JP6744862B2 - 眼疾患を治療するためのシリビニンおよび他の有効成分を送達するためのナノ構造製剤 - Google Patents
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Description
(1)SLN(固体脂質ナノ粒子)およびNLC(ナノ構造脂質担体)型の脂質ナノ粒子系、
(2)カリックスアレーンベースのナノ構造系、
(3)両親媒性のイヌリンコポリマーに基づいたミセルおよびナノ粒子系
に組み込まれたシリビニンを含有する局所適用のための製剤を用いて上記の欠点を克服し、対象の眼疾患のために使用の根拠を有する他の有効成分の組み込みおよび放出の例は下記に提供される。前記製剤は、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、緑内障などの神経変性眼疾患の治療のための治療有効用量で硝子体または網膜まで有効成分を送達できる。本発明はさらに、上記で定義されるシリビニンを組み込んでいるナノ粒子系の調製方法に関する。
のイヌリンベースのコポリマーを含有する眼に関する使用のための製剤およびそのようなコポリマーに関する。
R=CH3、(CH2)XCH3、(CH2)XOHであり、
R1=CH3、(CH2)XCH3、(CH2)XOHであり、
ここで、
x=1〜3であり、
n=4、6、8であり、
m=2〜15であり、
R=R1=CH3である場合、mは2〜9とは異なる)
の新規担体を得るために、コリンを含むアルコキシアミンにより官能化されたカリックス[4]アレーン誘導体からなるカチオン性巨大分子を含む局所眼科用途のための製剤に関し、これはまた、公知の有効成分を送達することに加えて、有効成分の生物活性を増強できるそれら独自の生物活性を提供する。
シリビニンを含有するSLN(SLN−A)の調製
Compritol HD−5−ATOで調製し、シリビニンを負荷した本発明のSLN対象物を用いた手順およびこれにより得た実験データを本明細書以下に記載する。
SLN−Aを高圧高温均質化法により調製した。200ミリグラムのCompritol HD5ATOをその融点(65〜70℃)を約5〜10℃超えて溶融した。薬物(68mg)をエタノール(0.5mL)のアリコートに可溶化し、次いで磁性撹拌下で溶融した脂質混合物に加えた。次いで薬物を含有する高温脂質混合物を、以前に同じ温度で加熱したPluronic F68界面活性剤の水溶液(100mL中に60mg)中で乳化した。得られたプレエマルションを、65〜70℃の温度にて高温水浴に入れたEmulsiflex−C5機器(Avestin)を使用して高圧均質化に供する(4サイクルにて7500±2500psi)。得られたナノエマルションを室温に冷却し、次いで蒸留水に対する透析(COMW 12000−14000)によって精製する。その後、抗凍結剤トレハロース(脂質:抗凍結剤重量比=1:1w/w)をナノ粒子分散物に加え、これを遠心分離(10℃にて10分間4000rpm)に供した。最後に、Modulyo凍結乾燥機を使用した凍結乾燥後、SLNを回復させ、後の特徴付けのために冷凍室に保存した。
調製したSLN−A系の平均直径および多分散指数(PDI)は、Zetasizer Nano ZSP(Malvern Instrument)を使用して光子相関分光法(PCS)によって決定した。各試料を好適には、NaCl水溶液0.9%w/wで分析のために希釈し、0.2μmのフィルターで濾過し、読み取りを入射線に対して173°の角度で行い、3連で分析した。
SLN−A試料に負荷したシリビニンの量を決定するために、以前に凍結乾燥に供した10mgの組成物をテトラヒドロフラン(THF)に溶解した。次いで有機溶液をメタノールで処理して脂質を沈殿させ、有効成分を抽出した。次いで得られた懸濁液を0.45μmのフィルターで濾過し、HPLCにより分析した。DL%(脂質+有効成分からなる、凍結乾燥に供した100mgの物質を考慮して、SLNに負荷した有効成分の百分率として表した)に関して得た結果は8.5%w/wであることを見出した。
