JP6762713B2

JP6762713B2 - 酵素的に遊離可能な検出部を有する接合体による細胞検出

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Publication number: JP6762713B2
Application number: JP2015252842A
Authority: JP
Inventors: ドーゼクリスティアン; ブリーデンジェニファー; ミルテニーシュテファン; ロッケルトーマス; ルドルフヴェロニカ
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 2014-12-27
Filing date: 2015-12-25
Publication date: 2020-09-30
Anticipated expiration: 2035-12-25
Also published as: EP3037820A1; EP3037821A1; EP3037821B1; JP2020178705A; CN105738612A; US10197561B2; US20160187326A1; JP2016136937A; ES2968782T3

Description

本発明は、標的部または標的細胞を、検出部と酵素的に分解可能なスペーサーを介して連結された抗原認識部とを有する接合体で標識することによって、標的部もしくは標的細胞を、または細胞試料から検出または同定するための方法であり、ここで、前記標的部の検出後に、前記スペーサーは酵素的に分解され、それにより標識された標的部から少なくとも前記検出部が遊離される、前記方法に関する。

１または複数の抗体に接合された蛍光色素は、免疫蛍光分析のために通常使用されている。抗体、蛍光色素、フローサイトメーター、フローソーター、および蛍光顕微鏡に関する数多くの別形がこの二十年間で開発され、標的細胞の特異的な検出および単離が可能となっている。免疫蛍光技術における一つの問題は、蛍光放出の検出閾値であり、その検出閾値は、例えばより優れた検出器、フィルタシステム、レーザ、または改変された蛍光色素、すなわちより良好な量子収率を有する蛍光色素によって高めることができる。

蛍光標識は多岐にわたり使用されているが、決してそれが細胞の標識と検出の唯一の方法というわけではない。蛍光色素以外に、遷移金属同位体マスタグ標識または放射性同位体標識等の他の検出部が使用されている。それから、標識の検出は、マスサイトメトリーまたはシンチレーションアッセイで行われる。

注目抗原を標的とする蛍光色素−接合体を使用したフローソーティングで標的細胞を単離することで、高純度の標的細胞フラクションが得られる。一つの欠点は、ソーティング工程の後に、細胞は依然として、該ソーティング工程の間に検出および同定のために使用された蛍光色素−接合体で標識されているということである。

ＭＨＣマルチマーによる抗原特異的Ｔ細胞の単離について記載されるように、標識の配備は標的細胞に影響を及ぼすことがある（特許文献１（米国特許第７７７６５６２号明細書））。細胞の変質を避けるためには、最善には、検出および／またはソーティングの後に、蛍光部および抗原認識部を遊離させることが可能である。特許文献１（米国特許第７７７６５６２号明細書）は、可逆的ペプチド／ＭＨＣマルチマーまたはＦａｂ−ストレプタマーによる標的細胞の間接的な非共役的な標識に基づく可逆的な蛍光標識法を開示している。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩを有する低親和性のペプチド／ＭＨＣモノマーもしくはＦａｂモノマーはストレプトアクチンを介してマルチマー化することで、標的抗原について高い結合力を有する複合体が得られる。マルチマー（多量体）化およびモノマー（単量体）化の可逆性は、競合物であるビオチンの添加によって開始される。低親和性のペプチド／ＭＨＣモノマーもしくはＦａｂモノマーの解離の後に、抗原は相互作用相手から遊離される。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ／ストレプトアクチン−相互作用の他に、ＰＥＯ−ビオチン／抗ビオチン抗体相互作用を基礎とする可逆的な磁気的細胞分離のためにもう一つの間接的な結合相互作用が記載されている（特許文献２（欧州特許出願公開第２７２５３５９（Ａ１）号明細書））。

特許文献３（国際公開第２００８０９１８１００号パンフレット）は、酵素が蛍光色素用のアクチベーターとして作用し、該酵素の放射線に誘導される開裂によって前記色素が標的細胞から遊離されうる接合体を開示している。

１種より多くの細胞ポピュレーションまたは特定のサブポピュレーションを識別してターゲティングするための多重パラメータ標識に関して、これらの開発された可逆的な間接的なシステムは、図１および図２に示した欠点を表す。図１は、２種の細胞ポピュレーション（ＣＤ４およびＣＤ８）と、抗ＣＤ８−ＰＥＯ−ビオチン／抗ビオチン−ＡＰＣおよび抗ＣＤ４−ＰＥＯ−ビオチン／抗ビオチン−ＰＥとの接触によって得られる混合物を示している。ビオチン／抗ビオチン複合体の可逆的性質のため、得られる平衡は、２種ではなく４種の細胞−色素接合体を含む。得られる平衡は、複合体の動力学的特性および熱力学的特性によって決定され、異なる結合相手が交換された後に至り、それぞれの標的抗原は両方の蛍光部で蛍光標識されるに至る。特異的標識ではなくて、ほぼ予測できない混合物が得られる。図２ａおよび図２ｂは、この効果の２つの例を示している。その交換の度合いは、図２ａおよび図２ｂで裏付けられる抗ビオチン−蛍光色素−接合体の選択ならびに複合体の成分の濃度のようなパラメータに左右される。従って、可逆的な間接的なシステムを基礎とする可逆的な蛍光標識は、単一パラメータ標識のために適しているにすぎず、多重パラメータ標識のためには適していない。可逆的な間接的なシステムと比較して、共有結合された抗原認識部と検出部は、特異的標識をもたらし、多重パラメータを標的とする可能性を有する。ＣＤ４⁺標的細胞およびＣＤ８⁺標的細胞の、共有結合された抗ＣＤ４−ＰＥおよび抗ＣＤ８−ＡＰＣによる特異的標識の一例は、図２ｃに示されている。

抗原認識部と検出部との間の間接的な非共有結合的な相互作用の特異的競合に基づく可逆的なシステムの他に、磁気的細胞分離のために、幾つかの他の可逆的なシステムが開発された。分離後に標的細胞から磁気粒子を遊離させるための公知の方法は、機械的撹拌、または化学的もしくは酵素的に開裂可能な該磁気粒子へのリンカーである。例えば特許文献４（米国特許第６１９０８７０号明細書）および特許文献５（国際公開第９６／３１７７６号パンフレット）は、デキストランで被覆された、および／またはデキストランを介して抗原認識部に連結された磁気粒子を基礎とする磁気的細胞分離を開示している。単離された標的細胞の引き続いての磁気粒子からの開裂は、デキストラン分解酵素のデキストラナーゼの添加によって開始される。デキストランベースの磁気粒子の他に、特許文献６（米国特許第５７１９０３１号明細書）にデキストラン−蛍光色素−接合体の消化が記載されている。この場合に、デキストラン−蛍光色素−接合体の標識の度合いは、蛍光消光をもたらすのに十分に高い。従って、分解は蛍光放出シグナルの強化を伴い、それが酵素的消化工程の定量化のために使用される。

蛍光色素の接続による蛍光消光は、特許文献７（英国特許出願公開第２３７２２５６号明細書）にも記載されている。細胞は、複数の蛍光色素を含み、それらがリンカーを介して抗体に結合された接合体で染色される。高密度の蛍光色素は蛍光シグナルを消光することとなるので、特許文献７（英国特許出願公開第２３７２２５６号明細書）は、前記リンカーを酵素的に分解して前記接合体から蛍光色素を遊離することを記載している。遊離された蛍光色素は自己消光を受けないため、より強力な蛍光シグナルが、すなわちより良好な解像度が得られる。しかしながら、該蛍光シグナルは標的から解離された後に検出されるので、細胞表面上にある標的部の同定は、特許文献７（英国特許出願公開第２３７２２５６号明細書）による方法では不可能である。更に、得られる混合型の蛍光シグナルを特定の接合体および／または標的へと割り当てることができないので、１種より多くの標的を同時に検出することはできない。

