JP6744531B2

JP6744531B2 - ｍｉＲＮＡ用プライマー及び該プライマーを用いた核酸増幅反応法

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Publication number: JP6744531B2
Application number: JP2018195280A
Authority: JP
Inventors: 史恵武井
Original assignee: 防衛装備庁長官
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2020-08-19
Anticipated expiration: 2038-10-16
Also published as: JP2020074683A

Description

本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を複製するためのｍｉＲＮＡ用プライマー及び該プライマーを用いた核酸増幅反応法に関する。

現在、１〜数サンプルの遺伝子を検出する方法として、核酸増幅反応法であるリアルタイムＰＣＲ（real time polymerase chain reaction ）法の一つであるＴａｑＭａｎ（登録商標）法が知られている。この方法は、非常に感度の高い方法である一方、検出に用いるプローブの設計及び合成が煩雑で時間がかかるとともに、役務委託による高額な検出コストがかかるという問題がある。

そこで、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法の問題点を解決するべく、下記特許文献１に開示される新たなＰＣＲ反応法が開発されている。

特開２０１６−４２８３０号公報

ところで、近年、様々な疾患のバイオマーカーとして有用なｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が注目されている。ｍｉＲＮＡは１８〜２５ｍｅｒのノンコーディングＲＮＡの一種である核酸分子であり、翻訳抑制、ｍＲＮＡ分解、脱アデニル化など様々な方法で遺伝子発現の下方制御を行うことが知られている。そのため、例えば被験者の細胞の中にある特定のｍｉＲＮＡを取り出して分析することで、どのｍｉＲＮＡを調べればその人が罹患している病気の種類や、今後の疾病リスクを知得することができるため、病気の治療や予防に大いに役立てることができる。

少量のｍｉＲＮＡを何度も被験者から取り出して分析する方法は現実的ではないため、実際は採取した少量のｍｉＲＮＡを何万・何億と複製して研究するのが一般的である。しかし、この技術は高額な費用が嵩むという問題の他、異なった種類のｍｉＲＮＡ検出を行う度に、核酸増幅反応法に適する試薬（逆転写酵素やＰＣＲ酵素など）を用意しなければならないという問題があった。

また、ｍｉＲＮＡの長さは１８〜２５ｍｅｒ程度と非常に短いため、特許文献１の方法を含む従来のＰＣＲ法を採用した場合、塩基長が１０ｍｅｒ程度のプライマーではＰＣＲがうまく進行せず複製できないという問題があった。

そこで、本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、酵素などの試薬の制約を受けず、安価で且つ迅速にｍｉＲＮＡの複製が行えるｍｉＲＮＡ用プライマー及び該プライマーを用いた核酸増幅反応法を提供することを目的とする。

上記した目的を達成するため、本発明の核酸増幅反応法は、
塩基長が１８ｍｅｒ〜２５ｍｅｒである鋳型としてのｍｉＲＮＡと相補的に結合し得るように塩基配列が設計されたポリヌクレオチド配列を有し、修飾されていない核酸からなる塩基長が６ｍｅｒ〜１２ｍｅｒのプライマー部位と、
前記プライマー部位と結合され、ＰＣＲ時に前記鋳型と結合し得るポリヌクレオチド配列を有し、修飾されていない核酸からなるタグ部位と、
を備えるｍｉＲＮＡ用プライマーのみを使用して前記ｍｉＲＮＡを増幅させる核酸増幅反応法であって、
前記ｍｉＲＮＡに第１の前記ｍｉＲＮＡ用プライマーを結合させる工程と、
逆転写反応により前記ｍｉＲＮＡに結合した第１の前記ｍｉＲＮＡ用プライマーの前記プライマー部位を伸長させてｃＤＮＡに変換する工程と、
前記ｃＤＮＡを分離させる工程と、
分離した前記ｃＤＮＡと第２の前記ｍｉＲＮＡ用プライマーとを結合させる工程と、
結合した第２の前記ｍｉＲＮＡ用プライマーの前記プライマー部位と前記ｃＤＮＡを伸長させる工程と、
を含むことを特徴としている。

本発明によれば、１８〜２５ｍｅｒと短いｍｉＲＮＡを鋳型として核酸増幅反応法を用いて複製するにあたり、鋳型の塩基配列に対応するプライマーやプローブの複雑な設計を必要とせず、また特殊な装置や酵素の制約を受けずに安価で迅速な核酸増幅反応法を実施することが可能となる。

