JP6733899B2 - セレン化合物含有食品用組成物の製造方法及びセレン化合物含有食品用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、セレン化合物含有食品用組成物の製造方法及びセレン化合物含有食品用組成物に関する。

セレンは、ヒトにとって必須の微量元素であり、生体内では、酵素や蛋白質の一部を構成し、例えば、抗酸化反応において重要な役割を担っている。セレンは藻類、魚介類、肉類、卵黄に豊富に含まれており、日本人が多く摂取するさまざまな魚種の魚肉にも豊富に含まれている。
セレンを含む化合物（以下、セレン化合物という）又はセレン化合物を含む組成物については、従来、多く開示されている（例えば、特許文献１及び２）。

特許文献１には、魚類等の生物由来の試料を有機溶媒又は水で抽出することによりセレノネイン等のセレン化合物が得られることが開示されている。

特許文献２には、セレン含有食品素材として、魚肉の脱脂物にプロテアーゼを添加して酵素反応させた後に濃縮した液体食品素材が開示されている。

特開２０１１−１２１９１４号公報 特開２００１−２３１４９８号公報

しかし、魚肉を原料とするセレン化合物含有食品用組成物は、従来の製造方法では、セレン化合物の含有量が低く、工業的な生産効率が十分とはいえなかった。

本発明は、従来の製造方法に比べてセレン化合物の含有量が高い、サバ類を原材料とするセレン化合物含有食品用組成物の製造方法及びセレン化合物の含有量が高いセレン化合物含有食品用組成物を提供することを課題とする。

本発明は、
〔１〕セレン化合物含有食品用組成物の製造方法であって、
前記製造方法が、
魚肉が有する蛋白質分解酵素を失活させて前記セレン化合物を含む魚肉由来組成物を得る工程１と、
前記魚肉由来組成物に、細菌由来の蛋白質分解酵素（酵素１）及び微生物由来の蛋白質分解酵素（酵素２）を順次加えて前記魚肉由来組成物を酵素反応に供した後に、前記酵素１及び２を失活させて、前記セレン化合物を含むセレン化合物含有食品用組成物を得る工程２とを含み、
前記魚肉がサバ類であるセレン化合物含有食品用組成物の製造方法（以下、本発明の製造方法という）、
〔２〕前項〔１〕記載のセレン化合物含有食品用組成物の製造方法で得られるセレン化合物含有食品用組成物（以下、本発明のセレン化合物含有食品用組成物という）、及び、
〔３〕 アミノ酸及びセレン化合物を含むセレン化合物含有食品用組成物であって、
前記アミノ酸の組成がサバ類由来のアミノ酸組成であり、
前記セレン化合物含有食品用組成物中、
前記セレン化合物の含有量が３μｇＳｅ／ｇ以上であり、
総セレン含有量が５μｇ／ｇ以上である、セレン化合物含有食品用組成物（以下、本発明の組成物という）に関する。

本発明によれば、従来の製造方法に比べてセレン化合物の含有量が高い、サバ類を原材料とするセレン化合物含有食品用組成物の製造方法及びセレン化合物の含有量が高いセレン化合物含有食品用組成物を提供することができる。

実施例１で得たセレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）の試料のクロマトグラム（Ａ）及びセレン化合物標準物質１のクロマトグラム（Ｂ）である。 実施例１で得た本発明の組成物のアミノ酸含有量の分析フローである。 実施例１で得た本発明の組成物のアミノ酸含有量の分析フローである。

〔本発明の製造方法〕
本発明の製造方法は、セレン化合物含有食品用組成物の製造方法であって、
前記製造方法が、
セレン化合物を含む魚肉が有する蛋白質分解酵素を失活させて前記セレン化合物を含むサバ類由来組成物を得る工程１と、
前記サバ類由来組成物に、細菌由来の蛋白質分解酵素（酵素１）及び微生物由来の蛋白質分解酵素（酵素２）を順次加えて前記サバ類由来組成物を酵素反応に供した後に、前記酵素１及び２を失活させて、前記セレン化合物を含むセレン化合物含有食品用組成物を得る工程２とを含む、セレン化合物含有食品用組成物の製造方法である。