蛍光シグナルの排除は、検体の逐次染色を基礎とする免疫蛍光技術のためには必要不可欠である。これらの技術は、標識と検出を同時に使用する標準的な手順と比較して、より高い多重化の可能性をもたらすと明らかになっている。しかしながら、これらの技術は、接合された蛍光部の光ブリーチング法または化学ブリーチング法（特許文献８（米国特許第７７４１０４５（Ｂ２）号明細書）、特許文献９（欧州特許第０８１０４２８（Ｂ１）号明細書）、または特許文献１０（独国特許出願公開第１０１４３７５７号明細書））による酸化分解を基礎としていて、検体に残る抗体による立体障害にさらされる。

蛍光シグナルを排除するための化学ブリーチング法の他に、特許文献１０（独国特許出願公開第１０１４３７５７号明細書）は、抗体の酵素的分解による蛍光シグナルの排除を提案している。抗体の酵素的分解は、抗体の構造に高度に左右されるとともに、酵素と抗体の「適合する」ペアの特異的選択を必要とする。

米国特許第７７７６５６２号明細書欧州特許出願公開第２７２５３５９（Ａ１）号明細書国際公開第２００８０９１８１００号パンフレット米国特許第６１９０８７０号明細書国際公開第９６／３１７７６号パンフレット米国特許第５７１９０３１号明細書英国特許出願公開第２３７２２５６号明細書米国特許第７７４１０４５（Ｂ２）号明細書欧州特許第０８１０４２８（Ｂ１）号明細書独国特許出願公開第１０１４３７５７号明細書

従って、本発明の課題は、生物学的検体の試料中または試料上で標的を特異的に標識および検出し、引き続き検出部を除去して、可逆的な標識をもたらし、および／または更なる異なる標識および検出のサイクルを可能にする方法を提供することであった。

驚くべきことに、酵素的に分解可能なスペーサーを介して検出部に連結された抗原結合部から構成される接合体を酵素的に分解でき、それにより、該検出部を生物学的検体から遊離させることができることが判明した。遊離後に、前記生物学的検体は、以前の標識の干渉を受けることなく、改めて同じまたは異なる接合体に供されうる。

従って、本発明の主題は、生物学的検体の試料中の標的部を検出するための方法であって、
ａ）一般式（Ｉ）Ｘ_n−Ｐ−Ｙ_m［式中、Ｘは、検出部であり、Ｐは、酵素的に分解可能なスペーサーであり、かつＹは、抗原認識部であり、かつｎ、ｍは、１から１００の間の整数であり、かつＸおよびＹは、Ｐに共有結合されている］を有する少なくとも１種の接合体を準備すること、
ｂ）前記生物学的検体の試料と少なくとも１種の接合体とを接触させることで、抗原認識部Ｙによって認識される標的部を標識すること、
ｃ）前記接合体で標識された標的部を、検出部Ｘにより検出すること、ならびに
ｄ）スペーサーＰを酵素的に分解することにより、検出部Ｘを前記接合体から開裂させること、によって行う前記方法である。

本発明の方法により、１または複数の異なる標的部を、同時にまたは逐次的に、検出部に由来するシグナルにより特異的に検出し、引き続き分析後に該検出部を遊離させる、迅速かつ確実な方法が提供される。該方法による検出部の「酵素的な消光」は、生物学的検体の分析のためのより迅速かつより侵襲性の低いプロトコールを可能にする。先行技術と比較して、本発明の方法は、注目対象物に有害なことがある反応性酸素種、高エネルギーまたは高熱の導入を避け、同時に、多重の標的部を可逆的に標識することを可能にする。更に、該接合体の分解／解体によって、多数の染色（検出）サイクルが用いられる場合に、ほとんど立体障害は認められない。

図１は、先行技術によるビオチン／抗ビオチン相互作用を基礎とする間接的な標識システムによる可逆的染色を示している。図２は、平衡状態における、ビオチン／抗ビオチン相互作用を基礎とする間接的な標識システムによる細胞の多色染色を示している。図３は、高親和性（ａ）または低親和性（ｂ）の抗原認識部Ｙ、酵素的に分解可能なスペーサーＰ、および検出部Ｘの接合体による、生物学的検体としての標的細胞の特異的標識による本発明の方法を図示している。図４は、種々の抗原認識部と検出部を有する本発明による接合体による３パラメータのフローサイトメトリー分析の結果のドットプロットを例示している。図５は、種々の抗原認識部と検出部を有する本発明による接合体による５パラメータのフローサイトメトリー分析の結果のドットプロットを例示している。図６は、種々の抗原認識部と検出部を有する本発明による、逐次的に２パラメータを標識する接合体の画像を示している。異なる細胞表面マーカーが細胞上に局在してよく、それにより異なる細胞ポピュレーションまたはサブポピュレーションの測定が可能となる。図７は、種々の抗原認識部と検出部を有する本発明による、同時に５パラメータを標識する接合体の画像を示している。異なる細胞表面マーカーが細胞上に局在してよく、それにより異なる細胞ポピュレーションまたはサブポピュレーションの測定が可能となる。

詳細な説明
検出部Ｘおよび抗原認識部Ｙは、酵素的に分解可能なスペーサーＰに、共有結合または準共有結合されていてよい。用語「共有結合または準共有結合」は、解離定数≦１０^-9Ｍを有するＸとＰとの間の結合およびＹとＰとの間の結合を指す。

用語「検出部Ｘおよび／または抗原認識部Ｙの接合体からの開裂」は、ＸとＰとの間の結合が抑制されて、検出部Ｘおよび／または抗原認識部Ｙが、例えば解離または洗浄によって標的から取り除かれうることを意味する。

図３は、高親和性（ａ）または低親和性（ｂ）の抗原認識部Ｙ、酵素的に分解可能なスペーサーＰ、および検出部Ｘの接合体による、生物学的検体としての標的細胞の特異的標識による本発明の方法を図示している。スペーサーが酵素的に分解されると、高親和性の抗原認識部、例えば抗体は、安定な結合をもたらし、それにより検出部ＸおよびスペーサーＰが除去される（ａ）。低親和性の抗原認識部は、分解の間に単量体化されることとなる。低親和性の抗原認識部の解離後に、抗原は検出部Ｘ、スペーサーＰ、および抗原認識部Ｙから除去される（ｂ）。

本発明の方法は、ステップａ）〜ｄ）の１または複数の序列で行うことができる。各序列の後に、前記検出部と、場合により前記抗原認識部は、前記標的部から遊離（除去）される。特に生物学的検体が更に加工されるべき生細胞であるとき、本発明の方法は、無標識の細胞が得られるという利点を有する。

各ステップａ）〜ｄ）の後および／または前に、洗浄ステップｅ）が、結合されなかった接合体または遊離された検出部のような不所望な材料を試料から除去するために実施されてよい。