（ａ）は本発明に係るｍｉＲＮＡ用プライマーの基本構成を示す概念図であり、（ｂ）は同プライマーが鋳型であるｍｉＲＮＡに結合した状態を示す図である。バルジ構造を形成し得るプローブ部位のシグナル発生に至るまでの流れを示す概念図である。本発明に係る核酸増幅反応法における逆転写反応法の一連の工程を示す図である。本発明に係る核酸増幅反応法におけるＰＣＲ法の一連の工程を示す図である。実施例１で使用したプライマー、タグ、プローブ及び鋳型の塩基配列を示す図である。実施例１で使用した反応溶液を用いてＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を電気泳動したゲル分析結果を示す写真である。実施例１におけるＰＣＲサイクルと蛍光強度の関係を示すグラフである。実施例２で使用した反応溶液を用いてＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を電気泳動したゲル分析結果を示す写真である。実施例３で使用したプライマー、タグ、プローブ及び鋳型の塩基配列を示す図である。実施例３で使用した各フォワードプライマーを含む反応溶液のＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を電気泳動したゲル分析結果を示す写真である。実施例３におけるＰＣＲサイクルと蛍光強度の関係を示すグラフである。実施例４で使用したタグありプライマーとタグなしプライマーの塩基配列を示す図である。実施例４において各鋳型にタグありプライマーとタグなしプライマーを用いた反応溶液のＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を電気泳動したゲル分析結果を示す写真である。実施例４におけるＰＣＲサイクルと蛍光強度の関係を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態について、添付した図面を参照しながら詳細に説明する。また、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではなく、この形態に基づいて当業者などによりなされる実施可能な他の形態、実施例及び運用技術などは全て本発明の範疇に含まれるものとする。

本願発明者は、鋳型核酸として塩基長が１８〜２５ｍｅｒと短いｍｉＲＮＡを複製するにあたり、鋳型の塩基配列に対応するプライマーやプローブの複雑な設計を必要とせず、また逆転写酵素やＰＣＲ酵素などの制約を受けない安価で迅速な新規の核酸増幅反応法を確立するべく鋭意研究を重ねた。その結果、鋳型の略半分程度の長さに設計したプライマー部位２にタグ部位３を結合した構造とすることで、タグ部位３がプライマー部位２のように機能し、逆転写反応およびＰＣＲ時の伸長反応がスムーズに進行してＰＣＲの増幅効率が格段に上がることを知得し、本願発明の開発に至った。

［１．ｍｉＲＮＡ用プライマー］
まず、本発明に係るｍｉＲＮＡ用プライマー１の構造について説明する。
図１（ａ）、（ｂ）に示すように、ｍｉＲＮＡ用プライマー１は、鋳型であるｍｉＲＮＡと結合する基部となるプライマー部位２と、プライマー部位２に結合され鋳型と相補的に結合し得るタグ部位３と、タグ部位３との結合状態に応じて構造（バルジ構造）が変化するプローブ部位４で構成される。また、ｍｉＲＮＡ用プライマー１は、ＰＣＲ中の伸長反応におけるシグナルの確認を行わずにｍｉＲＮＡの増幅のみを行う場合、プライマー部位２とタグ部位３のみの構成とすることもできる。

なお、本明細書において「相補的」とは、塩基配列におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）とが特異的な水素結合を介して向かい合い、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）とが特異的な水素結合を介して向かい合う関係を意図する。

また、「バルジ構造」とは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の二本鎖領域において、一方の鎖のポリヌクレオチドに余剰のヌクレオチドが存在するために生じる膨らみ（バルジ）を意図する。

例えば、「ＴＣＴ」と「ＡＡ」とが向かい合って二本鎖を形成する場合、「ＴＣＴ」の中の２つの「Ｔ」と、「ＡＡ」の中の２つの「Ａ」とがそれぞれ対合して二本鎖を形成する。このとき、２つの「Ｔ」の間に存在する「Ｃ」には対合するヌクレオチドがないため、当該「Ｃ」が膨らむこととなる。そして、この膨らんだ構造をバルジ構造とする。

＜鋳型＞
鋳型となるｍｉＲＮＡは、検出対象に応じて適宜選択され得る。ｍｉＲＮＡとしては、例えば真核生物であるヒトの血液、リンパ液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水などの体液、皮膚、粘膜、各種臓器、骨などの組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨などを洗浄した後の洗浄液、植物や微生物などに由来するポリヌクレオチドを鋳型として用いることができる。一例としては、ヒト細胞由来のｍｉＲＮＡ（Ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａ，Ｈｓａ−ｍｉＲ−１７，Ｈｓａ−ｍｉＲ−１８，Ｈｓａ−ｍｉＲ−２０など）が挙げられる。これらのｍｉＲＮＡは塩基配列が既に公知であるため、ｍｉＲＮＡ用プライマー１のプライマー部位２を容易に設計することができる。また、上記のような真核生物のｍｉＲＮＡの他、真正細菌や古細菌のｍｉＲＮＡでも同様に使用することができる。

＜プライマー部位＞
プライマー部位２は、塩基長が鋳型よりも所定長さだけ短く、鋳型と相補的に結合し得るように塩基配列が設計されたポリヌクレオチド配列を有している。

プライマー部位２の塩基配列の長さは、塩基長が短すぎると鋳型とプライマー部位２との結合率が低くＰＣＲ反応が進行せず、また塩基長が長すぎるとＰＣＲ反応時にフォワードプライマーとリバースプライマーとが重なってしまうという問題がある。
以上のことから、プライマー部位２の長さは、鋳型の塩基配列全長の略半分程度の長さ、詳細には鋳型の塩基配列全長に対して２５％以上５５％以下の長さとなるように塩基長を設計するのが好ましい。

