JP6757016B2 - 多硫酸化プロテオグリカン - Google Patents
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Description
本明細書において、「硫酸化」とは、ヒドロキシ基に対して、硫酸イオンをエステル結合させ、硫酸基を導入させることである。
本明細書において、「多硫酸化」とは、原料となる有機物質に硫酸化を行い、原料となる有機物質に含まれている硫酸基の量より多くの硫酸基を導入することである。
本明細書において、赤外吸収スペクトルにおける「吸収ピーク強度比」を以下のように定義する。はじめに「吸収ピーク強度」とは、特に断りがない限り、赤外吸収スペクトルの縦軸を透過率(%)、横軸を波数(cm −1 )とした場合に谷で表されるピークにおいて、「100−透過率(%)」で表される値(単位:%)のことである。「吸収ピーク強度比」とは、任意の2つの吸収ピークの「吸収ピーク強度」の相対比を表す。例えば、本明細書において、「吸収ピークAに対する吸収ピークBの吸収ピーク強度比」とは、吸収ピークBの吸収ピーク強度を吸収ピークAの吸収ピーク強度で割ることで得られる値である。
原料となるプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン((株)角弘プロテオグリカン研究所)を購入し、比較例として用いた(以降、「比較例のプロテオグリカン」と略記する)。強酸性陽イオン交換樹脂(商品名:ダイヤイオンSK1B(三菱化学(株)))をガラス製カラムに充填し(内径4.5cm、高さ5cm)、1M塩酸60mLと脱イオン水200mLを順次流下して樹脂をプロトン型に活性化した後、比較例のプロテオグリカン0.500gを脱イオン水10mLに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を約50mL流下し、溶出液約60mLを得た。溶出液のpHを卓上pHメータ(F−55、(株)堀場製作所製)で測定したところ、2.1であった。pHを測定しながら、ピリジン(試薬特級、関東化学(株))を滴下し、溶出液のpHを6.6とした。中和後の溶液を回収し、凍結乾燥し、0.536gの白色綿状固体であるプロテオグリカンピリジニウム塩を得た。以降の実施例で用いるプロテオグリカンピリジニウム塩は、すべて本実施例と同じ方法で得たものである。
本実施例に係るプロテオグリカンピリジニウム塩0.300gとジメチルスルホキシド(特級、関東化学(株))18mLをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体(純度98%、シグマアルドリッチ社)1.445gを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を40℃の恒温水層に入れた。5時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。遠沈管にエタノール300mLを加え、高速冷却遠心機(himac CR 22G3、日立工機(株)製)を用い、5,000rpmで20分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約120mLを加え、溶解させた。溶解液のpHを卓上pHメータ(F−55、(株)堀場製作所製)により測定したところ、2.8であった。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和した。中和後の溶液全量を透析用セルロースチューブ(エーディア(株))に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は1日に3回交換した。3日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約10mLになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、0.426gの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
実施例1で用いた比較例のプロテオグリカン0.30g、0.20g、0.10gをそれぞれ脱イオン水100mLに溶解し、比較例のプロテオグリカンの0.30w/v%、0.20w/v%、0.10w/v%水溶液を得た。この比較例のプロテオグリカン水溶液100mLずつをそれぞれ、透析用セルロースチューブ(外周9cm×長さ35cm、エーディア(株))に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして浮遊させ、4℃の低温室で透析した。外液の交換は1週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に30日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
実施例1に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量をカルバゾール硫酸法で求めた。実施例1に係る多硫酸化プロテオグリカンの200μg/mL水溶液0.25mLに、カルバゾール溶液50μLと濃硫酸1.5mLを添加してよく撹拌し、20分間100℃で加熱した。放冷後、分光光度計(U−3410、(株)日立製作所製)で535nmの吸光度を測定した。グルクロン酸(シグマ社)を標準物質として作成した検量線より、実施例1に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量は22.4重量%と算出された。
実施例1に係るプロテオグリカンピリジニウム塩0.300gとジメチルスルホキシド(特級、関東化学(株))18mLをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体(純度98%、シグマアルドリッチ社)1.445gを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を40℃の恒温水層に入れた。1時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。遠沈管にエタノール300mLを加え、高速冷却遠心機(himac CR 22G3、日立工機(株)製)を用い、5,000rpmで20分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約150mLを加え、溶解させた。溶解液のpHを卓上pHメータ(F−55、(株)堀場製作所製)により測定したところ、3.0であった。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和した。中和後の溶液全量を透析用セルロースチューブ(エーディア(株))に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は1日に3回交換した。3日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約10mLになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、0.411gの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