標的部
本発明による方法で検出されるべき標的部は、組織切片、細胞集合体、懸濁細胞、または付着細胞のような生物学的検体のいずれに存在してもよい。それらの細胞は生細胞であっても死細胞であってもよい。好ましい標的部は、生物学的検体、例えば、無脊椎動物（例えば、線虫、キイロショウジョウバエ）、脊椎動物（ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル）、および哺乳動物（ハツカネズミ、ヒト）の、動物全体、臓器、組織切片、細胞集合体または単一細胞に、細胞内または細胞外で発現された抗原である。

検出部
前記接合体の検出部Ｘは、検出目的に使用できる特性または機能を有する任意の部、例えば発色団部、蛍光部、リン光部、発光部、吸光部、放射性部、および遷移金属同位体マスタグ部からなる群から選択される部であってよい。

適切な蛍光部は、免疫蛍光技術、例えばフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法の技術から公知の蛍光部である。本発明のこれらの実施形態においては、前記接合体で標識された標的部は、検出部Ｘを励起させ、得られた放出（光ルミネセンス）を検出することによって検出される。この実施形態においては、前記検出部Ｘは、好ましくは蛍光部である。

有用な蛍光部は、タンパク質ベースの蛍光部、例えばフィコビリタンパク質、ポリマー型蛍光部、例えばポリフルオレン、小分子有機色素、例えばキサンテン、例えばフルオレセインもしくはローダミン、シアニン、オキサジン、クマリン、アクリジン、オキサジアゾール、ピレン、ピロメテン、または有機金属錯体、例えばＲｕ錯体、Ｅｕ錯体、Ｐｔ錯体であってよい。単分子実体の他に、蛍光性タンパク質または小分子有機色素のクラスター、ならびにナノ粒子、例えば量子ドット、アップコンバーティングナノ粒子、金ナノ粒子、色素付加ポリマーナノ粒子を、蛍光部として使用することもできる。

光ルミネセンス検出部のもう一つの群は、励起後の光の時間遅延型放出を伴うリン光部である。リン光部は、有機金属錯体、例えばＰｄ錯体、Ｐｔ錯体、Ｔｂ錯体、Ｅｕ錯体、またはリン光性顔料が導入されたナノ粒子、例えばランタニドドープされたＳｒＡｌ₂Ｏ₄を含む。

本発明のもう一つの実施形態においては、前記接合体で標識された標的は、照射による事前励起なくして検出される。この実施形態においては、前記検出部は、放射性標識であってよい。それらは、非放射性同位体を、その放射性対応物、例えばトリチウム、³²Ｐ、³⁵Ｓもしくは¹⁴Ｃと交換することによるか、または共有結合された標識、例えばチロシンに結合された¹²⁵Ｉ、フルオロデオキシグルコース内の¹⁸Ｆ、もしくは有機金属錯体、すなわち⁹⁹Ｔｃ−ＤＴＰＡを導入することによる、放射性同位体標識の形であってよい。

もう一つの実施形態においては、前記検出部は、化学発光を引き起こすことが可能である。すなわちルミノールの存在下のセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識である。

本発明のもう一つの実施形態においては、前記接合体で標識された標的は、放射線放出によっては検出されずに、紫外線、可視光もしくは近赤外線の吸収によって検出される。適切な吸光性検出部は、蛍光放出を有さない吸光性色素、例えば小分子有機クエンチャー色素、例えばＮ−アリールローダミン、アゾ色素およびスチルベンである。

もう一つの実施形態においては、前記吸光性検出部Ｘを、パルスレーザ光によって照射して、光音響シグナルを発生させることができる。

本発明のもう一つの実施形態においては、前記接合体で標識された標的は、遷移金属同位体の質量分析的検出によって検出される。遷移金属同位体マスタグ標識は、共有結合された有機金属錯体またはナノ粒子成分として導入できる。ランタニドおよび隣接する後期遷移元素の同位体タグが当該技術分野で知られている。

検出部Ｘは、スペーサーＰに共有結合、または非共有結合されていてよい。共有結合または非共有結合のための方法は、当業者に公知である。検出部ＸとスペーサーＰとの間で共有結合される場合に、検出部もしくはスペーサーＰにある活性化された基と、スペーサーＰもしくは検出部Ｘにある官能基とを直接的に反応させること、またはヘテロ二官能性リンカー分子を介して、該分子をまず一方の結合相手と反応させて、次にその他の結合相手と反応させることが可能である。

例えば、実体への連結のために多数のヘテロ二官能性化合物が入手可能である。例証される実体には、アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）、ビススルホスクシンイミジルスベレート、ジメチルアジピミデート、ジスクシンイミジルタートレート、Ｎ−ｙ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）ポリエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）、およびスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレートが含まれる。好ましい連結基は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）、または４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）であって、検出部に反応性スルフヒドリル基を有し、スペーサーＰに反応性アミノ基を有するものである。

検出部ＸとスペーサーＰとの準共有結合は、解離定数≦１０^-9Ｍをもたらす結合システム、例えばビオチン−アビジン結合相互作用で達成できる。

酵素的に分解可能なスペーサーＰ
酵素的に分解可能なスペーサーＰは、特定の酵素、特にヒドロラーゼによって開裂可能な任意の分子であってよい。酵素的に分解可能なスペーサーＰとして適しているのは、例えば多糖類、タンパク質、ペプチド、デプシペプチド、ポリエステル、核酸およびそれらの誘導体である。

適切な多糖類は、例えばデキストラン、プルラン、イヌリン、アミロース、セルロース、ヘミセルロース、例えばキシランまたはグルコマンナン、ペクチン、キトサンまたはキチンであり、それらは、誘導体化することで、検出部Ｘおよび抗原認識部Ｙの共有結合または非共有結合のための官能基をもたらすことができる。様々なそのような改変は当該技術分野で公知であり、例えばイミダゾリルカルバメート基は、多糖とＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールとを反応させることによって導入することができる。引き続き、アミノ基を、このイミダゾリルカルバメート基とヘキサンジアミンとを反応させることによって導入することができる。多糖類は、過ヨウ素酸塩を使用して酸化させることで、アルデヒド基をもたらすことができ、またはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジメチルスルホキシドで酸化させることで、ケトン基をもたらすこともできる。アルデヒドまたはケトン官能基は、引き続き好ましくは還元的アミノ化の条件下でジアミンと反応させることでアミノ基が得られるか、またはタンパク質様の結合部にあるアミノ置換基と直接的に反応させることができる。カルボキシメチル基は、多糖をクロロ酢酸で処理することによって導入することができる。カルボキシ基を当該技術分野で公知の方法により活性化させ、それにより活性化されたエステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはテトラフルオロフェニルエステルを得ることで、ジアミンのアミノ基と反応させてアミノ基を得ることも、またはタンパク質様の結合部のアミノ基と直接的に反応させることもできる。一般的に、アルキル基を有する官能基は、多糖類をハロゲン化合物でアルカリ性条件下で処理することによって導入することができる。例えば、アリル基は、臭化アリルを使用することによって導入することができる。アリル基は、更に、システアミン等のチオールを有する化合物とのチオール−エン反応において使用することでアミノ基を導入することができ、またはジスルフィド結合の還元によって遊離された、もしくは例えば２−イミノチオランによるチオール化によって導入されたチオール基を有するタンパク質様の結合部と直接的にチオール−エン反応において使用することができる。

酵素的に分解可能なスペーサーＰとして使用されるタンパク質、ペプチド、およびデプシペプチドは、アミノ酸の側鎖官能基を介して官能化することで、検出部Ｘおよび抗原認識部Ｙを結合させることができる。改変に適した側鎖官能基は、例えばリシンによって提供されるアミノ基であるか、またはシステインによってジスルフィド架橋の還元後に得られるチオール基である。