プライマーとして、二本鎖構造の鋳型（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型（一本鎖ＤＮＡ）に結合するフォワードプライマー（ＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡに結合するリバースプライマー（ＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ）と、を含む。鋳型と二本鎖を形成する、プライマー内の領域は、検出対象に応じて適宜設計され、鋳型に対して略相補的又は相補的なポリヌクレオチドとして設計されれば、具体的な構成は限定されない。

また、プライマー部位２の塩基配列を、鋳型の特定の塩基配列にのみ結合するように設計することで、特定の塩基配列にのみ結合するため、非特異的な核酸の増幅を抑えることができる。

＜タグ部位＞
タグ部位３は、鋳型やプライマー部位２と結合し得るポリヌクレオチド配列を有している。上記のように、プライマー部位２の塩基長は鋳型の塩基長よりも略半分程度と短いため、このままではＰＣＲの進行効率が悪く複製がスムーズに進まない。しかしながら、本発明のｍｉＲＮＡ用プライマー１のように、プライマー部位２にタグ部位３を結合することで、このタグ部位３が恰もプライマー部位２のように機能するため、複製時に鋳型がタグ部位３まで伸長して相補的に結合することでＰＣＲの効率を格段に上げることができる。

＜プローブ部位＞
プローブ部位４は、核酸の増幅量を定量するために用いられ、分子内にバルジ構造を形成しタグ部位３と解離してバルジ構造結合分子５が結合したときにシグナル（例えば、蛍光発光）を発するポリヌクレオチド配列を有する。

プローブ部位４は、ＰＣＲ反応が開始される時点において、タグ部位３と結合していることで立体構造が変化し、その結果、プローブ中のバルジ構造が失われている。そのため、ＰＣＲ反応が開始される時点では、バルジ構造結合分子に由来するシグナルは発生していない。

ここで、プローブ部位４の機能について説明する。
ＰＣＲ反応が開始されると、図２（ａ）に示すように、まず上記プローブとプライマーとの複合体が鋳型に結合するとともに、当該プライマーを起点として鋳型の相補鎖が伸長される。

次に、上記相補鎖と上記鋳型とによって形成されている二本鎖は、高温処理によって、少なくとも相補鎖を含む鎖（鎖Ｂ）と、鋳型からなる一本鎖（鎖Ａ）とに分離される。

次に、図２（ｂ）に示すように、鎖Ｂに対して別のプライマー（図１には、別のプライマーを図示せず）が結合し、当該別のプライマーを起点として鎖Ｂの相補鎖が伸長される。

鎖Ｂの相補鎖が伸長される過程において、当該相補鎖中に、プローブ内のプライマー結合領域に対応する相補的なヌクレオチドが形成される。そして、図２（ｃ）に示すように、結合する相手を失ったプローブは、ＰＣＲ反応溶液中に解離することになる。ＰＣＲ反応溶液中に解離したプローブは、プローブ分子内の水素結合などを介した相互作用によって、当該プローブ内にバルジ構造を形成し、さらに、当該バルジ構造にバルジ構造結合分子が結合することで所定のシグナルが発生する。

プローブ部位４内に形成されるバルジ構造としては、特に限定されないが、例えばシトシンバルジ構造、チミンバルジ構造、アデニンバルジ構造及びグアニンバルジ構造を挙げることができる。シグナル強度を増してＰＣＲの検出精度を高めるという観点からは、バルジ構造は、シトシンバルジ構造、チミンバルジ構造、又はアデニンバルジ構造であることが好ましく、シトシンバルジ構造、又はチミンバルジ構造であることがさらに好ましく、シトシンバルジ構造であることが最も好ましい。

バルジ構造に隣接するヌクレオチドの種類は特に限定されないが、アデニン、シトシン、又はチミンが好ましい。バルジ構造結合分子が蛍光を発する分子である場合、バルジ構造にグアニンが隣接すると、蛍光の強度が低下する傾向を示し、バルジ構造にアデニン、シトシン又はチミンが隣接すると、蛍光の強度が上昇する傾向を示す。

＜バルジ構造結合分子＞
バルジ構造結合分子５は、タグ部位３から解離したプローブ部位４と結合することによってシグナルを発するものであればよく、具体的な構成は限定されない。

バルジ構造結合分子５は、例えば、バルジ構造に結合することによって、蛍光を発光する物質、発光する蛍光の波長がシフトする物質、又は蛍光が消光する物質などを用いることが好ましい。これらの蛍光を検出することで、容易にバルジ構造を検出できる。なお、バルジ構造結合分子として、自身ではシグナルを発する能力がない物質を、シグナルを発する能力を有する物質（例えば、蛍光物質）にて標識化したものを用いることも可能である。

上記のようなバルジ構造結合分子５の一例としては、（Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−２, ７−ｄｉａｍｉｎｏ−１，８−ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ（ＤＡＮＰ））や前記ＤＡＮＰの誘導体などがある。

