JP6762524B2 - 嚢胞性線維症の治療における使用のためのチモシンα1 - Google Patents
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Description
したがって、本発明のさらなる目的は、嚢胞性線維症に罹患した患者における炎症の治療および/または予防において使用のためのチミシンα1である。
細胞
細胞株および細胞培養−δF508突然変異およびそのアイソジェニック野生型についてホモ接合性であるヒト気管支上皮細胞(HBE)細胞を、肺移植(CF患者)または肺切除(非CF患者)(イタリアの嚢胞性線維症財団のLJ Galiettaによって親切に提供された)から得た。細胞を、5%CO2を含む大気中の加湿インキュベータ内で37℃で維持し、実験をプレーティングの5日後に行った(21、22)。WT−CFTRまたはΔF508−CFTRのいずれかを用いて、D. Gruenert博士と共働者(32)によって本来は不死化され、特徴付けられた親CFBE41o細胞(ΔF508/ΔF508)の安定したレンチウイルスベースの形質導入を、Tranzyme, Inc. (Birmingham, AL)によって行った。形質導入されたCFBE41o細胞を、37℃で5%CO2、95%空気のインキュベータ中で、50単位/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン、2mMのL−グルタミン、10%のウシ胎児血清、および1μg/mlのブラスティサイジン(WT−CFTR)または2μg/mlのピューロマイシン(ΔF508−CFTR)の補充された最小イーグル培地中で維持した。親CFBE41o細胞を、同じ培養条件下で、ブラストサイジンまたはピューロマイシンなしで維持した。分極した単層を確立するために、CFBE41o細胞を、2×106で24mm直径のトランスウェル(Transwell)透過性担体(0.4mm孔径;Corning Corp., Corning, NY)上に播種し、37℃で6〜9日間、次に27℃で36時間、気−液界面培養で増殖させた。CFTRタンパク質発現および機能の評価の前に、細胞を、Tα1 100ng/l(CRIBI Biotechnology, Padova、以下を参照)、3μM VX−809(ルマカフトール(Lumacaftor)、Aurogene Rome, イタリア)、1μM VX−770(アイバカフトール(Ivafactor)、Aurogene)単独または組み合わせを用いて24時間培養した。DMSO賦形剤単独(0.1%v/v)を24時間、対照として使用した。
8〜12週齢の野生型(WT)同系交配のC57BL6マウスを、Charles River Breeding Laboratories (Calco, イタリア)から購入した。遺伝子操作されたホモ接合体Cftr−/−マウス(33)を、San Raffaele Hospital, Milan, イタリアの嚢胞性線維症のコア動物施設で飼育した。実験は、欧州経済共同体理事会指令並びに組織の動物保護および使用ガイドラインに従って機関動物委員会が承認したプロトコルに従って、実施された。
マウスを、2×107のA. fumigatus (Af293)休息分生子/20μl生理食塩水の鼻腔内点滴前に2.5%アベルチン(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO)のi.p.注射によって麻酔した。組織学について、パラフィン包理組織を、過ヨウ素酸−Schiff(PAS)で染色し、BAL液体回収を記載の通りに行った(21、22)。処理は次の通りであった:Tα1およびスクランブルされたポリペプチドを、精製された(エンドトキシンレベルは、標準リムルス溶解物アッセイによって<0.03pg/mlであった)無菌凍結乾燥アセチル化ポリペプチドとして供給した。配列は次の通りであった:Ac−Ser−Asp−Ala−Ala−Val−Asp−Thr−Ser−Ser−Glu−Ile−Thr−Thr−Lys−Asp−Leu−Lys−Glu−Lys−Lys−Glu−Val−Val−Glu−Glu−Ala−Glu−Asn−O (Tα1) (配列番号1)およびAc−Ala−Lys−Ser−Asp−Val−Lys−Ala−Glu−Thr−Ser−Ser−Glu−Ile−Asp−Thr−Thr−Glu−Leu−Asp−Glu−Lys−Val−Glu−Val−Lys−Ala−Asn−Glu−OH(スクランブルされたペプチド)(配列番号2)。凍結乾燥粉末を滅菌水中で再構築し、200μg/kg/i.p.を、感染の日から6日間連続して毎日与えた。
