JP6763114B2 - オオフトモモ抽出物を含むparp阻害剤 - Google Patents
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Description
これらのPARPは,その反応を介してDNA修復の遂行に密接に関係していると考えられており,2014年12月には,PARP阻害薬オラパリブ(Olaparib)が生殖細胞系BRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣がんの治療薬として,米国FDAにより承認された。
また,2016年1月,FDAは,あるタイプの遺伝子変異型前立腺癌患者に対して,オラパリブが画期的治療薬になると提唱している。
特に,PARP1は,塩基除去修復による単鎖切断(SSB)領域の修復および相同組換え(HR)による二本鎖切断領域の修復のいずれの過程においても,他の修復関連因子とともに必要とされる因子である。
二本鎖切断の修復過程には,BRCA1/2も関与し,これらの遺伝子に変異がみられる癌に対しては,DNA損傷を誘導する抗癌剤とPARP阻害薬の併用が,高い治療効果をもたらすとされており,近年,PARP1はBRCA1/2遺伝子変異陽性の卵巣癌の治療標的として注目されている(非特許文献1)。
しかしながら,オラパリブは,貧血症,疲労感,心臓に影響が出る悪心,嘔吐等,グレード3以上の重い有害事象が54%起きているとの報告もある。
また,細胞内部で損傷したDNAを修復するために,重要な2種類のタンパク質をコードするBRCA1遺伝子とBRCA2遺伝子に変異が生じると,BRCA遺伝子が胸や卵巣に癌を発達させる可能性(乳癌にかかるリスクが87%,卵巣癌にかかるリスクが50%であるといわれている。)が高くなり,最初の診断から10年以内に癌が再発するリスクも高くなる。
そのため,副作用が少なく効果が高いPARP阻害薬の開発が求められていた。
オオフトモモは,主にその果実が生食として利用されており,独特な見た目と酸味があり,リンゴのような味わいがある。
また,オオフトモモの葉は,長さ20cm程度の楕円形であるが,特段,利用の用途がないのが現状である。
本発明の第一の構成は,オオフトモモの葉抽出物を含むことを特徴とするPARP阻害剤である。
本発明の第二の構成は,前記抽出物が,5つの没食子酸ならびに開環した六炭糖の構造単位を有することを特徴とする第一の構成に記載のPARP阻害剤である。
本発明の第三の構成は,前記抽出物が,C-配糖体型エラジタンニンを有することを特徴とする第一の構成に記載のPARP阻害剤である。
本発明の第四の構成は,前記抽出物が,Castalagin,Vescalaginのいずれか又は複数からなることを特徴とする第一の構成に記載のPARP阻害剤である。
本発明の第五の構成は,第一から第四の構成に記載のPARP阻害剤を有効成分とすることを特徴とするBRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣ガン治療薬剤である。
本発明により,BRCA1/2変異乳癌や卵巣癌で苦しんでいる患者を,一刻も早く完治させるべく有益で安全なPARP阻害剤を提供できる。
すなわち,本発明のオオフトモモの葉から抽出した成分は,PARP阻害を可能とするものであり,また,そのメカニズムから,BRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣ガン治療薬剤としても期待できる。
一例をあげると,オオフトモモの葉,もしくは乾燥などの前処理を行った原料試料について,有機溶媒による抽出を行うなどである。
この場合の有機溶媒として特に限定する必要はなく,種々の有機溶媒を用いることができ,典型的には,エタノールを用いることができる。
抽出した後の有効成分を含む有機溶媒については,必要に応じ遠心による夾雑物の除去や濃縮,分液などの粗精製作業を行い,液体のまま,もしくは凍結乾燥などにより固体として保存すればよい(以下,「有効成分試料」という。)。
すなわち,有効成分中に含まれるPARP阻害を示す有効成分(以下,「PARP阻害化合物」)は,MSないしはNMRによる分析上,下記の構造的特徴を有するものである。
(1) 炭素原子数41,酸素原子数26以上,分子量934の化合物であり,15個の酸性水酸基を有する。
(2) NMR分析を行った際に,δ60-80に6本のシグナルが観測されるとともに,δ90-100にはシグナルが観測されない。
(3) NMR分析を行った際に,δ105-175に35本のシグナルが観測され,そのうち5本がδ165-175のカルボニル領域である。