［２．核酸増幅反応法］
本発明に係る上述したｍｉＲＮＡ用プライマー１を用いた核酸増幅反応法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う逆転写反応法と、逆転写反応法に続くポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うＰＣＲ法とを含む方法である。

＜逆転写反応法＞
図３には、第１のプライマーとして本発明に係るｍｉＲＮＡ用プライマー１を用いた逆転写反応法の一連の工程が示されている。

図３に示すように、逆転写反応法は、増幅対象である鋳型（ｍｉＲＮＡ）と、鋳型に合せて設計したプライマー部位２とタグ部位３とを有する第１のプライマーであるｍｉＲＮＡ用プライマー１と、逆転写酵素とを含む反応溶液を逆転写反応にかけ、鋳型にｍｉＲＮＡ用プライマー１のプライマー部位２を結合させた後、逆転写によってプライマー部位２を伸長させて鋳型と対の型となるｃＤＮＡ（complementary DNA ）に変換する方法である。

つまり、逆転写反応法によって得られるｃＤＮＡは、鋳型と結合したプライマー部位２が相補的に伸長したものとなる。

＜ＰＣＲ法＞
図４には、第２のプライマーとして本発明に係るｍｉＲＮＡ用プライマー１を用いたＰＣＲ法の一連の工程が示されている。

図４に示すように、ＰＣＲ法は、逆転写反応法に続くポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法である。ＰＣＲ法は、まず反応溶液中に存在する二本鎖となった鋳型であるｍｉＲＮＡとｃＤＮＡの水素結合を熱変性させて一本鎖に解離する反応（分離反応）を行い、解離した鋳型となるｃＤＮＡに第２のプライマーとしてｍｉＲＮＡ用プライマー１を相補的に結合させる反応（アニーリング反応）を行い、結合させたｍｉＲＮＡ用プライマー１を相補的に伸長させる反応（伸長反応）を行う。

このＰＣＲ法では、上記３つの反応を２５〜４０サイクル繰り返し行うことで目的生成物であるＰＣＲ産物を増幅させることができる。

また、反応溶液にバルジ構造を有するプローブ部位４と、このプローブ部位４との結合状態に応じて発するシグナルを変化させるバルジ構造結合分子とを含有させることで、伸長反応時にタグ部位３からプローブ部位４が解離してバルジ構造を形成し、溶液中に含まれるバルジ構造結合分子５がバルジ構造となったプローブ部位４と結合してシグナルを発する。これにより、伸長反応が進行していることを確認することができる。

なお、本発明で行われる核酸増幅反応法である逆転写反応法及びＰＣＲ法は、何れも従来から知られている方法を適宜用いることができる。また、逆転写反応法やＰＣＲ法に用いる酵素（逆転写酵素やＰＣＲ酵素など）についても、上記核酸増幅反応法に合せて適宜選択すればよく、特に制限がない。

核酸増幅反応法の一例を挙げると、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐＲＴ−ＰＣＲとしては反応酵素として「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲｗｉｔｈＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）」や、「ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）ＰｒｏｂｅＯｎｅ−ｓｔｅｐｑＲＴ−ＰＣＲｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）」を用いる方法があり、Ｔｗｏ−ｓｔｅｐＲＴ−ＰＣＲとしては反応酵素として「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ
ＲｅｇｅｎｔＫｉｔ（ｐｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（ＴＡＫＡＲＡ）及びＫＯＤＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）」を用いる方法がある。
なお、ｍｉＲＮＡ用プライマー１は、フォワードプライマーとリバースプライマーを含むが、フォワードプライマーは逆転写兼用としてもよい。

逆転写酵素の一例としては、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴＲｅｇｅｎｔＫｉｔ（ｐｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（タカラバイオ株式会社製の製品名），ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（登録商標）（東洋紡株式会社製の製品名）などがあり、ＰＣＲキットの一例としては、ＫＯＤＦＸ（東洋紡株式会社製の製品名），ｒＴａｑ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＴａｑ）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡株式会社製の製品名），ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（タカラバイオ株式会社製の製品名）などがあり、１ステップ逆転写＆ＰＣＲキットの一例としては、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲｗｉｔｈＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社製の製品名），ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）ＰｒｏｂｅＯｎｅ−ｓｔｅｐｑＲＴ−ＰＣＲｋｉｔ（東洋紡株式会社製の製品名）などがある。

また、上記方法を用いてＰＣＲを行うＰＣＲ装置も、従来から知られている市販の装置（一例として、ＴａＫａＲａＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ，ＴａＫａＲａＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＴＭＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ）を適宜選択して使用することができる。

また、上記各方法は、試料に由来するシグナル（例えば蛍光状態）を検出する工程を含んでいてもよい。例えばシグナルが蛍光状態の場合は、光学的性質を測定する測定機器として蛍光マイクロプレートリーダー（一例として、ＴＥＣＡＮＩｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００）を用いて蛍光状態を検出することができる。

