo de vida do material fluorescente, incluindo uma mudança entre um estado ligado do material fluorescente e um estado desligado do material fluorescente.

[0086] Por exemplo, em algumas modalidades, uma nanopartícula de polímero termorresistente pode exibir uma polaridade dependente da temperatura, e o material fluorescente disperso na nanopartícula pode exibir uma intensidade de fluorescência e/ou tempo de vida dependente da polaridade. Assim, uma alteração na temperatura da nanopartícula pode resultar em uma alteração na intensidade de fluorescência e/ou no tempo de vida do fluoróforo.

[0087] Noutra modalidade exemplar, uma nanopartícula de polímero termorresistente pode ter um interior hidrofílico abaixo de uma temperatura limite e um interior hidrofóbico acima da temperatura limite. Assim, tal nanopartícula pode exibir um tamanho dependente da temperatura quando disperso num solvente polar ou não polar. Por exemplo, quando dispersos em água ou outro solvente polar abaixo da temperatura limite, a nanopartícula pode exibir um tamanho maior devido à presença de água no interior hidrofílico da nanopartícula. Da mesma forma, acima da temperatura limite, a nanopartícula pode exibir um tamanho menor devido à exclusão da água do interior agora hidrófobo da nanopartícula. Desta forma, um material fluorescente disperso na nanopartícula pode ter uma concentração dependente da temperatura, o que pode resultar em propriedades de fluorescência dependentes da temperatura do fluoróforo global. Este processo é ilustrado esquematicamente na FIG. 2.

[0088] Ainda noutra modalidade exemplificativa, um fluoróforo comutável por ultrassons é formado por incorporação de um material fluorescente tal como um corante fluorescente no interior de uma nanopartícula ou micela polimérica, de modo que a nanopartícula ou micela polimérica atua como uma nanocápsula para o material fluorescente. Além disso, a nanopartícula polimérica pode ser formada a partir de um polímero termorresistente, tal como um polímero termorresistente descrito acima. Exemplos não limitativos de polímeros adequados para formar nanocápsulas aqui descritas incluem Pluronic F127, Pluronic F98, poli (N- isopropilacrilamida) (PNIPAM) e copolímeros de PNIPAM com acrilamida (AAm) ou N-terc-butilacrilamida (TBAm). Além disso, em alguns casos, uma nanopartícula ou nanocápsula pode ser formada por copolimerização de um polímero termorresistente descrito acima com um polietileno glicol (PEG) e/ou por conjugação de um PEG como um grupo pendente para um polímero termorresistente. Esse fluoróforo, em alguns casos, pode ter um limite de comutação que é controlado pelo menos em parte pela inclusão de PEG, conforme descrito mais adiante.

[0089] Uma nanopartícula de polímero tal como uma nanopartícula de polímero termorresistente ou uma nanocápsula de polímero aqui descrita pode ter qualquer tamanho ou forma não inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em algumas modalidades, por exemplo, uma nanopartícula de polímero termorresistente é substancialmente esférica e tem um diâmetro entre cerca de 10 nm e cerca de 300 nm, entre cerca de 50 nm e cerca de 250 nm, entre cerca de 50 nm e cerca de 200 nm, ou entre cerca de 70 nm e cerca de 150 nm. Em alguns casos, uma nanocápsula de polímero é substancialmente esférica e tem um diâmetro inferior a cerca de 100 nm ou inferior a cerca de 50 nm. Em alguns casos, uma nanocápsula de polímero tem um tamanho entre cerca de 20 nm e cerca de 90 nm, entre cerca de 20 nm e cerca de 80 nm, ou entre cerca de 20 nm e cerca de 70 nm. Outros tamanhos e formas também são possíveis.

[0090] Além disso, qualquer material fluorescente não incompatível com os objetivos da presente invenção pode ser disperso e/ou ligado a uma nanopartícula de polímero termorresistente ou a outra nanopartícula de polímero para formar um fluoróforo aqui descrito. Em algumas modalidades, como aqui descrito, o material fluorescente exibe uma intensidade de fluorescência sensível à polaridade e/ou vida útil. Noutros casos, o material fluorescente exibe uma intensidade de fluorescência dependente da viscosidade, dependente da viscosidade e dependente da temperatura, e/ou tempo de vida dependente da temperatura.

[0091] Exemplos não limitativos de materiais fluorescentes adequados para utilização em algumas modalidades aqui descritas incluem corantes orgânicos tais como N, N-dimetil-4-benzofurazansulfonamida (DBD); 4- (2- Aminoetilamino) - 7- (N, N- dimetilsulfamoil) benzofurazan (DBD-ED); indocianina verde (ICG); um Dylight-700, como Dylite-700-2B; IR-820; Iodeto de 3,3'-dietiltiatricarbocianina (DTTCI); LS-277; LS-288; um cypate; um corante de rodamina tal como a rodamina 6G ou a rodamina B; ou uma cumarina. Em alguns casos, um material fluorescente compreende um azadipirrometeno. Além disso, em alguns casos, um material fluorescente compreende uma espécie inorgânica tal como um nanocristal semicondutor ou ponto quântico, incluindo um nanocristal semicondutor IIVI tal como ZnS ou CdSe ou um nanocristal semicondutor III-V tal como InP ou InAs. Em outros casos, um material fluorescente compreende uma espécie Lantanídea. Exemplos adicionais não limitantes de materiais fluorescentes adequados para utilização em um fluoróforo comutável por ultrassons aqui descritos incluem os materiais fluorescentes descritos em Amin et al., “Syntheses, Electrochemistry, and Photodynamics of Ferrocene-Azadipyrromethane Donor-Acceptor Dyads and Triads,” J. Phys. Chem. A 2011, 115, 9810-9819; Bandi et al., “A Broad-Band Capturing and Emitting Molecular Triad: Synthesis and Photochemistry,” Chem. Commun., 2013, 49, 2867-2869; Jokic et al., “Highly Photostable Near-Infrared Fluorescent pH Indicators and Sensors Based on BF2-Chelated Tetraarylazadipyrromethane Dyes,” Anal. Chem. 2012, 84, 6723-6730; Jiang et al., “A Selective Fluorescent Turn-On NIR Probe for Cysteine,” Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 1966-1968; and Kucukoz et al., “Synthesis, Optical Properties and Ultrafast Dynamics of Aza-boron-dipyrromethane Compounds Containing Methoxy and Hydroxy Groups and Two-Photon Absorption Cross-Section,” Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 247 (2012), 24-29; cujas integrações são aqui incorporadas por referência. Outros materiais fluorescentes também podem ser usados.

[0092] Um fluoróforo comutável por ultrassons aqui descrito pode ter qualquer perfil de emissão de fluorescência não inconsistente com os objetivos da presente invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, um fluoróforo exibe um perfil de emissão que inclui luz visível ou centrado na região visível do espectro eletromagnético, tal como entre 450 nm e 750 nm. Em alguns casos, um fluoróforo exibe um perfil de emissão incluindo luz infravermelha (IR) ou centrado na região IR do espectro eletromagnético. Por exemplo, em alguns casos, um fluoróforo aqui descrito exibe um perfil de emissão centrado no IR próximo (NIR, 750 nm-1.4 μm) de IR de onda curta (SWIR, 1.4-3 μm) IR de comprimento de onda média (MWIR, 3-8 μm), ou IR de comprimento de onda longa (LWIR, 8-15 μm). Além disso, em algumas modalidades, um fluoróforo aqui descrito tem um perfil de emissão sobreposto com um comprimento de onda em que a água e/ou o tecido biológico tem um mínimo de absorção, tal como um comprimento de onda entre cerca de 700 nm e cerca de 800 nm ou entre cerca de 1,25 um e cerca de 1,35 μm. Adicionalmente, em alguns casos, uma população de fluoróforos comutáveis por ultrassom aqui descritos compreende fluoróforos com diferentes perfis de emissão. Por exemplo, em alguns casos, um primeiro fluoróforo da população pode emitir no NIR e um segundo fluoróforo da população pode emitir na região visível do espectro eletromagnético. Além disso, em alguns casos, um primeiro fluoróforo e um segundo fluoróforo podem ter diferentes perfis de decaimento da intensidade temporal, conforme descrito mais adiante. Em algumas modalidades, os perfis de emissão de fluorescência de ultrassom de um primeiro fluoróforo e um segundo fluoróforo são matematicamente ortogonais ou não correlacionados. Desta forma, a imagem multiplexada pode ser alcançada.

[0093] Além disso, em alguns casos, um fluoróforo aqui descrito apresenta uma vida útil de fluorescência de pelo menos cerca de 1 ns, pelo menos cerca de 3 ns, ou pelo menos cerca de 10 ns. Em algumas modalidades, um fluoróforo aqui descrito exibe uma vida de fluorescência entre cerca de 1 ns e cerca de 15 ns, entre cerca de 1 ns e cerca de 10 ns, entre cerca de 1 ns e cerca de 4 ns, entre cerca de 3 ns e cerca de 7 ns, entre cerca de 3 ns e cerca de 5 ns, ou entre cerca de 10 ns e cerca de 15 ns.

[0094] Adicionalmente, em algumas modalidades, um fluoróforo comutável por ultrassons descrito aqui exibe uma ou mais características desejáveis relacionadas aos estados de ligação e desligamento do fluoróforo. Por exemplo, em alguns casos, um fluoróforo exibe uma relação alta sobre a intensidade de fluorescência (ILigado/IDesligado), uma relação alta sobre a vida útil da fluorescência (TLigado/ TDesligado), uma banda de transição afiada entre os estados ligado e desligado (TBW), e/ou um limite de comutação ajustável (S°), tal como uma temperatura de limite de comutação ajustável (T°) ou uma pressão limite de comutação ajustável (P°). Essas métricas podem ser descritas adicionalmente com referência à FIG. 3.

[0095] A FIG. 3 ilustra plots da intensidade de fluorescência e vida útil da fluorescência de um fluoróforo dependente da temperatura em função da temperatura. No entanto, deve ser entendido que os mesmos princípios e nomenclaturas podem ser aplicados de forma análoga para um fluoróforo que exibe fluorescência ou fluorescência dependente da pressão dependente de alguma outra variável aqui descrita. Em tal caso, o eixo de temperatura da FIG. 3 poderia ser substituído por um eixo de pressão ou um eixo correspondente a outra variável relacionada à troca de fluorescência sem alterar substancialmente a aparência da FIG. 3. Com referência a FIG. 3, T° refere-se à temperatura do limite de comutação. ILigado/IDesligado refere-se à proporção da intensidade de fluorescência média do fluoróforo numa gama de temperaturas acima da temperatura do limite até a intensidade de fluorescência média do fluoróforo numa gama de temperaturas abaixo da temperatura limite. Da mesma forma, TLigado/ TDesligado refere-se à proporção da vida de fluorescência média do fluoróforo em uma gama de temperaturas acima da temperatura de limite até a vida de fluorescência média do fluoróforo em uma gama de temperaturas abaixo da temperatura limite. Em algumas modalidades, as médias são tomadas ao longo de uma gama de temperaturas com uma magnitude que é cerca de 5 por cento a cerca de 100 por cento da magnitude do valor do limite de comutação, mas que se situam fora da banda de transição com TBW. TBW refere-se à gama de valores de temperatura (ou, analogamente, pressão ou outros valores variáveis) sobre os quais o fluoróforomuda do estado ligado para o estado desligado à maneira de uma função da etapa. Em outras palavras, TBW refere-se à largura da etapa entre os estados ligado e desligado. Quanto menor o TBW, mais o perfil de intensidade de fluorescência do fluoróforo se assemelha a uma função da etapa verdadeira com uma descontinuidade entre o estado ligado e o estado desligado. Na FIG. 3, o valor ILigado é tomado como a intensidade média em uma faixa de temperatura de cerca de 33°C a cerca de 48°C (um intervalo de cerca de 16° C, ou cerca de 62 por cento do valor T° de 26° C) e o valor IDesiigado é tomado como a intensidade média em uma gama de temperatura de cerca de 23° C a cerca de 25° C (um intervalo de cerca de 3° C, ou cerca de 12 por cento do valor T° de 26° C). Em geral, a gama de valores de temperatura utilizados para determinar a intensidade média de fluorescência nos estados Ligado e Desligado pode basear-se na gama de valores de temperatura de interesse para uma aplicação de imagem particular. Um fluoróforo comutável por ultrassom aqui descrito pode exibir qualquer um dos valores IUgado/lDesligado, valores TUflθdo/ TDesligado, TBW, e T° abaixo descritos na Tabela 1. Tabela 1.

[0096] Os métodos de imagem aqui descritos, em algumas modalidades, também compreendem a exposição de um ambiente como um ambiente biológico a um feixe pulsado de radiação eletromagnética, incluindo antes de expor o ambiente biológico a um feixe de ultrassom. O feixe pulsado de radiação eletromagnética pode ter uma duração de impulso de picosegundo, como uma duração de pulso não superior a 100 ps, em que a duração do impulso é definida como o FWHM da potência óptica do feixe pulsado ao longo do tempo. O feixe pulsado pode ter qualquer comprimento de onda e poder não inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em alguns casos, por exemplo, o comprimento de onda do feixe pulsado é selecionado para se sobrepor substancialmente com o perfil de absorção de uma ou mais espécies presentes no ambiente biológico, como descrito acima. Em algumas modalidades, o feixe pulsado tem um comprimento de onda visível ou um comprimento de onda NIR. Outros feixes pulsados também podem ser usados.

[0097] Os métodos de imagem aqui descritos também compreendem a exposição de um ambiente como um ambiente biológico a um ou mais feixes de ultrassom para criar uma região de ativação dentro do meio ambiente. O feixe de ultrassom pode ter qualquer frequência de ultrassom não inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em algumas modalidades, um feixe de ultrassons compreende uma onda de pressão de som oscilante com uma frequência superior a cerca de 20 kHz ou superior a cerca de 2 MHz. Em alguns casos, um feixe de ultrassom aqui descrito tem uma frequência de até 5 GHz ou até cerca de 3 GHz. Em algumas modalidades, um feixe de ultrassom tem uma frequência entre cerca de 20 kHz e cerca de 5 GHz, entre cerca de 50 kHz e cerca de 1 GHz, entre cerca de 500 kHz e cerca de 4 GHz, entre cerca de 1 MHz e cerca de 5 GHz, entre cerca de 2 MHz e cerca de 20 MHz, entre cerca de 2 MHz e cerca de 10 MHz, entre cerca de 5 MHz e cerca de 200 MHz, entre cerca de 5 MHz e cerca de 15 MHz, entre cerca de 200 MHz e cerca de 1 GHz, entre cerca de 500 MHz e cerca de 5 GHz, ou entre cerca de 1 GHz e cerca de 5 GHz.

[0098] Além disso, um feixe de ultrassom pode ter qualquer poder não inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em algumas modalidades, por exemplo, um feixe de ultrassom tem um poder entre cerca de 0,1 W/cm2 e cerca de 10 W/cm2, entre cerca de 0,1 W/cm2 e cerca de 5 W/cm2, entre cerca de 0,5 W/cm2 e cerca de 5 W/cm2, entre cerca de 1 W/cm2 e cerca de 10 W/cm2, ou entre cerca de 1 W/cm2 e cerca de 5 W/cm2. Em outros casos, um feixe de ultrassom tem um poder entre cerca de 100 W/cm2 e cerca de 5000 W/cm2, ou entre cerca de 100 W/cm2 e cerca de 3000 W/cm2. Em alguns casos, a utilização de um feixe de ultrassom com alta potência, como uma potência aqui descrita, pode resultar na geração de efeitos não lineares dentro da região de ativação. Além disso, em algumas modalidades, o tamanho efetivo da região de ativação pode ser reduzido desta maneira, levando a uma melhor resolução de imagem.

[0099] Um ambiente pode ser exposto a um feixe de ultrassom de qualquer maneira que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, um ambiente biológico é exposto a um feixe de ultrassom aqui descrito por apenas uma duração limitada. Em alguns casos, por exemplo, o feixe de ultrassom é fornecido ao ambiente por menos de cerca de 1 segundo ou menos de cerca de 500 ms. Em algumas modalidades, o feixe de ultrassom é fornecido ao ambiente por menos de cerca de 300 ms, inferior a cerca de 100 ms, inferior a cerca de 50 ms, ou inferior a cerca de 10 ms. Em alguns casos, o feixe de ultrassom é fornecido ao ambiente por cerca de 1 ms a cerca de 1 segundo, cerca de 1 ms a cerca de 500 ms, cerca de 1 ms a cerca de 300 ms, cerca de 1 ms a cerca de 100 ms, cerca de 1 ms a cerca de 50 ms, cerca de 1 ms a cerca de 10 ms, cerca de 10 ms a cerca de 300 ms, cerca de 10 ms a cerca de 100 ms, cerca de 10 ms a cerca de 50 ms, ou cerca de 50 ms a cerca de 100 ms. O uso de tempos de exposição curtos de um ambiente biológico para um feixe de ultrassom, em algumas modalidades, pode permitir o tempo de exibição de sinais de fluorescência, de modo que um sinal USF desejado possa ser temporariamente separado de um ou mais sinais de fluorescência indesejados ou não analitos, como um sinal de autofluorescência de tecido ou um sinal de um fluoróforo alternado aleatoriamente.

[0100] Além disso, o feixe de ultrassom pode ser um feixe de onda contínua ou um feixe pulsado ou modulado. A utilização de um feixe de ultrassom modulado ou pulsado, em algumas modalidades, pode melhorar ainda mais o SNR de um método aqui descrito, permitindo a detecção com frequência do sinal USF. Por exemplo, em alguns casos, um feixe de ultrassom pulsado ou modulado fornece uma exposição de ultrassom com uma frequência ou modulação específica. Como resultado, o sinal USF correspondente também pode exibir a mesma frequência ou modulação específica. Assim, em alguns desses casos, um amplificador de bloqueio é usado para aumentar a sensibilidade do detector à frequência ou modulação específica, aumentando assim a sensibilidade geral e SNR do método.

[0101] Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, um único feixe de ultrassom é direcionado ao ambiente usando um único transdutor de ultrassom, como um transdutor de ultrassom focalizado de alta intensidade (HIFU). Em outros casos, uma pluralidade de feixes de ultrassom é direcionada para o ambiente usando uma pluralidade de transdutores de ultrassom. Além disso, em alguns casos, um primeiro feixe de ultrassom é direcionado para o ambiente em um primeiro ângulo e/ou em uma primeira direção e um segundo feixe de ultrassom é direcionado para o ambiente em um segundo ângulo e/ou em uma segunda direção diferente de o primeiro ângulo e/ou direção. Em algumas modalidades, por exemplo, as primeiras e segundas direções são direções ortogonais ou substancialmente ortogonais, tais como direções separadas por 80 a 100 graus. Em outros casos, as instruções são separadas por menos de 80 graus ou mais de 100 graus. Além disso, se desejado, feixes de ultrassom adicionais também podem ser direcionados para o ambiente a partir de direções adicionais ou em ângulos adicionais. Nesses casos, as zonas focais dos feixes podem se sobrepor ou se cruzar entre si para formar uma região de ativação na interseção dos feixes. Desta forma, uma região de ativação pode ter um volume ou seção transversal menor do que a área focal ou seção transversal de um único feixe de ultrassom usados para gerar a região de ativação, melhorando assim a resolução da imagem. Em alguns casos, por exemplo, a região de ativação tem uma dimensão lateral e/ou uma dimensão axial inferior a cerca de 2 mm, inferior a 1,5 mm, ou inferior a cerca de 1 mm. Em algumas modalidades, a região de ativação tem uma dimensão lateral e/ou uma dimensão axial inferior a cerca de 700 μm ou inferior a cerca de 500 μm. Em algumas modalidades, a região de ativação tem uma dimensão lateral e/ou uma dimensão axial de cerca de 300 μm a cerca de 2 mm, cerca de 400 μm a cerca de 1,5 mm, cerca de 400 μm a cerca de 1 mm, cerca de 400 μm a cerca de 700 μm, ou cerca de 400 μm a cerca de 500 μm. Em alguns casos, as dimensões lateral e axial têm um tamanho aqui indicado, incluindo um tamanho abaixo de cerca de 1 mm ou abaixo de cerca de 700 μm. Além disso, em algumas modalidades, as dimensões lateral e axial da região de ativação são diferentes, proporcionando desse modo uma região de ativação relativamente anisotrópica. Alternativamente, em outros casos, as dimensões lateral e axial são substancialmente as mesmas, proporcionando assim uma região de ativação relativamente "quadrada" ou isotrópica.

[0102] Uma "região de ativação", para fins de referência aqui, compreende uma região do ambiente em que os fluoróforos comutáveis por ultrassom aqui descritos podem ser alternados de um estado desligado para um estado ligado. Por exemplo, em alguns casos, uma região de ativação compreende uma região de pressão negativa em comparação com outras porções do meio ambiente. Da mesma forma, em outros casos, uma região de ativação compreende uma região de alta temperatura. Conforme descrito adiante, a temperatura, pressão ou outra característica de uma região de ativação aqui descrita pode ser selecionada com base no limite de comutação de um fluoróforo disposto no ambiente biológico. Por exemplo, em alguns casos, um ou mais feixes de ultrassom são configurados para formar uma região de ativação com uma temperatura média ou uma temperatura máxima superior a cerca de 30° C, superior a cerca de 35° C, ou entre cerca de 30° C e cerca de 50° C. Em outras modalidades, uma região de ativação tem uma pressão negativa média ou uma pressão negativa máxima entre cerca de 10 kPa e cerca de 150 kPa ou entre cerca de 80 kPa e cerca de 120 kPa. Além disso, como aqui descrito mais adiante, o tamanho, a forma e/ou outras propriedades da região de ativação podem ser determinadas pelo número e/ou potência de um ou mais feixes de ultrassom usados para formar a região de ativação. Em alguns casos, por exemplo, o tamanho e a forma de uma região de ativação são definidos pela zona focal de um único feixe de ultrassom. Em outros casos, uma região de ativação é definida pela sobreposição das zonas focais de uma pluralidade de feixes de ultrassom.