（工程１）
本発明の製造方法における工程１は、セレン化合物を含むサバ類が有する蛋白質分解酵素を失活させてセレン化合物を含む魚肉由来組成物を得る工程である。

（１）セレン化合物
サバ類中のセレン化合物は、セレンが、タンパク質の構成アミノ酸であるセレノシステイン残基等に存在する形態、遊離のセレン含有アミノ酸である形態が知られている。セレン含有蛋白質又はセレン含有アミノ酸としては、セレノシステイン、セレノメチオニン、
下記式（１）：

（式（１）中、Ｒは水素又はエルゴチオニル基、グルタチオニル基若しくはシステイニル基を表す）で表される化合物、下記式（２）：

で表される化合物、下記式（３）：

で表される化合物、及び、下記式（４）：

で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物が挙げられる。
なお、式（３）で表される化合物はセレノレインとも呼ばれ、セレノネイン（式３）とその互変異性体（式４）、セレノネイン酸化型二量体（式２）、修飾物（式１）の関係にある。

（２）セレン化合物を含む魚肉
セレン化合物を含む魚肉は、未加工の生の魚若しくはそれを切断したり捌いたりして得た魚肉片、又は、生の魚若しくはそれを切断したり捌いたりして得た魚肉片を粉砕して得た魚肉砕片であってよく、頭部、骨、内臓が含まれてよい。

セレン化合物を含む魚肉としては、セレン化合物が豊富であるという観点から、サバ類であり、例えば、スズキ目サバ科（サバ属（Ｓｃｏｍｂｅｒ ｓｐｐ．））魚類が好ましく、マサバ、ゴマサバ、タイセイヨウサバからなる群から選ばれる少なくとも１種のサバ類が好ましい。

以下、「魚肉」とは「サバ類の魚肉」を意味する。

セレン化合物を含む部位としては、セレン化合物が豊富であるという観点から、魚肉の可食部及び内臓を含むことが好ましいが、内臓を含むことがより好ましい。

（３）魚肉が有する蛋白質分解酵素の失活
セレン化合物を含む魚肉から、余計な蛋白質の分解反応や腐敗を抑えて工程２において効率よくセレン化合物を抽出する観点から、魚肉が有する蛋白質分解酵素（プロテアーゼともいう）を失活させてセレン化合物を含む魚肉由来組成物を得ることが必要である。

なお、魚肉が有する蛋白質分解酵素以外の酵素を、例えば、消化酵素、生体酵素等）も失活してもよく、また、工程１において、蛋白質分解酵素を失活させる際に細菌を死滅させて魚肉を腐敗し難くさせておいてもよい。

魚肉が有する蛋白質分解酵素を効率よく失活させ、工程２における蛋白質分解酵素による反応性を高める観点から、魚肉は魚肉砕片（固形分と水分の混合物）であることが好ましく、魚若しくは魚肉片又は魚若しくは魚肉片を水とともに、例えば、ミキサーにかけて粉砕されていることがより好ましい。

魚若しくは魚肉片に水を加える場合、水としては、水道水、井戸水、蒸留水、イオン交換水等が使用できるが、
安全性、安定供給の観点からは、水道水が好ましく、
ラジカル消去活性を有するセレン化合物の安定化の観点からは、活性炭やイオン交換、逆浸透膜処理または煮沸するなどして塩素が含まないようにすることが好ましく、そのような処理をしなくても使用できる井戸水が好ましい。

魚若しくは魚肉片を水とともに粉砕する際の水の量は、魚肉１００ｇ当たり、１０〜１０００ｇが好ましく、２０〜５００ｇがより好ましく、５０〜２００ｇが更に好ましく、７０〜１５０ｇが更に好ましく、９０〜１１０ｇが更に好ましい。

魚肉が有する蛋白質分解酵素を失活させる方法としては、加熱、加圧、ｐＨ変化等が知られているが、魚肉が有する蛋白質分解酵素を（必要に応じて他の酵素も）効率よく失活させる観点から加熱することが好ましい。

魚肉が有する蛋白質分解酵素を加熱して失活させる場合、例えば、粉砕された魚肉又は粉砕された魚肉と水の混合スラリーを、
好ましくは７０〜１２０℃、より好ましくは８０〜１００℃、更に好ましくは８５〜９５℃の温度で、好ましくは１０分〜３時間、より好ましくは３０〜６０分加熱する。