以上のように、本発明に係るｍｉＲＮＡ用プライマー１は、１８〜２５ｍｅｒと塩基長が短いｍｉＲＮＡを鋳型として複製するにあたり、鋳型の略半分程度の塩基長であるプライマー部位２と、プライマー部位２に結合され鋳型と相補的に結合し得るタグ部位３と、タグ部位３との結合状態に応じて構造が変化するプローブ部位４とで構成されるため、鋳型の塩基配列に対応するプライマーやプローブの複雑な設計を必要とせず、また逆転写酵素やＰＣＲ酵素などの制約を受けないため、安価で迅速な核酸増幅反応を実施することが可能となる。

また、鋳型の略半分程度の長さに設計したプライマー部位２にタグ部位３を結合した構造としたため、タグ部位３がプライマー部位２のように機能して鋳型とプライマー部位２とが結合した後に伸長反応がスムーズに進行してＰＣＲの増幅効率を格段に上げることができる。

次に、本発明に係るｍｉＲＮＡ用プライマー１を用いた鋳型の逆転写反応法・ＰＣＲ法による実施例について説明する。
なお、下記に示す実施例は本発明を限定するものではなく、前・後記の趣旨に照らし合わせて本発明の構成及び特徴要件を逸脱しない範囲で適宜設計変更することは、何れも本発明の技術的範囲に含まれるものとする。

［実施例１. ＰＣＲ生成物の電気泳動解析及び蛍光解析］
実施例１は、下記に示す鋳型、ｍｉＲＮＡ用プライマー１を用いて逆転写反応及びＰＣＲを行い、各ＰＣＲ産物を電気泳動法によって検出するとともに、各ＰＣＲ産物の増加にともなって蛍光強度がどのように変化するかを検証する試験を行った。

反応溶液の内訳については図５に示す通りであり、「フォワードプライマー，リバースプライマー」はタグ部位３が結合されたプライマー部位２を指し、「プローブ」はプローブ部位４を指す。
なお、図５において、塩基配列中の下線は、タグ部位３の塩基配列を示し、太字は、鋳型と相補的な結合が可能なように設計された配列部分を示している。

＜プライマー＞
・フォワードプライマー：ｍｉｒ１２２Ｆ−１２−Ｔａｇ
（塩基配列）５‘−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT ACA AAC ACC ATT −３’
・リバースプライマー：ｍｉｒ１２２Ｒ−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT TGG AGT GTG AC−３’
＜プローブ＞
・Ｈｐｒｏ
（塩基配列）５’−ATC ATC TAC AAC TTT TGT CTG TAA TGA TCT C −３‘
＜鋳型＞
・ｍｉＲＮＡ−１２２ａ（２３ｍｅｒ）
（塩基配列）５’−UGG AGU GUG ACA AUG GUG UUU GU−３’

反応溶液として、上述した０．５μＭの逆転写兼フォワードプライマー、０．５μＭのリバースプライマー、１μＭのシトシンバルジ構造を形成するプローブ、１０μＭのバルジ構造結合分子及び０．５ｎＭの鋳型の反応溶液（合計２０μＬ）を用いた。

また、核酸増幅反応法は、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐＲＴ−ＰＣＲを行い、反応酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲｗｉｔｈＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社）を用いた。
なお、上記核酸増幅反応法の試験条件における逆転写・ＰＣＲサイクルは、下記の通りである。
＜逆転写反応法＞
・５０℃ ３０ｍｉｎ（ｃＤＮＡ合成）
＜ＰＣＲ法＞
・初期変性処理：９４℃ ２ｍｉｎ
・分離反応：９４℃ １５ｓｅｃ（反応１）
・アニーリング反応：５５℃ ３０ｓｅｃ（反応２）
・伸長反応：６８℃ ３０ｓｅｃ（反応３）
なお、上記反応１〜反応３の処理は３５〜４０サイクル繰り返し行われるが、ここでは４０サイクル行った。

図６は、上記反応溶液を用いてＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を電気泳動したゲル分析結果を示す写真である。図６に示すように、上記反応溶液はＰＣＲが順調に進み、２０〜２５サイクルから徐々に目的生成物であるＰＣＲ産物が増え始めて正常に複製されていることが確認された。

図７は、ＰＣＲサイクルと蛍光強度の関係を示すグラフである。図７に示すように、蛍光強度もＰＣＲが２０サイクルから徐々に強まり、２５サイクルを超えたあたりから急激に強くなっていることが確認された。これは、ＰＣＲが進むにつれて鋳型とｍｉＲＮＡ用プライマー１と結合による複製が進み、この複製が増えることでｍｉＲＮＡ用プライマー１からプローブ部位４の解離する量が増えたことで、この解離したプローブ部位４と試薬中のバルジ構造結合分子５とが結合し蛍光発光を示すプローブ部位４が増え試薬中の蛍光強度が増したものと推察される。