[0103] Um fluoróforo aqui descrito pode ser disposto dentro de uma região de ativação de qualquer maneira que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em alguns casos, um fluoróforo entra ou está disposto dentro de uma região de ativação de um ambiente difundindo na região de ativação de uma área adjacente do meio ambiente. Em outras instâncias, uma região de ativação é criada dentro de uma localização específica dentro de um ambiente em que se sabe que um fluoróforo ou uma população de fluoróforos é provavelmente encontrada ou pode ser encontrada. Por exemplo, em algumas modalidades, um feixe de ultrassom aqui descrito é rastreado através de varredura através ou dentro de um ambiente, produzindo assim uma pluralidade de regiões de ativação em diferentes localizações dentro do ambiente de uma maneira sequencial.

[0104] Os métodos de imagem aqui descritos também compreendem a exposição de um ambiente a um feixe de radiação eletromagnética e/ou a excitação de pelo menos um fluoróforo em um estado ligado com um feixe de radiação eletromagnética. Um fluoróforo pode ser excitado com um feixe de radiação eletromagnética de qualquer maneira que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em algumas modalidades, por exemplo, um fluoróforo é excitado usando uma fonte de excitação a laser, como um laser de diodo. Em outros casos, um fluoróforo é excitado usando um ou mais diodos emissores de luz (LEDs) ou uma fonte de excitação de banda larga. Além disso, uma fonte de excitação aqui descrita pode proporcionar qualquer comprimento de onda de luz não inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em algumas modalidades, um fluoróforo aqui descrito é excitado com um feixe de radiação eletromagnética que compreende luz visível, luz NIR ou luz IR. Em outros casos, o feixe de radiação eletromagnética compreende luz ultravioleta (UV).

[0105] Os métodos aqui descritos também compreendem detectar um sinal de fotoluminescência ou outra luz emitida dentro de um ambiente ou dentro de uma localização específica dentro de um ambiente. Em algumas modalidades, por exemplo, um método compreende a detecção de luz emitida por pelo menos um fluoróforo comutável por ultrassom. A luz emitida pelo fluoróforo pode ser detectada de qualquer maneira que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em algumas modalidades, por exemplo, a detecção de luz emitida por pelo menos um fluoróforo em um estado de entrada compreende a detecção da luz de um modo fechado ou com entrada de frequência, incluindo uma maneira fechada no horário ou uma maneira fechada por frequência aqui descrita. Em alguns casos, a luz emitida por, pelo menos, um fluoróforo no estado ligado é detectada após um atraso de tempo que é maior do que o tempo de vida de fluorescência do fluoróforo no estado desligado ou maior do que a vida útil da fluorescência de outra espécie presente no ambiente biológico. Por exemplo, em algumas modalidades, a luz emitida por, pelo menos, um fluoróforo no estado ligado é detectada após um atraso de tempo que é maior do que o tempo de vida de autofluorescência de uma espécie não fluoróforo presente no ambiente biológico, como a vida de autofluorescência do tecido, que pode ser de até 4 ns ou até cerca de 5 ns. Além disso, qualquer detector não incompatível com os objetivos da presente invenção pode ser usado. Em algumas modalidades, por exemplo, um ou mais detectores de tubo fotomultiplicador (PMT) podem ser usados. Outras configurações são também possíveis.

[0106] De modo semelhante, a detecção de um sinal de fotoluminescência em uma ou mais localizações dentro de um ambiente pode ser realizada de qualquer maneira que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em alguns casos, por exemplo, uma pluralidade de sinais de fotoluminescência em uma pluralidade de localizações dentro de um ambiente é detectada por raster de varredura do ambiente. Esse raster de varredura pode incluir raster de varredura de um ou mais feixes de ultrassom através ou dentro do ambiente, de modo que o feixe de ultrassom gera sequencialmente uma série de regiões de ativação em localizações diferentes dentro do ambiente. Também é possível, em alguns casos, mover ou digitalizar um detector aqui descrito de localização para localização dentro do ambiente. Mover ou digitalizar um detector de tal forma pode aumentar a área de detecção do método. Noutros casos, um detector bidimensional, tal como um sensor ou câmara de imagem do dispositivo de acoplamento de carga (CCD), é usado para detectar sinais de fotoluminescência em uma pluralidade de localizações simultaneamente.

[0107] Os métodos de imagem aqui descritos, em algumas modalidades, também compreendem correlacionar um ou mais sinais de fotoluminescência detectados com um ou mais sinais de referência para gerar um ou mais coeficientes de correlação para uma ou mais localizações dentro de um ambiente formado por imagens. Tais métodos podem também compreender a multiplicação de um ou mais sinais de fotoluminescência detectados pelo ou pelos coeficientes de correlação para uma ou mais localizações para gerar um ou mais sinais de fotoluminescência modificados para uma ou mais localizações. As etapas anteriores de correlação e multiplicação podem ser realizadas de qualquer maneira não incompatível com os objetivos da presente invenção. Além disso, um sinal de "referência"de um método aqui descrito pode ser um sinal que tenha o mesmo perfil de emissão de fluorescência ou fluorescência que um fluoróforo disposto no ambiente formado. Assim, um sinal de "referência"pode ser usado como um sinal padrão contra o qual um sinal detectado é comparado, conforme descrito aqui. Além disso, deve ser entendido que um tal sinal de referência pode ser gerado ou medido sob as mesmas condições experimentais semelhantes ou substancialmente semelhantes, quando usado quando um ou mais sinais de fotoluminescência são detectados a partir do ambiente de imagem. Por exemplo, as seguintes condições experimentais podem ser mantidas constantes ou substancialmente constantes (dentro do erro experimental) para a geração ou medição de um sinal de referência e a detecção de um ou mais sinais de fotoluminescência: a maneira de expor o ambiente a um feixe de ultrassom (por exemplo, o número, o poder e a orientação dos feixes de ultrassom utilizados); a maneira de expor o ambiente a um feixe de radiação eletromagnética (por exemplo, a potência, o comprimento de onda e o tipo (onda pulsada ou contínua) da fonte de radiação utilizada); a maneira de detectar sinais de fotoluminescência (por exemplo, o tipo e a colocação do detector usado); e a natureza do meio ambiente (por exemplo, a profundidade da imagem e o tipo de tecido utilizado).

[0108] Em algumas modalidades aqui descritas, correlacionar um sinal de fotoluminescência com um sinal de referência compreende a comparação de um perfil de decaimento de intensidade temporal do sinal de fotoluminescência com um perfil de decaimento de intensidade temporal do sinal de referência. Tal comparação, em alguns casos, pode gerar um coeficiente de correlação que serve como uma métrica de quão próximo um sinal de fotoluminescência detectado corresponde ao sinal de referência. Não pretendendo estar ligado pela teoria, acredita-se que as assinaturas espectrais únicas de fluoróforos comutáveis por ultrassom no domínio do tempo podem permitir a geração de coeficientes de correlação especialmente úteis quando os perfis de decaimento da intensidade temporal do sinal de fotoluminescência e do sinal de referência são comparados, como descrito mais adiante. Em algumas modalidades, um coeficiente de correlação para uma localização dentro de um ambiente é gerado de acordo com a Equação (1):

em que pI, R é o coeficiente de correlação para a primeira localização, I (t) é o perfil de decaimento da intensidade temporal do primeiro sinal de fotoluminescência na primeira localização, R (t) é o perfil de decaimento da intensidade temporal do primeiro sinal de referência e N é o número do ponto de tempo em I (t) e R (t).

[0109] Além disso, em alguns casos, um coeficiente de correlação gerado de uma maneira aqui descrita é um coeficiente de correlação binário. Um coeficiente de correlação "binarizada", para fins de referência aqui, é um coeficiente de correlação ao qual é atribuído um valor com base em uma binarização de todos os possíveis coeficientes de correlação. Por exemplo, em alguns casos, o valor de um coeficiente de correlação pode primeiro ser determinado de acordo com a Equação (1) acima. Ao usar a Equação (1), todos os coeficientes de correlação podem teoricamente ter um valor entre -1 e +1. No entanto, para uma etapa de correlação aqui descrito, os valores negativos podem não ser fisicamente significativos. Portanto, se a Equação (1) fornecer um valor negativo de um coeficiente de correlação, o processo de binarização pode ser usado para forçar o coeficiente de correlação negativo a ter um valor de zero. Outros valores de coeficientes de correlação também podem ser "alterados" ou binarizados para fornecer um SNR melhorado. Assim, em alguns casos, como uma próxima etapa no processo de binarização, o valor "real" de um coeficiente de correlação específico pode ser usado para colocar o coeficiente de correlação específico em uma de uma pluralidade de "binário"de valores de coeficiente. Além disso, para fins de realização de uma etapa de multiplicação aqui descrito, tal como a etapa (g) ou (gn) acima, todos os coeficientes de correlação na mesma bandeja podem ser tratados como tendo o mesmo valor, como um valor fornecido por uma tabela de binarização usada para armazenar os coeficientes de correlação. Um exemplo não limitativo de uma tabela de binarização adequada para utilização em algumas modalidades aqui descritas é proporcionada abaixo na Tabela 2. No entanto, deve ser entendido que outras tabelas de binarização também podem ser usadas. Tabela 2.

[0110] Além disso, também deve ser entendido que uma etapa de correlação e/ou multiplicação aqui descrito pode ser realizado usando qualquer algoritmo de computador ou software ou outro hardware e/ou software não inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em alguns casos, por exemplo, um ou mais algoritmos MATLAB são usados.

[0111] Os métodos aqui descritos, em algumas modalidades, também compreendem a combinação de uma pluralidade de sinais de fotoluminescência modificados para uma pluralidade de localizações dentro de um ambiente para gerar uma parcela espacial de fluorescência de ultrassom emitida por um fluoróforo dentro do meio ambiente. Os sinais de fotoluminescência modificados podem ser combinados de qualquer maneira que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em alguns casos, por exemplo, os sinais de fotoluminescência modificados são combinados para fornecer um plot da intensidade de fluorescência em função da distância ao longo de um ou mais eixos. Os plots de intensidade de fluorescência como função da distância em uma dimensão são ilustrados, por exemplo, na FIG. 22. Em outras modalidades, os sinais de fotoluminescência modificados são combinados para proporcionar um plot da intensidade de fluorescência como uma função de duas dimensões ou três dimensões dentro do ambiente. Os sinais de fotoluminescência modificados também podem ser combinados de outras maneiras.

[0112] Além disso, como descrito acima, um plot espacial gerado de acordo com um método aqui descrito pode ter uma SNR melhorada, incluindo em comparação com um plot de outra forma similar gerado sem realizar as etapas de correlação e multiplicação aqui descritas. Por exemplo, em alguns casos, um plot espacial da fluorescência de ultrassom emitido por um fluoróforo dentro de um ambiente aqui descrito pode ter um SNR que seja pelo menos cerca de 50% maior, pelo menos cerca de 70% maior, pelo menos cerca de 100% maior, em pelo menos cerca de 150% maior, pelo menos cerca de 200% maior, pelo menos cerca de 250% maior, pelo menos cerca de 300% maior, pelo menos cerca de 400% maior, pelo menos cerca de 500% maior, pelo menos cerca de 600% maior, pelo menos cerca de 700% maior, pelo menos cerca de 800% maior, pelo menos cerca de 900% maior ou pelo menos cerca de 1000% maior do que o SNR de um plot espacial de fluorescência de ultrassom emitido pelo fluoróforo no ambiente (ou um ambiente similar) quando uma etapa de correlação não é realizado de uma maneira aqui descrita. Deve ser entendido que as porcentagens acima são determinadas dividindo a diferença nos dois valores SNR relevantes pelo valor SNR inferior e depois multiplicando por 100. Em alguns casos, o SNR obtido utilizando um método aqui descrito é cerca de 20-300% maior, cerca de 15-250% maior, cerca de 15-200% maior, cerca de 15-100% maior, cerca de 50-300% maior, cerca de 50 -250% maior, cerca de 50-200% maior, cerca de 50150% maior, cerca de 50-100% maior, cerca de 70-300% maior, cerca de 70-250% maior, cerca de 100-300% maior, cerca de 100- 250% maior, cerca de 100-200% maior, cerca de 150-300% maior, cerca de 150-250% maior, cerca de 200-300% maior, ou cerca de 200-250% superior ao SNR obtido por um método de outra forma similar que faz não inclui uma etapa de correlação aqui descrito. Além disso, em algumas modalidades, um plot espacial da fluorescência de ultrassom emitido por um fluoróforo dentro de um ambiente aqui descrito pode ter um SNR de pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 350, ou pelo menos cerca de 400. Em alguns casos, o SNR de um plot espacial gerado de uma maneira aqui descrito está entre cerca de 80 e cerca de 400, entre cerca de 100 e cerca de 350, entre cerca de 150 e cerca de 350, entre cerca de 200 e cerca de 350, entre cerca de 250 e cerca de 350, entre cerca de 300 e cerca de 400, ou entre cerca de 300 e cerca de 350. Exemplos não limitativos de plots espaciais proporcionados de uma maneira aqui descrita são ilustrados e descritos adicionalmente no Exemplo 10 abaixo.

[0113] É ainda de notar que o valor da SNR de um plot espacial aqui descrito pode ser determinado por qualquer maneira que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção. Em alguns casos, o SNR de um plot espacial é determinado da seguinte forma. Primeiro, usando o perfil de emissão de uma imagem USF normalizada, a intensidade do pico e o FWHM do perfil são determinados. O comprimento de onda de pico é então designado como o centro de uma faixa de sinal com uma largura de banda que é três vezes o valor do FWHM. Em seguida, todos os dados, fora desta faixa de sinal, são tratados como fundamento. O desvio padrão do fundamento é então calculado e tratado como o ruído do perfil de emissão. O SNR do perfil pode então ser calculado dividindo a intensidade do pico pelo ruído. Além disso, se desejado, o SNR para uma pluralidade de medições pode ser determinado e em média. O SNR médio pode então ser tomado como o SNR da imagem USF.

[0114] Além disso, os métodos aqui descritos, em alguns casos, compreendem a decomposição ortogonal de um ou mais sinais de fotoluminescência em um primeiro vetor de base correspondente a um sinal de fluorescência de ultrassom normalizado de um primeiro fluoróforo e um segundo vetor de base correspondente a um sinal de ultrassom normalizado de um segundo fluoróforo. Tais métodos podem também compreender a determinação de coeficientes de base do vetor para sinais de fluorescência de ultrassom normalizados de uma pluralidade de fluoróforos numa pluralidade de localizações dentro de um ambiente. Um sinal de fotoluminescência pode ser decomposto de qualquer maneira não incompatível com os objetivos da presente invenção. Por exemplo, em alguns casos, um sinal de fotoluminescência é decomposto em vetores de base usando um algoritmo de computador ou software ou outro hardware, como um algoritmo de ajuste de curva MATLAB. Da mesma forma, uma vez que o sinal de fotoluminescência é decomposto em vetores de base, os coeficientes dos vetores de base podem ser determinados usando qualquer algoritmo de computador ou software adequado, como um algoritmo MATLAB, conforme descrito mais adiante. Além disso, a multiplicação de um sinal de fluorescência de ultrassom normalizado de um fluoróforo pelo coeficiente apropriado para gerar um sinal de fluorescência de ultrassom separado do fluoróforo em uma localização específica dentro do ambiente pode ser realizada de qualquer maneira que não seja inconsistente com os objetivos da presente invenção. Por exemplo, em alguns casos, um algoritmo como um algoritmo MATLAB pode ser usado.

[0115] Os métodos aqui descritos, em alguns casos, também compreendem a combinação de sinais de fluorescência de ultrassom separados de um ou mais fluoróforos em uma pluralidade de localizações para gerar um plot espacial de fluorescência de ultrassom emitido por um ou mais fluoróforos dentro do ambiente. Os sinais de fluorescência de ultrassom separados podem ser combinados de qualquer maneira não incompatível com os objetivos da presente invenção. Em alguns casos, por exemplo, os sinais separados são combinados são combinados para fornecer um plot da intensidade de fluorescência em função da distância ao longo de um ou mais eixos. Em outras modalidades, sinais separados são combinados para proporcionar um plot da intensidade de fluorescência como uma função de duas dimensões ou três dimensões dentro do ambiente. A combinação de sinais de fluorescência de ultrassom separados de uma maneira aqui descrita pode assim proporcionar imagens de imagem multiplexadas de uma pluralidade de fluoróforos em uma, duas ou três dimensões dentro de um ambiente.

[0116] Conforme descrito acima, os métodos de imagem aqui descritos, em algumas modalidades, podem apresentar profundidade de penetração/proporções de resolução (DRRs) melhoradas. A "profundidade de penetração"de um método de imagem, para fins de referência aqui, é definida como a profundidade abaixo da superfície de um objeto fotografado em que a intensidade do feixe de ultrassom dentro do objeto cai para 1/e (cerca de 37 por cento) deste valor inicial na superfície. A "resolução"de um método, para fins de referência aqui, é a resolução microscópica (ou seja, o tamanho em que os objetos separados podem ser distinguidos), que é considerado igual ao FWHM da região de ativação em uma determinada dimensão. Em algumas modalidades, um método aqui descrito exibe uma DRR de pelo menos cerca de 100. Nos outros casos, um método aqui descrito exibe uma DRR de pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, ou pelo menos cerca de 400. Em algumas modalidades, um método aqui descrito apresenta uma DRR de até cerca de 500. Em alguns casos, um método aqui descrito exibe uma DRR entre cerca de 100 e cerca de 500, entre cerca de 100 e cerca de 400, entre cerca de 100 e cerca de 300, ou entre cerca de 200 e cerca de 500. Além disso, a profundidade de penetração de um método aqui descrito, em algumas modalidades, pode ser até 100 mm, até 50 mm, ou até 30 mm. Em alguns casos, a profundidade de penetração está entre cerca de 10 mm e cerca de 100 mm, entre cerca de 10 mm e cerca de 60 mm, entre cerca de 10 mm e cerca de 50 mm, entre cerca de 20 mm e cerca de 90 mm, ou entre cerca de 20 mm e cerca de 50 mm. Além disso, a resolução de um método aqui descrito, em algumas modalidades, é inferior a cerca de 100 μm, inferior a cerca de 70 μm, inferior a cerca de 50 μm, ou inferior a cerca de 30 μm. Em alguns casos, a resolução está entre cerca de 10 μm e cerca de 100 μm, entre cerca de 10 μm e cerca de 70 μm, entre cerca de 10 μm e cerca de 50 μm, entre cerca de 10 μm e cerca de 30 μm, entre cerca de 20 μm e cerca de 100 μm, entre cerca de 20 μm e cerca de 80 μm, entre cerca de 20 μm e cerca de 50 μm, ou entre cerca de 30 μm e cerca de 70 μm.

[0117] Deve ser entendido que um método de imagem aqui descrito pode incluir qualquer combinação de etapas aqui descritas e usar qualquer combinação de equipamentos e materiais aqui descritos não inconsistente com os objetivos da presente invenção. Por exemplo, em alguns casos, um método aqui descrito compreende a eliminação de um ou mais fluoróforos compreendendo um polímero termorresistente em tecido biológico profundo, formando uma região de ativação usando dois transdutores de HIFU ortogonais e detectando a emissão dos fluoróforos de uma maneira temporizada, fornecendo uma DRR maior do que cerca de 200. Além disso, em alguns casos, esse método compreende ainda gerar um plot espacial da emissão de fluorescência de ultrassom dos fluoróforos depois de gerar uma pluralidade de coeficientes de correlação para uma pluralidade de localizações dentro do ambiente, e/ou após a decomposição ortogonal de um ou mais sinais de fotoluminescência e subsequentemente gerando sinais separados de fluorescência de ultrassom para uma pluralidade de fluoróforos. Outras combinações e configurações também são possíveis.

[0118] Algumas modalidades aqui descritas são ainda ilustradas nos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLO 1 Fluoróforos de ultrassom comutáveis Geral.