本発明に記載した系を、0から12時間の範囲のインキュベーション時間で、pH7.4のリン酸緩衝液を使用して37℃にてインビトロでの放出研究に供した。得られた結果は、本発明の系が、12時間以内に最大7.8%w/w以下で薬物をゆっくり放出することを示す。pH7.4および37℃でのインキュベーション後の薬物の放出および溶解プロファイルを図1に示す。
シリビニンを含有するNLC(NLC−B)の調製
非限定的な例として、Compritol HD−5−ATO、Gelucire44/14およびAcconon CC−6で調製し、シリビニンを負荷した本発明のNLC対象物を用いた手順およびこれにより得た実験データを本明細書以下に記載する。
NLC−Bを溶媒沈殿−蒸発法により調製した。Compritol HD5ATO(250mg)をその融点(65〜70℃)を約5〜10℃超えて溶融し、薬物(30mg)を溶融した脂質に加えた。Gelucire 44/14(100mg)およびAcconon CC−6(100mg)をエタノール(2.0mL)に可溶化し、次いで磁性撹拌下で溶融した脂質混合物に加えた。次いで薬物および界面活性剤を含有する高温脂質混合物を、以前に同じ温度で加熱した界面活性剤タウロコール酸ナトリウムを含有する高温水溶液(100mL中に100mg)中で沈殿させ、Ultra−Turrax(13.500rpm)を使用して均質化に供した。依然として撹拌下で、高温ナノ粒子懸濁液を、その温度が10℃の値に達するまで氷浴に入れた。次いで得られたナノ粒子を、3日間、蒸留水に対する透析(COMW 12000−14000)によって精製し、次いで抗凍結剤トレハロースを加える(脂質:抗凍結剤重量比=1:2w/w)。最後に、Modulyo凍結乾燥機を使用した凍結乾燥後、NLCを回復させ、後のイヌリン誘導体(INU−DETA)およびキトサンによる被覆のために冷凍室に保存した。INU−DETAによる被覆の場合、9mLの透析したナノ粒子懸濁液(4.3mg/mLの濃度)を、磁性撹拌下で1時間、1mLの0.1%INU−DETAとインキュベートした。低分子量(5000Mw)キトサンによる被覆の場合、トレハロースを追加した9mLの透析し、凍結乾燥したナノ粒子(0.165mg/mLの濃度)を、磁性撹拌下で30分間、1mLの0.1%キトサンとインキュベートした。次いで被覆したナノ粒子を凍結乾燥し、後の特徴付けのために粉末として保存した。
調製したINU−EDAおよびキトサンで被覆したNLC−B系の平均直径および多分散指数(PDI)は、Zetasizer Nano ZSP(Malvern Instrument)を使用して光子相関分光法(PCS)によって決定した。各試料を好適には、NaCl水溶液0.9%w/wで分析のために希釈し、0.2μmのフィルターで濾過し、読み取りを入射線に対して173°の角度で行い、3連で分析した。
INU−DETAおよびキトサンで被覆したNLC−B試料に負荷したシリビニンの量を決定するために、以前に凍結乾燥に供した2mgの組成物を8mLのエタノール(EtOH)に高温溶解し、3分間超音波処理した。次いで得られた溶液を5.00μmの再生したセルロースフィルタで濾過し、HPLCにより分析した。
本発明に記載したINU−DETAおよびキトサンで被覆したNLC−B系を、0から12時間の範囲のインキュベーション時間で、pH7.4のリン酸緩衝液を使用して37℃にてインビトロでの放出研究に供した。得られた結果は、本発明の両方の系が、INU−DETAで被覆したNLC−Bについて12時間以内に最大50%w/w以下、およびキトサンで被覆したNLC−Bについて12時間以内に最大30%w/w以下で薬物をゆっくり放出することを示す。pH7.4および37℃でのインキュベーション後の2つの被覆した系からの薬物シリビニンの放出および溶解プロファイルを図2に示す。