［実施例２．プライマーの検討］
実施例２は、ｍｉＲＮＡ用プライマー１に結合されるタグ部位３の有無によるＲＴ−ＰＣＲへの影響を検証する試験を行った。

反応溶液の内訳については下記に示す通りであり、「フォワードプライマー，リバースプライマー」はプライマー部位２を指し、「プローブ」はプローブ部位４を指す。
反応溶液を３種類用意し、反応溶液１についてはタグ部位３を結合していないプライマーを使用し、反応溶液２と反応溶液３についてはタグ部位３が結合されたプライマーを使用した。また、反応溶液３にはテンプレートとなるｍｉＲＮＡを含有しない溶液として調製した。

−反応溶液１−
＜プライマー＞
・フォワードプライマー：ｍｉｒ１２２Ｆ−１２−Ｔａｇ
・リバースプライマー：ｍｉｒ１２２Ｒ（タグ部位３なし）
＜プローブ＞
・Ｈｐｒｏ
＜鋳型＞
・ｍｉＲＮＡ−１２２ａ
−反応溶液２−
＜プライマー＞
・フォワードプライマー：ｍｉｒ１２２Ｆ−１２−Ｔａｇ
・リバースプライマー：ｍｉｒ１２２Ｒ−Ｔａｇ（タグ部位３あり）
＜プローブ＞
・Ｈｐｒｏ
＜鋳型＞
・ｍｉＲＮＡ−１２２ａ
−反応溶液３−
＜プライマー＞
・フォワードプライマー：ｍｉｒ１２２Ｆ−１２−Ｔａｇ
・リバースプライマー：ｍｉｒ１２２Ｒ−Ｔａｇ
＜プローブ＞
・Ｈｐｒｏ

なお、各反応溶液で使用するプライマー、プローブ、鋳型の塩基配列については実施例１の図５に示した各塩基配列と同等である。また、反応溶液１で使用したタグ部位３を付けていないリバースプライマーの塩基配列は、図５のリバースプライマーにおける太字の部分のみとする。

また、核酸増幅反応法は、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐＲＴ−ＰＣＲを行い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲｗｉｔｈＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社製の製品名) を用いた。なお、試験条件については、上記実施例１と同様である。

図８は、上記反応溶液を用いてＲＴ−ＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を電気泳動したゲル分析結果を示す写真である。図８に示すように、反応溶液１については反応が進まず、反応溶液２のみＰＣＲが進んでいることが確認された。これにより、プライマーとしてフォワードプライマー及びリバースプライマーに共にタグ部位３が結合していないとＲＴ−ＰＣＲが進行しないことが明らかとなった。また、反応溶液中にテンプレートである鋳型が含まれないとＲＴ−ＰＣＲは進行せず、また変則的な反応産物の生成も起こらないことが明らかとなった。
以上により、タグ部位３がないプライマーではｍｉＲＮＡの増幅が行われないため、ｍｉＲＮＡ用プライマー１には、少なくともプライマー部位２とタグ部位３が必要であることが確認された。

［実施例３．プライマー部位の長さによるＰＣＲ増幅の違い］
実施例３は、ｍｉＲＮＡ用プライマー１のプライマー部位２における鋳型との相補的結合部分の塩基長を複数種設計して各プライマーのＰＣＲ増幅の違いを検証する試験を行った。

反応溶液の内訳については下記に示す通りであり、「フォワードプライマー，リバースプライマー」はプライマー部位２を指し、「プローブ」はプローブ部位４を指す。
なお、図９において、塩基配列中の下線は、タグ部位３の塩基配列を示し、太字は、鋳型と相補的な結合が可能なように設計された配列部分を示しており、各フォワードプライマーにおけるプライマー部位２の塩基数を上から順に１２ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、７ｍｅｒ、６ｍｅｒ、５ｍｅｒで設計した。

＜プライマー＞
・フォワードプライマー（１２ｍｅｒ）：ｍｉｒ１２２Ｆ−１２−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT ACA AAC ACC ATT −３’
・フォワードプライマー（１０ｍｅｒ）：ｍｉｒ１２２Ｆ−１０−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT ACA AAC ACC A −３’
・フォワードプライマー（７ｍｅｒ）：ｍｉｒ１２２Ｆ−７−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT ACA AAC A −３’
・フォワードプライマー（６ｍｅｒ）：ｍｉｒ１２２Ｆ−６−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT ACA AAC −３’
・フォワードプライマー（５ｍｅｒ）：ｍｉｒ１２２Ｆ−５−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT ACA AA−３’
・リバースプライマー：ｍｉｒ１２２Ｒ−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT TGG AGT GTG AC−３’
＜プローブ＞
・Ｈｐｒｏ
（塩基配列）５’−ATC ATC TAC AAC TTT TGT CTG TAA TGA TCT C −３’
＜鋳型＞
・ｍｉＲＮＡ−１２２ａ（２３ｍｅｒ）
（塩基配列）５’−UGG AGU GUG ACA AUG GUG UUU GU−３’