抗CFTR抗体(クローンCF3、Abcam)を使用するイムノブロット技術を、CFTRまたはF508del−CFTRを発現するFRT、HEK−293、またはHBE細胞中でCFTR成熟を測定するために使用した(34)。インキュベーション後、細胞を、氷冷D−PBS溶液(カルシウムおよびマグネシウムなし)中で採取し、4℃で1,000×gでペレット化した。細胞ペレットを、氷上で30分間、1%Nonidet P−40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、200mMのNaCl、10mMのトリス、pH7.8、および1mMのEDTA+プロテアーゼ阻害剤混合物(1:250; Roche)中で溶解した。溶解物を、10分間、10,000×gで、4℃で回転させて、核および不溶性材料をペレット化した。約12μgの全タンパク質を、37℃で5分間、5%β−メルカプトエタノールでLaemmli緩衝液中で加熱し、3%〜8%トリス−アセテートゲル(Invitrogen)中に充填した。ゲルをニトロセルロースに移し、β−アクチンに対するモノクロナールCFTR抗体またはポリクロナール(Santa Cruz Biotechnology)を使用して、ウエスタンブロッティング処理した。ブロットは、増強された化学発光によって開発された。ChemiDocTM XRS+ Imagigシステム(Bio−Rad Laboratories)を使用するLiteAblotPlus化学発光基質(Euroclone S.p.A.)およびブロット定量を、Image Lab 3.1.1ソフトウェア(Bio−Rad)を使用するデンシトメトリー画像分析によって得た。
CFTRチャネルは、ヨウ化物に対して透過性であるため、SPQ(6−メトキシ−N−(3−スルホプロピル)キノリウム)蛍光プローブを使用する比色分析によって予め充填された細胞からこのイオンの流出を決定することができる(35)。
記載されているように、cDNAの総RNA抽出および合成およびPCRを、全肺細胞で行った(21、22)。増幅効率は、Gapdhに対して有効にされ、標準化された。SYBR GreenリアルタイムPCRの熱プロファイルは、95℃で3分間、次に95℃で30秒間の変性および60℃で30秒間のアニーリング/伸長のステップの40サイクルであった。各データポイントは、増幅プロットの分析によって完全性について試験された。mRNA正規化データは、非刺激細胞のmRNAと比較して、処理細胞における相対mRNAとして発現された。
記載されるように、処理および未処理マウスからの肺ホモジネート中のサイトカインレベルは、サイトカイン特異的ELISA(R&D Systems, Inc. Space Import−Export srl, Milan, イタリア)で決定した(21、22)。
Studentの対応t検定を使用して、実験サンプル中の値の有意性を決定した(有意性を、P<0.05として定義した)。生存データをMann−Whitney U検定を使用して分析した。インビボ群は、6匹の動物からなっていた。他に示されない限り、データは平均±SEである。データを、GraphPad Prism 4.03プログラム(GraphPad Software)によって分析した。
Tα1は、CF細胞においてΔF58−CFTRの細胞表面発現を増加させることによって中和剤として働く。
ΔF508−CFTR突然変異についてホモ接合であるSV40形質転換CF気道上皮細胞株(CFBE41o−)を使用した(32)。ΔF508CFTRまたはWT CFTRを安定に発現するCFBE41o細胞を、30分から24時間、100ng/mlのTα1で処理した。図2は、Tα1で処理された対照(HBE WT)およびΔF508(HBE ΔF508)細胞からの全細胞タンパク質の代表的なイムノブロットを示す(パネルA、図2)。イムノブロット技術を使用して、小胞体からのΔF508−CFTR出口およびゴルジ体通過を測定し、これは、グリコシル化の結果として、CFTRの分子量の増加(135〜140kDaバンドから170〜180kDaバンド)によって特徴付けられる。CFTRがゴルジによって処理された後、成熟した複合体−グリコシル化CFTR形態は、細胞表面に送達される。
増強剤は、細胞表面で突然変異体CFTRのcAMP依存性クロライドチャネル活性を回復させることを意図される。インビボでCFTR機能の30%未満(5〜30%)を回復することは、肺機能を改善することによってCF患者に少なくとも部分的な臨床的有益性を与えると考えられている(36)。CF患者からのTα1、CFBE41o−細胞およびHBE細胞のCl−チャネル活性を評価するために、24時間、100ng/mlのTα1で処理し、cAMP/PKA経路を介してCFTRを活性化させるために、フォリスコリンでの刺激の際に、ハロゲン感受性蛍光プローブ(6−メトキシ−N−(−スルホプロピル)キノリウム(SPQ)の使用によって、塩化物輸送を評価した(35)。結果は、Tα1は、CFBE 41o−細胞(図3、パネルA)およびCF患者からのHBE細胞(図3、パネルB)において、(100%参照値としてWT対照を考慮して)対照に対して約70%にΔF508CFTRの塩化物透過性を増加させたことを示す。したがって、Tα1は、膜関連CFTRの増加したレベルに関連して、CFTR媒介塩化物透過性を増加させた。