[0119] Uma série de fluoróforos ou agentes de contraste permutáveis por ultrassom adequado para utilização em métodos de imagem de acordo com algumas modalidades aqui descritas foi preparado por encapsulação de um corante NIR sensível ao meio ambiente, indocianina verde (ICG), em nanopartículas de polímero termorresistentes (NPs). Os NPs podem ser dispostos em um ambiente aquoso, como um ambiente biológico aqui descrito. Quando a temperatura do ambiente está abaixo de uma temperatura limite (que pode ser referida como LCST dos NPs), os NPs são hidrofílicos e absorvem uma grande quantidade de água, com o resultado de que os NPs têm um diâmetro médio relativamente grande. Não pretendendo ficar ligado pela teoria, acredita-se que as moléculas de ICG fluorescem fracas em microambientes ricos em água, pois a água fornece um microambiente polar e não visível e, assim, aumenta a taxa de decaimento não radioativo das moléculas de ICG excitadas. Quando a temperatura aumenta acima da temperatura limite, os NPs se tornam hidrofóbicos, causando a expulsão de água dos NPs e uma redução correspondente no diâmetro NP médio. Novamente, não pretendendo ficar limitado pela teoria, acredita-se que as moléculas de ICG dispersas dentro dos NPs são assim expostas a um microambiente rico em polímero com uma polaridade relativamente baixa e alta viscosidade em comparação com o microambiente rico em água. Acredita-se que um microambiente de baixa polaridade e alta viscosidade pode suprimir a taxa de decaimento não radiativa das moléculas de ICG excitadas, resultando em um aumento na intensidade de fluorescência do ICG. Observou-se que esse comportamento de comutação de fluorescência de um estado desligado para um estado ligado foi reversível e repetível. Em particular, um transdutor de ultrassom focalizado de alta intensidade (HIFU) pode ser usado para alternar reversivelmente e repetidamente os fluoróforos entre os estados ligados e desligados alterando a temperatura na zona focal do transdutor acima e abaixo da LCST das NPs.

[0120] Os NPs foram formados a partir de polímeros termorresistentes de poli (N-isopropilacrilamida) (PNIPAM) ou seu copolímero com acrilamida (AAm) ou N-terc-butilacrilamida (TBAm). A FIG. 4 ilustra as estruturas de tais polímeros e ICG. Especificamente, foram sintetizados quatro tipos de NPs de polímero, incluindo (1) P(NIPAM- TBAm185: 15) encapsulados com ICG, (2) NPs PNIPAM encapsulados com ICG, (3) NPs encapsulados com ICG (NIPAM-AAm 90:10) NPs, e (4) NPs encapsulados ICG (NIPAM-AAm 86:14) NPs. As relações nas fórmulas anteriores referem-se à relação molar entre o monômero de NIPAM e o monômero de TBAm ou AAm usado para formar os NPs. A LCST destes NPs de polímero termorresistentes poderia ser alterada com base na quantidade de AAm e/ou TBAm copolimerizados com PNIPAM. Por exemplo, utilizando um monômero hidrofílico (tal como AAm) resultou num polímero com uma LCST mais elevada. Em contraste, o uso de um monômero hidrofóbico (como TBAm) diminuiu a LCST. Além disso, deve notar-se que o TBAm é mais hidrofóbico que o NIPAM, enquanto que AAm é mais hidrofílico que o NIPAM.

Materiais.

[0121] N-isopropilacrilamida (NIPAM), acrilamida (AAm), persulfato de amônio (APS), dodecilsulfato de sódio (SDS), N, N, N', N'-tetrametil etilenodiamina (TEMED), N, N'-metilenobisacrilamida (BIS), N-terc- butilacrilamida (TBAm), ascorbato de sódio e ICG foram adquiridos a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Todos os produtos químicos foram utilizados como recebidos sem purificação adicional.

Síntese.

[0122] Os PNIPAM NPs contendo ICG foram preparados da seguinte forma. Outros NPs foram preparados usando um protocolo similar, exceto com a adição de quantidades apropriadas de monômeros TBAm e/ou AAm. Além disso, também foi possível substituir parcial ou completamente TBAm e/ou AAm por um ou mais ácidos acrílicos (AAc) e alilamina (AH) para formar outros copolímeros de NIPAM, como P (NIPAM-AAc), P (TBAm- NIPAM-AAc), ou P(NIPAM-AH).

[0123] Em breve, para preparar PNIPAM NPs, NIPAM (monômero, 0,6822 g), BIS (reticulante, 0,0131 g) e SDS (surfactante, 0,0219 g) foram dissolvidos em 50 mL de água desionizada em um tubo Schlenk de 250 mL, seguido de purga com Nitrogênio durante 10 minutos. ICG (fluoróforo, 0,0034 g), APS (iniciador, 0,039 g) e TEMED (acelerador, 51 μL) foram então adicionados ao tubo. O tubo foi então colocado sob uma atmosfera de nitrogênio inerte por três ciclos de aplicação de vácuo em uma linha de Schlenk seguido de enchimento com nitrogênio. O conteúdo do balão foi então agitado à temperatura ambiente durante 4 horas. A reação foi interrompida expondo o conteúdo do balão ao ar. O produto foi dialisado contra água desionizada utilizando uma membrana de corte de peso molecular de 10 kDa durante 3 dias para remover surfactantes adicionais e materiais não reagidos. A composição do produto final foi confirmada com um espectrômetro de infravermelho de transformação de Fourier (FTIR) (Thermo Nicolet 6700, West Palm Beach, FL, EUA), de 4.000 a 600 cm-1.

[0124] O diâmetro dos NPs foi medido por dispersão de luz dinâmica (DLS) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). TEM também foi usado para determinar a morfologia dos NPs. Para medições de DLS, 200 μL do produto foram diluídos com 2,8 mL de água desionizada e depois analisados à temperatura ambiente (25°C) com um Nanotrac 150 (Microtrac, Inc., Nikkiso, San Diego, CA, EUA). Para as medições de TEM, as amostras foram preparadas por moldagem por gota de uma dispersão aquosa de NPs de produto (a cerca de 1 mg/mL) em uma grade de cobre revestida de carbono (FF200-Cu-50, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA), seguida por coloração com 0,2% de acetato de uranil. Os experimentos TEM foram realizados utilizando um JEOL 1200 EX TEM (JEOL, Peabody, MA, EUA). Os NPs tiveram tamanhos entre 70 nm e 150 nm, com base na dispersão de luz dinâmica (DLS) e na microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Em particular, quando medido por DLS, (1) PNIPAM NPs contendo ICG tinha um tamanho médio de 150 ± 25 nm; (2) P contendo ICG (NIPAM-TBAm 185: 15) NPs tinha um tamanho médio de 76 ± 4 nm; (3) P contendo ICG (NIPAM-AAm 86:14) NPs tinha um tamanho médio de 75 ± 25 nm; e (4) P contendo ICG (NIPAM-AAm 90:10) NPs tinham um tamanho médio de tamanho de 76 ± 2 nm. Os tamanhos medidos pela DLS foram um pouco maiores que os tamanhos medidos pelo TEM devido à presença de surfactante (SDS) e camadas de hidratação em torno dos NPs em solução aquosa. Por exemplo, o tamanho médio dos NPs da amostra (1) acima foi de aproximadamente 110 nm quando medido por TEM. Os NPs eram quase esféricos.

[0125] As curvas de comutação de fluorescência dos NPs de polímero são mostradas na FIG. 5. A intensidade de fluorescência é plotada em função da temperatura da amostra. As características de comutação acentuadas podem ser claramente vistas para os quatro NPs, com temperaturas de comutação (LCSTs ou ToS) de 28°C, 31°C, 37°C e 41°C. Além disso, a mudança foi observada várias vezes em uma única amostra. Por exemplo, a FIG. 6 ilustra dados de fluorescência para NPs com P (NIPAM-AAm 90:10) contendo ICG em 12 pontos de tempo diferentes (pontos de medição 1-12 no eixo dos x) ciclos entre a baixa temperatura (25°C, pontos de medição 1, 3, 5 7, 9 e 11) e alta temperatura (44°C, pontos de medição 2, 4, 6, 8, 10 e 12). Além disso, a relação ILigado/IDesligado atingiu 3,3, 2,9, 9,1 e 9,1, respectivamente, para amostras (1), (2), (3) e (4). Esses valores são pelo menos 1,6 a 5,1 vezes superiores aos de alguns outros agentes de contraste.

[0126] O sistema utilizado para medir as características de fluorescência dos fluoróforos aqui descritos é ilustrado esquematicamente naFIG. 7. Em geral, os pulsos de emissão de fluoróforos foram calculados em média 100 vezes e o valor de pico médio foi usado para representar a intensidade de fluorescência. Conforme ilustrado na FIG. 7, "Fex"refere-se a um filtro de excitação; "Fem" refere-se a um filtro de emissão; "L" refere-se a uma lente; "PMT" refere-se a um tubo fotomultiplicador; "BS" refere-se a um divisor de feixe; "PD" refere-se a um fotodiodo; "PDG" refere-se a um gerador de atraso de pulso; e "filtro ND" refere-se a um filtro de densidade natural.

EXEMPLO 2 Métodos de Imagem Usando Nanopartículas de Polímero Termorresistente Geral.

[0127] Os métodos de imagem de acordo com algumas modalidades aqui descritas foram realizados da seguinte forma. Primeiro, um pequeno tubo de silicone (com um diâmetro médio de 0,69 mm; Instech Lab, BSILT031, PA, EUA) foi preenchido com uma solução aquosa dos PNIPAM NPs contendo ICG (LCST = 31° C) do Exemplo 1. O tubo foi então incorporado em um pedaço de tecido muscular porcino para simular um vaso sanguíneo como alvo para imagens de USF. A FIG. 8A ilustra esquematicamente a configuração da amostra de tecido, do tubo, da fonte de luz de excitação, da fibra de coleta de fluorescência e do transdutor HIFU usado para imagens. O tecido porcino tinha uma espessura de aproximadamente 8 mm (na direção z da FIG. 8A) e uma largura de aproximadamente 20 mm (na direção x). O tubo foi inserido no tecido ao longo da direção y. A distância do centro do tubo para a superfície superior do tecido foi de aproximadamente 4 mm. Um feixe de fibras com um diâmetro de aproximadamente 3 mm (Edmund Optics NT39-366, New Jersey, EUA) foi usado para entregar a luz de excitação de um laser para o fundo do tecido para excitar fluoróforos comutados para o estado de ativação pela exposição ao feixe HIFU. Um segundo pacote de fibras (Edmund Optics NT42-345) foi colocado na parte superior do tecido para coletar fótons USF. Um transdutor 2,5 MHz HIFU (H-108, Sonic Concepts, Washington, EUA; diâmetro ativo: 60 mm; distância focal: 50 mm) foi posicionado na parte inferior do tecido e focado na região do tubo. Para transmitir eficientemente a energia acústica no tecido, o transdutor HIFU, a superfície inferior da amostra de tecido e o feixe de fibras para fornecer a luz de excitação foram submersos em água. Para fotografar o tubo de forma bidimensional, o transdutor HIFU foi digitalizado ou traduzido no plano x-y.

Sistema de Imagem USF.

[0128] A configuração do sistema de imagem USF é ilustrada esquematicamente na FIG. 8B. O sistema incluiu quatro subsistemas primários: (1) um subsistema óptico, (2) um subsistema de ultrassom, (3) um subsistema de medição de temperatura e (4) um subsistema de controle eletrônico. O subsistema óptico inclui componentes para a entrega da luz de excitação ou feixe de radiação eletromagnética e a coleta da luz de emissão. A luz de excitação foi gerada usando um laser de diodo 808 nm (MDL-III-808R) e foi entregue no fundo do tecido de amostra através do feixe de fibras descrito acima. Um filtro de passagem de banda F1 (FF01- 785/62-25, Semrock, Nova York, comprimento de onda central: 785 nm; largura de banda: 62 nm) foi usado como um filtro de excitação para limpar quaisquer componentes de banda lateral indesejáveis do laser de diodo localizado na banda de passagem dos filtros de emissão. O laser foi operado em modo onda contínua (CW); no entanto, os tempos e durações de iluminação da amostra foram controlados usando um obturador mecânico rápido (UNIBITZ LS3T2, Nova York) que foi acionado por um gerador de atraso de pulso (PDG, P400, Highland, Califórnia). O obturador teve um tempo de resposta de 0,5 ms. Alternativamente, também é possível usar um laser de pulso em vez de um laser CW. Os fótons emitidos coletados através do segundo feixe de fibras descrito acima foram entregues a um conjunto de filtros de emissão e depois recebidos por um tubo fotomultiplicador (PMT). A combinação de quatro filtros de emissão permitiu a rejeição máxima dos fótons de excitação e a passagem dos fótons de emissão de fluorescência. Especificamente, dois filtros de interferência de passagem longa (F2 e F5; BLP01-830R-25, Semrock, Nova York, EUA; comprimento de onda de borda: 846 nm) e dois filtros de vidro absorventes de passagem longa (F3 e F4; FSR-RG830, Newport, Irvine, Califórnia, EUA, corte de 830 nm) foram posicionados como ilustrado na FIG. 8B. Duas lentes de dupleto acromáticas NIR (AC-254-035-B, Thorlabs, New Jersey, EUA) foram utilizadas para colimar os fótons de fluorescência para a melhor rejeição dos fótons de excitação pelos filtros de interferência e para concentrar os fótons filtrados em um refrigerado e baixo-ruído PMT (H7422P-20 movido por uma fonte de alta tensão C8137-02, Hamamatsu, Japão). O sinal foi ainda amplificado por um pré-amplificador de corrente de baixo ruído (SR570, Stanford Research Systems, Califórnia, EUA) e adquirido por um osciloscópio multicanal (DPO4102B-L, Tektronix, Oregon, EUA).

[0129] O subsistema ultrassônico incluiu o transdutor HIFU descrito acima, vários componentes de direção, uma rede de compensação de impedância (NWM), um amplificador de potência de radiofrequência (RF) e um gerador de função (FG). Especificamente, um sinal de onda sinusoidal fechado com uma frequência central de 2,5 MHz foi gerado pelo FG (33220A, Agilent, Califórnia, EUA) e foi ainda amplificado pelo amplificador de potência de RF (325LA, E&I, Nova York, EUA). O sinal amplificado foi inserido no NWM para conduzir o transdutor HIFU. O transdutor HIFU foi focado no tubo de amostra de silicone. O transdutor HIFU foi montado em um estágio de tradução bidimensional tanto para o posicionamento HIFU inicial quanto para a varredura subsequente. No posicionamento inicial, o transdutor HIFU foi movido para a posição em que o sinal de temperatura do termopar atingiu seu máximo (indicando que a junção do termopar estava localizada no foco HIFU). Esta posição foi considerada como o centro da imagem. Uma área retangular (4,0 mm x 1,02 mm) foi rastreada pelo transdutor HIFU que circundava o centro. Todo o subsistema ultrassônico foi controlado pelo PDG, incluindo o disparo do pulso HIFU, a queima do pulso de luz de excitação e a aquisição de dados do osciloscópio. A sequência temporal desses processos é plotada na FIG. 8C. Neste exemplo, o tempo de exposição ultrassônica foi de 300 ms, determinado pela largura do pulso de canais do PDG.

[0130] Para sincronizar adequadamente o pulso laser, o sinal de fluorescência e a aquisição de dados, foram adotadas as seguintes estratégias. O pulso laser foi atrasado aproximadamente 100 ns, acoplando o raio laser a uma fibra óptica de 20 m (FT200EMT, Thorlabs Inc., Newton, NJ, EUA). Quando um pulso de luz de excitação foi disparado pelo laser, uma pequena quantidade de energia laser foi dividida por um divisor de feixe e entregue a um fotodiodo rápido (PD) para gerar um pulso eletrônico. Este pulso foi usado para desencadear o PDG. A saída do PDG foi utilizada para acionar o osciloscópio para aquisição de dados. O tempo de disparo foi ajustado controlando o tempo de atraso de saída do PDG. Assim, a aquisição de dados do osciloscópio foi bem sincronizada e combinada com o sinal de fluorescência. O atraso de 100 ns do pulso do laser foi grande o suficiente para explicar o atraso eletrônico total do sinal de disparo.

[0131] A temperatura no foco HIFU foi medida por um termopar de tamanho micrométrico através de um amplificador e um segundo osciloscópio. Especificamente, um termopar com um pequeno tamanho de junção de 75 μm (CHCO003, Omega Engineering, Connecticut, EUA) foi colocado no tubo de silicone para medir as mudanças de temperatura induzidas por HIFU. A junção foi fixada no centro da área de varredura. O sinal de tensão de saída do termopar foi amplificado por um circuito amplificador incluindo um amplificador operacional OPA2277 de alta precisão e adquirido por um osciloscópio (Infiniium 54830D MSO, Agilent, Califórnia, EUA). Pela varredura o transdutor HIFU ao longo da direção x, o perfil de temperatura foi adquirido. Verificou-se que o sinal do termopar era linearmente proporcional à temperatura, que foi previamente calibrado fora da amostra de tecido antes do teste. A temperatura de pico medida no foco HIFU foi aproximadamente de 45° C.

[0132] Durante o período de exposição ultrassônica, a temperatura do tecido no foco HIFU aumentou continuamente. Após a exposição, a temperatura diminuiu como resultado da difusão térmica. A luz de excitação iluminou o tecido para os últimos 2 ms logo antes do final da exposição ultrassônica, e a iluminação foi iniciada pela abertura do obturador. Ao mesmo tempo, o sinal de fluorescência foi adquirido pelo osciloscópio, que foi acionado por um pulso do PDG. O transdutor HIFU foi digitalizado ou traduzido usando um estágio de tradução bidimensional.

Imagens USF de alta resolução.

[0133] O transdutor HIFU descrito acima foi utilizado para a imagem por ultrassonografia do tubo de amostra na amostra de tecido mostrada acima. Um pulsador/receptor (5073 PR, Olympus NDT, EUA) foi usado para excitar o transdutor e receber os ecos acústicos refletidos. O NWM também foi usado para a correspondência de impedância entre o transdutor e o pulsador/receptor. O sinal acústico refletido foi amplificado pelo pulsador/receptor e adquirido por um digitalizador (NI USB 5133) interligado a um computador. Esse sinal recebido é geralmente chamado de uma linha A no campo de imagens de ultrassom e representa a distribuição da imunidade acústica do tecido ao longo da direção da profundidade (z). Uma linha A foi adquirida em cada local no plano x-y. Pela varredura o transdutor HIFU no plano x-y, um conjunto de dados tridimensionais (x, y e z) foi adquirido. O envelope de cada linha A foi calculado para formar as imagens do modo C em diferentes profundidades. Para comparar com a imagem USF, um conjunto de dados bidimensionais no plano x-y (uma das imagens do modo C) foi extraído fixando a profundidade de z na localização do tubo. A imagem da FIG. 9B foi formada dessa maneira.

[0134] A FIG. 9A ilustra uma imagem USF do tubo no plano x-y. As duas linhas tracejadas verticais indicam a localização das bordas internas do tubo. O FWHM e a largura total em um oitavo do máximo (FWEM) do perfil de imagem USF ao longo da direção x em cada localidade y foram calculados. O FWHM médio e o FWEM em diferentes localizações y foram de 0,48 ± 0,13 mm e 0,68 ± 0,19 mm, respectivamente. Embora o FWHM (0,48 mm) seja mais estreito do que o diâmetro interno do tubo, o FWEM (0,69 mm) é muito próximo ao diâmetro interno do tubo (0,69 mm). Como o diâmetro interno pode ser considerado um parâmetro que descreve o tamanho completo do tubo, o FWEM em vez do FWHM pode ser considerado como um parâmetro que descreve o tamanho completo da imagem USF.

[0135] Para comparar a imagem USF com uma imagem de ultrassom pura, a mesma amostra foi digitalizada no plano x-y usando o mesmo transdutor HIFU através do método de pulso e eco comumente usados. Em cada localização x-y, o eco ultrassônico refletido do limite interno superior do tubo foi gravado e usados para gerar a imagem ultrassonográfica. O resultado é mostrado na FIG. 9B. Suas médias FWHM e FWEM foram 0,76 ± 0,01 mm e 1,12 ± 0,02 mm, respectivamente. Ambos os valores são maiores do que os da imagem USF. Além disso, se um supõe que a velocidade de ultrassom no músculo está entre 1.542 e 1.626 m/s, então o tamanho focal lateral de difração teórico (equivalente ao FWHM) do transdutor HIFU adotado (frequência = 2,5 MHz e número f = 0,83) está entre 0,512 e 0,54 mm, que também é maior do que o FWHM médio dos perfis USF do tubo. Portanto, os métodos de imagem aqui descritos podem atingir uma resolução além do limite de difração acústica.

[0136] As FIGS. 9C e 9D ilustram as comparações dos perfis de intensidade da fluorescência gerada pelo USF, luz fluorescente difusa, ultrassom e temperatura ao longo da linha tracejada horizontal marcada na FIG. 9A. Em particular, a FIG. 9C ilustra os perfis do sinal USF e o sinal de fluorescência difuso ao longo do eixo x em y = 0. A FIG. 9D ilustra os perfis dos sinais USF, ultrassom e temperatura ao longo do eixo x em y = 0. Tanto o USF quanto as imagens de ultrassom foram normalizadas e interpoladas com base em um método bicúbico. O FWHM do sinal de fluorescência difuso foi de 3,9 mm, que é significativamente maior do que o FWHM do perfil da imagem USF correspondente (0,48 mm) e o diâmetro interno do tubo (0,69 mm). Assim, os métodos aqui descritos podem proporcionar uma resolução melhorada em comparação com métodos de fluorescência difusa tais como a tomografia óptica difusa de fluorescência (FDOT). Deve também notar-se que o perfil de temperatura apresentou um FWHM de 0,66 mm e o perfil de ultrassom apresentou um FWHM de 0,76 mm na FIG. 9D, em comparação com um perfil de sinal USF de FWHM de 0,54 mm. Para adquirir o perfil da luz de fluorescência difusa, como ilustrado na FIG. 9C, a amostra foi digitalizada ao longo da direção x enquanto todos os outros componentes permaneceram fixos. Embora o HIFU tenha permanecido desligado e a temperatura foi mantida à temperatura ambiente (< LCST), os agentes de contraste USF ainda emitiram alguma fluorescência quando o laser estava ligado porque os agentes de contraste USF não estão 100 por cento apagados, mesmo em estado desativado. Para evitar a distorção dos resultados por vazamento do filtro de emissão da luz de excitação, uma verificação de fundo foi realizada preenchendo o tubo com água e esses dados de fundo foram subtraídos do resultado adquirido do tubo contendo os fluoróforos.