また、核酸増幅反応法は、Ｔｗｏ−ｓｔｅｐＲＴ−ＰＣＲを行い、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴＲｅｇｅｎｔＫｉｔ（ｐｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（タカラバイオ株式会社製の製品名）及びＫＯＤＦＸ（東洋紡株式会社製の製品名) を用いた。なお、上記核酸増幅反応法の試験条件における逆転写・ＰＣＲサイクルは、下記の通りである。
＜逆転写反応法＞
・４２℃ １５ｍｉｎ（ｃＤＮＡ合成）
・８５℃ ５ｓｅｃ
・４℃
＜ＰＣＲ法＞
・初期変性処理：９４℃ ２ｍｉｎ
・分離反応：９８℃ １０ｓｅｃ（反応１）
・アニーリング反応：５７℃ ３０ｓｅｃ（反応２）
・伸長反応：６８℃ ３０ｓｅｃ（反応３）
なお、上記反応１〜反応３の処理は３５〜４０サイクル繰り返し行われるが、ここでは４０サイクル行った。

図１０は、各フォワードプライマーを用いた反応溶液のＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を電気泳動したゲル分析結果を示す写真である。図１０に示すように、プライマー部位２が１２ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、７ｍｅｒ、６ｍｅｒのフォワードプライマーを用いた反応溶液ではＰＣＲが順調に進み、目的生成物であるＰＣＲ産物が増え始めて正常に複製されていることが確認された。

一方、プライマー部位２が５ｍｅｒのフォワードプライマーを用いた反応溶液では、ＰＣＲが進まず、ＰＣＲ産物が正常に複製されていないことが確認された。

図１１は、ＰＣＲサイクルと蛍光強度の関係を示すグラフである。図１１に示すように、プライマー部位２が１２ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、７ｍｅｒ、６ｍｅｒのフォワードプライマーを用いた反応溶液ではＰＣＲが１５〜２５サイクルから徐々に蛍光強度が増えていることが確認された。これは、ＰＣＲが進むにつれて鋳型とｍｉＲＮＡ用プライマー１と結合による複製が進み、この複製が増えることでｍｉＲＮＡ用プライマー１からプローブ部位４の解離する量が増えたことで、この解離したプローブ部位４と試薬中のバルジ構造結合分子５とが結合し蛍光発光を示すプローブ部位４が増え試薬中の蛍光強度が増したものと推察される。

一方、プライマー部位２が５ｍｅｒのフォワードプライマーを用いた反応溶液では、ＰＣＲが進まず、蛍光強度が殆ど上がらないことが確認された。これは、逆転写反応時にプライマー部位２の長さが短く鋳型とうまく結合されず、その後のＰＣＲが進行しないものと推測される。

以上のことから、ｍｉＲＮＡ用プライマー１におけるプライマー部位２の長さは、鋳型の塩基配列全長の２５％以上５５％以下の範囲に収まるように塩基数を調整して設計することで、プライマー部位２が鋳型に結合してＰＣＲが正常に進行することが確認された。

［実施例４．他種の鋳型によるｍｉＲＮＡの検出］
実施例４では、実施例１〜３で使用した鋳型と異なる他種のｍｉＲＮＡを鋳型として使用したときの増幅の有無を検証する試験を行った。

鋳型として下記に示す３種の合成ｍｉＲＮＡを各１×１０^-8Ｍに調製したものを使用した。
・Ｈｓａ−ｍｉＲ−１７（ｍｉｒ１７）
（塩基配列）CAA AGU GCU UAC AGU GCA GGU AG（２３ｍｅｒ）
・Ｈｓａ−ｍｉＲ−１８（ｍｉｒ１８）
（塩基配列）UAA GGU GCA UCU AGU GCA GAU AG（２３ｍｅｒ）
・Ｈｓａ−ｍｉＲ−２０（ｍｉｒ２０）
（塩基配列）UAA AGU GCU UAU AGU GCA GGU AG（２３ｍｅｒ）

反応溶液の内訳については下記に示す通りであり、「フォワードプライマー，リバースプライマー」はプライマー部位２を指し、「プローブ」はプローブ部位４を指す。
なお、図１２において、塩基配列中の下線は、タグ部位３の塩基配列を示し、太字は、鋳型と相補的な結合が可能なように設計された配列部分を示している。また、３種類の鋳型に対し、フォワードプライマーとリバースプライマーはそれぞれタグ部位３がある配列とタグ部位３がない配列の２種類を設計した。