魚肉砕片又は魚肉砕片と水の混合スラリーを、上述したような加熱処理をすると、得られたセレン化合物を含む魚肉由来組成物は、魚肉砕片が十分に膨潤し、工程２における酵素１及び２による蛋白質の分解効率が向上する。

（４）セレン化合物を含む魚肉由来組成物
魚肉が有する蛋白質分解酵素（好ましくは、少なくともプロテアーゼ）を失活させてセレン化合物を含む魚肉由来組成物（以下、魚肉由来組成物）を得ることができる。

魚肉由来組成物は、魚肉を構成する固形分と水分の混合物又はスラリーであってもよいが、工程２における蛋白質の分解効率を向上させるとともに、水溶性のセレン化合物の収量を高める観点から、これらの混合物又はスラリーを固液分離して得られた液相部分であることが好ましい。

従って、工程１は、魚肉由来組成物を固液分離して液相部分を採取する工程を有することが好ましい。

（工程２）
本発明の製造方法における工程２は、魚肉由来組成物に、細菌由来の蛋白質分解酵素（酵素１）及び微生物由来の蛋白質分解酵素（酵素２）を順次加えて前記魚肉由来組成物を酵素反応に供した後に、前記酵素１及び２を失活させて、前記セレン化合物を含むセレン化合物含有食品用組成物得る工程である。

（１）酵素１及び２
工程２における酵素１は枯草菌（バチルス・サブティリス）などの細菌由来の蛋白質分解酵素であり、
工程２における酵素２は麹菌（アスペルギルス・オリゼー）などの微生物由来の蛋白質分解酵素である。
酵素１及び２は、市販の工業用グレード使用することができ、粗酵素の状態であってもよい。

（２）酵素反応の条件
工程２では、魚肉由来組成物に酵素１及び酵素２を順次加えるが、
酵素１を加えて酵素１による酵素反応（酵素反応１）を行い、次に、酵素２を加えて酵素２による酵素反応（酵素反応２）を行ってもよいし、逆に、酵素反応２を行い、次に、酵素反応１を行ってもよいが、
魚肉由来組成物からセレン化合物を効率よく抽出する観点から、酵素反応１を行い、次に、酵素反応２を行うことが好ましい。

魚肉由来組成物からセレン化合物を効率よく抽出する観点から、酵素反応１は、
好ましくは、温度が３０〜７０℃、ｐＨが５〜９、反応時間が２〜８時間、
より好ましくは、温度が４０〜６５℃、ｐＨが５〜８、反応時間が２〜６時間、
更に好ましくは、温度が５５〜６５℃、ｐＨが５〜７、反応時間が２〜４時間である。

魚肉由来組成物からセレン化合物を効率よく抽出する観点から、
酵素１は、魚肉由来組成物が、
好ましくは、温度が３０〜７０℃、ｐＨが５〜９、
より好ましくは、温度が４０〜６５℃、ｐＨが５〜８、
更に好ましくは、温度が５５〜６５℃、ｐＨが５〜７の状態になったときに加える。

魚肉由来組成物からセレン化合物を効率よく抽出する観点から、
魚肉由来組成物中の固形分１００質量部に対して、加える酵素１は、好ましくは０.０１〜１０質量部、より好ましくは０.０２〜５質量部、更に好ましくは０.０５〜１質量部である。

魚肉由来組成物からセレン化合物を効率よく抽出する観点から、酵素反応２は、
好ましくは、温度が３０〜７０℃、ｐＨが５〜９、反応時間が２〜８時間、
より好ましくは、温度が４０〜６５℃、ｐＨが５〜８、反応時間が２〜６時間、
更に好ましくは、温度が５５〜６５℃、ｐＨが５〜７、反応時間が２〜４時間である。

魚肉由来組成物からセレン化合物を効率よく抽出する観点から、
酵素２は、魚肉由来組成物が、
好ましくは、温度が３０〜７０℃、ｐＨが５〜９、
より好ましくは、温度が４０〜６５℃、ｐＨが５〜８、
更に好ましくは、温度が５５〜６５℃、ｐＨが５〜７の状態になったときに加える。