EXEMPLO 3 Fluoróforos de ultrassom comutáveis Geral.

[0137] Uma série de fluoróforos permutáveis por ultrassons adequados para utilização em algumas modalidades dos métodos aqui descritos foram preparados como se segue. Os fluoróforos compreendiam uma pluralidade de espécies doadoras de FRET e uma pluralidade de espécies aceitadoras de FRET (1) acopladas a uma estrutura polimérica termorresistente linear, (2) dispersa dentro de um polímero NP termorresistente, tal como os NPs descritos acima no Exemplo 1, (3) acoplado à superfície de um polímero termorresistente NP, ou (4) parcialmente disperso dentro e parcialmente acoplado à superfície de um polímero NP termorresistente. As estruturas (1), (3) e (4) são ilustradas esquematicamente nas FIGS. 10-12, respectivamente. Além disso, algumas propriedades de vários fluoróforos são fornecidas nas Tabelas 2 e 3. A Tabela 3 descreve propriedades de fluoróforos com base em estruturas de polímero termorresistentes lineares. A Tabela 4 descreve propriedades de fluoróforos à base de nanopartículas de polímero termorresistentes. A nomenclatura utilizada nas Tabelas 3 e 4 corresponde à nomenclatura descrita mais adiante neste Exemplo. Além disso, os valores medidos relatados nas Tabelas 3 e 4 foram obtidos da maneira descrita nos Exemplos 1 e 2 acima.

Estrutura (1).

[0138] Em geral, os polímeros lineares termorresistentes foram primeiro sintetizados e, em seguida, as espécies fluorescentes foram enxertadas no polímero formando ligações químicas covalentes entre frações apropriadas sobre o polímero e as espécies fluorescentes, tais como frações de hidroxil, carboxil e/ou amina. Em alguns casos, por exemplo, foi utilizado um esquema de acoplamento com carbodi-imida. A conjugação também poderia ser realizada de outras maneiras. Em geral, as espécies doadoras tiveram comprimentos de onda de excitação/emissão curtos na região visível, enquanto as espécies aceitadoras tiveram uma emissão vermelha/NIR (comprimento de onda longo). Uma luz de excitação de curto comprimento de onda (para o doador) foi usada para excitar o sistema, de modo que pouco ou nenhum aceitador estava excitado para um estado fluorescente. Quando um polímero termorresistente assumiu uma conformação globular como descrito acima, a distância entre dadores e/ou aceitadores diminuiu, levando a FRET dos doadores aos aceitadores. Portanto, a emissão do aceitador (em comprimento de onda longo) pode ser observada.

[0139] Para formar uma série de fluoróforos com estrutura geral (1), foram utilizados os seguintes materiais. N-isopropilacrilamida (NIPAM), N- terc-butilacrilamida (TBAm), acrilamida (AAm), ácido acrílico (AAc), alilamina (AH), N, N, N', N'-tetrametil etilenodiamina (TEMED), persulfato de amônio (APS), cloridrato de N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodi-imida (EDC), dodecilsulfato de sódio (SDS), N, N'-metilenobisacrilamida (BIS) e 7- (2-aminoetilamino) -N, N-dimetil-4-benzofurazansulfonamida (DBD-ED) foram adquiridas a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Mono-N- hidroxissuccinimida (NHS) SeTau 425, o mono-NHS Square 660, o mono- NHS Seta 700, o mono-NHS Seta 633 e o mono-NH2 Square 660 foram adquiridos da SETA BioMedicals (Urbana, IL, EUA) e denotados como ST425, Sq660, St700, Sq633 e Sq660a, respectivamente. Todos os produtos químicos foram utilizados como recebidos sem purificação adicional.

[0140] Os componentes de polímero termorresistentes dos fluoróforos com estrutura geral (1) incluíram pelo menos três porções funcionais: (a) uma unidade termorresistente primária (como NIPAM); (b) uma unidade de controle LCST (como TBAm ou AAm); e (c) uma unidade de funcionalização (como AAc ou AH) para acoplamento a uma espécie fluorescente. Os polímeros lineares foram sintetizados através da polimerização por radicais livres. Todas as reações foram realizadas em um tubo Schlenk de 250 mL. As três etapas principais foram as seguintes. Primeiro, realizou-se um procedimento de purga em que a mistura reacional foi purgada com nitrogênio durante 10 minutos. Quando um iniciador (por exemplo, APS) ou acelerador (por exemplo, TEMED) foi adicionado, oxigênio foi purgado por três ciclos de aplicação de vácuo (1 m) e preenchimento de retorno com nitrogênio (5 s). Em seguida, a reação de polimerização foi realizada por agitação da mistura reacional sob nitrogênio durante 4 h à temperatura ambiente. Finalmente, os produtos de polímero foram purificados por diálise com uma membrana apropriada de corte de peso molecular (MWCO) durante três dias para remover monômeros não reagidos, iniciador e outras moléculas pequenas.

[0141] Usando P (NIPAM-AAc 200: 1) como um exemplo, um procedimento geral é o seguinte. Amostras de 1,3644 g de NIPAM (monômero) e 4 μL de AAc (monômero) numa relação molar de 200: 1 foram dissolvidos em 50 mL de água desionizada (DI) no tubo de Schlenk. Durante o procedimento de purga, foram adicionados 0,067 g APS (iniciador) e 51 μL de TEMED (acelerador) no tubo. Após a reação, a amostra foi dialisada com uma membrana de 3,5K MWCO. A solução resultante foi coletada e liofilizada para posterior conjugação com espécies fluorescentes contendo amina. Para a conjugação com espécies fluorescentes contendo NHS, o polímero P (NIPAM-AH) funcionalizado com amina foi sintetizado usando o mesmo protocolo que o anterior, exceto usando AH em vez de AAc. Mais geralmente, o procedimento anterior foi utilizado para sintetizar os seguintes polímeros termorresistentes: P (NIPAM-TBAm-AAc 85: 15: 1), P (NIPAM-TBAm-AAc 185: 15: 1), P (NIPAM-TBAm-AAc 585: 15: 1) e P (NIPAM-AAm-AAc 200: 32: 1).

[0142] Após a síntese dos polímeros, a conjugação entre os polímeros e as espécies fluorescentes foi realizada utilizando reações químicas entre as frações de carboxil e de amina primária. Em alguns casos, as espécies fluorescentes incluíram NHS, que reagiu com uma amina primária do polímero termossorresistente (como uma amina presente em P (NIPAM-AH)). Em outros casos, as espécies fluorescentes incluíram uma amina primária que foi conjugada com um grupo carboxil do polímero (como P (NIPAM-AAc)) na presença de EDC. A reação de conjugação foi realizada em um tubo de vidro marrom de 7 mL para proteger corantes sensíveis à luz ou espécies fluorescentes. Os procedimentos gerais de conjugação foram os seguintes. Para os corantes contendo amina (tais como DBD-ED ou Sq660a), 5 mg de polímero, 25 mg de EDC e 0,3 mg de DBD-ED e/5 μL de Sq660a (solução de reserva de 1 mg/100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO)). Foram dissolvidos em 5 mL de água desionizada no tubo. Em seguida, o tubo foi agitado e reagiu durante a noite à temperatura ambiente. Após a conclusão da reação, os conjugados foram purificados com membranas de diálise MWCO adequadas como descrito acima. Para os corantes contendo NHS (como ST425, St633, Sq660 e St700), 5 mg de polímero e 10 μL de corante (solução principal: 1 mg/100 μL de DMSO) foram dissolvidos em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS, 8 mM de fosfato de sódio, 2 mM de fosfato de potássio, NaCl 0,14 M, KCl 10 mM, pH 8,3-8,6). Em seguida, a solução foi agitada e reagiu durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se 1 mL de tampão Tris 20 mM (pH 7,8) à solução para extinguir as frações de NHS não reagidas do corante durante duas horas. Finalmente, a amostra foi purificada por diálise.

[0143] Deve-se notar que, em alguns casos, DBD-ED, St633, Sq660 e St700 foram utilizados como fluoróforos sensíveis à polaridade. Em outros casos, DBD-ED ou ST425 foi usado como uma espécie doadora e o Sq660 (a) foi usado como aceitador.

Estrutura (2).

[0144] Os fluoróforos possuindo a Estrutura (2) foram preparados como descrito acima no Exemplo 1.

Estrutura (3).

[0145] Os fluoróforos possuindo a Estrutura (3) foram preparados primeiro preparando NPs termossorresistentes como descrito no Exemplo 1 acima, exceto sem incluir uma espécie fluorescente. Em seguida, as espécies fluorescentes foram anexadas à superfície dos NPs de uma maneira correspondente à descrita acima para polímeros termorresistentes lineares, exceto 5 mL de solução de polímero NP utilizada em vez de 5 mg de polímero linear. Como um exemplo de fluoróforo possuindo a estrutura (3), P (NIPAM-AAc 200: 1) NPs-DBD-ED-Sq660a foi preparada por ligação covalente de dois corantes contendo amina (DBD-ED e Sq660a) à superfície do polímero NPs (P (NIPAM-AAc 200: 1) NPs através de frações carboxil proporcionadas pelo monômero AAc.

Estrutura (4).

[0146] Os fluoróforos possuindo a Estrutura (4) foram preparados primeiro preparando NPs termorresistentes como descrito no Exemplo 1 acima e depois conjugando espécies fluorescentes na superfície dos NPs como descrito acima para a Estrutura (3). Como um exemplo de fluoróforo possuindo a Estrutura (4), DBD-ED foi encapsulado dentro de P (NIPAM- AH 86:14) NPs e Sq660 foram anexados à superfície do NPS por conjugação de frações de NHS (do corante) e frações de amina (do monômero AH). Tais fluoróforos são denotados usando a nomenclatura geral DBD-ED@P (NIPAM-AH 86:14) NPs-Sq660, onde as espécies que precedem o símbolo "@" são encapsuladas nos NPs de polímero identificados e as espécies seguindo o hífen "- " são conjugadas com a superfície dos NPs. Tabela 3.

Tabela 4.

EXEMPLO 4 Fluoróforos de ultrassom comutáveis Geral.

[0147] Uma série de fluoróforos permutáveis por ultrassons adequados para utilização em algumas modalidades dos métodos aqui descritos foram preparados como se segue. Os fluoróforos compreendiam um polímero termorresistente e um material fluorescente com um pico de emissão na porção vermelha/NIR do espectro eletromagnético. Em particular, utilizou-se o corante de ácido cianocinâmico ADPDI (ADPDICA). A estrutura da ADPDICA está ilustrada na FIG. 13. Alguns fluoróforos foram da estrutura geral (1) do exemplo 3 acima; outros fluoróforos foram da Estrutura geral (2) do Exemplo 3; e ainda outros fluoróforos foram da Estrutura geral (3) do Exemplo 3.

Materiais.

[0148] N-isopropilacrilamida (NIPAM), acrilamida (AAm), persulfato de amônio (APS), dodecilsulfato de sódio (SDS), N, N, N', N'-tetrametil etilenodiamina (TEMED), N, N'-metilenobisacrilamida (BIS), ácido acrílico (AAc), N-terc-butilacrilamida (TBAm), e ascorbato de sódio foram adquiridos a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Todos os produtos químicos são utilizados como recebidos sem purificação adicional.

Síntese.

[0149] A ADPDICA foi preparada de acordo com os procedimentos de síntese de azadipirrometeno descritos em Bandi et al., “ExcitationWavelength-Dependent, Ultrafast Photoinduced Electron Transfer in Bisferrocene/BF2-Chelated-Azadipyrromethene/Fullerene Tetrads,” Chem. Eur. J. 2013, 19, 7221-7230, and Bandi et al., “Self-Assembled via MetalLigand Coordination AzaBODIPY-Zinc Phthalocyanine and AzaBODIPY- Zinc Naphthalocyanine Conjugates: Synthesis, Structure, and Photoinduced Electron Transfer,” J. Phys. Chem. C 2013, 117, 5638-5649. Resumidamente, 3- (4-hidroxifenil) -1-fenilprop-2-en-1-ona foi primeiro preparada pela reação do correspondente 4-hidroxibenzaldeído, acetofenona e hidróxido de potássio. Esta espécie foi subsequentemente feita reagir com nitrometano e dietilamina em etanol seco para obter 3- (4- hidroxifenil) -4-nitro-1-fenilbutan-1-ona. Em seguida, adicionou-se 4- {2- [3- (4-hidroxifenil) -5-fenil-1H-pirrolilimino] -5-fenil-2H-pirrol-3-il} fenol foi sintetizado pela reação com acetato de amônio em etanol. Então, BF2- quelatado 4- {2- [3- (4-hidroxifenil) -5-fenil-1H-pirrol-2-ilimino] -5-fenil-2H- pirrol-3-il} fenol foi formado a partir deste produto tratando o produto com di- isopropiletilamina e eterato de dietil de trifluoreto de boro em CH 2Cl2 seco. O BF2-espécies quelatadas foi então reagido com o ácido benzoico apropriado na presença de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDCI) seguido por purificação cromatográfica.

[0150] Os fluoróforos possuindo a Estrutura geral (1) foram preparados de acordo com o protocolo descrito para a Estrutura (1) no Exemplo 3 acima, exceto ADPDICA foi usado como a espécie fluorescente. Além disso, a purificação foi realizada por diálise durante 3 dias usando uma membrana MWCO de 3,5 kDa. Os polímeros termorresistentes incluíram P (NIPAM-AH 200: 1), P (NIPAM-TBAm-AH 185: 15: 1) e P (NIPAM-AAm-AH 172: 28: 1). Portanto, os seguintes fluoróforos da Estrutura geral (1) foram formados: (a) P (NIPAM-AH 200: 1) -ADPDICA, (b) P (NIPAM-TBAm-AH 185: 15: 1) -ADPDICA e (c) P (NIPAM-AAm-AH 172: 28: 1) -ADPDICA. A conjugação de ADPDICA aos polímeros termorresistentes foi realizada formando uma ligação de amida entre os grupos carboxil de ADPDICA e os grupos de amina proporcionados pelas unidades de repetição AH do polímero.

[0151] Os fluoróforos com Estrutura geral (2) foram preparados de acordo com o protocolo descrito para Estrutura (2) no Exemplo 3 acima. Em particular, o protocolo correspondia ao do sistema DBD-Sq660 FRET. Um fluoróforo exemplar formado desta maneira foi ADPDICA @ P (NIPAM-AH 200: 1) NPs, em que ADPDICA foi encapsulado dentro dos NPs.

[0152] Os fluoróforos com Estrutura geral (3) foram preparados de acordo com o protocolo descrito para Estrutura (3) no Exemplo 3 acima. Em particular, o protocolo correspondia ao do sistema DBD-Sq660 FRET. Um fluoróforo exemplar formado desta maneira foi P (NIPAM-AH 200: 1) NPs- ADPDICA, em que ADPDICA estava ligado à superfície dos NPs. Tal como a Estrutura (1), a conjugação de ADPDICA aos polímeros termorresistentes foi realizada formando uma ligação de amida entre os grupos carboxil de ADPDICA e os grupos de amina proporcionados pelas unidades de repetição AH do polímero.

Imagem de Fluorescência.

[0153] As propriedades de fluorescência dependentes da temperatura dos fluoróforos descritas acima foram avaliadas em dois comprimentos de onda de excitação diferentes (Àex = 609 nm ou 655 nm) e utilizando um filtro de emissão de passagem de banda de 711 nm/25 nm. A temperatura dos fluoróforos foi controlada descartando os fluoróforos em um banho de água com temperatura controlada. Os resultados são fornecidos nas Tabelas 5 e 6. A Tabela 5 fornece dados para Àex = 609 nm. A Tabela 6 fornece dados para Àex = 655 nm. Os dados nas Tabelas 5 e 6 rotulados como "Àex"refere-se aos filtros de emissão usados, onde" lp" se refere a um filtro de passagem longa. Tabela 5.

Tabela 6,

EXEMPLO 5 Métodos de imagem usando Microbolhas

[0154] Os métodos de imagem de acordo com algumas modalidades aqui descritas foram realizados da seguinte forma. Primeiro, foi preparada uma série de fluoróforos contendo microbolhas. Em um caso, os fluoróforos incluíam microbolhas Targestar-B com uma pluralidade de espécies aceitadoras de FRET (ou espécies de "fluoróforos", abreviadas como "F") e uma pluralidade de espécies de dadores de FRET (ou espécies de "desativador", abreviados como "Q") ligado à superfície exterior das microbolhas. Especificamente, Alexa Fluor (AF) 546 (doador ou F) e AF 647 (aceitador ou Q) foram rotulados na superfície das microbolhas através do acoplamento biotina-estreptavidina.

[0155] Para imagens, a intensidade da luz de excitação (532 nm) foi modulada a 15 MHz. As microbolhas F-Q individuais foram fluídas lentamente através de umas microbolhas ultrassônicas e opticamente transparente. Uma explosão de ultrassom com três ciclos a uma frequência central de 2,25 MHz foi utilizada para expandir as microbolhas F-Q. Inicialmente, o sinal de fluorescência da AF 546 foi fraco devido à transferência de energia FRET de AF 546 para AF 647. No entanto, a emissão de fluorescência da AF 546 pode ser ultrassonicicamente ligada (com uma relação ILigado/IDesligado de cerca de 5 e uma relação TLigado/ TDesligado de cerca de 5) devido à expansão das microbolhas durante os ciclos de pressão negativa formados pelas explosões de ultrassom. A emissão do aceitador (AF 647) mostrou um comportamento complementar.

[0156] Descobriu-se que um campo de pressão negativa ultrassônica bem confinado poderia ser formado usando dois feixes de ultrassom com difração limitada para imagens de USF baseada com microbolhas F-Q. Os feixes de ultrassom foram fornecidos por dois transdutores de 5 MHz focados. O FWHM do tamanho lateral da região de pressão negativa focada de cada feixe foi de cerca de 450 μm. Este tamanho foi determinado principalmente pela difração e abertura numérica (NA) do transdutor. O tamanho axial do foco foi de cerca de 380 μm. Este tamanho foi determinado principalmente pelo comprimento e frequência do pulso ultrassom e pelo transdutor (assumindo que a resolução axial é pelo menos metade da largura do pulso multiplicada pela velocidade do ultrassom). Quando os dois pulsos de ultrassons se propagaram perpendicularmente e se cruzaram nas zonas focais comuns, obteve-se um campo de pressão interferente somando os dois campos perpendiculares individuais. Desta forma, formou-se uma pequena região de pressão negativa, em que a região pequena tinha um tamanho menor do que a zona focal de qualquer feixe usado para formar a região. O FWHM da região de pressão negativa principal (MNPR) formada pelas duas vigas era de cerca de 165 μm na direção lateral, que era cerca de 2,7 vezes e 2,3 vezes mais estreito do que as resoluções lateral e axial dos pulsos individuais de ultrassom, respectivamente. Um resultado semelhante foi encontrado na direção axial do campo interferido.

[0157] Enquanto o MNPR estava espacialmente confinado, também foi temporariamente limitado devido à propagação dos pulsos de ultrassom. A duração da MNPR confinada foi de aproximadamente 0,08-24 μs. Este período de tempo foi longo o suficiente para permitir a iluminação do tecido circundante usando pulsos de luz ps para excitar os fluoróforos no estado ligado. Também foi muito maior do que a largura dos pulsos de luz de excitação, que pode ser ampliada para 1-3 ns em tecido profundo devido à dispersão da luz no tecido. Portanto, se necessário, vários pulsos de luz podem ser fornecidos em uma única janela de tempo. Ao iluminar opticamente o tecido apenas dentro desta janela de tempo (ou seja, temporariamente confinando a excitação), foi possível evitar o ruído de fluorescência de fundo gerado por fluoróforos alternadamente encapsulados pelos pulsos de ultrassom individuais antes e depois da formação do MNPR. Assim, o sinal de fluorescência USF só pode ser detectado quando os impulsos ópticos e ultrassônicos foram sobrepostos espacialmente e temporariamente.