＜プライマー＞
（タグありプライマー）
・フォワードプライマー（３６ｍｅｒ）：ｍｉｒ１７Ｆ−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT CTA CCT GCA CTG −３’
・フォワードプライマー（３６ｍｅｒ）：ｍｉｒ１８Ｆ−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT CTA TCT GCA CTA −３’
・フォワードプライマー（３６ｍｅｒ）：ｍｉｒ２０Ｆ−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT CTA CCT GCA CTA −３’
・リバースプライマー（３５ｍｅｒ）：ｍｉｒ１７Ｒ−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT CAA AGT GCT TA−３’
・リバースプライマー（３５ｍｅｒ）：ｍｉｒ１８Ｒ−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT TAA GGT GCA TC−３’
・リバースプライマー（３５ｍｅｒ）：ｍｉｒ２０Ｒ−Ｔａｇ
（塩基配列）５’−AGA CAA AAG TTG TAG ATG ATT TTT TAA AGT GCT TA−３’
（タグなしプライマー）
・フォワードプライマー：ｍｉｒ１７Ｆ
（塩基配列）５’−CTA CCT GCA CTG −３’
・フォワードプライマー：ｍｉｒ１８Ｆ
（塩基配列）５’−CTA TCT GCA CTA −３’
・フォワードプライマー：ｍｉｒ２０Ｆ
（塩基配列）５’−CTA CCT GCA CTA −３’
・リバースプライマー：ｍｉｒ１７Ｒ
（塩基配列）５’−CAA AGT GCT TA−３’
・リバースプライマー：ｍｉｒ１８Ｒ
（塩基配列）５’−TAA GGT GCA TC−３’
・リバースプライマー：ｍｉｒ２０Ｒ
（塩基配列）５’−TAA AGT GCT TA−３’
＜プローブ＞
・Ｈｐｒｏ
（塩基配列）５’−ATC ATC TAC AAC TTT TGT CTG TAA TGA TCT C −３’

反応溶液として、上述した０．５μＭの逆転写兼フォワードプライマー、０．５μＭのリバースプライマー、１μＭのシトシンバルジ構造を形成するプローブ、１０μＭのバルジ構造結合分子及び１×１０^-8Ｍの鋳型の反応溶液（合計２０μＬ）を用いた。

また、核酸増幅反応法は、Ｔｗｏ−ｓｔｅｐＲＴ−ＰＣＲを行い、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴＲｅｇｅｎｔＫｉｔ（ｐｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（タカラバイオ株式会社製の製品名）及びＫＯＤＦＸ（東洋紡株式会社製の製品名) を用いた。なお、核酸増幅反応法の試験条件は、上記実施例３と同様である。

図１３は、各鋳型にタグありプライマーとタグなしプライマーを用いた反応溶液のＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を電気泳動したゲル分析結果を示す写真である。図１３に示すように、タグありプライマーを用いた反応溶液（１），（３），（５）についてはｍｉＲＮＡが何れも増幅が確認されたが、タグなしプライマーを用いた反応溶液（２），（４），（６）についてはＰＣＲが進行せずｍｉＲＮＡの増幅が確認できなかった。

図１４は、ＰＣＲが進行した反応溶液（１），（３），（５）におけるＰＣＲサイクルと蛍光強度の関係を示すグラフである。図１４に示すように、各反応溶液はＰＣＲが１５〜２５サイクルから徐々に蛍光強度が増えていることが確認された。これは、ＰＣＲが進むにつれて鋳型とｍｉＲＮＡ用プライマー１と結合による複製が進み、この複製が増えることでｍｉＲＮＡ用プライマー１からプローブ部位４の解離する量が増えたことで、この解離したプローブ部位４と試薬中のバルジ構造結合分子５とが結合し蛍光発光を示すプローブ部位４が増え試薬中の蛍光強度が増したものと推察される。

以上のことから、鋳型となるｍｉＲＮＡの種類は特に限定されず、プライマー部位２にタグ部位３が結合された本発明に係るｍｉＲＮＡ用プライマー１を用いることでＰＣＲによるｍｉＲＮＡの複製が可能であることが明らかとなった。また、タグ部位３がないプライマーではｍｉＲＮＡの増幅が行われないため、ｍｉＲＮＡ用プライマー１には、少なくともプライマー部位２とタグ部位３が必要であることが確認された。

１…ｍｉＲＮＡ用プライマー
２…プライマー部位として機能するポリヌクレオチド配列
３…タグ部位として機能するポリヌクレオチド配列
４…バルジ構造を形成し得るプローブ部位として機能するポリヌクレオチド配列
５…プローブ部位と結合してシグナルを発するバルジ構造結合分子

Claims

塩基長が１８ｍｅｒ〜２５ｍｅｒである鋳型としてのｍｉＲＮＡと相補的に結合し得るように塩基配列が設計されたポリヌクレオチド配列を有し、修飾されていない核酸からなる塩基長が６ｍｅｒ〜１２ｍｅｒのプライマー部位と、
前記プライマー部位と結合され、ＰＣＲ時に前記鋳型と結合し得るポリヌクレオチド配列を有し、修飾されていない核酸からなるタグ部位と、
を備えるｍｉＲＮＡ用プライマーのみを使用して前記ｍｉＲＮＡを増幅させる核酸増幅反応法であって、
前記ｍｉＲＮＡに第１の前記ｍｉＲＮＡ用プライマーを結合させる工程と、
逆転写反応により前記ｍｉＲＮＡに結合した第１の前記ｍｉＲＮＡ用プライマーの前記プライマー部位を伸長させてｃＤＮＡに変換する工程と、
前記ｃＤＮＡを分離させる工程と、
分離した前記ｃＤＮＡと第２の前記ｍｉＲＮＡ用プライマーとを結合させる工程と、
結合した第２の前記ｍｉＲＮＡ用プライマーの前記プライマー部位と前記ｃＤＮＡを伸長させる工程と、
を含むことを特徴とする核酸増幅反応法。