酵素的に分解可能なスペーサーＰとして使用されるポリエステルおよびポリエステルアミドは、側鎖官能性をもたらすコモノマーを用いて合成でき、または後に官能化させることもできる。分岐したポリエステルの場合には、官能化は、カルボキシルまたはヒドロキシル末端基を介して行うことができる。ポリマー鎖の重合後官能化は、例えば不飽和結合の付加、すなわちチオレン反応もしくはアジド−アルキン反応を介して、またはラジカル反応による官能基の導入を介して行うことができる。

酵素的に分解可能なスペーサーＰとして使用される核酸は、好ましくは、検出部Ｘおよび抗原認識部Ｙの付着のために適した３’末端および５’末端に官能基を伴って合成される。例えばアミノまたはチオール官能価をもたらす核酸合成のための適切なホスホラミダイト構成単位は、当該技術分野で公知である。

酵素的に分解可能なスペーサーＰは、同じ酵素または異なる酵素によって分解可能な１つより多くの異なる酵素的に分解可能な単位から構成されていてよい。

抗原認識部Ｙ
用語「抗原認識部Ｙ」は、細胞に細胞内または細胞外で発現された抗原のような、生物学的検体に発現された標的部に対する任意の種類の抗体、フラグメント化抗体、またはフラグメント化抗体誘導体を指す。前記用語は、完全にインタクトな抗体、フラグメント化抗体、またはフラグメント化抗体誘導体、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、ジｓｃＦｖ、ナノボディーに関する。そのようなフラグメント化抗体誘導体は、これらの種類の分子を含む共有結合および非共有結合の接合体を含めて組み換え法によって合成することができる。抗原認識部の更なる例は、ペプチド／ＭＨＣ複合体を標的とするＴＣＲ分子、細胞接着受容体分子、共刺激分子のための受容体、人工的にエンジニアリングされた結合分子、例えば細胞表面分子を標的とするペプチドまたはアプタマーである。

本発明の方法で使用される接合体は、１００個までの、好ましくは１〜２０個の抗原認識部Ｙを含んでよい。抗原認識部と標的抗原との相互作用は、高親和性であっても、低親和性であってもよい。単独の低親和性の抗原認識部の結合相互作用は、低すぎて抗原と安定な結合をもたらすことができない。低親和性の抗原認識部は、酵素的に分解可能なスペーサーＰへの接合によって多量体化することで、高い結合力を提供することができる。前記スペーサーＰがステップｄ）において酵素的に開裂されると、低親和性の抗原認識部は単量体化されることとなり、それにより、検出部Ｘ、スペーサーＰ、および抗原認識部Ｙの完全な除去がもたらされる（図３ｂ）。高親和性の抗原認識部は安定な結合を提供し、それにより、ステップｄ）の間に検出部ＸおよびスペーサーＰの除去がもたらされる。

好ましくは、用語「抗原認識部Ｙ」は、生物学的検体（標的細胞）によって、細胞内で発現される抗原、例えばＩＬ２、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１５４、または細胞外で発現される抗原、例えばＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ３４、ＣＤ５６、およびＣＤ１３３に対する抗体を指す。

抗原認識部Ｙ、特に抗体は、側鎖アミノ基またはスルフヒドリル基を通じてスペーサーＰへと結合されうる。幾つかの場合において、抗体のグルコシド側鎖を過ヨウ素酸塩によって酸化させて、アルデヒド官能基を得ることができる。

抗原認識部Ｙは、スペーサーＰに共有結合、または非共有結合されていてよい。共有結合または非共有結合のための方法は、当業者に公知であり、検出部Ｘの接合について挙げたのと同じものである。

本発明の方法は、特に、複合体混合物からの特定の細胞型の検出および／または単離のために有用であり、ステップａ）〜ｄ）の１つより多くの逐次的な序列または並行した序列を含んでよい。該方法は、様々な接合体の組み合わせを使用することができる。例えば、接合体は、２つの異なるエピトープに特異的な抗体、例えば２つの異なる抗ＣＤ３４抗体を含みうる。複数の異なる抗原は複数の異なる抗体、例えば、２つの別異のＴ細胞ポピュレーションの間の区別のために抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体を含む複数の異なる接合体により、または制御性Ｔ細胞のような異なる細胞サブポピュレーションの区別のために抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ２５抗体を含む複数の異なる接合体により対処されうる。

酵素
遊離剤としての酵素の選択は、酵素的に分解可能なスペーサーＰの化学的性質によって決定され、これは１種の酵素または異なる酵素の混合物であってよい。酵素は好ましくはヒドロラーゼであるが、リアーゼまたはレダクターゼも可能である。例えば、スペーサーＰが多糖である場合に、グリコシダーゼ（ＥＣ３．２．１）が遊離剤として最も適している。好ましいのは、特定のグリコシド構造を認識するグリコシダーゼ、例えばデキストランのα（１→６）結合を開裂するデキストラナーゼ（ＥＣ３．２．１．１１）、プルランのα（１→６）結合を開裂するプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．１４２）もしくはプルランのα（１→６）結合およびα（１→４）結合を開裂するプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、プルラン中のα（１→４）結合を開裂するネオプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．１３５）、およびイソプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．５７）である。好ましいのは、アミロースのα（１→４）結合を開裂するα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）およびマルトジェニックアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）、イヌリン中のβ（２→１）フルクトシド結合を開裂するイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７）、セルロースのβ（１→４）結合で開裂するセルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、キシランのβ（１→４）結合で開裂するキシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）、α（１→４）Ｄ−ガラクツロナンメチルエステル結合で排除的に開裂するエンドペクチンリアーゼ等のペクチナーゼ（ＥＣ４．２．２．１０）、またはペクチンのα（１→４）Ｄ−ガラクトシヅロン結合で開裂するポリガラクツロナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５）、キトサンのβ（１→４）結合で開裂するキトサナーゼ（ＥＣ３．２．１．１３２）、およびキチンの開裂のためのエンドキチナーゼ（ＥＣ３．２．１．１４）である。

タンパク質およびペプチドはプロテイナーゼによって開裂されうるが、該プロテイナーゼは、細胞上の標的構造の分解を避けるために配列特異的である必要がある。配列特異的プロテアーゼは、例えばＥＮＬＹＦＱ／Ｓで開裂するシステインプロテアーゼであるＴＥＶプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２．４４）、配列ＤＤＤＤＫの後で開裂するセリンプロテアーゼであるエンテロペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．９）、配列ＩＥＧＲもしくはＩＤＧＲの後で開裂するセリンエンドペプチダーゼである第Ｘａ因子（ＥＣ３．４．２１．６）、または配列ＬＦＶＬＦＱ／ＧＰで開裂するシステインプロテアーゼであるＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２．２８）である。

ペプチド骨格にエステル結合を含むペプチドであるデプシペプチドまたはポリエステルは、エステラーゼ、例えばブタ肝臓エステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）またはブタ膵臓リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）によって開裂されうる。核酸は、配列特異的でありうるエンドヌクレアーゼ、例えば制限酵素（ＥＣ３．１．２１．３、ＥＣ３．１．２１．４、ＥＣ３．１．２１．５）、例えばＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩもしくはＢａｍＨＩ、またはより一般的には例えばピリミジンに隣接するホスホジエステル結合を開裂するＤＮＡｓｅＩ（ＥＣ３．１．２１．１）によって開裂されうる。