しかるに,PARP阻害化合物は,必ずしも,これに限定する趣旨ではない。
すなわち,前述の(1)から(3)の特徴は,本願における実験例において確認された有効成分試料に含まれるPARP阻害化合物の一つに過ぎず,また,構造として別の異なる構造体を含む余地を残すものだからである。
有効成分試料からのPARP阻害化合物の精製については,PARP阻害化合物の精製が可能である限り特に限定する必要はなく,種々の精製方法を用いることができる。
典型的には,HPLCにより,PARP阻害化合物を含む画分を分取し,これを必要に応じ有機溶媒の蒸散や脱塩などを行い,さらに精製を行えばよい。
かかる薬剤については,PARP阻害化合物そのものが有効成分として機能する場合に加え,本発明の趣旨に鑑み,投与後,生体内において分子形を変化させてPARP阻害化合物が有効成分として機能する,いわゆるDDS化された場合も含まれるものである。また,これらPARP阻害化合物は,オオフトモモ葉を原料として抽出・精製したものを用いることができるが,本発明の趣旨を鑑み,化学構造を明らかにしたうえで,オオフトモモ葉からの抽出物ではなく,化学的に合成したものを用いても構わない。
1.162種類の沖縄自生植物の葉,実を用いて,これらからPARP阻害活性を有する成分を見出すことを目的に実験を行った。
2.図1に葉や実からの有用成分の抽出方法,図2にPARP阻害活性のアッセイ方法を示す。
PAR合成反応液(10μM NAD+,15μg/ml nicked DNA,50mM Tris-HCl buffer pH8.0,10mM MgCl2,0.25μg PARP1)を25℃,30分間反応させ,2MKOH,20%アセトフェノン(50μl)添加し,4℃,10分暗室で冷却後88%formic acid(225μl)を添加し,110℃で5分間熱処理して残存NAD+を蛍光誘導体化し,その蛍光強度を測定した。
4.PARP阻害活性の定義
上記PAR合成反応系を用いてPARP阻害活性を求めた。
PAR合成が進むとNAD+が消費されて蛍光強度が弱まる。
仮にPARP阻害物質を加えた場合,PARP活性が抑制され,NAD+の消費が抑えられ,結果として蛍光強度が強くなる。
そこで,PARP未添加と添加の両反応系の反応後の蛍光強度差を求め,その差をPARP活性100%(仮にA)とする。
一方,PARPとPARP阻害物質の共存下における反応後の蛍光強度と,PARP存在下の反応後の蛍光強度との差をBとする。
PARP阻害活性を便宜上B/A×100とした(図2)。
これら一連の実験により,比較的高いPARP阻害活性を示す3種類の抽出成分(63番,67番,103番)が見出され,そのうちの一つ(図3中,63番)が,オオフトモモの葉であり,以降,オオフトモモの葉に関して実験を行った。
1.図4及び5に,オオフトモモ葉からの成分抽出方法,ならびに有効成分の精製方法を示す。
この精製方法により,PARP阻害活性を有する画分として,2つの成分(AQ1,AQ2)を得た。
そして,2つの成分(AQ1,AQ2)についてMass,NMRによる分析を行い,その構造を明らかにすることを目的に実験を行った。
その結果,AQ1,AQ2は,それぞれVescalagin,Castalaginであることが推定されたが,AQ1,AQ2の単離は,次のとおり行った(以下,「Castalagin」はAQ2を,「Vescalagin」はAQ1を意味する。)。
(1)Castalaginの単離
レンブ(別名:オオフトモモ)の葉は,2014年に沖縄市の民家で採集し,60℃で乾燥後,粉砕(IKA社MF10,3000rpm カッターミル φ1mm篩)したものを使用した。
抽出は高速溶媒抽出装置(DIONEX社ASE-350)により,抽出試料90g(試料/セライト45:45)を100mLセル2本に45gずつ充填し,水を溶媒に,85℃,1500psi,静置時間10分,フラッシュ容量60%,パージ時間300秒で行った。
得られた水抽出液(250mL)は,室温に戻したのちODS(YMC社YMC-Pack ODS-AQ 120-S50)を充てんしたカラム(φ50mm×L100mm)で粗分離(溶媒系:0.1%ギ酸→0.1%ギ酸/アセトニトリル 80:20,流速27mL/分)を行った。
得られたcastalaginを含む画分(426mg)をゲルろ過(東ソー社TOYOPEARL HW40F,φ30mm×L300mm)により分離(水/アセトニトリル 75:25,流速6mL/分)し,粗castalagin (153mg)を得た。