比較例のプロテオグリカンと実施例2に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を、実施例1と同様に測定した。図5は、比較例のプロテオグリカンと、実施例2に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数(日)を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量(g)を示す。図5中の白抜きのひし形は実施例2に係る多硫酸化プロテオグリカンの0.20w/v%水溶液の重量変化を、黒塗りの四角は比較例のプロテオグリカンの0.20w/v%水溶液の重量変化を示す。30日間の測定結果を平均すると、1日当たりの重量の増加量は、比較例のプロテオグリカン2.7g/日に対して、実施例2に係る多硫酸化プロテオグリカンは8.9g/日であった。比較例のプロテオグリカンと比較して、実施例2に係る多硫酸化プロテオグリカンは約3.3倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
実施例2に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例1と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は24.9%、タンパク質含量は2.2重量%であった。
実施例1に係るプロテオグリカンピリジニウム塩0.300gとジメチルスルホキシド(特級、関東化学(株))18mLをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体(純度98%、シグマアルドリッチ社)0.867gを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を40℃の恒温水層に入れた。1時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。遠沈管にエタノール300mLを加え、高速冷却遠心機(himac CR 22G3、日立工機(株)製)を用い、5,000rpmで20分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約120mLを加え、溶解させた。溶解液のpHを卓上pHメータ(F−55、(株)堀場製作所製)により測定したところ、3.0であった。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和した。中和後の溶液全量を透析用セルロースチューブ(エーディア(株))に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は1日に3回交換した。3日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約10mLになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、0.410gの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
比較例のプロテオグリカンと実施例3に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を、実施例1と同様に測定した。図7は、比較例のプロテオグリカンと、実施例3に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数(日)を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量(g)を示す。図7中の白抜きのひし形は実施例3に係る多硫酸化プロテオグリカンの0.20w/v%水溶液の重量変化を、黒塗りの四角は比較例のプロテオグリカンの0.20w/v%水溶液の重量変化を示す。30日間の測定結果を平均すると、1日当たりの重量の増加量は、比較例のプロテオグリカン2.7g/日に対して、実施例3に係る多硫酸化プロテオグリカンは8.1g/日であった。比較例のプロテオグリカンと比較して、実施例3に係る多硫酸化プロテオグリカンは約3.0倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
実施例3に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例1と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は24.1重量%、タンパク質含量は2.0重量%であった。
実施例1に係るプロテオグリカンピリジニウム塩0.273gとジメチルスルホキシド(特級、関東化学(株))16.4mLをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体(純度98%、シグマアルドリッチ社)0.523gを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を40℃の恒温水層に入れた。1時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。遠沈管にエタノール300mLを加え、高速冷却遠心機(himac CR 22G3、日立工機(株)製)を用い、7,000rpmで20分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約40mLを加え、溶解させた。溶解液のpHを卓上pHメータ(F−55、(株)堀場製作所製)により測定したところ、2.6であった。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和した。中和後の溶液全量を透析用セルロースチューブ(エーディア(株))に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は1日に3回交換した。3日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約10mLになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、0.393gの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
比較例のプロテオグリカンと実施例4に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を、実施例1と同様に測定した。図9は、比較例のプロテオグリカンと、実施例4に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数(日)を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量(g)を示す。図9中の白抜きのひし形は実施例4に係る多硫酸化プロテオグリカンの0.20w/v%水溶液の重量変化を、黒塗りの四角は比較例のプロテオグリカンの0.20w/v%水溶液の重量変化を示す。30日間の測定結果を平均すると、1日当たりの重量の増加量は、比較例のプロテオグリカン2.7g/日に対して、実施例4に係る多硫酸化プロテオグリカンは7.2g/日であった。比較例のプロテオグリカンと比較して、実施例4に係る多硫酸化プロテオグリカンは約2.7倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
実施例4に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例1と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は24.8重量%、タンパク質含量は1.2重量%であった。