添加される酵素の量は、所望の時間で前記スペーサーを実質的に分解するのに十分である必要がある。検出シグナルは、通例、少なくとも約８０％低下され、より通例には少なくとも約９５％低下され、好ましくは少なくとも約９９％低減される。遊離のための条件は、温度、ｐＨ、金属補因子の存在、還元剤等の点で実験的に最適化されうる。分解は、通例では、少なくとも約１５分で、より通例には、少なくとも約１０分で完了することとなり、通例は、約３０分を上回ることにはならない。

細胞検出法
接合体Ｘ_n−Ｐ−Ｙ_mで標識された標的を検出するための方法および装置は、検出部Ｘによって決まる。

本発明の一つの別形においては、前記検出部Ｘは、蛍光部である。蛍光色素−接合体で標識された標的は、蛍光部Ｘの励起と、得られた蛍光シグナルの分析によって検出される。励起波長は通常は蛍光部Ｘの吸収極大に応じて選択され、当該技術分野で公知のようにレーザーまたはＬＥＤによって提供される。幾つかの異なる検出部Ｘが多重色／パラメータ検出のために使用される場合に、重なり合った吸収スペクトルを有さず、少なくとも重なり合った吸収極大を有さない蛍光部を選択することに注意するべきである。検出部として蛍光部が使用される場合に、標的は、例えば蛍光顕微鏡下で、フローサイトメーター、スペクトルフルオロメーター、または蛍光スキャナー中で検出することができる。化学発光によって放出された光は、励起を省く類似の計器によって検出することができる。

本発明のもう一つの別形においては、検出部は吸光部であり、前記吸光部は、照射光強度と透過光強度または反射光強度との間の差異によって検出される。吸光部は、光音響イメージングによって検出することもでき、前記光音響イメージングは、超音波シグナル等の音響シグナルを生成するためにパルスレーザーの吸収を使用する。

放射性検出部は、放射性同位体によって放出される放射線を通じて検出される。放射線の検出のための適切な計器は、例えばシンチレーションカウンターを含む。ベータ放出の場合には、電子顕微鏡法を検出のために使用することもできる。

遷移金属同位体マスタグ部は、マスサイトメトリー機器に組み込まれたＩＣＰ−ＭＳ等の質量分析法によって検出される。

本方法の使用
本発明の方法は、調査、診断、および細胞療法における様々な用途のために使用することができる。

本発明の第一の別形においては、細胞のような生物学的検体は、計数の目的のために、すなわち接合体の抗原認識部によって認識されるある一定の抗原のセットを有する試料からの細胞の量を確認するために検出される。

第二の別形においては、生物学的検体の１または複数のポピュレーションは、前記試料から検出されて、標的細胞として分離される。この別形は、例えば臨床調査、診断、および免疫療法において標的細胞の純化のために使用することができる。この別形においては、１または複数のソーティングステップを、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）のいずれかの後に、そして場合により洗浄ステップｅ）の後に行うことができる。

もう一つの別形においては、ステップｃ）において前記接合体によって検出された生物学的検体は、光学的手段、静電力、圧電力、機械的分離、または音響的手段によって試料から分離される。この目的のために、ステップｃ）において前記接合体によって検出された生物学的検体は、試料から、それらの検出シグナルに応じて１または複数のポピュレーションへと、同時にまたは引き続きステップｄ）の実施前に、光学的手段、静電力、圧電力、機械的分離、または音響的手段によって分離される。

そのような分離のために適しているのは、特にフローソーター、例えばＦＡＣＳまたはＭＥＭＳを基礎とするセルローターシステムであり、それらは、例えば欧州特許出願公開第１４１８７２１５．０号明細書または欧州特許出願公開第１４１８７２１４．３号明細書に開示されている。

本発明のもう一つの別形においては、前記接合体の抗原認識部によって認識される生物学的検体上の抗原のような標的部が測定される。そのような技術は、「マルチエピトープリガンド地図作成（ＭｕｌｔｉＥｐｉｔｏｐｅＬｉｇａｎｄＣａｒｔｏｇｒａｐｈｙ）」、「チップベースサイトメトリー（Ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄＣｙｔｏｍｅｔｒｙ）」または「Ｍｕｌｔｉｏｙｍｘ」として知られており、例えば欧州特許第０８１０４２８号明細書、欧州特許第１１８１５２５号明細書、欧州特許第１１３６８２２号明細書、または欧州特許第１２２４４７２号明細書に記載されている。この技術においては、細胞は固定化され、蛍光部と結合された抗体と接触される。前記抗体は、生物学的検体（例えば細胞表面）上のそれぞれの抗原によって認識され、未結合のマーカーを除去し、蛍光部を励起した後に、抗原の位置は、蛍光部の蛍光放出によって検出される。ある一定の別形においては、蛍光部に結合された抗体の代わりに、ＭＡＬＤＩイメージングまたはＣｙＴＯＦのために検出可能な部に結合された抗体を使用することができる。当業者は、どのように蛍光部を基礎とする技術を改変して、これらの検出部を用いて作業するかを認識している。

標的部の位置特定は、蛍光放射線の波長について十分な解像度および感度を有するデジタルイメージングデバイスによって達成される。前記デジタルイメージングデバイスは、光学的拡大装置と一緒に、または前記装置を用いずに、例えば蛍光顕微鏡と一緒に使用してよい。得られた画像は、適切な記憶装置に、例えばハードドライブに、例えばＲＡＷ形式、ＴＩＦ形式、ＪＰＥＧ形式またはＨＤＦ５形式で記憶される。

異なる抗原を検出するために、同じもしくは異なる蛍光部または抗原認識部Ｙを有する異なる抗原−接合体を提供することができる。異なる波長を有する蛍光放出の並行した検出は限られているので、抗体−蛍光色素−接合体は、逐次的に、個々に、または小さいグループ（２〜１０）で順々に利用される。

本発明による方法の更なるもう一つの別形においては、試料の生物学的検体、特に懸濁細胞は、マイクロキャビティ中での捕捉によって、または接着によって固定化される。

更に、一般式（Ｉ）Ｘ_n−Ｐ−Ｙ_m［式中、Ｐは酵素的に分解可能なスペーサーを表す］を有する接合体の他に、一般式（ＩＩ）Ｘ_n−Ｐ’−Ｙ_m［式中、Ｘ、Ｙ、ｎ、ｍは、式（Ｉ）中と同じ意味を有し、かつＸおよびＹは、Ｐ’に対して共有結合または非共有結合されているが、その際、Ｐ’はスペーサーであってよく、それはＰＥＧスペーサーのように酵素的に分解可能ではない］を有する追加の接合体を提供することができる。もう一つの別形においては、一般式（ＩＩＩ）Ｘ_n−Ｙ_m［式中、Ｘ、Ｙ、ｎ、ｍは、式（Ｉ）中と同じ意味を有する］を有する少なくとも１種の酵素的に分解できない少なくとも１種の接合体が提供されうる。一般式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の酵素的に分解できない接合体は、開裂ステップを乗り越え、更なる検出のために使用することができる。酵素的に分解できない接合体は、蛍光部の酸化的破壊または放射線に誘導される破壊によって消光することができる。

一般的に、本発明の方法は、幾つかの別形において実施することができる。例えば、標的部によって認識されなかった接合体は、例えばバッファーによって、該接合体で標識された標的部を検出する前に洗浄することによって除去することができる。