魚肉由来組成物からセレン化合物を効率よく抽出する観点から、
魚肉由来組成物中の固形分１００質量部に対して、加える酵素２は、好ましくは０.０１〜１０質量部、より好ましくは０.０２〜５質量部、更に好ましくは０.０５〜１質量部である。

魚肉由来組成物を上述の酵素反応に供することにより、魚肉由来組成物の蛋白質が酵素分解され、セレン化合物が効率よく抽出されたセレン化合物含有食品用組成物を得ることができる。

上述の酵素反応に、酵素１及び２を使用することで、例えば、苦味を有するアミノ酸の遊離量が少なく、最終的に苦味が少ないセレン化合物含有食品用組成物を得ることができる。

（３）酵素１及び２の失活
工程２では、上述した酵素反応の後に、酵素１及び２を失活させて、本発明の組成物でもあるセレン化合物含有食品用組成物を得ることができる。

酵素１及び２を失活させる方法としては、加熱、加圧、ｐＨ変化等が知られているが、酵素１及び２を効率よく失活させる観点から加熱することが好ましい。

酵素１及び２を加熱して失活させる場合、好ましくは７０℃超１００℃以下、より好ましくは８０〜１００℃、更に好ましくは８５〜９５℃の温度で、好ましくは１０分〜３時間、より好ましくは３０〜６０分加熱する。

（４）本発明のセレン化合物含有食品用組成物
工程２において、酵素１及び２を加熱して失活させることによって、本発明のセレン化合物含有食品用組成物を得ることができる。本発明の組成物も本発明の製造方法によって得ることができる本発明のセレン化合物含有食品用組成物である。

本発明のセレン化合物含有食品用組成物は、セレン化合物含有食品用組成物を構成する固形分と水分の混合物又はスラリーであってもよいが、食品等に添加する観点から、これらの混合物又はスラリーを固液分離して得られた液相部分であることが好ましく、この液相部分をさらに濃縮して得た組成物でることがより好ましい。

本発明のセレン化合物含有食品用組成物は、用途に応じて、上述の液相部分（好ましくは当該液相物の濃縮物）を、例えば乾燥（好ましくスプレードライ）させることにより液体が除去された粉末として得ることができる。

従って、工程２は、本発明のセレン化合物含有食品用組成物を固液分離して液相部分を採取する工程を有することが好ましく、さらに、当該液相部分を濃縮する工程を有することがより好ましい。

濃縮して得られる濃縮物の固形分濃度は、好ましくは４０〜８０質量％、より好ましくは５０〜８０質量％、更に好ましくは５５〜７５質量％である。

また、工程２は、本発明のセレン化合物含有食品用組成物の用途に応じて、液相部分（好ましくは当該液相物の濃縮物）を乾燥する工程を有することが好ましい。

工程１及び２において固液分離する方法としては、ふるい通過、加圧濾過、遠心分離等が挙げられるが、製造設備の観点から、ふるい通過及び加圧濾過が好ましい。

ふるい通過で使用するふるいの目開きは、粗大な魚肉砕片を液相から除去する観点から、３.２３〜１０.８ｍｍが好ましく、１.１４〜４.８５ｍｍがより好ましく、０.９８〜１.８４ｍｍが更に好ましい。

工程２において本発明のセレン化合物含有食品用組成物を濃縮する方法としては、減圧濃縮、プレート式濃縮、グローバル濃縮、等が挙げられるが、製造設備がコンパクトで操作が容易であるという観点から減圧濃縮が好ましい。

本発明の製造方法によれば、酵素反応が酵素反応１及び２の２段階で行われるため、従来の方法に比べて、セレン化合物の含有量の高い本発明のセレン化合物含有食品用組成物をえることができる。さらに、食品用途においては、苦みを抑制した本発明のセレン化合物含有食品用組成物を得ることもできる。

〔本発明の組成物〕
本発明の組成物は、
アミノ酸及びセレン化合物を含むセレン化合物含有食品用組成物であって、
アミノ酸の組成がサバ類由来のアミノ酸組成であり、
セレン化合物含有食品用組成物中、
セレン化合物の含有量が３μｇＳｅ／ｇ以上で、
総セレン含有量が５μｇ／ｇ以上である、セレン化合物含有食品用組成物である。