実施例1に係るプロテオグリカンピリジニウム塩0.283gとジメチルスルホキシド(特級、関東化学(株))17.0mLをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体(純度98%、シグマアルドリッチ社)0.271gを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を40℃の恒温水層に入れた。1時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。遠沈管にエタノール300mLを加え、高速冷却遠心機(himac CR 22G3、日立工機(株)製)を用い、7,000rpmで20分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約40mLを加え、溶解させた。溶解液のpHを卓上pHメータ(F−55、(株)堀場製作所製)により測定したところ、2.8であった。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和した。中和後の溶液全量を透析用セルロースチューブ(エーディア(株))に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は1日に3回交換した。3日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約10mLになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、0.369gの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
比較例のプロテオグリカンと実施例5に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を、実施例1と同様に測定した。図11は、比較例のプロテオグリカンと、実施例5に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数(日)を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量(g)を示す。図11中の白抜きのひし形は実施例5に係る多硫酸化プロテオグリカンの0.20w/v%水溶液の重量変化を、黒塗りの四角は比較例のプロテオグリカンの0.20w/v%水溶液の重量変化を示す。30日間の測定結果を平均すると、1日当たりの重量の増加量は、比較例のプロテオグリカン2.7g/日に対して、実施例5に係る多硫酸化プロテオグリカンは7.1g/日であった。比較例のプロテオグリカンと比較して、実施例5に係る多硫酸化プロテオグリカンは約2.6倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
実施例5に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例1と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は25.1重量%、タンパク質含量は2.0重量%であった。
実施例1に係るプロテオグリカンピリジニウム塩15.0mgとジメチルスルホキシド(特級、関東化学(株))0.9mLをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体(純度90%以上、和光純薬工業(株))47.1mgを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を20℃の恒温水層に入れた。1時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液のpHを卓上pHメータ(F−55、(株)堀場製作所製)により測定したところ、弱酸性を呈した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で中和し、全量をプラスチック製遠沈管に移し、エタノール30mLを加え、卓上遠心機(himac CT 6D、日立工機(株)製)を用い、2,000rpmで10分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約10mLを加え、溶解させた。溶解液にエタノール30mLを加え、再度遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約15mLを加え、溶解させた。溶解液全量を透析用セルロースチューブ(エーディア(株))に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は1日に3回交換した。3日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約5mLになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、15.0mgの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
実施例6に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例1と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は32.7重量%、タンパク質含量は3.4重量%であった。
実施例1に係るプロテオグリカンピリジニウム塩30.0mgとジメチルスルホキシド(特級、関東化学(株))1.8mLをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体(純度90%以上、和光純薬工業(株))157mgを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を60℃の恒温水層に入れた。5時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、バイアル瓶のふたを開け、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。溶液の入った遠沈管にエタノール6mLを加え、卓上遠心機(himac CT 6D、日立工機(株)製)を用い、2,000rpmで10分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約4mLを加え、溶解させた。溶解液にエタノール6mLを加え、再度遠心分離を行った後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約10mLを加え、溶解させた。溶解液のpHを卓上pHメータ(F−55、(株)堀場製作所製)により測定したところ、弱酸性を呈した。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和し、溶液全量を透析用セルロースチューブ(エーディア(株))に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は1日に3回交換した。3日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約5mLになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、31.7mgの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
実施例7に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例1と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は22.8重量%、タンパク質含量は3.3重量%であった。
Claims (1)
- 鮭由来のプロテオグリカンを、プロトン型強酸性陽イオン交換樹脂に接触させ、次に、該接触プロテオグリカンをピリジンで中和させ、次に、中和したプロテオグリカンに三酸化硫黄ピリジン錯体を加え、ジメチルスルホキシド中で20〜40℃で1〜5時間反応させて得られた硫酸基が22重量%以上36重量%以下の範囲で付加されたことを特徴とするプロテオグリカン。
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