本発明の一つの別形においては、少なくとも２種の接合体は、同時に準備されるか、または後続の染色序列において準備され、その際、それぞれの抗原認識部Ｙは、異なる抗原を認識する。その他の一つの別形においては、少なくとも２種の接合体は、同時にまたは後続の染色序列において試料へと提供でき、その際、それぞれの接合体は、異なる酵素によって開裂される異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰを含む。両方の場合において、前記標識された標的部は、同時にまたは逐次的に検出されうる。逐次的な順次の検出は、スペーサー分子Ｐの同時の酵素的分解を含むか、または引き続き任意に未結合部を任意に中間的に除去（洗浄）しつつスペーサー分子Ｐを酵素的に分解することを含んでよい。

本発明のもう一つの別形は、酵素的分解と酸化的ブリーチングの組み合わせによる蛍光放出の排除を含む。ブリーチングのために必要な化学物質は、「マルチエピトープリガンド地図作成（ＭｕｌｔｉＥｐｉｔｏｐｅＬｉｇａｎｄＣａｒｔｏｇｒａｐｈｙ）」、「チップベースサイトメトリー（Ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄＣｙｔｏｍｅｔｒｙ）」または「Ｍｕｌｔｉｏｙｍｘ」技術についての上述の文献から公知である。

本発明の方法は、以下の実施形態において実施することができる。

本発明の実施形態Ａは、生物学的検体の試料をステップｂ）において、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する少なくとも第一の接合体および第二の接合体と、同時に接触させ、そして後続のステップｃ）およびステップｄ）において、検出を実施し、そしてそれぞれの接合体を開裂させることを特徴とする。開裂ステップは、同じまたは異なる酵素を用いて行うことができる。

本発明の実施形態Ｂは、生物学的検体の試料をステップｂ）において、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する少なくとも第一の接合体および第二の接合体と、同時に接触させ、そしてステップｃ）およびステップｄ）において、検出を同時に実施して、それぞれの接合体を開裂させることを特徴とする。

例２（図４および図５）ならびに例３（図７）は、この実施形態の効果を実証している。ここでは、異なるＰＢＭＣポピュレーションが、３種または５種のＦａｂ−デキストラン−蛍光色素−接合体で同時に標識され、それにより、フローサイトメトリー分析による細胞の区別が可能となり（図４ａおよび図５ａ）、または蛍光顕微鏡による細胞上の表面マーカーの位置特定が可能となる（図７ａ）。蛍光部は、デキストラナーゼによって同時に酵素的に開裂され、それはフローサイトメトリー分析（図４ｂおよび図５ｂ）によって、または蛍光顕微鏡法（図７ｂ）によって実証されている。この別形は、異なる細胞ポピュレーションまたは細胞サブポピュレーションの同時の検出および／または単離のための迅速かつ特異的な多重パラメータ標識を提供する。

本発明の実施形態Ｃは、生物学的検体の試料を、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する少なくとも第一の接合体および第二の接合体と、ステップａ）〜ｄ）を含む後続の序列において接触させることを特徴とする。

例３（図６）は、実施形態Ｃに従って行われる。ＰＢＭＣは、逐次的に、後続の序列において、抗ＣＤ４−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥ（抗ＣＤ４−Ｆａｂ−Ｄｅｘ−ＰＥ、図６ａ）または抗ＣＤ８−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥ（抗ＣＤ８−Ｆａｂ−Ｄｅｘ−ＰＥ、図６ｃ）で標識され、それにより、細胞上の表面マーカーの位置特定が蛍光顕微鏡によって可能となる（図６ａおよび図６ｃ）。この実施形態のそれぞれの序列において、蛍光シグナルは、Ｆａｂ−デキストラン−蛍光色素−接合体の酵素的分解によって排除された（図６ｂ）。

この実施形態は、任意に、開裂された検出部Ｘを除去するための洗浄ステップｅ）（すなわちステップｄ）の後）、および／またはステップｂ）の後に未結合の接合体を除去するための洗浄ステップｅ）を含みうる。

本発明の実施形態Ｄは、生物学的検体の試料を、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する少なくとも第一の接合体および第二の接合体と、ステップａ）〜ｃ）を含む後続の序列において接触させ、単独のステップｄ）において該接合体の開裂を同時に行うことを特徴とする。

本発明の実施形態Ｅは、生物学的検体の試料を、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する少なくとも第一の接合体および第二の接合体と、ステップａ）〜ｃ）を含む後続の序列において接触させ、後続のステップｄ）においてそれぞれの接合体の開裂を行うことを特徴とする。

本発明の実施形態Ｆは、生物学的検体の試料を、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する少なくとも第一の接合体および第二の接合体と、ステップａ）〜ｄ）（任意に洗浄ステップｅ））を含む後続の序列において接触させることで、開裂された検出部Ｘ）を除去することを特徴とし、その際、第一の接合体のステップｄ）および第二の接合体のステップｂ）が同時に行われる。

実施形態Ｃと比べて、実施形態Ｆによる方法は、多重の標識サイクル、検出、およびスペーサーＰの酵素的分解のための時間の削減をもたらす。

例１ − 可逆的な間接的ＰＥＯ−ビオチン／抗ビオチンシステムによる多重パラメータ細胞表面染色
コントロール：ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡバッファー中のＰＢＭＣを、抗ＣＤ８−ＡＰＣおよび抗ＣＤ４−ＰＥで４℃で１０分かけて染色した。前記細胞を洗浄して、フローサイトメトリーによって分析した。

複合体Ａ〜Ｄを、抗ＣＤ８−ＰＥＯ−ビオチン＋抗ビオチン−ＡＰＣ（Ａ）；抗ＣＤ４−ＰＥＯ−ビオチン＋抗ビオチン−ＰＥ（Ｂ）；抗ＣＤ８−ＰＥＯ−ビオチン＋抗ビオチン−ＰＥ（Ｃ）；抗ＣＤ４−ＰＥＯ−ビオチン＋抗ビオチン−ＡＰＣ（Ｄ）の４℃での１５時間にわたるインキュベートによって調製した。

ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡバッファー中のＰＢＭＣを、複合体Ａ（抗ＣＤ８−ＰＥＯ−ビオチン／抗ビオチン−ＡＰＣ）または複合体Ｃ（抗ＣＤ８−ＰＥＯ−ビオチン／抗ビオチン−ＰＥ）で４℃で１０分かけて染色した。前記細胞を、冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡバッファーで洗浄し、そして複合体Ｂ（抗ＣＤ４−ＰＥＯ−ビオチン／抗ビオチン−ＰＥ）または複合体Ｄ（抗ＣＤ４−ＰＥＯ−ビオチン／抗ビオチン−ＡＰＣ）で４℃で１０分かけて染色した。前記細胞を冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡ−ＢＳＡバッファーで洗浄して、フローサイトメトリーによって分析した。抗体−ＰＥＯ−ビオチン接合体は、欧州特許出願公開第２７２５３５９（Ａ１）号明細書に従って調製した。