非限定的な例として、INU−C8およびINU−C8−PEG2000に基づき、シリビニンまたはソラフェニブを負荷した本発明の高分子ミセル対象物を用いた手順およびこれにより得た実権データを本明細書以下に記載する。
INU−C8およびINU−C8−PEG2000コポリマーの生成を、文献に既に存在している手順に従って良好な収率で実施した。INU−C8およびINU−C8−PEG2000コポリマーのCACは、蛍光プローブとしてピレンを使用して蛍光分光分析によって決定した。20μLのアセトン中のピレンの溶液(6.0×10−5M)をバイアルに入れ、乾燥するまでオービタルシェーカーにおいて37℃で蒸発させた。その後、濃度を増加させ、1×10−5から5mg/mLの範囲の2mLのコポリマーの水溶液を、6.0×10−7Mに等しいピレンの最終濃度を得るようにピレン残留物を含有するバイアルに加えた。このように得た分散物を、プローブをミセルと平衡にするために一定の撹拌下で37℃にて24時間維持した。ピレンの発光スペクトルおよび励起スペクトルは、以下の波長、それぞれ373nmおよび333nmを使用して記録した。結果は表3に示す。
シリビニンおよびソラフェニブを負荷した高分子ミセルは乾式複合体形成法(混練)によって調製した。詳細には、200mgのINU−C8またはINU−C8−PEGを、乳鉢および乳棒を使用して薬物(50mg)と乾式混合し、エタノール(5mL)の存在下で粉砕した。その後、エタノールの蒸発後に得られ、薬物を均一に分散させた、ポリマーによって形成された乾燥マトリクスを、ユニマー(unimer)の自己凝集および得られたミセルの疎水性コア内の薬物の組み込みを促進するために、ゆっくりと水和させ、機械的撹拌下に置いた。
シリビニンを負荷したまたはソラフェニブを負荷した3mgのミセルをメタノール(5mL)に分散させ、分散を10分間超音波処理し、次いで4時間激しく撹拌した。この時間の後、0.2μmのカットオフを有するシリンジフィルターを使用して分散物を濾過し、最後にフィルターをメタノール(5mL)で洗浄して10mLの最終体積を得た。抽出手順から得たメタノール中の600μLの溶液でシリビニンを決定するために、HPLC分析のために使用する溶出混合物の組成に適合するように400μLの1%酢酸(v/v)を加えた。その結果として、ミセルから抽出した薬物の量を、溶出相として1%(v/v)(60:40)にてC6−フェニル、メタノール:酢酸カラムを使用してHPLC分析により決定した。流速は0.65mL/分に設定し、溶出液を288nmにてモニターした。
ミセルのサイズ分布は、Malvern Zetasizer Nano ZSを使用した動的光散乱測定によって測定した。これらの測定は173°の固定角および25℃の温度にて行った。ミセルの水溶液(2mg/mL)は5μmのカットオフを有するセルロース膜フィルターによる濾過後に分析した。平均流体力学直径および多分散指数(PDI)は相関関数の累積的分析を使用して得た。ゼータ電位(mV)は、電気泳動移動度によって、およびK・a>>1(ここで、Kおよびaはそれぞれデバイ・ヒュッケル(Debye−Huckel)パラメーターおよび粒径である)と仮定してスモルコフスキー(Smoluchowsky)の関係式を使用して算出した。結果を表4に示す。見られ得るように、全てのコポリマーは疎水性薬物であるソラフェニブおよびシリビニンを組み込むことができる。
得られた系の、組み込まれた薬物を放出する能力を評価するために、適切な量のINU−C8およびINU−C8−PEG(15mg)の高分子ミセルをPBS、pH7.4(5mL)中に分散させ、1kDaの公称カットオフ(MWCO)を有する浮遊透析膜Spectra/Porに移した。薬物を負荷したミセル分散物および薬物単独を含有する透析膜をpH7.4にてPBS(50mL)中に浸漬し、Benchtop 808Cオービタルシェーカーインキュベーターモデル420において連続撹拌下(100rpm)で37℃にて24時間インキュベートした。