この粗castalaginは最終的に向流クロマトグラフ(三鬼社CPC-LLB-M)により精製(1100rpm,水/n-ブタノール/n-プロパノール 100:45:55,上層移動相,流速2.5mL/分)し,106mgのcastalaginを薄褐色のアモルファスとして得た。
(2)Vescalaginの単離
レンブ(別名:オオフトモモ)の葉は2014年に沖縄市の民家で採集し,60℃で乾燥後,粉砕(IKA社MF10,3000rpm カッターミル φ1mm篩)したものを使用した。
試料70gを700mLのアセトン/水7:3で抽出(1日静置)したのち,遠心分離(3000rpm,30分)により固液分離した。
固体はさらに2回,700mLのアセトン/水7:3で抽出(1日静置)したのち,遠心分離(3000rpm,30分)による固液分離を行った。
3回の抽出操作により合わせて約2000mLの抽出液を得た。
この抽出液をろ過(東洋濾紙社 GA-100)後,減圧下アセトンを除去し,さらに濃縮を行い約500mLの水溶性抽出液を得た。
これを酢酸エチル500mLで分液を行い,その下相(水相)を減圧下で酢酸エチルを除去し,さらに濃縮を行い約250mLの抽出液を得た。
この抽出液をODS(YMC社YMC-Pack ODS-AQ 120-S50)を充てんしたカラム(φ50mm×L100mm)で粗分離(0.1%ギ酸→0.1%ギ酸/アセトニトリル 80:20,流速27mL/分)を行った。
得られたvescalaginを含む画分(463mg)をゲルろ過(東ソー社TOYOPEARL HW40F,φ30mm×L300mm)により分離(水/アセトニトリル 75:25,流速6mL/分)し,粗vescalagin (236mg)を得た。
この粗vescalaginは最終的にゲルろ過(東ソー社TOYOPEARL HW40F,φ30mm×L300mm)により精製(水/アセトニトリル 75:25,流速2.5mL/分)し,205mgのvescalaginを薄褐色のアモルファスとして得た。
これらの分析結果から,AQ1,AQ2,いずれもその分子量は,934であると考えられる。
δ60-80に6本のシグナル,δ90-100にシグナルが観測されないことから,AQ2は,開環した六炭糖の構造を有すると考えられる(図8,下)。
δ105-175に35本のシグナルが観測され,そのうち5本がδ165-175のカルボニル領域であることから,AQ2は,没食子酸の構造単位を5つ有すると考えられる(図8,下)。
炭素原子数41,酸素原子数26以上,分子量934であることから,AQ2の分子式はC41H26O26であると推定される。
水酸基をメチル化するジアゾメタン処理によるNMRの分析結果から,AQ2は,酸性の水酸基(フェノール性またはカルボン酸)が15あると推定される(図9,上)。
また,AQ1は,MSスペクトルがAQ2のそれとほぼ一致していることから,AQ2と異性体の関係にあるvescalaginもしくはcastalaginである可能性が高いと考えられた。
また,AQ1についてもAQ2と同様に,NMRスペクトルデータ,比旋光度及びUVスペクトルデータを基にcastalaginの異性体であるvescalaginのそれと比較したところ一致した。
したがって,AQ1は,vescalaginであると同定した(図10)。
なお,vescalagin及びcastalaginは,いずれもC-配糖体型エラジタンニンである。
1.AQ2について,その構造の安定性を知ることで,経口薬としての可能性を検討することを目的に実験を行った。
表に,各前処理の方法を簡潔に示す。
(1) AQ2は,酸の前処理を行ってもPARP阻害活性は中性処理の時とほとんど変わらず,AQ2は,酸に対して安定であることが分かった。
(2) 一方,アルカリ処理の場合は,その活性が著しく低下しており,AQ2自体がアルカリ処理によりその構造が変化していることが考えられ,アルカリに対しては,不安定であることが分かった。
3.これらの結果より,AQ2は,少なくとも酸に対しては安定であることから,経口薬剤としての設計が可能であることが示唆された。
1.AQ2が,既存のPARP阻害剤と比較して,どの程度のPARP阻害能を有しているかを確認することを目的に実験を行った。
3.図2のPARP阻害活性の測定方法に基づいて,AQ1,AQ2の阻害活性を調べるとともに,AQ2,既存のPARP阻害剤であるオラパリブのIC50値の算出を行った。
(1) AQ1,AQ2ともに同様の阻害活性を示し,IC50値は,0.8μg/mL(856nM)であった(図13,左)。