図２は、直接的な標識システムおよび可逆的な間接的な標識システムにおける、異なる抗体による多重パラメータ標識のフローサイトメトリー分析の典型的な結果のドットプロットを例示している。コントロール実験においては、細胞は、抗ＣＤ４−ＰＥと抗ＣＤ８−ＡＰＣの直接接合体であって抗体と蛍光色素とが共有結合されたもので標識された（ｃ）。同じ抗体と蛍光色素であるが可逆的な間接的なビオチン／抗ビオチン結合相互作用を介して連結されたもの（図１に描いた）は、図２ａと図２ｂに例示される抗ビオチン−蛍光色素接合体のかなりの交換をもたらした。交換の度合いは、標識条件（複合体の逐次的なまたは同時の標識）、複合体の成分の濃度、抗ビオチン−蛍光色素接合体の選択等のパラメータに左右される。最良の事例のうちの一つの一例は、ａに示されており、最低の事例はｂに示されている。ｂにおいては、ＣＤ８+細胞の蛍光シグナルは、複合体Ｄ（抗ＣＤ４−ＰＥＯ−ビオチン／抗ビオチン−ＡＰＣ）によってＣＤ４+細胞に向けられるＡＰＣチャンネルにおいて、複合体Ｃ（抗ＣＤ８−ＰＥＯ−ビオチン／抗ビオチン−ＰＥ）での標識により当初向けられたＰＥチャンネルにおけるよりも高い。複合体の成分のこの交換は、多重パラメータ分析において標的細胞の数え切れない蛍光シグナルをもたらす。

例２ − 直接的なＦａｂ−デキストラン−蛍光色素接合体を用いた可逆的な多重パラメータ細胞表面染色およびフローサイトメトリー分析
タンパク質ベースの蛍光部、例えばＰＥもしくはＡＰＣを有する抗体−またはＦａｂ−デキストラン−蛍光色素接合体を調製するために、抗体またはＦａｂを、ＭＥＳバッファー中１０ｍＭのＤＴＴで還元した。室温で９０分のインキュベート時間後に、抗体をＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質ベースの蛍光部を、２−イミノチオランと一緒に室温で６０分にわたりインキュベートすることによってチオール化した。蛍光部をＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。アミノデキストランを、ＳＭＣＣと一緒に室温で６０分のインキュベートによって活性化し、そしてＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。抗体−もしくはＦａｂ−デキストラン−蛍光色素接合体の接合のために、活性化されたＦａｂまたは抗体および蛍光部をまず混合し、次いで活性化されたデキストランに添加した。室温で６０分間インキュベートした後に、β−メルカプトエタノールに続いてＮ−エチルマレイミドをモル過剰で添加することで、未反応のマレイミド官能基またはチオール官能基をブロックした。前記抗体−またはＦａｂ−デキストラン−蛍光色素接合体をＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。抗体またはＦａｂおよび蛍光部の濃度を、２８０ｎｍでの吸光度と、蛍光色素の特定の波長での吸光度によって測定した。

小分子有機色素、例えばフルオレセインを有する抗体−またはＦａｂ−デキストラン−蛍光色素接合体の調製のために、アミノデキストランを、ＮＨＳ活性化された小分子色素と一緒にインキュベートした。室温で６０分のインキュベート時間後に、デキストラン−蛍光色素接合体をＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。デキストラン−蛍光色素−接合体を、更にＳＭＣＣと一緒に室温で６０分のインキュベートによって活性化し、そしてＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。抗体またはＦａｂを、ＭＥＳバッファー中１０ｍＭのＤＴＴで還元した。室温で９０分のインキュベート時間後に、抗体をＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。抗体−もしくはＦａｂ−デキストラン−蛍光色素接合体の接合のために、活性化されたＦａｂまたは抗体を、活性化されたデキストランに添加した。室温で６０分間インキュベートした後に、β−メルカプトエタノールに続いてＮ−エチルマレイミドをモル過剰で添加することで、未反応のマレイミド官能基またはチオール官能基をブロックした。前記抗体−またはＦａｂ−デキストラン−蛍光色素接合体をＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。抗体またはＦａｂおよび蛍光部の濃度を、２８０ｎｍでの吸光度と、蛍光色素の特定の波長での吸光度によって測定した。

３パラメータ標識
ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡバッファー中のＰＢＭＣを、抗ＣＤ８−Ｆａｂ−デキストラン−フルオレセイン、抗ＣＤ４−Ｆａｂ−デキストラン−ＡＰＣ、および抗ＣＤ３−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥで４℃で１０分かけて染色した。前記細胞を冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡ−ＢＳＡバッファーで洗浄して、フローサイトメトリーによって分析した。蛍光標識の可逆性のために、細胞をデキストラナーゼと一緒に、またはデキストラナーゼなしに、２１℃で１０分にわたりインキュベートし、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ−ＢＳＡバッファーで洗浄し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。

５パラメータ標識
ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡバッファー中のＰＢＭＣを、抗ＣＤ３−Ｆａｂ−デキストラン−ＶｉｏＢｌｕｅ（登録商標）、抗ＣＤ８−Ｆａｂ−デキストラン−フルオレセイン、抗ＣＤ４５ＲＡ−Ｆａｂ−デキストラン−ＶｉｏＧｒｅｅｎＴＭ、抗ＣＤ４５ＲＯ−Ｆａｂ−デキストラン−Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）６４７、および抗ＣＤ６２Ｌ−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥで４℃で１０分かけて染色した。前記細胞を冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡ−ＢＳＡバッファーで洗浄して、フローサイトメトリーによって分析した。蛍光標識の可逆性のために、細胞をデキストラナーゼと一緒に、またはデキストラナーゼなしに、２１℃で１０分にわたりインキュベートし、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ−ＢＳＡバッファーで洗浄し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。

図４および図５は、異なる細胞ポピュレーションおよび細胞サブポピュレーションの区別を可能にした種々のＦａｂ−デキストラン−蛍光色素接合体での３パラメータ標識の、および５パラメータ標識のフローサイトメトリー分析の結果のドットプロットを例示している。

３パラメータでの例のために、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ８−Ｆａｂ−デキストラン−フルオレセイン（フルオレセイン）、抗ＣＤ４−Ｆａｂ−デキストラン−ＡＰＣ（ＡＰＣ）、および抗ＣＤ３−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥ（ＰＥ）で特異的に同時に標識した（図４ａ）。異なる細胞サブポピュレーションを、抗ＣＤ３−Ｆａｂ−デキストラン−ＶｉｏＢｌｕｅ（登録商標）（ＶｉｏＢｌｕｅ）、抗ＣＤ８−Ｆａｂ−デキストラン−フルオレセイン（フルオレセイン）、抗ＣＤ４５ＲＡ−Ｆａｂ−デキストラン−ＶｉｏＧｒｅｅｎＴＭ（ＶｉｏＧｒｅｅｎ）、抗ＣＤ４５ＲＯ−Ｆａｂ−デキストラン−Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）６４７（Ｏｙｓｔｅｒ−６４７）、および抗ＣＤ６２Ｌ−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥ（ＰＥ）によるＰＢＭＣの例示的な５パラメータ標識によって区別した（図５ａ）。

デキストラン分解酵素であるデキストラナーゼの添加の後に、種々の標識がされた細胞ポピュレーションの残留している蛍光強度は、検出限界の範囲にあった（図４ｂおよび図５ｂ）。デキストラナーゼを用いないと、細胞ポピュレーションの蛍光強度には影響が及ぼされなかった（図４ｃおよび図５ｃ）。

例３ − 直接的なＦａｂ−デキストラン−蛍光色素接合体を用いた可逆的な逐次的な多重パラメータ細胞表面染色および蛍光顕微鏡分析
Ｆａｂ−デキストラン接合体は、例２に従って調製した。