[0158] Além disso, descobriu-se que a resolução espacial dos métodos de imagem aqui descritos, em algumas modalidades, poderia ser ainda melhorada ao selecionar apropriadamente o limite de pressão para oscilar uma microbolha aqui descrita. Por exemplo, assumindo um limite de pressão negativa de 100 kPa e uma pressão de pico negativa em cada impulso de ultrassom individual abaixo desse limite, os fluoróforos não seriam ligados até que os dois pulsos ultrassônicos estejam sobrepostos e o MNPR seja formado. Quando dois pulsos ultrassônicos descritos acima são usados para formar o MNPR, a pressão negativa máxima do campo de interferência é duplicada (200 kPa) devido a interferência construtiva. Somente as microbolhas F-Q dentro da região onde a pressão está acima de 100 kPa podem ser ligadas. O tamanho completo desta região é de cerca de 165 μm e a sua FWHM (a resolução espacial) é de cerca de 83 μm. No entanto, podem ser obtidos níveis de região de ativação ainda menores ou mesmo potências de alta resolução ajustando ainda mais a relação entre o valor limite de comutação (por exemplo, 100 kPa) e a pressão negativa de pico fornecida por cada feixe ultrassônico individual. Quando o limite de comutação de pressão negativa aumenta (torna-se mais negativo), o tamanho da região em que as microbolhas F-Q podem ser ativadas diminui e, portanto, a resolução espacial é melhorada. A FIG. 14 ilustra a relação entre o FWHM da região de ativação na qual as microbolhas F-Q são ligadas e o valor limite das microbolhas, em que o limite de comutação é representado como uma porcentagem da pressão negativa máxima de um feixe de ultrassom individual. Quando o limite é acima de cerca de 70 por cento da pressão negativa máxima, a resolução é rapidamente melhorada para frequências de ultrassom de 5 e 10 MHz. Por exemplo, quando o limite é de 90 por cento da pressão negativa máxima, a resolução espacial pode atingir 14 μm e 35 μm para as frequências de ultrassom de 10 MHz e 5 MHz, respectivamente, o que é significativamente melhorado em comparação com as resoluções axiais e axiais ultrassônicas puras (450 μm e 380 μm).

[0159] Em geral, a melhoria da resolução espacial pode ser acompanhada pela degradação da relação sinal-ruído (SNR). Essa degradação pode ser devida ao menor volume da região de ativação. A uma dada concentração de fluoróforos, é provável que se encontrem menos fluoróforos em um volume menor de um ambiente biológico. Como resultado, poucos fluoróforos podem estar disponíveis em um estado ligado de excitação e um sinal de USF mais fraco pode ser esperado. O caso extremo, não-zero, ocorre quando apenas uma única microbolha F-Q está localizada em um voxel de imagem (como voxel de 30 μm x 30 μm x 30 μm). Tipicamente, uma microbolha de 2 μm de diâmetro pode ser rotulada com 5 x 104 moteculas/μm2, com base no volume da microbolha, que é equivalente a uma concentração volumétrica de 249 μM, utilizando o volume da bolha para calcular a concentração. Se o volume for considerado um voxel de 30 μm x 30 μm x 30 μm, então esta quantidade de rotulagem é equivalente a uma concentração de volume de 36 nM. Essas concentrações estão muito acima dos limites de detecção (fM-nM) da maioria das técnicas ópticas para imagens de tecido. Portanto, o uso de um sistema de detecção óptica altamente sensível (como um sistema de contagem hormonal e/ou fotônico) pode compensar substancialmente qualquer perda no SNR devido ao pequeno volume da região de ativação e é possível detectar uma única microbolha F-Q no tecido.

EXEMPLO 6 Fluoróforos de ultrassom comutáveis

[0160] Fluoróforos adicionais comutáveis por ultrassons adequados para utilização em métodos de acordo com algumas modalidades aqui descritas incluem o seguinte.

Microbolhas F-Q-HJ.

[0161] Para implementar FRET entre um par doador-aceitador na superfície de uma microbolha, um doador e um aceitador podem ser rotulados em uma microbolha através de uma junção Holliday (HJ). A FIG. 15 ilustra essa microbolha de forma esquemática. As duas linhas cruzadas representam dois braços do HJ, que é composto de quatro hélices duplas de DNA na forma de uma junção de quatro vias. Os dois quadrados indicam um par de espécies doadoras e aceitadoras que são rotuladas nas duas extremidades dos dois braços (através do acoplamento de estreptavidina- biotina ou através da reação entre os ácidos nucleicos do HJ e um éster de NHS ligado ao doador e ao aceitador). A linha orientada horizontalmente indica o shell da microbolha em que as outras duas extremidades do HJ estão ligadas (via acoplamento biotina-estreptavidina ou outro esquema de acoplamento). Quando a bolha é expandida (comprimida), a distância RS é aumentada (diminuída). Isso resulta no aumento (diminuição) da distância entre o doador e o aceitador (RDA) com uma ampliação de (l1/I2) e comutação concomitante (desligado) do doador. O ângulo inicial (θ) entre os dois braços pode ser controlado. Devido à área superficial relativamente grande de uma microbolha, numerosos F-Q-HJs podem ser rotulados em uma única microbolha sem interferência significativa. Tal design pode reduzir a banda de transição USF e melhorar a eficiência de comutação de ultrassom e SNR.

Mmicrobolhas F-Q-Hairpin-NP.

[0162] Outra estratégia de rotulagem é anexar um par doador- aceitador em um complexo de hairpin de DNA (ver FIGS. 16 e 17). Uma extremidade do complexo de hairpin é anexada a uma superfície de microbolhas através do acoplamento biotina-estreptavidina e a outra extremidade é anexada a uma nanopartícula de ouro muito menor (Au-NP, dezenas de nm de diâmetro) via acoplamento com digoxigenina- antidigoxigenina. O F-Q (ou D-A) rotulou o complexo de hairpin de DNA composto por três componentes principais: (1) uma molécula de hairpin (região pontilhada na FIG. 16), (2) um oligonucleotídeo ligado a um doador e uma digoxigenina, e (3) um oligonucleotídeo ligado a um aceitador e uma biotina. Não pretendendo ficar ligado pela teoria, o princípio de mudar o doador pode ser descrito da seguinte forma. Uma onda de pressão de ultrassom pode acelerar a parede das microbolhas e, portanto, acelerar a nanopartícula Au ao esticar a molécula da hairpin. O Au-NP acelerado aplica uma força oposta na molécula da hairpin. Quando esta força é grande o suficiente, o loop da hairpin pode ser aberto, aumentando assim a distância do doador-aceitador e comutando o doador. Uma força de cerca de 18 picoNewton (pN) pode ser usada para abrir uma hairpin e ativar a emissão do doador. Quando a força é reduzida para menos de cerca de 6 pN, a hairpin é fechada e o dador é desligado. Estima-se que um pulso de ultrassom com uma onda de pressão de 150 kPa aplicado a uma microbolha com um diâmetro de 2 μm e ligado a um Au-NP com um diâmetro de 20 nm pode gerar uma força de cerca de 20 pN para esticar as moléculas de hairpin. Portanto, é possível ativar ultrassom a fluorescência.

Microbolhas de Hairpin F-Q.

[0163] Também é possível substituir a junção Holliday das microbolhas F-Q-HJ acima com uma molécula de hairpin de DNA descrita acima. Suas duas extremidades podem ser recozidas a dois oligonucleotídeos complementares. Um oligonucleotídeo é marcado com um doador (como AF 610) e uma biotina. Da mesma forma, o outro oligonucleotídeo está ligado a um aceitador (como AF 647) e uma biotina. As extremidades de biotina podem ser ligadas a uma microbolha marcada com estreptavidina. Quando o comprimento da molécula de DNA é mais curto que o seu comprimento persistente (geralmente cerca de 50 nm), a molécula de DNA se comporta como uma haste elástica. Portanto, os dois braços são naturalmente esticados e presos à superfície das microbolhas. Quando a exposição a um feixe de ultrassom expande a microbolha durante um ciclo de pressão negativa, é aplicada uma força nas duas extremidades dos braços em forma de hairpin, que pode abrir a hairpin e ativar o doador como descrito acima.

Microbolhas F-Q-DNA-NP.

[0164] Também é possível unir uma microbolha com nanopartículas relativamente pequenas (dezenas de nm) através de moléculas de DNA de cadeia dupla marcadas com fluorescência (ds). O ds-DNA está ligado à superfície das microbolhas através do acoplamento biotina-estraptavidina. A outra extremidade do ds-DNA é anexada a uma nanopartícula de ouro (Au NP) através de uma ligação de tiol. Normalmente, o ds-DNA é dobrado e absorvido uniformemente na superfície do AuNP devido à atração eletrostática, interações hidrofóbicas e interações dispersivas íon-dipolo entre o ds-DNA e o AuNP. Devido à atração entre o Au NP e a molécula de DNA, o Au NP é próximo das espécies fluorescentes que são rotuladas em uma extremidade do ds-DNA. A superfície do AuNP pode extinguir as espécies fluorescentes dentro de uma distância relativamente longa (cerca de 3-20 nm). Quando uma onda de pressão de ultrassom é aplicada para comprimir a microbolha, a parede de microbolha acelerada acelerará o Au NP esticando a molécula ds-DNA. Quando a aceleração da parede das microbolhas é suficientemente grande (controlada pela força da pressão de ultrassom), as forças geradas pela atração eletrostática e outras interações entre o DNA e o Au NP, o Au NP não pode experimentar a mesma aceleração (devido à massa do AuNP), resultando na separação das espécies fluorescentes da superfície Au NP e remoção do efeito de extinção.

Fluoróforos aceitadores de Polímero termorresistentes QD.

[0165] Outro fluoróforo baseado em FRET usa um ponto quântico de semicondutor, como um ponto quântico CdSe como dador e um corante de molécula pequena como aceitador. O ponto quântico está ligado a um ou mais corantes aceitadores utilizando um ou mais ligantes formados a partir de um polímero termorresistente. Por exemplo, um ponto quântico emissor de vermelho (Qdot® 655, Invitrogen, Inc.) é selecionado como doador e um corante NIR (Alexa Fluor 750, Invitrogen, Inc.) como o aceitador. Múltiplos aceitadores (AF 750) estão ligados em um único doador (Qdot® 655) por meio de polímeros termorresistentes usando esquemas de acoplamento descritos acima. O doador QD tem uma vida útil muito longa (aproximadamente 30 ns) e o aceitador AF 750 tem uma vida útil muito curta (aproximadamente 0,7 ns). Quando T < LCST, o polímero termorresistente exibe uma conformação de bobina ou cadeia prolongada, que é relativamente longa. Portanto, as distâncias entre o doador e os aceitadores geralmente são maiores do que a faixa de extinção FRET (> 40 nm). Quando um transdutor de HIFU aquece o polímero termorresistente acima de sua LCST de uma maneira descrita acima, o polímero faz uma transição para uma conformação globular, reduzindo assim as distâncias doador-aceitador (<20 nm). Como resultado, ocorre transferência de energia FRET. Consequentemente, parte da energia de excitação do doador (Qdot® 655) é transferida para os aceitadores (AF 750), que emitem fótons aos comprimentos de onda NIR. Esses fótons relacionados com FRET podem ter uma vida próxima do tempo de vida do doador e da vida útil do destinatário, o que é aproximadamente 30 ns neste caso. Assim, os fótons NIR emitidos podem ser prontamente detectados com SNR elevado usando uma técnica de detecção fechada no tempo aqui descrita. Um filtro óptico de passagem longa pode ser usado para eliminar a detecção da emissão QD.

EXEMPLO 7 Fluoróforos de ultrassom comutáveis Geral.

[0166] Uma série de fluoróforos permutáveis por ultrassons adequados para utilização em algumas modalidades dos métodos aqui descritos foram preparados como se segue. Os derivados de ftalocianina de zinco (ZnPC) foram encapsulados em micelas Pluronic F-98 ou nanopartículas P (NIPAM-TBAm) como agente de contraste para métodos de imagem de acordo com algumas modalidades aqui descritas.

Materiais.

[0167] Ftalocianina de zinco (ZnPC), zinco 2,9,16,23-tetra-terc-butil- 29H, 31H-ftalocianina (ZnPCTTB), zinco 1,4,8,11,15,18,22,25-octabutoxi- 29H, 31H-ftalocianina (ZnPCOB), zinco 1,2,3,4,8,9,10,11,15,16,17,18,22,23,24,25-hexadecafluoro-29H, 31H- ftalocianina (ZnPCHF), zinco 2,3,9,10,16,17,23,24-octakis (octiloxi) -29H, 31H-ftalocianina (ZnPCOO) e zinco 2,11,20,29-tetra-terc-butil-2,3- naftalocianina (ZnTTBNPC) foram adquiridos a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). As estruturas químicas desses derivados ZnPC são mostradas na FIG. 18A e FIG. 18B. O iodeto de tetrametilamônio (TBAI) (Sigma- Aldrich), Pluronic F-98 (BASF, Florham Park, NJ, EUA), NIPAM, TBAm, BIS, 4,4'-Azobis (ácido 4-cianovalérico) (ACA) e SDS também foram usados.

Síntese de Micela Pluronic F-98 Encapsulada com ZnPC .

[0168] ZnPC foi dissolvido em clorofórmio com a adição de iodeto de tetrabutilamônio sob sonicação durante 30 minutos. Enquanto isso, Pluronic F-98 foi dissolvido em água desionizada (DI) (pH 8,5) a uma concentração de 50 mg/mL. A solução de clorofórmio ZnPC foi adicionada gota a gota na solução aquosa Pluronic F-98 sob agitação vigorosa (500 rpm). A emulsão resultante foi ainda dispersa com uma sonda de sonicação (Qsonica) a 40 W por 4 minutos (pulso de 30 segundos após cada 1 minuto de execução). O clorofórmio foi evaporado numa coifa durante a noite. Obteve-se uma solução límpida que foi posteriormente filtrada utilizando uma membrana de 0,45 μm.

Síntese de Ns NP encapsulados com ZnPC (NIPAM-TBAm).

[0169] Uma mistura de 1,3644 g de NIPAM, 0,1247 g de TBAm, 0,0131 g de BIS, 0,070 g de ACA e 0,0219 g de SDS foram dissolvidos com 50 mL de água DI (pH 10,5) num tubo Schlenk de 250 mL, seguido de purga de nitrogênio durante 10 minutos. Adicionou-se solução de ZnPC DMSO (2 mL) ao tubo, que foi então colocado sob vácuo e posteriormente purgado com nitrogênio. O procedimento de bomba/purga foi repetido três vezes para proporcionar uma atmosfera de nitrogênio dentro do tubo. A reação foi realizada a 70° C durante a noite. A reação foi então interrompida afrouxando a válvula para expor o ambiente ao ar. A amostra foi dialisada contra a água DI utilizando uma membrana de corte de peso molecular de 10 kDa durante 3 dias para remover os surfactantes em excesso e o material que não reagiu.

Resposta Fluorescente de Micelas Pluronic F-98 encapsuladas com ZnPC.

[0170] As propriedades de fluorescência dependentes da temperatura dos fluoróforos descritos acima foram avaliadas com um comprimento de onda de excitação de Àex = 609 nm e usando um filtro de emissão de passagem de banda de 711 nm/25 nm (com exceção de ZnTTBPC, que possui um comprimento de onda de pico de emissão mais longo, para o qual foi utilizado um filtro de passagem de banda de 765 nm/62 nm). Os resultados são fornecidos na Tabela 7 e FIGS. 19A-19F. Tabela 7.

*Não estável. Resposta Fluorescente de P encapsulado com ZnPC(NIPAM-TBAm) NPs.

[0171] A intensidade de fluorescência dos NPs P (NIPAM-TBAm) encapsulado com ZnPC é mostrada na FIG. 20A e FIG. 20B. A relação ILigado/IDesligado foi de aproximadamente 1.8 para ZNPC- e P (NIPAM-TBAm) contendo NPs. A duração de fluorescência do corante (A) encapsulado dentro dos NPs no estado de desligado (T < LCST) foi de aproximadamente 3 ns (FIG. 20A)

EXEMPLO 8 Fluoróforos de ultrassom comutáveis Geral.

[0172] Uma série de fluoróforos permutáveis por ultrassons de acordo com algumas modalidades aqui descritas foram preparadas da seguinte forma. Especificamente, duas classes de corantes NIR foram utilizadas para preparar fluoróforos: derivados de aza-BODIPY e derivados de ftalocianina de zinco (ZnPC). Os polímeros termo-sensíveis de Pluronic F-127, Pluronic F-98 e seus copolímeros com PEG foram utilizados para sintetizar nanocápsulas para os corantes com diferentes limites de comutação. Os diâmetros das nanocápsulas estavam entre cerca de 20 nm e cerca de 70 nm, com base na medição por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Das duas classes de corantes acima, ADPDICA e ZnPC (TTB) foram utilizados para formar fluoróforos. As propriedades de comutação destes fluoróforos estão resumidas na Tabela 8.

Materiais.

[0173] A ADPDICA foi sintetizada de acordo com as técnicas descritas em Bandi et al. Consistente com o Exemplo 4 acima. A estrutura química da ADPDICA é fornecida na FIG. 13. ZnPC (TTB) foi adquirido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). A estrutura química do ZnPC (TTB) é fornecida na FIG. 18A. Pluronic F-127 e F-98 foram obtidos de BASF (Florham Park, NJ, EUA). Os produtos de ácido carboxílico de metoxil PEG (MW = 20,000, 30,000 e 40,000 g/mol) foram adquiridos da Nanocs Inc. (New York, NY, EUA). Todos os produtos químicos foram utilizados diretamente sem purificação adicional. TBAI também foi usado.

Síntese.

[0174] Pluronic F-127 ou F-98 (dependendo da preparação desejada) foi dissolvido em água DI (pH 8). Os corantes/TBAI (relação molar = 1/6) foram dissolvidos em clorofórmio e manteve-se em sonicação durante 30 min. A solução de corante/TBAI clorofórmio foi adicionada gota a gota na solução aquosa Pluronic enquanto a solução foi agitada. A solução foi ainda dispersa com um sonicador (Qsonica, LLC., Newtown, CT, EUA) operado a 20 W durante 4 minutos e a solução resultante foi mantida sob agitação sob uma aspiradora até que o clorofórmio fosse completamente evaporado. A solução clara que resultou foi filtrada através de uma membrana de 1,2 μm (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA) e um filtro centrífugo Amicon Ultra (10 mil pesos de corte molecular, Millipore, Billerica, MA, EUA).

Caracterização de Fluoróforos.

[0175] As propriedades de comutação óptica dos fluoróforos foram medidas de acordo com o sistema descrito acima nos Exemplos 1 e 2. Os resultados são providos na tabela 8. Tabela 8.

EXEMPLO 9 Sistema de Imagem USF

[0176] São proporcionados sistemas de imagem de USF adequados para utilização em algumas modalidades dos métodos de imagem aqui descritos. Especificamente, os seguintes três sistemas de imagem USF foram testados: (1) um sistema de modo de onda contínua (CW), (2) um sistema de modo de domínio de frequência (FD) e (3) sistema de modo de domínio temporário (TD). As configurações do sistema e as sequências de tempo desses sistemas são mostradas nasFIGS. 21A-21G.

[0177] Com um sistema de modo CW, o ambiente de imagem (como o tecido biológico) é exposto ao HIFU continuamente por um curto período de tempo (na ordem de milissegundos). O laser de excitação é ativado ou ativado antes ou durante a exposição HIFU, gerando um sinal USF. A intensidade de fluorescência do sinal USF é então calculada em cada localização (ver FIG. 21A e FIG. 21B).

[0178] Com um sistema de modo FD, a exposição HIFU é modulada com uma frequência predeterminada por um breve período. Além disso, o sinal USF tem a mesma frequência que a frequência HIFU modulada. Ao usar um amplificador de bloqueio, o sinal USF modulado pode ser detectado com sensibilidade muito alta (FIG. 21C-21E). Além disso, a iluminação a laser também pode ser modulada para uma frequência relativamente alta, como de kHz a MHz, enquanto o sinal de ultrassom funciona em um modo CW (FIG. 21C-21E). Assim, o amplificador de bloqueio pode ser usado para detectar mudanças de sinal de fluorescência causadas pelo ultrassom. Além disso, o uso de um amplificador de bloqueio pode permitir uma alta sensibilidade do sistema ao sinal USF.

[0179] Com um sistema de modo TD, a exposição HIFU é contínua durante um curto período de tempo (na ordem de milissegundos), e o laser ilumina um pulso de picosegundo para excitar os agentes de contraste USF logo após o aquecimento HIFU ter terminado. Assim, o sinal USF emitido torna-se um pulso com uma largura na ordem de dezenas de nanosegundos devido à longa duração de fluorescência dos fluoróforos comutados (FIG. 21F e FIG. 21G). Em contrapartida, o ruído de fundo cai muito mais rapidamente devido à curta duração da fluorescência das espécies de fundo fluorescente. Portanto, usando uma técnica de detecção de tempo, o sinal de USF pode ser temporariamente separado do ruído de fundo por aquisição de apenas a porção de cauda do sinal. Assim, tanto a sensibilidade quanto a relação sinal/ruído são significativamente aumentadas em relação a outros métodos/sistemas.

[0180] Além disso, deve notar-se que, para evitar uma difusão térmica significativa no período de aquecimento, o tempo de exposição HIFU pode ser limitado a milissegundos, uma duração muito menor do que a constante de tempo de difusão térmica.