本発明の組成物は、アミノ酸の組成がサバ類由来のアミノ酸組成である。
アミノ酸の組成がサバ類由来のアミノ酸組成であるとは、本発明の組成物に含まれる下記１８種類のアミノ酸のうちの少なくとも６種類、より好ましくは９種類、更に好ましくは１２種類、更に好ましくは１５種類、更に好ましくは１７種類が、実施例１に記載した測定条件の下で、グルタミン酸１００質量部に対して、以下の質量部を有することでる：
アルギニン（Ｒ）６〜６０質量部、好ましくは１０〜５０質量部、より好ましくは２０〜４５、更に好ましくは３０〜４０質量部、
リジン（Ｋ）１５〜１００質量部、好ましくは２０〜８０質量部、より好ましくは３０〜７０質量部、更に好ましくは４０〜６０質量部；
ヒスチジン（Ｈ）５〜５０質量部、好ましくは１０〜４０質量部、より好ましくは１５〜３５質量部、更に好ましくは２０〜３０質量部；
フェニルアラニン（Ｆ）２〜５０質量部、好ましくは５〜４０質量部、より好ましくは１０〜３０質量部、更に好ましくは１５〜２５質量部；
チロシン（Ｙ）２〜５０質量部、好ましくは５〜４０質量部、より好ましくは１０〜３０質量部、更に好ましくは１５〜２５質量部；
ロイシン（Ｌ）１０〜１００質量部、好ましくは２０〜８０質量部、より好ましくは３０〜６０質量部、更に好ましくは４０〜５０質量部；
イソロイシン（Ｉ）５〜５０質量部、好ましくは１０〜４０質量部、より好ましくは１５〜３５質量部、更に好ましくは１５〜２５質量部；
メチオニン（Ｍ）１〜５０質量部、好ましくは５〜４０質量部、より好ましくは１０〜３５質量部、更に好ましくは１０〜２０質量部；
バリン（Ｖ）５〜５０質量部、好ましくは１０〜４５質量部、より好ましくは１５〜４０質量部、更に好ましくは２０〜３５質量部；
アラニン（Ａ）２０〜８０質量部、好ましくは３０〜７０質量部、より好ましくは３５〜６０質量部、更に好ましくは４０〜５０質量部；
グリシン（Ｇ）２０〜１００質量部、好ましくは３０〜８０質量部、より好ましくは４０〜６５質量部、更に好ましくは４５〜５５質量部；
プロリン（Ｐ）１０〜６０質量部、好ましくは１５〜５０質量部、より好ましくは２０〜４５質量部、更に好ましくは２５〜３５質量部；
セリン（Ｓ）１０〜６０質量部、好ましくは１５〜５０質量部、より好ましくは２０〜４５質量部、更に好ましくは２５〜３５質量部；
トレオニン（Ｔ）１０〜６０質量部、好ましくは１５〜５０質量部、より好ましくは２０〜４５質量部、更に好ましくは２５〜３５質量部；
アスパラギン酸（Ｄ）３０〜１５０質量部、好ましくは４０〜１００質量部、より好ましくは５０〜８０質量部、更に好ましくは６０〜７０質量部；
トリプトファン（Ｗ）０．５〜１０質量部、好ましくは１．５〜８質量部、より好ましくは２．５〜６質量部、更に好ましくは３．５〜４．５質量部；
システイン（Ｃ）１〜１０質量部、好ましくは１．５〜８質量部、より好ましくは２．５〜６質量部、更に好ましくは２．５〜４．５質量部。

セレン化合物含有食品用組成物中及び本発明の組成物中、セレン化合物の含有量は、セレン化合物の効率的な摂取、利用又は苦味低減の観点から、３μｇＳｅ／ｇ以上であり、好ましくは４μｇＳｅ／ｇ以上であり、より好ましくは４〜１０μｇＳｅ／ｇであり、更に好ましくは４〜７μｇＳｅ／ｇである。