逐次的な２パラメータ標識
ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡバッファー中のＰＢＭＣを、ＣｙｔｏＣａｐｔｕｒｅディッシュ中で沈降によって捕捉した。まず、前記細胞を、抗ＣＤ４−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥで２１℃で１０分にわたり染色し、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡバッファーで洗浄し、そして蛍光顕微鏡で画像を撮影した。蛍光標識の可逆性のために、細胞をデキストラナーゼと一緒に２１℃で１０分にわたりインキュベートし、改めてＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡバッファーで洗浄し、そして蛍光顕微鏡で画像を撮影した。次に、試料を抗ＣＤ８−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥで再染色し、その後に蛍光標識を、抗ＣＤ４−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥについて記載したのと同じ手順を用いて遊離させた。その分析のために、細胞特異的蛍光強度値を、撮影した画像から物体認識アルゴリズムを介して引き出した。

５パラメータ標識
ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡバッファー中のＰＢＭＣを、抗ＣＤ３−Ｆａｂ−デキストラン−ＶｉｏＢｌｕｅ（登録商標）、抗ＣＤ８−Ｆａｂ−デキストラン−フルオレセイン、抗ＣＤ４５ＲＡ−Ｆａｂ−デキストラン−ＶｉｏＧｒｅｅｎＴＭ、抗ＣＤ４５ＲＯ−Ｆａｂ−デキストラン−Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）６４７、および抗ＣＤ６２Ｌ−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥで染色した。その細胞をＰＢＳ／ＥＤＴＡ−ＢＳＡバッファーで洗浄して、蛍光顕微鏡法によって分析した。蛍光標識の可逆性のために、細胞をデキストラナーゼと一緒に２１℃で１０分にわたりインキュベートし、改めてＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡバッファーで洗浄し、そして蛍光顕微鏡法によって分析した。

図６および図７は、細胞上の異なる細胞表面マーカーの位置決定、ならびに異なる細胞ポピュレーションおよび細胞サブポピュレーションの区別を可能にした種々のＦａｂ−デキストラン−蛍光色素接合体での逐次的な２パラメータ標識の、および同時の５パラメータ標識の蛍光顕微鏡で撮影された画像を例示している。

逐次的な２パラメータ標識の例のために、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ４−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥ（抗ＣＤ４−Ｆａｂ−Ｄｅｘ−ＰＥ、図６ａ）または抗ＣＤ８−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥ（抗ＣＤ８−Ｆａｂ−Ｄｅｘ−ＰＥ、図６ｃ）で標識し、蛍光顕微鏡法によって分析した。２つの標識と検出のステップの間で、蛍光シグナルは、Ｆａｂ−デキストラン−蛍光色素−接合体の酵素的分解によって排除された（図６ｂ）。図６ｄは、全ての画像の統計的解析を示す。

５パラメータ標識のために、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３−Ｆａｂ−デキストラン−ＶｉｏＢｌｕｅ（登録商標）（抗ＣＤ３−Ｆａｂ−Ｄｅｘ−ＶＢ）、抗ＣＤ８−Ｆａｂ−デキストラン−フルオレセイン（抗ＣＤ８−Ｆａｂ−Ｄｅｘ−ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ４５ＲＡ−Ｆａｂ−デキストラン−ＶｉｏＧｒｅｅｎＴＭ（抗ＣＤ４５ＲＡ−Ｆａｂ−Ｄｅｘ−ＶＧ）、抗ＣＤ４５ＲＯ−Ｆａｂ−デキストラン−Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）６４７（抗ＣＤ４５ＲＯ−Ｆａｂ−Ｄｅｘ−Ｏｙ６４７）、および抗ＣＤ６２Ｌ−Ｆａｂ−デキストラン−ＰＥ（抗ＣＤ６２Ｌ−Ｆａｂ−Ｄｅｘ−ＰＥ）で同時に染色した（図７ａ）。

デキストラン分解酵素であるデキストラナーゼの添加の後に、種々の標識がされた細胞ポピュレーションの残留している蛍光強度は、背景シグナルの範囲内にあった（図７ｂ）ため、それは、更なる逐次的な多重パラメータ標識と検出のサイクルを可能にする。

Claims

ａ）一般式（Ｉ）Ｘ_n−Ｐ−Ｙ_m［式中、Ｘは、検出部であり、Ｐは、酵素的に分解可能なスペーサーであり、かつＹは、抗原認識部であり、かつｎ、ｍは、１から１００の間の整数であり、かつＸおよびＹは、Ｐに共有結合されている］を有する接合体を準備すること、
ｂ）生物学的検体の試料と前記接合体とを接触させることで、抗原認識部Ｙによって認識される標的部を標識すること、
ｃ）前記接合体で標識された標的部を、検出部Ｘにより検出すること、ならびに、
ｄ）スペーサーＰを酵素的に分解することで、検出部Ｘを前記接合体から開裂させること、によって行う、生物学的検体の試料中の標的部を検出するための方法であって、
少なくとも２種の接合体が準備され、ここで、それぞれの抗原認識部Ｙは異なる抗原を認識するものであり、前記検出部Ｘが発色団部、蛍光部、リン光部、発光部、吸光部、放射性部、遷移金属および同位体マスタグ部からなる群から選択されており、酵素的に分解可能な前記スペーサーＰは、多糖類、デプシペプチド、ポリエステルおよびそれらの誘導体からなる群から選択され、かつ、前記抗原認識部Ｙは抗体、フラグメント化抗体、フラグメント化抗体誘導体、ペプチド／ＭＨＣ複合体を標的とするＴＣＲ分子、細胞接着受容体分子、共刺激分子のための受容体、または人工的にエンジニアリングされた結合分子であり、ここで、前記スペーサーＰは、多量体化された低親和性の抗原認識部Ｙと一緒に準備され、前記抗原認識部Ｙは、スペーサーＰの酵素的に分解により単量体化され、かつ、前記標的部分から開裂されることを特徴とする、前記方法。
前記酵素的に分解可能なスペーサーＰを分解するために使用される酵素は、グリコシダーゼ、デキストラナーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、イヌリナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、プロテイナーゼ、エステラーゼおよびリパーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記接合体によって検出される生物学的検体は、光学的手段、静電力、圧電力、機械的分離、または音響的手段によって試料から分離される、請求項１または２に記載の方法。
少なくとも２種の接合体が準備され、それぞれの酵素的に分解可能なスペーサーＰが異なる酵素によって分解されることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
生物学的検体の試料を、ステップｂ）において、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する、少なくとも２種の接合体と同時に接触させ、そして後続のステップｃ）およびステップｄ）において、検出を実施し、そしてそれぞれの接合体を開裂させることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
生物学的検体の試料を、ステップｂ）において、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する少なくとも２種の接合体と同時に接触させ、そしてステップｃ）およびステップｄ）において、検出の実施とそれぞれの接合体の開裂を同時に行うことを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
生物学的検体の試料を、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する少なくとも２種の接合体と、ステップａ）〜ｄ）を含む後続の序列において接触させることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
生物学的検体の試料を、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する少なくとも２種の接合体と、ステップａ）〜ｃ）を含む後続の序列において接触させ、単独のステップｄ）において、この接合体の開裂を同時に行うことを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
生物学的検体の試料を、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する少なくとも２種の接合体と、ステップａ）〜ｃ）を含む後続の序列において接触させ、後続のステップｄ）において、それぞれの接合体の開裂を行うことを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
細胞の試料を、異なる検出部Ｘおよび／または異なる酵素的に分解可能なスペーサーＰおよび／または異なる抗原認識部Ｙを有する少なくとも２種の接合体と、ステップａ）〜ｄ）を含む後続の序列において接触させ、その際、第一の接合体のステップｄ）と、第二の接合体のステップｂ）を同時に行うことを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。