EXEMPLO 10 Método de criação de imagem fornecendo um SNR melhorado

[0181] Os métodos de imagem de acordo com algumas modalidades aqui descritas foram realizados da seguinte forma. Primeiro, uma série de fluoróforos comutáveis por ultrassom foram preparados de acordo com o Exemplo 7 acima. Os fluoróforos incluíram (1) um fluoróforo compreendendo ADPDICA encapsulado em nanocápsulas ou micelas formadas a partir de polímero Pluronic F127 e (2) um fluoróforo compreendendo ICG encapsulado em nanopartículas PNIPAM. Estes fluoróforos foram preparados de uma maneira semelhante à descrita nos Exemplos 7 e 8 acima. Os comprimentos de onda de pico dos dois fluoróforos diferentes foram aproximadamente 710 nm e 810 nm, respectivamente. Além disso, os comportamentos dinâmicos dos sinais da USF desses fluoróforos eram diferentes um do outro e também foram diferentes do ruído, conforme ilustrado na FIG. 22. Especificamente, FIG. 22A mostra um perfil de decaimento temporal do sinal USF do fluoróforo contendo ADPDICA. A FIG. 22B mostra o perfil de decaimento temporal do fundo ou sinal de ruído para o experimento de imagem usando o fluoróforo contendo ADPDICA. Similarmente, FIG. 22E mostra um perfil de decaimento temporal do sinal USF do fluoróforo contendo ICG. A FIG. 22F mostra o perfil de decaimento temporal do fundo ou sinal de ruído para o experimento de imagem usando o fluoróforo contendo ICG. Não pretendendo ficar ligado pela teoria, acredita-se que os diferentes perfis de decaimento temporal dos dois fluoróforos foram devidos a uma ou mais (1) das diferentes sensibilidades ambientais dos corantes fluorescentes; (2) as diferentes estruturas dos fluoróforos (por exemplo, micela versus nanopartícula); e (3) os diferentes polímeros termossensíveis utilizados para formar os fluoróforos. Os diferentes perfis de emissão dos diferentes fluoróforos comutáveis por ultrassom podem permitir imagem de USF multiplexadas.

[0182] Especificamente, deve notar-se que os perfis de emissão dos fluoróforos mostrados nas FIG. 22A e FIG. 22E têm uma forma única e consistente para determinadas condições experimentais, como as condições descritas acima. Deve ainda notar-se que, uma vez que o instrumento e as condições experimentais são fixados, a forma da curva dinâmica USF para um fluoróforo dado não muda e é independente da força do sinal. Cada sinal aumenta em intensidade para um valor de pico em um ponto de tempo fixo e depois decai ou reduz em intensidade. Em contraste, os sinais de fundo (FIG. 22B e FIG. 22F) flutuam de forma irregular e não exibem nenhuma correlação com outros sinais de ruído. Mais importante ainda, os sinais de fundo não exibem o mesmo perfil de decaimento temporal que os sinais de fluorescência de ultrassom exibem. Portanto, os sinais de fundo não estão fortemente correlacionados matematicamente com os sinais de fluorescência de ultrassom. Não pretendendo ficar limitado pela teoria, acredita-se que os diferentes perfis de decaimento temporal permitem que qualquer sinal USF seja selecionado como um sinal de referência para realizar uma análise de correlação de um sinal de fotoluminescência total detectado em um local específico dentro de um ambiente. Quando a correlação é realizada, um coeficiente de correlação (CrC) pode ser calculado. Verificou-se que os sinais relacionados ao USF possuem um CrC grande, enquanto os sinais de fundo possuem um CrC pequeno quando essa análise é realizada. Assim, o CrC pode ser usado para diferenciar um sinal de USF do ruído de fundo selecionando apropriadamente um limite de CrC, conforme descrito acima.

[0183] Na imagem USF de uma cor, um pequeno tubo de silicone (diâmetro interno: 0,31 mm; diâmetro externo: 0,64 mm) foi preenchido com uma solução aquosa de um fluoróforo descrito acima e incorporado em um pedaço de tecido muscular porcino. Esta estrutura destinava-se a simular um vaso sanguíneo como alvo para o experimento de imagem USF. A espessura do tecido foi de aproximadamente 12 mm. A distância entre o centro do tubo e a superfície superior do tecido foi de aproximadamente 6 mm. Um feixe de ultrassom focado foi usado para alternar externamente e localmente os fluoróforos dentro do tubo de um estado desligado para um estado ligado, conforme descrito mais detalhadamente. Os fótons de fluorescência emitidos foram coletados por um PMT refrigerado e com baixo ruído. Após a varredura raster da amostra com o feixe de ultrassom, as imagens do USF foram geradas da maneira descrita acima. Especificamente, para cada uma de uma pluralidade de localizações dentro da amostra, foi realizada uma análise de correlação para comparar o sinal de fotoluminescência detectado total com o sinal de referência. Neste caso, um sinal USF típico foi selecionado a partir da imagem USF para servir como um sinal de referência. O coeficiente de correlação foi calculado de acordo com a Equação (1) acima. Como o sinal de fundo não seguiu o padrão dinâmico exclusivo do sinal de referência, como mostrado na FIG. 22, o coeficiente de correlação para sinais de fundo foi zero, próximo a zero ou muito pequeno (como <0,3). Desta forma, o ruído pode ser significativamente suprimido pela multiplicação do sinal detectado que compreende o sinal de fundo com o coeficiente de correlação associado ao sinal de fundo para a localização relevante dentro do ambiente.

[0184] Desta forma, o SNR da imagem USF foi dramaticamente aumentado. Imagens USF antes e depois do processamento de correlação são mostradas nas FIG. 22 e FIG. 23. Especificamente, FIG. 22C/FIG. 23C e FIG. 22D/FIG. 23D ilustram o perfil espacial de emissão de fluorescência do fluoróforo baseado em ADPDICA antes e depois do processo de correlação/multiplicação, respectivamente. O SNR desses dois perfis foi calculado como 88 e 300, respectivamente. Da mesma forma, os perfis de emissão de fluorescência espacial do fluoróforo baseado em ICG antes e depois da análise de correlação são ilustrados nas FIG. 22G/FIG. 23A e FIG. 22H/FIG. 23B, respectivamente. Para o fluoróforo ICG, os SNRs foram 31 e 345 antes e depois da correlação, respectivamente.

EXEMPLO 11 Método de Imagem Multiplexado

[0185] Um método de imagem multiplexado de acordo com uma modalidade aqui descrita foi realizado da seguinte forma. Em primeiro lugar, os fluoróforos comutadores de ultrassom que contêm ICP contendo ADPDICA foram preparados como descrito acima no Exemplo 10. Em seguida, os fluoróforos anteriores foram criados usando um sistema de imagem semelhante ao descrito acima no Exemplo 2. A fonte de luz de excitação foi um laser de diodo com um comprimento de onda de excitação de 671 nm (MLL-FN-671). Um filtro de passagem de banda 673/11 (comprimento de onda central: 673 nm; largura de banda: 11 nm) foi aplicado como o filtro de excitação e três filtros de passagem longa (comprimento de onda da borda: 715 nm) e dois filtros absorventes de passagem longa (comprimento de onda da borda: 690 nm) foram utilizados como o filtro de emissão.

[0186] Para imagem de USF de duas cores, um pequeno tubo (diâmetro interno: 0,31 mm, diâmetro externo: 0,64 mm) foi incorporado em um fantasma de silicone disperso. O material de dispersão foi TiO2. A espessura do fantasma foi de aproximadamente 12 mm. O tubo preencheu uma mistura de 350 μL de uma solução aquosa do fluoróforo à base de ADPDICA e 250 μL de uma solução aquosa do fluoróforo à base de ICG. As duas soluções continham o mesmo peso de fluoróforo por volume de solução. Um feixe de ultrassom focado foi usado para ligar e desligar externamente e localmente os fluoróforos dentro dos tubos. Fótons emitidos foram coletados por um PMT refrigerado e com baixo ruído. Após a varredura raster com o feixe de ultrassom, os imagems do USF foram obtidos da maneira descrita acima.

[0187] Especificamente, os sinais de fotoluminescência detectados foram decompostos ortogonalmente em vetores de primeira base correspondentes a um sinal de fluorescência de ultrassom normalizado do fluoróforo baseado em ADPDICA e vetores de segunda base correspondentes a um sinal de ultrassonografia normalizado do fluoróforo baseado em ICG. Assim, para uma localização específica dentro do ambiente, um sinal de fotoluminescência detectado total poderia ser representado de acordo com a Equação (2):

em que "Mistura" representa o sinal de fotoluminescência total (representado como vetor), "ADPDICA" representa o vetor de base correspondente ao fluoróforo baseado em ADPDICA, "ICG" representa o vetor de base correspondente ao fluoróforo baseado em ICG e a e b são os coeficientes para os vetores de base. A FIG. 24 ilustra os sinais correspondentes à Equação (2) para uma localização específica. Especificamente, a FIG. 24A ilustra o sinal de componente do fluoróforo baseado em ADPDICA, a FIG. 24B ilustra o sinal componente do fluoróforo baseado em ICG, e a FIG. 24C ilustra o sinal de fotoluminescência detectado total. Usando um algoritmo de ajuste de curva em MATLAB, o coeficiente de base do vetor a estava determinado a ser 3,9, e o coeficiente de base do vetor b estava determinado a ser 2,6, dentro de 95% de confiança para uma localização dentro da amostra. A relação de a para b (3,9/2,6 = 1,5) foi próxima da composição da mistura (350/250 = 1,4).

EXEMPLO 12 Método de imagem usando uma pluralidade de transdutores de ultrassom

[0188] Um método de imagem usando uma pluralidade de transdutores de ultrassom de acordo com uma modalidade aqui descrita foi realizado como se segue. Além de usar uma pluralidade de transdutores de ultrassom, o seguinte método também incluiu imagem de modalidade dual usando uma combinação de imagem de USF e imagem de ultrassom (EUA).

[0189] O método foi realizado usando o sistema de imagem USF ilustrado na FIG. 25. No diagrama de blocos ilustrado na FIG. 25, MT é um gerador de atraso de pulso para enviar um gatilho mestre (T-1) com uma frequência de 0,1 Hz. O FG-1 é um gerador de função para gating (único ciclo, sinal de pulso com atraso de 0,5 ms) e disparo múltiplo (1-KHz, 300 ciclos, sinal de pulso) o módulo do transdutor HIFU duplo (dual-9 MHz- HIFU) e módulo transdutor de ultrassom (UST), respectivamente. O FG-2 é um gerador de função para acionar cada um dos HIFU duplos (HIFU-1 e HIFU-2) por meio de amplificadores de potência (RFA-1 e RFA-2), respectivamente, usando o sinal sinusoidal de 9 MHz. Pulso T/R é um transmissor de pulso e receptor para conduzir o UST. O FG-3 é um gerador de funções para modular, a uma frequência de 1 KHz, a fonte de laser de excitação (laser). W é um tanque de água para mergulhar o módulo dual HIFU-UST e mergulhar parcialmente a amostra (S). ST é um tubo de silicone de diâmetro interno (ID) 0,31mm e diâmetro externo (OD) 0,64mm. 3D-TS é um estágio translacional tridimensional (3D). O TS-MCU é uma unidade de controle motorizado em estágio translacional 3D. CT-1 é um tubo de colimação para focar a fonte de laser de excitação em um feixe óptico (OB-1). CT-2 é um tubo de colimação otimizado para guiar o sinal de fluorescência coletado de um feixe óptico (OB-2) dentro da amostra (S). PMT é um tubo foto-multiplicador para detectar o sinal de fluorescência óptica. O pré-amplificador é um pré-amplificador para filtrar o sinal óptico detectado do PMT. LIA é um amplificador de bloqueio para detectar o sinal de frequência de 1 KHz do sinal óptico detectado. NI-DAQ é um módulo de aquisição de dados do Instrumento Nacional para gravar sinal óptico. O digitalizador é um módulo de aquisição de dados do Instrumento Nacional para gravar o sinal de ultrassom. CB-1 é um barreamento de comunicação para transferir dados de sinal de ultrassom. CB-2 é um barreamento de comunicação serial para controlar TS-MCU. CB-3 é um barreamento de comunicação para transferir dados de sinal óptico. T-2 é um sinal de pulso com frequência de 1 KHz e serve como sinal de referência para LIA. T-3 é um sinal de pulso digital de ciclo único para desencadear o movimento de 3D-TS.

[0190] Mais geralmente, o sistema retratado na FIG. 25 pode ser compartimentado em quatro módulos. Os módulos incluem: (1) módulo de origem, (2) módulo de modelo de amostra, módulo de detecção (3) e (4) módulo de tradução. Cada um desses módulos é descrito em mais detalhes abaixo.

Módulo de origem

[0191] O módulo de origem pode ser compartimentado em três sub- módulos: (1) módulo de ultrassom, (2) módulo de ultrassom focado de alta intensidade e (3) módulo de laser de excitação. Cada um desses sub- módulos é descrito mais adiante.

Módulo de ultrassom

[0192] O módulo de ultrassom é usado para a obtenção da linha A em cada local durante a varredura, onde a varredura pode serrealizada ao longo de qualquer linha, plano ou plano 3D desejado e é regulada usando o módulo de tradução. Com a finalidade de obter imagens de ultrassom de alta resolução, um transdutor de ultrassom focalizado (UST) de 10 MHz (10MHz, V315, Olympus, Waltham, MA, EUA) foi empregado. Neste documento, um transdutor de ultrassom de elemento único foi selecionado por simplicidade de desenho. No entanto, se desejado, o transdutor de ultrassom de elemento único pode ser substituído por uma série de transdutores de ultrassom onde a focagem eletrônica pode ser realizada para imagens de setor de multiprofundidade e alcançar uma resolução mais aprimorada. A distância focal do UST é de aproximadamente 34 mm (cerca de 1,34 polegadas) e o diâmetro é de 19 mm (cerca de 0,75 polegadas). Um método de pulso-eco é empregado para a geração de imagens de ultrassom e é, portanto, conduzido por um gerador/receptor (5077RP, Olympus, NDT, Waltham, MA, EUA), que é acionado pelo primeiro canal de um gerador de função de 2 canais (FG-1, AFG 3252, Tektronix, TX, EUA). Múltiplos disparos obtidos por vários ciclos de pulso em cada explosão a partir do canal 1 da FG-1 em cada local de varredura são empregados para reduzir o ruído por mediação (detalhes adicionais são discutidos na seção de processamento de dados deste Exemplo).

Módulo de Ultrassom Focalizado de Alta Intensidade Duplo

[0193] Para o módulo de ultrassom focalizado de alta intensidade duplo, um segundo canal de gerador de função de 2 canais (FG-1) é usado como disparo de comutação para o segundo gerador de função (FG-2), que conduz os transdutores ultrassom focalizado de alta intensidade duplo (HIFU duplo) (HIFU, SU-109, Sonic Concepts Ltd, Bothell, WA, EUA). Os transdutores de HIFU duplo são projetados de modo que dois transdutores de HIFU de frequência de 9 MHz (diâmetro = 23 mm e comprimento focal = 35 mm) sejam montados em aproximadamente 45 graus para sua base, com 90 graus um para o outro, de frente um para o outro e aproximadamente 5 cm separados. A área de separação entre o HIFU duplo é projetada para ter um intervalo circular oco contínuo. Este espaço tem um diâmetro de 31,75 mm e é personalizado como tal para ter espaço suficiente para organizar um transdutor de ultrassom cujo diâmetro seja de 2 cm, com aproximadamente 0,5 cm de liberdade de movimento em ambos os lados. Durante o teste preliminar de HIFUs duplos, observou-se que as especificações de desempenho dos HIFUs são ligeiramente variadas. Portanto, para obter aproximadamente a mesma pressão de pico em seus respectivos focos de HIFU, os dois HIFUs são conduzidos em diferentes tensões. Os HIFUs duplos são conduzidos usando o sinal sinusoidal da respectiva amplitude (tensão pico-a-pico, Vpp) de um gerador de função de 2 canais (FG-2, Agilent 33500B, Chicago, IL, EUA). Cada um dos 2 canais está conectado aos seus amplificadores de energia dedicados para conduzir seus respectivos transdutores de HIFU de 9 MHz em configurações de HIFU duplo individualmente. Assim, o poder de condução amplificado gera pressões de pico mais altas em seus respectivos focos. Desta forma, as unidades de HIFU-UST são agrupadas e dispostas voltadas para cima (perpendiculares à mesa óptica), onde o UST está disposto no meio do HIFU duplo projetado de modo personalizado voltado para a amostra ou tecido desejados. A unidade agrupada é montada em um sistema de estágio de transição de 3 dimensões (3D-TS, VXM motor driven X-Slide assemblies, Velmex, NY, EUA) para a linha, plano ou varredura tridimensional desejados, usando um MATLAB GUI programado de modo personalizado. A duração do sinal de comutação do segundo canal do FG-1 controla a duração da exposição à HIFU, que, combinada com as tensões de direção desejadas do FG-2, fornece um método indireto para controlar variações de temperatura induzidas por ultrassons dentro da amostra ou tecido em estudo.

[0194] Um gerador de atraso de pulso é usado como o disparo principal, com frequência de 0,1 Hz, que aciona o gerador de função (FG-1) e o cartão de aquisição de dados (cartão NI-DAQ, PCIE-6363, National Instruments, Dallas, TX, EUA), controlando, portanto, ambas as operações de HIFU duplo e UST juntamente com o tempo de aquisição e varredura. Um atraso de 0,5 segundo é definido para o segundo canal do gerador de funções, FG-1, em comparação com o disparo imediato para o seu primeiro canal para fornecer tempo suficiente para que a geração de imagem de ultrassom seja completa. Isso garante que os sinais de HIFU de 9 MHz não sejam captados por UST de 10 MHz, uma vez que suas frequências estão próximas uma da outra.

Módulo de Laser de Excitação

[0195] O módulo de laser de excitação é o terceiro sub-módulo. Compreende um laser de onda contínua como fonte de excitação de fluoróforo. A fonte de excitação é usada para irradiar uma amostra desejada ou tecido em estudo por meio de um feixe óptico (OB-1 e OB-2, Modelo # 39366, Edmund optics, Barrington, NJ, EUA). Isto é obtido usando 808 nm (MGL-II-808-2W, Dragon lasers, JL, China) ou 671 nm (MLL-FN-671- 500mW, Optoengine LLC, Midvale, UT, EUA), dependendo da solução de corante/contraste usada para o estudo. No caso de uma fonte de laser de 808 nm, o perfil do feixe deste laser é retangular. Para o qual uma disposição simples de ter uma lente NIR plano-convexa (L1 & L2, Modelo # AC254-035-B, Thorlabs, Newton, NJ, EUA) para focar o feixe retangular em uma extremidade de um feixe óptico (OB- 1, Modelo # 39366) é empregada. Para o outro laser (laser CW de 671 nm), nenhuma lente é necessária porque a seção transversal do perfil do feixe é comparável ao feixe aberto de feixe óptico. Em ambos os arranjos, um filtro é colocado na frente da cabeça do laser para limitar o intervalo de onda de excitação, onde 785/62n m (FF01-785/62-25, Semrock, Rochester, NY, EUA) e 671/11 nm (FF01 -673/11-25, Semrock, Rochester, NY, EUA) são empregados, respectivamente. A outra extremidade do feixe óptico está disposta de modo que o laser de saída ilumine o mesmo lado do tecido sob a água onde a unidade de ultrassom está focada como descrito na FIG. 25. Dispor o feixe óptico a uma distância aceitável da amostra e cerca de 45 graus para a tabela óptica, juntamente com iluminação a laser divergente de saída, garante uma irradiação homogênea de mais do que a região desejada de amostra/tecido em estudo. O laser é conduzido a uma frequência de 1 KHz usando um gerador de função (FG-3,33220A, Agilent, Chicago, IL, EUA), uma vez que a geração de imagem de fluorescência dependente da frequência foi selecionada para este estudo. A saída de disparo do gerador de função FG-3 é usada como entrada de referência para o amplificador de bloqueio, de modo que apenas um sinal óptico de 1 KHz pode ser observado e registrado, aumentando assim a sensibilidade do sistema para o sinal óptico desejado.

Módulo de Amostra

[0196] O módulo de amostra consiste em preparação de amostras ou tecidos e as preparações de agente de corante/contraste. A preparação da amostra em relação ao módulo de HIFU-US duplo está ilustrada em FIG. 26, que ilustra uma versão miniaturizada de um diagrama de blocos de experiências, enfatizando a configuração do ultrassom e do módulo de amostra. Entrada-1: sinal de direção para transdutor de HIUF duplo (HIFU de 9 MHz, X HIFU-1 e HIFU-2 duplos); Entrada-2: o sinal de direção para o transdutor de ultrassom (UST); UST: transdutor de ultrassom de 10 MHz; ST: tubo de silicone incorporado na amostra (S) em que 1, 2 e 3 representam o tubo 1, tubo 2 e tubo 3, respectivamente; 3D-TS: estágios translacionais tridimensionais; W: tanque de água para mergulhar o módulo de HIFU-UST duplo.

[0197] A amostra de tecido porcino em estudo contém três tubos de silicone (60-011-01, Hellix Medical, Carpinteria, CA, EUA) embutidos a aproximadamente 5-6 mm de cada lado de grandes faces da amostra de tecido, ao longo da profundidade. A distância lateral entre dois tubos de silicone é de cerca de 2 mm de distância dentro do tecido. O HIFU duplo é focado no tubo 2 e a digitalização é feita em relação a esta posição. Antes da digitalização, as posições do tubo 2 em relação ao foco do US e ao foco de HIFU duplo são medidas e registradas. Esta incompatibilidade de localização 2D dos locais do tubo 2 entre os EUA e o foco de HIFU duplo precisa ser considerada na sobreposição do processamento de MATLAB de modalidade dupla. O tubo 1 contém solução de corante de ADP puro, o tubo 2 consiste em solução de razão de ICG: ADp (3:2) e o tubo 3 consiste em solução de corante de ICG. Todas as soluções são lavadas com taxa de injeção muito lenta usando sua respectiva seringa, onde a taxa de fluxo é de cerca de 0,1 polegadas por hora.