突然変異体CFTRの標的化によるイオン輸送欠陥の薬理学的修正、またはCFTR機能不全を補償し得る代替イオンチャネルは、CFの原因療法への魅力的なアプローチとして長く考えられてきた(37)。TMEM16Aは、Ca2+活性化Cl−チャネルであり、カルシウム依存性塩化物電流と関連しており(38)、CFTRとは異なるが、CFTRと機能的および分子的相互作用を示す(39)。薬理作用のある物質とのTMEM16Aの活性化は、CFTR遺伝子型にかかわらず、CFの主要な欠陥を回避することができる(40)。DNAマイクロアレイ分析は、TMEM16Aの発現が、Tα1での治療の際に、肺アスペルギウス症のマウスで大幅に増加した(未発表の結果)。これらの知見に基づいて、TMEM16A発現が、対照またはCF患者由来のHBE細胞上でTα1によって誘導されたかどうかが評価された。この目的のために、細胞は、24時間まで100ng/mlのTα1に曝露し、細胞からの総RNAに対するRT−PCRによってTMEM16A mRNA発現を評価した。結果は、Tα1は、対照および曝露の4時後のCF細胞でTMEM16A発現を著しく増加させたことを示す。しかしながら、TMEM16A発現は、24時間で対照細胞のベースラインレベルに戻ったが、CF細胞で上昇したままであった(図4A)。これらの結果は、代替のCl−チャネルTEM16Aの発現を誘導することにより、Tα1が、CFにおけるイオンチャネル活性をさらに改善することができることを示唆する。
Tα1の活性は、単独またはアイバカフトール(ivafactor)と組み合わせて、ΔF508CFTRを発現するCFBR41o−細胞上でおよびCF患者由来のHBE細胞上で、ルマカフトール(lumacaftor)の活性と比較的に評価されている。この目的のために、細胞を、Tα1(100ng/ml)、VX−770(1μM)またはVX−809(3μM)単独または組み合わせて、24時間処理し、CFTRタンパク質発現および機能について評価した。結果は、ルマカフトール(lumacaftor)と同様に、Tα1は、ΔF508トランスフェクトされた細胞でCFTRの未成熟形態(Bで示す)と比較して、成熟形態(Cで示す)の発現を増加させることを示す(A、全細胞タンパク質の代表的なイムノブロット(図5)。CFTRバンドを、デンシトメトリーによって定量し、C/B比として表した)。図5において、矢印は、相対移動性に基づくCFTRのBおよびC型の位置を示す。)ルマカフトール(lumacaftor)は、CFTR発現を増加させなかったが、Tα1/アイバカフトール(ivafactor)の組み合わせは、それを行った。イオンチャネル活性の観点から、Tα1は、単独またはアイバカフトール(ivafactor)と組み合わせて、(100%参照値としてWT対照を考慮して)対照と比較して、60〜70%の間のΔF508CFTR細胞の塩化物透過性を増加させた(B、フォリスコリンFsk刺激の際の蛍光アッセイによって評価した)。ルマカフトール(lumacaftor)と比較して、Tα1の活性は、ΔF508CFTRを発現するCFBE41o細胞で低かったが(B)、CF患者由来のHE細胞では同様であった(C)。ルマカフトール(lumacaftor)と組み合わせて、Tα1は、ルマカフトール(lumacaftor)の活性を増加させなかった(BおよびC)。これらの結果は、CFTR発現を増加させるTα1の能力は、ルマカフトール(lumacaftor)の能力に匹敵し、アイバカフトール(ivafactor)との併用療法に利用できることを示す。
CFにおけるTα1の治療活性を評価するために、CF患者の気道の既知の微生物コロニー剤であるアスペルギルスフミガタス(Aspergillus fumigatus)による感染に関連する炎症性病状に関連するC57BL/6およびCftr―/−マウスの感受性(41)が、評価されている。C57BL/6およびCftr―/−マウスは、生存A.fumigatusで鼻腔内に感染させ、炎症のパラメータについて評価した。BAL(図6、パネルA)および肺(図6、パネルBおよびC)における好中球(PMN)および好酸球(EOS)補充によって特徴付けられる長時間続き持続性な炎症反応が、炎症の程度が感染前にすでに目に見えるCftr―/−マウスで観察された(C、異なるdpiで肺組織学(過ヨウ素酸−Schiffm、挿入図で、ゴモリ染色)。単核細胞(MNC)、PMN細胞およびEOSの異なる細胞数を、感染後の異なる日(dpi)で、May Grunwald Giemsa染色の際に決定した。値は、グループ当たり3匹のマウスの平均±SEMを表し、3回の実験の代表である。写真は、20倍の対物レンズを使用して高解像度Microscopy Olympus DP71で撮影した。スケールバー200μm。(C)Gr1+陽性細胞の数を、異なるdpiで全肺細胞のフローサイトメトリーによって評価した。*P<0.05
CFマウスは、アスペルギルス感染およびアレルギーに関連する炎症応答に感受性があり、したがってTα1の効果を評価するのに適したモデルを表す。