セレン化合物の含有量は、実施例に記載した条件で、セレン当量（μｇＳｅ／ｇ）として算出する。

セレン化合物含有食品用組成物中及び本発明の組成物中、セレン化合物の効率的な摂取又は利用の観点から、総セレン含有量は、５μｇ／ｇ以上であり、好ましくは６μｇ／ｇ以上であり、より好ましくは７〜１００μｇ／ｇであり、更に好ましくは７．５〜５０μｇ／ｇ、であり更に好ましくは７．５〜２０μｇ／ｇである。

本発明の組成物は、例えば、本発明の製造方法において、サバ類由来の魚肉を使用して製造することができる。

本発明の組成物は液状又は粉末であることが好ましい。
液状の場合は、濃縮物であることがより好ましく、固形分濃度が、好ましくは４０〜８０質量％、より好ましくは５０〜８０質量％、更に好ましくは５５〜７５質量％である。

（本発明のセレン化合物含有食品用組成物及び本発明の組成物の用途）
本発明の製造方法で得られる本発明のセレン化合物含有食品用組成物及び本発明の組成物（以下、まとめて本発明の組成物等ともいう）は、栄養補助剤、機能性食品、食品添加物等の食品用途に、主成分としてそのまま又は原料として使用することができる。

本発明の組成物等は、セレン欠乏を予防するためのサプリメント等の栄養補助剤の用途に使用できる。例えば、１錠当たりに、セレン欠乏を予防するために必要となる、好ましくは０．１１〜２００μｇ程度、より好ましくは１〜１００μｇ程度、更に好ましくは５〜５０μｇ程度となるように、本発明のセレン含有化合物を添加した栄養補助剤等が挙げられる。

本発明の組成物等は、セレン欠乏に起因することが推定されている疾病において、セレンが関与するレドックス経路の生体抗酸化作用を高めて、その予防や症状の軽減に役立つと考えられる（可能な場合はその旨を明記した）機能性食品の用途に使用できる。

本発明の組成物等は、セレンが関与するレドックス経路の生体抗酸化作用を高めて、セレン欠乏を予防するために食品に添加することを目的とする食品添加物の用途に使用できる。

なお、栄養補助剤、機能性食品、食品添加物等の食品用途においては、セレンが関与するレドックス経路の生体抗酸化作用を高める効果によってアンチエイジングを目的とすることも可能と考えられる。

本発明の組成物等は、セレンが関与するレドックス経路の生体抗酸化作用を高めるための抗酸化剤として、セレン欠乏に起因することが推定されている肺がん、前立腺がん、大腸がん等のがん、心臓疾患、糖尿病等の生活習慣病のリスクの軽減を目的とする食品の用途に使用できる。

本発明の組成物等は、セレン含有化合物が抗酸化力を有すると考えられることから、食品用抗酸化剤の用途に使用できる。

（原材料）
（１）魚肉原料：未加工のサバ類（国産・唐津漁港水揚げ）（頭部、骨、内臓を含む）
（２）酵素１：バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）由来プロテアーゼ（エイチビィアイ社製、品名オリエンターゼ２２ＢＦ）
（３）酵素２：アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来プロテアーゼ（新日本化学工業社製、品名スミチームＬＰ）
（４）比較酵素：バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来プロテアーゼ（ＤＥＥＲＬＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ社製、品名ＰＡＬ４４０）

（機器）
（１）粉砕機：ＴＥＳＣＯＭ社製、モデルＮｏ．ＴＭ−８１４
（２）固液分離用ふるい装置：東京スクリーン社製、品名：Ｔｅｓｔ ｓｉｅｖｅｓ 試験用ふるい ＪＩＳ Ｚ ８８０１目開き１．０ｍｍ
（３）固液分離用減圧濾過装置：東京理化器械社製、モデルＮｏ．アスピレーターＡ−３Ｓ
（４）スプレードライ装置：大川原化工機社製、モデルＮｏ.ＦＧＡ-８
（５）恒温槽：ヤマト科学社製、ＷＡＴＥＲ ＢＡＴＨ、モデルＮｏ.ＢＭ-８２

（実施例１）
（１）工程１
魚肉原料２，０００ｇと水１，０００ｇとを、室温（２０℃）で、粉砕機で１０，０００ｒｐｍ５分間粉砕混合した混合物とし、その混合物を９０±３℃で３０分間加熱して、６０±３℃で４時間、１８０ｒｐｍで連続撹拌して魚肉由来組成物を得た。