Material de Agente de Contraste de USF e Síntese

[0198] Materiais: N-isopropilacrilamida (NIPAM), N-terc- butilacrilamida (TBAm), dodecil sulfato de sódio (SDS), N, N'- metilenobisacrilamida (BIS), N, N, N', N'-tetrametil etilenodiamina (TEMED), Persulfato de amônio (APS), iodeto de tetrabutilamônio (TBAI), cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) e ICG foram adquiridos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Pluronicô F98 foi obtido a partir de BASF (Florham Park, NJ, EUA). Todas as substâncias foram usadas quando recebidas.

Síntese de Agentes de Contraste USF

[0199] (1) ICG NPs. Os PNIPAM NPs encapsulados com ICG foram sintetizados como descrito acima. (2) nanocápsulas de ADP (OH)2(fundo). Estas nanocápsulas foram preparadas como descrito anteriormente. Resumidamente, o Plurônico F98 foi dissolvido em água desionizada com a concentração de 50 mg/mL. O corante/TBAI (razão molar = 1: 6) foi dissolvido em clorofórmio e manteve-se em sonicação durante 30 minutos. A solução de corante foi então retirada na solução de Plurônico aquoso com agitação e depois foi dispersa com um sonicador durante 4 minutos. O clorofórmio foi evaporado para encapsular o corante nos núcleos hidrofóbicos das nanocápsulas de Plurônico. O corante livre foi removido usando filtros centrífugos Amicon Ultra (10000 de corte de peso molecular, Millipore, Billerica, MA, EUA).

Módulo de Detecção

[0200] O módulo de detecção é categorizado em três sub-módulos: (1) módulo de conjunto de filtro de tubo de colimação, (2) módulo de sensor óptico e (3) módulo de módulo de sensor pós-óptico.

[0201] (1) Um diagrama de blocos do tubo de colimação (CT-2) é ilustrado em FIG. 27. Na FIG. 27, L1: lente ultra-vermelha (NIR) plano- convexa para passar do sinal de fluorescência óptica do OB-2 (feixe óptico); LP1 e LP2: filtro óptico de passagem longa, 715LP e 830LP para a solução ADP e ICG respectivamente; RG1 e RG2: filtros de absorção, RG680 e RG808 para ADP e ICG, respectivamente; IR-1: íris para controlar a passagem ou a rejeição do sinal óptico colimado para o PMT; IR-2; íris aberta fixa que atua como um orifício na frente da PMT. Verificou-se surpreendentemente que resultados inesperadamente bons podem ser alcançados usando uma disposição de lente de filtro customizada que é organizada para minimizar o sinal de vazamento óptico e maximizar a eficiência de detecção de onda óptica maior (maior que a onda de excitação). Este arranjo de filtro-lente é denominado como disposição de tubo de colimação (CT) por conveniência. Um feixe de fibras ópticas é disposto, em estreita proximidade, perpendicularmente ao lado da face do tecido porcino que é exposto ao ar. Isso garante que a maior parte do sinal de fluorescência, juntamente com o sinal óptico de fundo, que é principalmente vazamento, é coletado por feixe aberto de feixe óptico, uma vez que seu ângulo de aceitação é de cerca de 60 graus. A outra extremidade do feixe óptico (OB-1), denominada como lado da amostra do tubo de colimação, destes feixes ópticos é fixada no ponto focal da lente NIR-plano-convexa (L1), de modo que o sinal óptico divergente do feixe óptico é feito paralelo ou colimado. Outra lente plano-convexa (L2) está disposta a aproximadamente 40 cm da extremidade da amostra do tubo de colimação voltada para uma direção oposta, de modo que o feixe óptico paralelo é focado em uma extremidade de sensor aberto do PMT arrefecido (H7422-20, Bridgewater, NJ, EUA). Este final do tubo de colimação é denominado o lado PMT do tubo de colimação. Neste documento, o tubo de colimação tem três seções, conjunto de filtro de amostra, conjunto de filtro do meio e o obturador. O filtro de fim de amostra é um filtro de passagem longa (LP1). Para o corante ADP, é usada uma passagem longa de 715 nm (FF01-715/LP-25, Semrock, Rochester, NY, EUA) e para o corante ICG, uma passagem longa de 830 nm (BLP01-830R-25, Semrock, Rochester, NY, EUA) é usada. O LP1 é montado logo após a lente de extremidade de amostra (L1). O conjunto de filtro do meio está disposto no centro do tubo colimado e consiste em três filtros, onde um filtro de passagem longa (LP2, o mesmo que LP1) está disposto entre dois filtros de absorção (RG1 e RG2). Uma íris de abertura zero (SM1D12SZ, Thorlabs, Newton, NJ, EUA) é usada como um obturador e é colocada em cerca de dois terços da distância entre as lentes L1 e L2 (medidas a partir da extremidade da amostra). Ao ajustar/variar o diâmetro da abertura da íris, o sinal óptico pode ser permitido ou obstruído completamente. Todas as três seções, juntamente com a lente do lado da amostra (L1) e a lente do lado PMT (L2), são conectadas por meio de uma lente de tubo para que o sinal óptico estranho e não relacionado seja totalmente rejeitado. Assim, o sinal óptico emergente do lado PMT do tubo de colimação é um sinal de fluorescência filtrada do agente de contraste com vazamento mínimo da fonte do laser de excitação e sinal óptico periférico indesejado. Conforme indicado acima, descobriu-se surpreendentemente que resultados inesperadamente bons podem ser alcançados usando uma disposição de lente de filtro customizada, como a descrita acima. Especificamente, descobriu-se que a detecção de um sinal de fotoluminescência usando um tubo de colimação com uma estrutura aqui descrita pode fornecer um SNR melhorado. Especificamente, pode ser vantajoso usar um tubo de colimação com uma primeira lente de colimação proximal (L1), uma segunda lente de colimação distal (L2) e um ou mais filtros dispostos entre a primeira e a segunda lentes de colimação, em que as primeiras lentes de colimação é separada dos filtros e/ou das segundas lentes de colimação por uma distância superior a 10 cm ou superior a 20 cm, como uma distância de 25-50 cm, 25-40 cm ou 30-40 cm.

[0202] (2) Um tubo foto-multiplicador refrigerado é usado como o sensor óptico com uma fonte de alimentação interna de alta tensão. As características desejadas deste sensor óptico são que sua resposta espectral está em uma faixa de 300 nm a 890 nm com variações de ruído térmico reduzidas e possui alta relação sinal-ruído (SNR) mesmo para sinais ópticos extremamente baixos. Uma íris é colocada na frente da cabeça de sensor de PMT arrefecida no comprimento focal das lentes plano-convexas (L2) e é bloqueada para uma abertura de 1 mm (cerca de 20%) de diâmetro, que atua como uma disposição de furo de pino para rejeitar o sinal óptico não essencial.

[0203] (3) O módulo de hardware do sensor pós-óptico consiste em pré-amplificador de baixa corrente de ruído (PreAmp, SR570, Stanford Research, Sunnyvale, CA, EUA) e um amplificador de bloqueio (LIA, SR830, Stanford Research, Sunnyvale, CA, EUA). O pré-amplificador atual converte a saída de corrente do PMT refrigerado em saída de tensão ao aplicar filtragem de hardware (com corte de cerca de 6 ou 12dB) e sensibilidade definida pelo usuário (desejada). A sensibilidade é definida como 50nA/V para permitir o sinal óptico de frequência de 1 KHz, uma vez que a fonte de excitação é modulada a 1 KHz, para passar sem obstrução. Ou uma passagem inferior de 10 KHz (com 12 dB) ou passagem de banda de 3Hz a 10 KHz (com 6dB) pode ser configurada para filtrar qualquer sinal ótico não essencial. A saída de sinal óptico filtrado do pré-amplificador é fornecida ao amplificador de bloqueio como entrada (a ser processada) e o sinal de referência é obtido/fornecido a partir da saída de sincronização do gerador de função (FG-3), que foi usado para modular o laser de excitação a uma frequência de 1KHz. A saída do amplificador de bloqueio consiste em dados e informações de amplitude e fase apenas do sinal óptico que tenha a frequência de 1-KHz preferida/desejada (uma vez que 1-KHz é dado como sinal de referência para LIA) em relação ao tempo. A saída LIA é determinada por sua configuração de dois parâmetros, constante de tempo e sensibilidade. A constante de tempo é configurada para 300 ms (maior que 1/2πf-0,159 ms para f = 1 KHz) garantindo a resposta acumulada lenta de LIA em relação ao tempo. A sensibilidade varia entre 20mV a 500mV dependendo da força do sinal, que é a derivação da resposta de fluorescência da solução de corante à variação da temperatura local dentro do tecido/amostra em estudo.

Módulo Translacional

[0204] Três estágios motorizados translacionais lineares de Velmex estão dispostos a ter capacidades de digitalização 3D para o sistema de desenho (3D-TS). O 3D-TS está conectado ao computador e é controlado usando a interface GUI MATLAB de criação personalizada. A GUI está programada para controlar vários aspectos do módulo 3D-TS, como tamanho do passo, aceleração, velocidade de varredura, plano de varredura, número de localização de varredura no plano de varredura, etc. O plano de verificação inclui recursos de varredura de plano 1D, 2D e 3D ao longo de todas as direções (direções x, y e z). O módulo HIFU-UST duplo é montado neste módulo 3D-TS para executar a varredura do alvo dentro da amostra de tecido. Todos os outros componentes do estágio da amostra são relativamente estacionários quando a digitalização é realizada.

Experimento

[0205] O experimento é dividido em dois conjuntos de varredura dependendo do comprimento de onda do laser de excitação e do seu respectivo conjunto de filtros para minimizar ou rejeitar o comprimento de onda de vazamento que interdepende da solução de corante usada com o alvo (tubos de silicone). Os tubos são numerados de 1 a 3. O tubo 1 contém ADP e o tubo 3 contém solução de corante de ICG. O tubo 2 contém a mistura de ICG e ADP na razão 3: 2. O módulo HIFU-US deve ser organizado perpendicularmente à consideração da amostra. O ponto focal do US e o ponto focal cruzado do USF são diferentes em aproximadamente 1,5 mm em 0,2 mm ao longo da profundidade e lateral, respectivamente, devido ao ajuste de limitação física do transdutor do US em relação ao módulo de HIFU duplo. O módulo de HIFU-US duplo é ajustado de modo que o ponto de foco cruzado do HIF duplo dual seja focado no tubo 2, que é o centro da amostra.

Tempo Operacional da Experiência

[0206] O disparo principal (AM), usando um gerador de atraso de pulso (DG645, Stanford Research, Sunnyvale, CA, EUA), é usado para desencadear o gerador de função (FG-1) e o cartão de aquisição de dados (NI-DAQ). O disparo principal inicia dois canais do gerador de função FG-1 para enviar o respectivo trem de pulso de comutação. O canal 1 do FG-1 é definido como um trem de pulso de 1-Khz com 8-16 pulso por disparo. Cada pulso do trem de pulso de 1-Khz atua como disparo externo para o gerador/receptor de pulso (pulsar, 5077PR, Olympus, Waltham, MA, EUA) para implementar o método de pulso-eco para aquisição de ultrassom. Uma vez que a velocidade de aquisição de pulso-eco de ultrassom e a transferência de dados em conjunto representam cerca de dezenas de microssegundos, a frequência de pulso de 1-Khz (cerca de 1 ms entre os pulsos) é suficiente para adquirir e registrar os dados de linha A do ultrassom. O sinal de ultrassom recebido (linha A) pelo pulsar é registrado usando o digitalizador (NI-USB 5133, National Instruments, Dallas, TX, EUA), ativado por pulsar, e múltiplos pulsos por disparo registram a linha A múltipla em um local de varredura único. A mediação dessas linhas A, reduzindo assim o ruído, é processada e armazenada como um arquivo matriz no local desejado no computador para cada local de varredura. Por outro lado, o canal 2 do gerador de função FG-1 é usado para a comutação do gerador de função FG-2, que é usado para conduzir o HIFU duplo. O canal 2 é configurado com um atraso de 500 ms para dar tempo suficiente para que a aquisição do US seja completada. Ao controlar a duração da largura de pulso do canal 2 e o número de pulsos por disparo usando o FG- 1 combinado com as voltagens de condução usadas, fazendo uso do gerador de função FG-2, os HIFUs duplos podem ser ligados e desligados conforme a energia de condução desejada. Portanto, é obtido um controle indireto sobre a temperatura reguladora dentro do tecido ou amostra.

[0207] O disparo principal desencadeia o NI-DAQ para iniciar sua aquisição e não é introduzido nenhum atraso, adquirindo assim o sinal óptico (sinal de USF) a partir do início do disparo principal. Para este estudo, dois canais do cartão de NI-DAQ são programados para gravar o sinal de saída do pré-amplificador PMT e a saída LIA no disparo a partir do disparo principal, que são a saída de sinal de fluorescência modulada e a saída de sinal de amplitude de sensibilidade de frequência de 1 KHz respectivamente. A duração típica da aquisição do sinal óptico é de cerca de 4-6 segundos se o LIA estiver configurado com uma constante de tempo de 300ms. Uma vez que a aquisição é registrada e armazenada em uma variável de matriz usando MATLAB, um disparo de pulso de software é gerado. Este disparo de pulso é enviado por meio da saída da porta de NI- DAQ para desencadear as etapas de translação 3D de Velmex para passar para o próximo local. Deve-se ter cuidado para garantir que a duração combinada da aquisição de DAQ (cerca de 4-6 segundos) e a duração da translação para o local de varredura seguinte (menos de 2 segundos) juntos não excedam a duração entre os disparos principais. Portanto, para este estudo, o disparo principal é ajustado para frequência de 0,1 Hz (cerca de 10 segundos). A transferência de dados de NI-DAQ para o sinal óptico de USF, e do digitalizador, para sinal de ultrassom, é significativamente rápida, a duração entre o disparo principal determina a duração entre duas localizações de varredura, determinando assim a duração geral da varredura e aquisição do sistema.

Processamento de Dados Processamento de Geração de Imagem de USF

[0208] A geração de imagem de fluorescência alternável é conduzida usando uma técnica de geração de imagem de fluorescência de domínio de frequência, onde a fonte do laser de excitação é modulada com a forma de onda desejada (1 KHz sinusoidal) e a fluorescência detectada irá também modular com a frequência de modulação da fonte de excitação. Desta forma, apenas o sinal de fluorescência de 1 KHz é o único desejado para ser processado e todos os outros sinais ópticos podem ser rejeitados. O sinal de fluorescência detectado é registrado usando PMT arrefecido e é fornecido ao LIA para aumentar a sensibilidade e especificidade do sinal de fluorescência. Portanto, a fluorescência detectada possui dois sinais de saída, saída do PMT e do LIA. Ambos são registrados pelos dois canais do módulo de aquisição de NI-DAQ.

[0209] O alvo dentro da amostra de tecido é um tubo de silicone de diâmetro interno (DI) de 0,36 mm e diâmetro externo (DE) de 0,61 mm. A solução de corante é circulada com uma taxa de fluxo lenta de 0,01 polegada por hora usando bomba de seringa para evitar a estagnação.

Saída de LIA - amplitude máxima versus linha inicial de amplitude

[0210] Conforme mencionado na seção de origem, o módulo LIA possui duas configurações principais de parâmetros que determinam a sensibilidade e especificidade do LIA: (1) Constante de tempo e (2) Sensibilidade. A constante de tempo é definida para 300 ms para o sinal óptico modulado de 1 KHz. Isso fornece uma resposta acumulada mais lenta do LIA ao sinal de amplitude de 1 KHz em relação ao tempo, resultando em maior razão sinal/fundo. Também há atrasos de 0,5 segundo entre o início do módulo de aquisição de dados de Ni-DAQ e o início do módulo de HIFU duplo que gera sinal de USF. Portanto, aproximadamente cerca de 0,5 segundo de aquisição de dados iniciais não possui sinal de USF que, portanto, pode ser usado como a linha de base ou o sinal de fundo. Os dados de USF são registrados por cerca de 4-6 segundos, dependendo da duração da condução de HIFU duplo ('ON'), cerca de 250 ms, que controla indiretamente a duração da temperatura induzida na amostra ou tecido em consideração. Deve-se notar que a combinação da duração e da amplitude com a qual o HIFU duplo é conduzido (correspondente à potência distribuída ao HIFU duplo) determina o aumento da temperatura dentro do tecido. Deve-se considerar também que o aumento da temperatura é gradual em relação à duração do HIFU duplo sendo ativo ou 'ON' e diminui gradualmente, uma vez que o HIFU duplo é inativo ou desligado 'OFF'. A taxa de aumento e diminuição do sinal de fluorescência induzido pelo HIFU é diferente e é mais lenta no caso de ser mais tardia. Essa taxa e quantidade de aumento de temperatura e, portanto, a resposta de fluorescência também depende das características físicas e térmicas intrínsecas do tecido e das especificações mecânicas e elétricas do HIFU duplo.

[0211] O sinal de referência para LIA é fornecido a partir do sinal de sincronização do gerador de função (FG-3), que é sinal de pulso de 1 KHz. A sensibilidade é ajustada para 20 mv ou 200 mv dependendo da solução de corante de geração de imagem de contraste usada para o estudo (ICG e ADP, respectivamente). A diferença do máximo do sinal de amplitude de saída de LIA e da primeira linha de base de 0,5 segundo é considerada como a variação de sinal de USF que corresponde diretamente às variações de temperatura de pico induzidas. Assim, uma intensidade de sinal de fluorescência absoluta correspondente à temperatura de pico no local de varredura é registrada e o processo é repetido para outros locais de varredura. Logo, é gerada uma imagem 2D cujos valores de intensidade da escala de cinza correspondem à temperatura máxima do sinal de USF em relação ao local físico dentro do tecido ou amostra em consideração.

[0212] Uma saída típica de detecção sensível à fase do LIA com seu sinal de entrada e referência correspondente é a seguinte:

[0213] O sinal é VSigsen (wrt+ θsig), onde Vsigé a amplitude do sinal, wr é a frequência do sinal e θsigé a fase do sinal enquanto o sinal de referência é VLsen (wLt+ θRef), onde VL é a amplitude de referência, wr é a frequência do sinal de referência e θRef é a fase do sinal de referência.

Extração de características

[0214] Uma vez que a imagem 2D de USF foi gerada, observou-se que a razão sinal/ruído de fundo foi relativamente baixa. Para aumentar o SNR da imagem de USF, um algoritmo de extração de recursos personalizado é adotado. O algoritmo de extração de recursos é categorizado em duas partes, geração de matriz de correlação e mapeamento de escala de cinza usando a função de energia. A matriz de correlação processada é então multiplicada para a imagem 2D de USF original para melhorar os recursos desejados e assim aumentar o SNR da imagem de USF que denominamos como imagem de USF processada.

Geração de Matriz de Correlação

[0215] A resposta dinâmica típica do sinal de fluorescência do corante ICG ou ADP no tubo embutido na amostra de tecido é tomada como o sinal de referência. Uma função de correlação de MATLAB geral é aplicada a cada um dos sinais correspondentes a cada um dos pontos de varredura na imagem de USF para se obter um valor de correlação entre -1 a 1, onde o negativo corresponde à relação oposta ao sinal de referência, 0 corresponde a nenhuma correlação e positivo corresponde a alta correlação com o sinal de referência. A função de correlação é regida pela seguinte fórmula de correlação cruzada:

onde R (X, Y) coeficiente de correlação cruzada de séries de sinal X (t) e Y (t), X (t) é o sinal de entrada, Y (t) é o sinal de referência e N é o tamanho da amostra de sinal.

Mapeamento de Escala de Cinza

[0216] Uma vez que a matriz de correlação ou imagem de correlação da imagem 2D original de USF é gerada e o algoritmo de extração de recursos é implementado na imagem de correlação 2D. O algoritmo de extração de recursos é regido pela seguinte fórmula de energia:

onde P0Ut(i,j)é o valor do pixel de saída, Pin(i,;)representa os valores de matriz de correlação, a e b são constantes. Ao selecionar valores mais altos para 'b' tipicamente 1000 a 100000 (um igual a 1), os recursos das imagens com valores de intensidade mais altos podem ser aumentados para ser ainda maiores, suprimindo os valores de intensidade mais baixos muito menores. Em geral, a escala de cinza dinâmica da imagem aumenta ainda mais. Esse processo é denominado mapeamento em escala de cinza. Isso garante que os valores de escala de cinza correlacionados, não correlacionados e, em alguns casos, baixos de escala de cinza sejam completamente suprimidos, portanto as intensidades altamente correlacionadas/escalas de cinza são destacadas.

Imagem de USF Processada: Aplicação da Matriz de Correlação Processada à Imagem de USF Original

[0217] A matriz de correlação mapeada com escala cinza é gerada e multiplicada pela imagem 2D de USF original, de modo que a imagem 2D deUSF resultante é uma imagem de USF processada com características de altas concentrações das regiões de fluorescência a serem destacadas.

[0218] O algoritmo acima mencionado é uma abordagem passo a passo para gerar uma imagem 2D de USF e enfatizando regiões de alta concentração fluorescente. Deve-se notar que as intensidades da imagem 2D de USF original não são processadas diretamente; em vez disso, uma matriz de correlação de imagem 2D de USF é processada. Portanto, as intensidades da imagem 2D de USF original podem ser recuperadas ou recalculadas a partir da imagem 2D de USF processada, simplesmente através da divisão da imagem de USF processada pela matriz de correlação processada em pixels.