(2) 一方,同じ実験系にてオラパリブのIC50値を算出したところ,およそ15nMであった(図14)。
(3) なお,AQ1,AQ2の構造単位として没食子酸を有する可能性が高いことを述べたが,この没食子酸についても検討を行ったところ,10μMでもPARP阻害活性を示さなかった(図14)。
(1) AQ2は,オラパリブよりは低く,3-アミノベンズアミドを超える阻害能を有していた。
(2) なお,没食子酸は,前述の結果(図14)と同様,PARP阻害活性を示さなかった。
1.神経細胞芽腫細胞SH-SY5Yを対象細胞として用い,AQ1,AQ2によるPARP阻害を行った際,PAR合成がどのように変化するか調べることを目的に実験を行った。
電気泳動後,タンパクをPVDF膜に転写し,一次抗体に抗ポリADPリボース抗体を用いてタンパクに共有結合しているPAR鎖を検出した。
なお,PARP阻害剤のポジティブコントロールとしてオラパリブを用いた。
(1) コントロールである一番左の濃いラダー上に示されたバンドと比較して,3μg/mL濃度のAQ1ならびにAQ2の前処理によるバンドは薄くなっており,このことからPAR合成が阻害されていることが分かった。
(2) また,3μg/mL濃度と比較して,15μg/mL濃度のAQ1ならびにAQ2のバンドは濃くなっており,PARP阻害効果は,逆に抑制されている結果となっていた。この原因については,不明である。
(3) なお,10μMのオラパリブでは,PAR合成は強く阻害されていた。
1.紫外線照射によりDNA損傷を惹起し,このDNA損傷により誘発されるPAR合成が,AQ1等によりどのような影響を受けるかを明らかにすることを目的に実験を行った。
回復時間2時間経過後,回収した細胞から可溶性タンパクを調製し,実験例5の方法に従ってタンパク結合PAR鎖を検出した。
(1) DNA損傷のコントロールである左から2番のバンドと比較して,AQ1,AQ2による処理については,PAR合成は抑制されていなかった。
(2) 一方,オラパリブは,PAR合成を強く抑制していた。
1.AQ2が,どのような機序でPARP阻害を行っているかを明らかにすることを目的に実験を行った。
(1) AQ2を予めPARPと反応させる前処理の有無でAQ2の阻害活性を比較しても,その阻害活性効果はほとんど変わらなかった。
(2) また,いずれについてもAQ2の濃度依存的な阻害活性効果は変わっていなかった。
(3) これらの結果より,AQ2がPARP分子そのものに不可逆的に結合するなどの構造変化をもたらし阻害活性効果を発揮している可能性はないものと考えられた。
すなわち,PARPは,Znを必要とする酵素(Zn酵素)であることから,AQ2がZnをキレートにより捕捉し,PARP活性を低下させている可能性について,Znを必要とする酵素であるアルカリホスファターゼ(ALP)を対象として検討を行ったものである。
(1) 陰性対象であるDMSOと比較して,AQ2添加によるALP活性はほとんど変化しておらず,また,濃度を変更してもその影響は全く見られなかった。
(2) なお,オラパリブの添加を行っても,ALP活性は,変化していないことが分かった。
(3) これらの結果から,AQ2が,ZnをキレートすることでPARP阻害効果を発揮している可能性はないものと考えられた。
すなわち,PARPは,その活性の発揮に,10mM程度のMg2+を必要とする。
関与する反応は異なるものの,NheI,XhoIは,PARP同様,その活性の発揮に,10mM程度のMg2+を必要とすることから,これらを対象として検討を行ったものである。
(1) AQ1については,3μg/mL,15μg/mL,いずれの濃度でも,阻害作用は見られなかった。
(2) 一方,AQ2について,3μg/mLでは阻害作用は見られなかったものの,15μg/mLでは,部分的な阻害作用が見られた。
(3) なお,オラパリブについて,5μMの濃度で検討を行ったが,阻害作用は見られなかった(不図示)。
Claims (3)
- Castalagin、Vescalaginのいずれか又は両方を含むことを特徴とするPARP阻害剤。
- Castalagin、Vescalaginのいずれか又は両方が,オオフトモモの葉から得られたものであることを特徴とする請求項1に記載のPARP阻害剤。
- 請求項1又は2に記載のPARP阻害剤を有効成分とすることを特徴とするBRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣ガン治療薬剤。
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