定期的な時間間隔にて、外部媒体のアリコート(1mL)を透析膜の外側から採取し、等量の新鮮な媒体と置き換えた。採取した試料を凍結乾燥させ、メタノール:酢酸1%(v/v)に懸濁し、放出した薬物の量を測定するためにHPLCによって分析した。例として、系に組み込んだ有効成分シリビニンの放出グラフを示す。得られた全ての放出データを、同じ手順を使用して得たシリビニン単独(0.25mg)の拡散プロファイルと比較した(図3)。希釈プロセスを考慮してデータを補正した。各実験は3連で行い、結果は、標準誤差±5%に従っていることが見出された。グラフから見られ得るように、シリビニンを負荷したINU−C8およびINU−C8−PEGの高分子ミセルは遊離シリビニンの拡散と比較して非常に遅い放出動力学を示す(シリビニンの5%w/w未満が12時間のインキュベーション後に放出される)。同様の放出プロファイルもまた、有効成分ソラフェニブについて得た。
シリビニンまたはソラフェニブを負荷したINU−C8およびINU−C8−PEGのミセルの安定性を、4℃および25℃にて1、2および3ヶ月間、新たに凍結乾燥した系をインキュベートすることによって評価した。特に、新たに調製し、凍結乾燥した試料は、1、2および3ヶ月間、制御した温度で保存した。インキュベーション期間後、試料を再蒸留水(2mg/mL)中に分散させ、その平均直径、多分散指数およびゼータ電位を評価するために動的光散乱測定によって分析した。別々に、3mgの試料をメタノール(5mL)に分散させ、分散物を最初に10分間超音波処理し、2時間撹拌し、最後に5μmのカットオフを有するシリンジフィルターで濾過し、追加の5mLのメタノールで希釈した。抽出した有効成分の量は、薬物負荷の測定について記載されたのと同じ手順を使用してHPLC分析によって測定した。
INU−C8およびINU−C8−PEGの空ミセルの生体適合性を、市販のキット(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferationアッセイ、Promega)を使用したMTSアッセイによってヒト気管支上皮(16HBE)細胞株で評価した。細胞を2・104細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種し、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に懸濁し、10%vol/volのウシ胎仔血清(FBS)、1%vol/volの抗生物質(10mg/mLのストレプトマイシン、10000U−1mLのペニシリン)で濃縮し、標準的な条件下(37℃にて95%RHおよび5%CO2)でインキュベートした。インキュベーションの24時間後、培地を除去し、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5および1mg/mLに等しい濃度でINU−C8およびINU−C8−PEGの空ミセルを含有する200μLの新鮮な培地と置き換えた。インキュベーションの4および24時間後、DMEM中のミセルの分散物を除去し、細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1回洗浄し、100μLの新鮮な培地および20μLのMTS溶液で37℃にて2時間インキュベートした。DMEMのみでインキュベートした細胞を陰性対照として使用した。結果は、対照細胞と比較した細胞生存率の減少パーセントとして表した(図4aおよび4b)。全ての実験は3連で行った。
カリックスアレーンナノ粒子の調製
例として、シリビニン、クルクミンまたはラタノプロストを負荷したカリックス[4]アレーン誘導体(化合物1)による手順およびこれにより得られた実験データが、本明細書以下に記載される。
大員環の下端において4つのドデシル脂肪族鎖および上端においてコリンの4つの極性頭部基を有する両親媒性のカリックス[4]アレーン誘導体(化合物1)を、同様の誘導体に関する文献に記載された手順を適合して良好な収率で合成した。化合物はNMR分光法および質量分析により特徴付けた。