Processamento de Imagem de US

[0219] O digitalizador é usado para registrar o sinal da linha A do ultrassom para uma alta taxa de amostragem (a taxa de amostragem máxima é de 100MS/seg). O digitalizador é controlado usando o MATLAB pelo qual está configurado para registrar 60 micro segundos de dados após um atraso de 20 segundos com o disparo. Isso garante que os primeiros 20 micro segundos do sinal de eco do US que contém o alto sinal de amplitude de eco a partir da superfície de UST e a água seja rejeitada. Portanto, se a velocidade média de ultrassom na água é considerada 1480 metros por segundo, então os 60 microssegundos de registro correspondem a aproximadamente 4,4 cm de informações de profundidade registradas.

Geração de Imagem de Linha A ao Modo B

[0220] A linha A em cada ponto de varredura é registrada e armazenada juntamente com a informação de coordenadas, como o local absoluto e a distância entre o ponto de varredura tanto ao longo das direções axiais como laterais. Uma vez que a linha A registrada tem a informação de eco de amplitude, ela é convertida em informações de envelope superiores depois de remover a mudança de linha de base. Ao longo de cada profundidade, o envelope de linha A, denominado como envelope de sinal do US, é empilhado em coluna em uma matriz que é armazenada como uma imagem 2D. Isso significa uma imagem de modo B ou imagem do US de modo de brilho, onde os valores de intensidades de escala de cinza correspondem às interfaces de incompatibilidade de impedância acústica mais altas, enfatizando assim a informação estrutural do ROI.

[0221] Deve-se notar que, para uma varredura em profundidade 2D (varredura XZ), o número de imagens de modo B geradas é igual ao número de linhas de varredura de profundidade, pois, para cada ponto de varredura de cada linha, possui um sinal de envelope de envelope 1D. A seleção do modo B que necessita ser observada é explica em detalhes em Sobreposição de USF e seção de imagem do US abaixo.

Extração de Local do Tubo por Algoritmo de Compatibilidade de Modelo Personalizado

[0222] Um algoritmo de compatibilidade de modelo personalizado é desenvolvido com base no método de correlação. Uma estrutura de tubo em uma imagem de modo B de ultrassom (US) é selecionada como modelo cuja dimensão é o diâmetro de seção transversal do tubo de silicone (OD = 0,64mm) mais 0,4 mm, garantindo assim o uso do tubo inteiro. Em seguida, a imagem original do modo B do US e os modelos são dados à 'normxcorr2', função embutida de MATLAB que gera uma matriz de correlação. Em seguida, um limiar é aplicado com ponto de corte no valor de correlação de 0,7, assim, os valores correlacionados negativos, zero e menores do que zero são suprimidos para zero. A matriz de correlação processada então gerada contém três regiões correspondentes à localização dos três tubos que estão incorporados dentro da amostra de tecido em consideração.

Geração de Imagem de Modalidade Dupla: Sobreposição de Imagem de USF à Imagem do US Sobreposição Direta de Imagem de USF Processada à Imagem de Modo B do US

[0223] A imagem 2D de USF processada é usada para sobreposição como uma imagem colorida na imagem em modo B em escala cinza usando o método direto de sobreposição de imagem usando a transparência, mas com pequenas modificações. O código de sobreposição é modificado para ter controle sobre o limite dos valores de intensidade de imagem de USF processados e o grau de transparência. O controle sobre o limiar é categorizado em dois métodos para minimizar ou remover caudas na imagem de USF e para mostrar regiões de fluorescência de concentrações mais altas.

[0224] Método 1: Este método usou um limiar definido de imagem de USF processada é determinado pelo ponto de corte entre 0 e 1. O valor determina a porcentagem de intensidade máxima na imagem (1 sendo 100 por cento da intensidade máxima da imagem inteira). Portanto, toda a porcentagem de intensidades acima do ponto de corte limiar é sobreposta à imagem em escala de cinza de modo B do US.

[0225] Método 2: Para a imagem de USF processada, um algoritmo morfológico generalizado personalizado é implementado usando o método de limiar. Um processo similar de limiar é implementado, mas com valores de corte menores. A imagem de USF então obtida é convertida em regiões de concentração de formação de imagem binária que são segregadas. Entre as regiões, as duas maiores áreas são selecionadas e o resto das regiões segregadas são removidas ou rejeitadas. A imagem binária processada então gerada age como uma máscara e é então multiplicada para a imagem de USF processada. Assim, as caudas da imagem de USF são consideravelmente reduzidas e as regiões de fluorescência de maior concentração são enfatizadas.

Observação

[0226] As operações morfológicas na imagem de USF processada com dois ou mais alvos (neste estudo, tubos de silício cheios de solução de corante, com ICG ou ADP) às vezes produziram regiões que não coincidem com o local do tubo. Não pretendendo ficar vinculado pela teoria, acredita- se que às vezes as regiões de cauda de dois tubos adjacentes estão próximas ou se sobrepõem, criando uma área que é maior que a área das regiões de alta concentração. Portanto, o algoritmo acima seleciona inadvertidamente as regiões sobrepostas das caudas para ser uma das maiores duas regiões na imagem de USF. Esta preocupação pode ser superada se as regiões de concentração fluorescente forem selecionadas com base no local dos tubos.

Sobreposição de Imagem de USF Guiada por US: Para Destacar Regiões de Concentração Maior de Imagem de USF

[0227] A implementação do algoritmo de correspondência de modelos na imagem de modo B do US produziu os locais ou regiões dos tubos. A imagem de modo B do US correlacionada processada então obtida é convertida em imagem binária. Essa imagem binária da matriz de correlação de modo B do US é usada como imagem de referência e a imagem binária da imagem de USF é usada como a imagem de entrada para uma função de MATLAB desenvolvida personalizada. Esta função seleciona as regiões que se cruzam entre as imagens de entrada e de referência e omite ou rejeita as outras regiões que não se cruzam. A imagem binária então obtida é usada para se multiplicar com a imagem de USF processada. Assim, as regiões de concentrações fluorescentes de USF que estão localizadas no local do tubo são selecionadas e são usadas no programa de sobreposição de imagem.

[0228] A modificação adicional do programa de sobreposição de imagem inclui a incorporação de duas imagens USF 2D processadas sobrepostas na imagem em modo B em escala de cinza, mas com cores diferentes. Esta codificação de cores ajuda a distinguir a diferente solução de corante usada nos tubos durante a imagem. A codificação de cor vermelha indica a amostra de ICG enquanto a de cor verde é para a amostra de ADP dispersa dentro do tubo. A terceira cor de amarelo é usada para enfatizar a região das duas imagens sobrepostas com áreas comuns de sobreposição, indicando que o tubo é preenchido com a mistura das duas soluções de corante (ICG e ADP).

Resultados e Discussão Geração de Imagem de USF para Alvo Único

[0229] Para um único alvo (tubo único) incorporado no experimento de amostra de tecido porcino, a espessura do tecido porcino usado para a experiência preliminar é de cerca de 4-5mm, a solução de corante usada é ADP e as especificações do tubo de silicone alvo são as seguintes: DI: 0,31mm e DE: 0,64mm.

[0230] A imagem 2D de USF gerada contém informações sobre a variação de temperatura e, portanto, as regiões de fluorescência na imagem de USF são os resultados diretos da temperatura induzida dentro da área focal do HIFU duplo. Portanto, a resposta de fluorescência à sonicação de HIFU duplo de um único tubo dentro do tecido mostra que possui regiões de fluorescência em forma de cruz dentro de uma imagem de USF. Esta região é representada para ter dois segmentos: (a) região central cruzada e (b) regiões de cauda. A região central cruzada é formada no local do tubo com a solução de corante e as regiões de cauda são as extremidades das áreas focais dos HIFUs individuais respectivos do módulo de HIFU duplo.

[0231] As regiões centrais transversais demonstraram ter intensidades de fluorescência relativamente maiores em comparação com quatro caudas. Esta observação é consistente com a hipótese de que as regiões transversais têm uma maior variação de temperatura, uma vez que as pressões dos HIFUs individuais são comparativamente maiores (têm interferência construtiva) na conjunção de duas regiões focais dos HIFUs duplos e são movimentos relativamente menores a partir da região central ao vértice ao longo do eixo principal das regiões focais.

[0232] Em um único estudo de HIFU-USF, observa-se que a FWHM da região de fluorescência da região alvo similar é a convolução do FWHM da região de pressão de HIFU e a seção transversal da região alvo (tubo de silicone) em que a solução de corante é dispersa. Neste estudo sobre HIFU duplo e USF, pode-se observar claramente que o FWHM da região de fluorescência é consideravelmente reduzido para cerca de 1-1,2 mm ao longo da profundidade e da direção lateral em comparação com o estudo anterior em que a FWHM é de cerca de 4-6 mm ao longo da profundidade e 1,2 - 1,5 mm ao longo da direção lateral. Portanto, o uso de HIFU duplo para imagens de USF pode ser visto para aumentar a resolução axial da imagem de USF. Em um caso, concluiu-se que a resolução ao longo da direção axial foi reduzida de 7,66 mm para 1,5 mm dessa maneira.

Geração de Imagem de USF com Três Alvos

[0233] Uma imagem de USF de uma série de alvos semelhantes (tubos de silicone) dentro de uma amostra de tecido porcino mais espesso, com cerca de 10-12mm de espessura, foi obtida juntamente com uma imagem do US. Especificamente, a imagem do US em modo B dá a informação estrutural quanto à forma e local dos três alvos e a imagem de USF fornece a informação fisiológica subjacente proporcional à concentração da solução de corante dispersa dentro dos tubos de silicone. Para experiências de alvo múltiplo, três tubos são considerados e organizados conforme discutido na seção de preparação da amostra. Os resultados apresentados neste documento usaram 808 nm de excitação a laser com o correspondente conjunto de filtros de ADP (830LP, filtro de passagem longa + RG780, filtro de absorção). Uma vez que o SNR da imagem de USF baseada em ADP é significativamente alto, o algoritmo de extração de recursos (correlação mais mapeamento de escala de cinza) não é aplicado e, portanto, os dados originais não processados são usados na sobreposição. No caso do ICG, o algoritmo de extração de recursos é aplicado para enfatizar as regiões de baixa concentração da imagem de USF baseada em ICG.

[0234] Observou-se que o tubo 1 não exibiu fluorescência, pois sua solução de ADP não foi excitada pela fonte laser de 808 nm. Por outro lado, os tubos 2 e 3 apresentaram fluorescência em resposta à sonicação com HIFU dupla, indicando a ocorrência do fenômeno de USF. A área e os níveis de intensidade de fluorescência variam a partir dos tubos 2 e 3 devido ao fato de que a concentração de ICG é diferente no tubo 2 (cerca de 3: 2 de ICG: ADP) em comparação com a solução de ICG não misturada no tubo 3. Os agrupamentos de concentração de fluorescência sobrepostos precisamente nas localizações dos tubos na imagem do US em modo B, confirmando ainda a presença de solução sensível de 808nm, solução de corante de ICG, dentro dos respectivos tubos. A imagem de USF sobreposta mostrou duas áreas de concentração diferentes/regiões de fluorescência. As regiões de fluorescência afastadas das localizações dos tubos são designadas como regiões da cauda e as regiões de alta concentração sobre os locais dos tubos são designadas como regiões de centro cruzado. Dependendo do limiar de ponto de corte escolhido, as regiões da cauda se tornam predominantes para valores menores e menos predominantes para valores maiores. Mas o ponto de corte maior implica que a maior concentração de fluorescência na imagem é exibida apenas, mas à custa de perder a informação circundante. É necessário preservar a máxima informação da imagem de USF, minimizando a informação das regiões da cauda de fluorescência. Para obter isto, operações morfológicas são realizadas para selecionar as regiões que estão próximas ou em cima dos locais dos tubos.

Geração de Imagem de USF Processada Usando Operações Morfológicas

[0235] As operações morfológicas envolvem a conversão da imagem de USF em imagem binária e, em seguida, selecionando as regiões de imagem binária que se sobrepõem com os locais dos tubos em modo B do US. A vantagem das operações morfológicas é que o limite de ponto de corte inferior pode ser escolhido. Mesmo que essa operação na imagem de USF tenha regiões de intensidade de fluorescência mais baixas, todas essas regiões serão removidas ou rejeitadas posteriormente, sendo, portanto, retida a maioria das informações de fluorescência de USF.

[0236] É evidente que a imagem binária da imagem de USF processada é composta por várias regiões. Por observação, pode-se deduzir que as pequenas regiões pertencem principalmente às regiões da cauda do sinal de USF consistindo em baixos valores de intensidade de fluorescência. Portanto, pode-se observar que as regiões da cauda de baixa fluorescência que não são óbvias na imagem de USF processada são evidentes na imagem binária e, em seguida, podem ser removidas para obter regiões de alta concentração, principalmente a seção transversal da imagem de USF. Dois métodos simplificados são usados para selecionar as regiões do centro de cruzamento de USF desejadas. O primeiro método é selecionar duas regiões maiores na imagem binária e o segundo método é usar o local dos tubos a partir da imagem do US de modo B para selecionar as regiões desejadas.

Método 1: Método Morfológico Simplificado.

[0237] Este método de seleção envolve a segmentação de todas as regiões na imagem binária separadamente em cada uma das suas próprias imagens binárias e também calcula a área dentro de cada região. As regiões são ordenadas em função da área. As duas maiores regiões e suas respectivas imagens binárias são selecionadas e adicionadas entre si e as restantes são ignoradas. A imagem ou máscara binária resultante contém apenas duas regiões localizadas precisamente em dois locais de tubos que são preenchidos com solução de ICG. Essas imagens binárias são multiplicadas por partes com a imagem de USF e, em seguida, sobrepostas à imagem em modo B do US. Uma desvantagem do método morfológico geral é que existe uma possibilidade em que uma das maiores duas regiões não se sobrepõe ao local do tubo. Este cenário é observado quando as regiões de cauda de dois tubos adjacentes às vezes se sobrepõem e formam regiões que são maiores do que a região central fluorescente de fluorescência do tubo 2. Portanto, é necessária uma modificação para incorporar o local do tubo em relação às seleções das regiões de fluorescência de USF.

Método 2: Método de Operação Morfológica Auxiliado do US.

[0238] Ao usar o algoritmo de correspondência de modelo explicado na seção de processamento de dados da imagem do US, os locais dos tubos alvo podem ser obtidos com precisão. Esta imagem é então corrigida para o tamanho da imagem de USF original e depois convertida em uma imagem binária. A imagem binária processada do US resultante é usada como imagem de referência para o algoritmo de operação morfológica para selecionar as regiões de interesse desejadas. A seleção das regiões é realizada simplesmente encontrando as regiões de interseção entre a imagem processada do US e a imagem binária processada de USF.

Realização de Geração de Imagem de Modalidade Dupla:

[0239] Para uma determinada amostra de tecido porcino, são registrados dois conjuntos de dados. O primeiro conjunto de dados é com excitação a laser de 671nm com o conjunto de filtros de ADP (715LP+ RG695) e o conjunto de dados de segundos é com excitação a laser de 808nm com o conjunto de filtros de ICG (830LP+ RG780). O resto dos módulos de experiência não são alterados. O processamento de imagem discutido acima também é aplicado ao conjunto de dados de USF de ADP e resultados semelhantes foram obtidos. A seção a seguir aborda a imagem de USF processada de ICG e de ADP à imagem de modo B do US. O cuidado extremo foi tomado para não alterar o local do módulo de USF do HIFU duplo e a amostra de tecido porcino para dois conjuntos de imagens de USF. Ambas as imagens de USF são normalizadas e o limite de 0,5 é aplicado tanto às imagens de USF.

[0240] Observou-se que as regiões de concentração de fluorescência de ADP foram confinadas em comparação com regiões de ICG. Isso é compreensível, uma vez que a resposta de fluorescência (sensibilidade) de ADP à mudança de temperatura é alta comparada à de ICG. Isso combinado com o fato de que o mesmo limite é aplicado à ambas imagens de USF normalizadas; as regiões de fluorescência são, portanto, muito limitadas no caso do tubo preenchido com ADP em comparação com o tubo preenchido com ICG. Deve-se notar que o tubo 2 é preenchido com uma mistura de ICG e ADP (na razão de 3:2). Todas as regiões de fluorescência são perfeitamente sobrepostas com os respectivos locais de tubos. No caso do tubo 2, mesmo que as duas imagens de USF processadas sobreponham-se precisamente, a ideia subjacente de enfatizar as intensidades de fluorescência a partir de ambas as imagens de USF é subestimada. Por isso, uma outra operação morfológica simples é empregada para selecionar a área comum das duas imagens processadas pelo USF e atribuir uma cor diferente para destacar a noção de que o tubo 2 é preenchido com a mistura de solução de ICG e ADP.

[0241] A imagem de modalidade dupla de USF e US combinada com algoritmo sobreposto de imagem modificada incorpora a ideia de usar a área comum de ambas as imagens binárias de USF processadas. Isso abrange a maioria (acima de 90%) das regiões de fluorescência central no local do tubo 2. Os níveis de intensidade das imagens de USF combinadas (PCombined(i,j)) são calculados pela soma do produto de suas respectivas intensidades ponderadas em seus respectivos locais de pixels, como mostrado pela fórmula abaixo:

[0242] Uma vez que as intensidades de fluorescência ponderadas combinadas são calculadas, estas são sobreposta nas imagens de USF de duas cores. Deve-se notar que a área comum de duas imagens de USF é feita zero ou removida na respectiva imagem de USF enquanto se sobrepõe, uma vez que seria sobreposta pela terceira imagem de USF ponderada combinada.

[0243] Além disso, pode-se realizar uma varredura em vários planos de profundidade semelhante a experiências anteriores, que posteriormente podem ser empilhadas em conjunto para formar dados tridimensionais que podem ser vistos posteriormente em qualquer plano desejado. Portanto, capturar e visualizar o perfil 3D de uma determinada região de interesse em qualquer ângulo ou plano desejado usando a modalidade dual de imagens de ultrassom e USF pode ser possível.

[0244] Várias modalidades da presente invenção foram descritas em cumprimento dos vários objetivos da invenção. Deve ser reconhecido que estas modalidades são meramente ilustrativas dos princípios da presente invenção. Numerosas modificações e adaptações serão facilmente evidentes para os versados na técnica sem se afastarem do sentido e do escopo da invenção.

Claims

1. Método de geração de imagem, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) dispor um primeiro fluoróforo comutável por ultrassom em um ambiente; (b) expor o ambiente a um feixe de ultrassom para criar uma região de ativação dentro do ambiente; (c) dispor o primeiro fluoróforo dentro da região de ativação para alternar o primeiro fluoróforo de um estado desligado para um estado ligado; (d) expor o ambiente a um feixe de radiação eletromagnética, excitando assim o primeiro fluoróforo; (e) detectar um primeiro sinal de fotoluminescência numa primeira localização dentro do ambiente, o primeiro sinal de fotoluminescência compreendendo pelo menos um dentre um primeiro sinal de fluorescência induzido por ultrassom emitido pelo primeiro fluoróforo e um primeiro sinal de fundo; (f) correlacionar o primeiro sinal de fotoluminescência com um primeiro sinal de referência para gerar um primeiro coeficiente de correlação para a primeira localização, em que o primeiro sinal de referência corresponde ao primeiro sinal de fluorescência induzido por ultrassom do primeiro fluoróforo; e (g) multiplicar o primeiro sinal de fotoluminescência pelo coeficiente de correlação para a primeira localização para gerar um primeiro sinal de fotoluminescência modificado para a primeira localização em que a correlação do primeiro sinal de fotoluminescência com o primeiro sinal de referência compreende a comparação de um perfil de decaimento de intensidade temporal do primeiro sinal de fotoluminescência com um perfil de decaimento de intensidade temporal do primeiro sinal de referência.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a exposição do ambiente ao feixe de radiação eletromagnética também excita pelo menos uma espécie de fundo fotoluminescente presente no ambiente.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro sinal de fundo compreende um primeiro sinal de fotoluminescência de fundo emitido por pelo menos uma espécie de fundo fotoluminescente.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o coeficiente de correlação para a primeira localização é gerado de acordo com a Equação (1):

em que pi,R é o coeficiente de correlação para a primeira localização, I(t) é o perfil de decaimento da intensidade temporal do primeiro sinal de fotoluminescência na primeira localização, R(t) é o perfil de decaimento da intensidade temporal do primeiro sinal de referência e N é o número do ponto de tempo em i(t) e R(t).

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o coeficiente de correlação para a primeira localização é um coeficiente de correlação binarizado.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: (en) detectar n sinais de fotoluminescência adicionais em n localizações adicionais dentro do ambiente, os n sinais de fotoluminescência adicionais compreendendo pelo menos um dentre um n sinal adicional de fluorescência induzido por ultrassom emitido pelo primeiro fluoróforo e um n sinal de fundo adicional; (fn) correlacionar os n sinais de fotoluminescência adicionais com o primeiro sinal de referência para gerar n coeficientes de correlação adicionais para as n localizações adicionais; e (gn) multiplicar os n sinais adicionais de fotoluminescência pelos n coeficientes de correlação adicionais para gerar n sinais de fotoluminescência modificados adicionais para os n locais adicionais, em que né um número inteiro entre 1 e 1000.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: (h) combinar o primeiro sinal de fotoluminescência modificado para a primeira localização, o segundo sinal de fotoluminescência modificado para a segunda localização e os n sinais fotoluminescentes modificados adicionais para as nlocalizações adicionais para gerar um gráfico espacial de fluorescência induzido por ultrassom emitida pelo primeiro fluoróforo dentro do ambiente.