C57BL/6およびCftr―/−マウスを、生存A.fumigatus分生子で鼻腔内に感染させ、感染の日から6日間連続して毎日Tα1を200μg/kg/腹腔内投与で処理した。結果を図8に示す。それらは、感染中のBAL中のIL−1βおよびIL−1αのC57/BL6と比較して、Cftr―/−マウスにおける高められたおよび未解決の炎症応答がより高いレベルに関連していることを示す。Tα1処理の際に、IL−1βおよびIL−1αの両方のレベルが、いずれのマウスのタイプにおいても急激に減少し、大きな関心のあった炎症性ブロッキングサイトカイン(IL−1RA)のレベルが上昇した。IL−1βおよびIL−1αの高いレベルが、CF患者で観察されることから(42)、これらのデータは、Tα1は、CF患者の局所炎症/抗炎症サイトカインバランスに寄与し得ることを示す。BAL中のIL−1β、IL−1αおよびIL−1RAのレベルを、ELISA(pg/ml)によって感染後7日目に測定した。示された結果は、2つの実験からプールされたデータを示す。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
炎症Th17経路は、CF肺炎に含まれ(21、22、43)、Th2経路は、CF真菌アレルギーに関連する(44)。Th細胞活性化に対するTα1の効果の影響を評価のために、肺におけるThサイトカインおよび排出リンパ節における対応する転写因子のレベルは、上記のようなTα1で感染され処理されたC58BL/6およびCftr―/−マウスで測定された。Tα1は、Th17(IL−17AおよびTh17転写因子Rorcの低下したレベル)、Th2(低IL−4およびGata3)細胞活性を低下させたが、Th1(増加したIFN−γおよびTbet)およびTreg(増加したIL−10およびFoxp3)細胞活性の両方を促進する。これらの結果は、炎症性Th1/Th2細胞の活性化を抑制しながら、Tα1が、CFにおける抗炎症性Th1/Treg軸の強力な活性化剤であることを示す(図9)。サイトカインレベルを、肺ホモジネート(ELISAまたはRT−PCTによる)および排出胸部リンパ節における対応するTh転写因子の発現(RT−PCRによる)で評価した。示された結果は、2つの実験からのプールされたデータを表す。n.d.実施なし。*P<0.05、**P<0・01、***P<0.001。
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Claims (10)
- 嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)のΔF508突然変異を有する対象における嚢胞性線維症の治療のための、チモシンα1を含むか又はチモシンα1からなる、医薬組成物。
- チモシンα1を含むか又はチモシンα1からなる医薬組成物であって、細胞表面における、ΔF508突然変異を有する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)の発現を、嚢胞性線維症に罹患している対象において増加させる使用のための中和剤としての、医薬組成物。
- チモシンα1を含むか又はチモシンα1からなる医薬組成物であって、ΔF508突然変異を有するCFTRの機能活性を、嚢胞性線維症に罹患している対象において増加させる使用のための増強剤としての、医薬組成物。
- チモシンα1を含むか又はチモシンα1からなる医薬組成物であって、代替イオンチャネルTMEM16Aの発現を嚢胞性線維症に罹患している対象において増加させる使用のための、前記対象は嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)のΔF508突然変異を有している、医薬組成物。
- 抗生物質、抗真菌剤、CFTR中和剤及びCFTR増強剤からなる群から選択される少なくとも1つの薬剤とチモシンα1の組み合わせを含む請求項1〜4のいずれかに記載の医薬組成物であって、前記CFTR中和剤または増強剤は、チモシンα1以外である医薬組成物。
- 前記少なくとも1つの抗生物質が、トブラマイシン、シプロフロキサシン及びコリスチンからなる群から選択される、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも1つの抗真菌剤が、イトラコナゾール及びアンフォテリシンBからなる群から選択される、請求項5に記載の医薬組成物。
- チモシンα1以外の前記少なくとも1つのCFTR中和剤または増強剤は、アイバカフトール(Ivafactor)及びルマカフトール(Lumacaftor)からなる群から選択される、請求項5に記載の医薬組成物。
- 1つ又は2つ以上の添加剤および/または補助剤を含む請求項1〜8のいずれかに記載の医薬組成物。
- チモシンα1pならびに抗生物質、抗真菌剤、CFTR中和剤及びCFTR増強剤からなる群から選択される少なくとも1つの薬剤の投与が別個に又は連続的に行われる、請求項5に記載の医薬組成物。
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