シリビニンを負荷したおよび負荷していないカリックスアレーンナノ粒子の平均直径、多分散指数(PDI)およびゼータ電位は、Zetasizer Nano ZS−90(Malvern Instrument)を使用して測定し、読み取りを入射線に対して90°の角度で行い、3連で分析した。平均直径、PDIおよびゼータ電位について得た結果を表6に与える。
1mg/mLのカリックスアレーンナノ粒子を含有するコロイド溶液中で負荷したシリビニンの量を決定するために、溶液のアリコートをメタノールで希釈し、HPLCにより分析した。288nmでのシリビニンの吸収バンドを考慮して薬物の量を測定した。PBS中のシリビニンの327nmバンドを考慮してUV分光計にて薬物の量も測定した。
pH7.4でのリン酸緩衝液中のシリビニンの放出を、透析による0から12時間の範囲のインキュベーション時間で37℃にてインビトロで調べた。得られた結果は、系が、12時間以内に最大6.5%w/w以下で薬物をゆっくり放出することを示した(図7)。持続放出は、病理部位における薬物送達の目的のために有益であり得る。
シリビニンを負荷したカリックスアレーンナノ粒子の安定性は、25℃にてPBS中でコロイド溶液を維持することによって評価した。調製物からの7および14日における対照は、実質的に変化していないサイズ、PDIおよびDL%の値を示す(表10)。製剤の安定性は、重要な薬理(例えば、眼底における病理部位への到達)および工業化要件である。
Claims (6)
- 眼疾患の局所治療における使用のための、シリビニンまたはソラフェニブまたはクルクミンまたはラタノプロストから選択される有効成分を含有する製剤であって、前記有効成分は、場合によりアミノ基を有するイヌリンポリマー、キトサンおよびカチオン性界面活性剤から選択される粘膜付着性物質の存在下で、
(1)固体脂質ナノ粒子(SLN)型およびナノ構造脂質担体(NLC)型の脂質ナノ粒子系、
(2)カリックスアレーンベースのナノ粒子系、
(3)両親媒性イヌリンコポリマーに基づいたミセルおよびナノ粒子系
に組み込まれている、製剤であって、
前記ナノ粒子系は、0.5未満の多分散指数で50から200nmの範囲の平均直径を有する、製剤。 - 前記眼疾患は神経変性眼疾患である、請求項1に記載の製剤。
- 前記脂質ナノ粒子系は、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、脂肪族アルコール、脂肪酸(C10−C22)、脂肪アルコールとの脂肪酸エステル、ペグ化ベヘン酸のモノ−、ジ−およびトリグリセリドの混合物、ペグ化カプリル酸およびカプロン酸のモノ−、ジ−およびトリグリセリドから選択される脂質からなる、請求項1または2に記載の製剤。
- 前記系は、シリビニン、ソラフェニブ、クルクミン、ラタノプロストから選択される有効成分を1から15%w/wの範囲の量で組み込んでいる、請求項3に記載の製剤。
- 神経変性眼疾患は、脈絡膜血管新生(CNV)、加齢性黄斑変性症(AMD)、黄斑浮腫、血管新生緑内障、黄斑浮腫、未熟児網膜症(ROP)、糖尿病性網膜症(DR)、ブドウ膜炎、眼内炎、網膜炎、脈絡膜炎、脈絡網膜炎、全身性疾患の網膜合併症から選択される、請求項2に記載の製剤。
- 前記カリックスアレーンベースのナノ粒子系に用いられる化合物が、下記式(A)の化合物である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製剤:
Rは、CH3、(CH2)xCH3、(CH2)xOHであり、
R1は、CH3、(CH2)xCH3、(CH2)xOHであり、
ここで、
xは1〜3であり、
nは4、6、8であり、
mは2〜15であり、
かつ、R=R1=CH3である場合、mは2〜9とは異なる)。
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