（２）工程２
得られた魚肉由来組成物３，０００ｇに、
酵素１を４ｇ加えて、６０±３℃で２時間の加熱を行った後、
酵素２を２ｇ加えて、６０±３℃で２時間の加熱を行い、その後、
９０±３℃で３０分の加熱を行い、酵素１及び２を失活させ、さらに、
固液分離用ふるい装置を通過させて残渣相と濾過相１に分離した。
なお、ｐＨは調整していないがｐＨ＝５.０〜７.０の範囲である。

残渣相を固液分離用減圧濾過装置によって吸引濾過し、得られた濾過相２を、濾過相１と合わせた後、静置して沈殿相を含まない液相を採取してセレン化合物含有食品用組成物１（本発明の組成物１）とした。

セレン化合物含有食品用組成物１（本発明の組成物１）をさらに恒温槽で９０℃１０分間加熱して殺菌した後に濃縮し、固形分濃度約６５質量％のセレン化合物含有食品用組成物２（本発明の組成物２）である濃縮液組成物を得た。

その濃縮液組成物をスプレードライ装置によって粉末化して、セレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）である粉末組成物約１２６ｇを得た。

（比較例１）
実施例１の工程１と同様にして魚肉由来組成物を得た。

得られた魚肉由来組成物を、固液分離用ふるい装置を通過させて残渣相と濾過相１に分離した。残渣相を固液分離用減圧濾過装置によって吸引濾過し、得られた濾過相２を、濾過相１と合わせた後、静置して沈殿相を含まない液相を採取した。

実施例１と同様にして、当該液相が粉末化された約４２ｇの比較組成物１を得た。

（比較例２）
実施例１の工程１と同様にして魚肉由来組成物を得た。

得られた魚肉由来組成物３，０００ｇに、酵素１を４ｇ加えて、６０±３℃で２時間の加熱を行った後、
９０±３℃で３０分の加熱を行い、酵素１を失活させ、さらに、
固液分離用ふるい装置を通過させて残渣相と濾過相１に分離した。残渣相は固液分離用減圧濾過装置によって吸引濾過し、得られた濾過相２を、濾過相１と合わせた後、静置して沈殿相を含まない液相を採取した。
なお、ｐＨは調整していないがｐＨ＝５.０〜７.０の範囲である。

実施例１と同様にして、当該液相をさらに固形分濃度約６５質量％まで濃縮し、これを粉末化して約１００ｇの比較組成物２を得た。

（比較例３）
実施例１の工程１と同様にして魚肉由来組成物を得た。

得られた魚肉由来組成物３，０００ｇに、酵素２を４ｇ加えて、６０±３℃で２時間の加熱を行った後、
９０±３℃で３０分の加熱を行い、酵素２を失活させ、さらに、
固液分離用ふるいを通過させて残渣相と濾過相１に分離した。残渣相は固液分離用減圧濾過装置によって吸引濾過し、得られた濾過相２を、濾過相１と合わせた後、静置して沈殿相を含まない液相を採取した。
なお、ｐＨは調整していないがｐＨ＝５.０〜７.０の範囲である。

実施例１と同様にして、当該液相をさらに固形分濃度約６５質量％まで濃縮し、これを粉末化して約１００ｇの比較組成物３を得た。

（比較例４）
実施例１の工程１と同様にして魚肉由来組成物を得た。

得られた魚肉由来組成物３，０００ｇに、比較酵素を４ｇ加えて、６０±３℃で２時間の加熱を行った後、
９０±３℃で３０分の加熱を行い、比較酵素を失活させ、さらに、
固液分離用ふるいを通過させて残渣相と濾過相１に分離した。残渣相は固液分離用減圧濾過装置によって吸引濾過し、得られた濾過相２を、濾過相１と合わせた後、静置して沈殿相を含まない液相を採取した。
なお、ｐＨは調整していないがｐＨ＝５.０〜７.０の範囲である。

実施例１と同様にして、当該液相をさらに固形分濃度約６５質量％まで濃縮し、これを粉末化して約１００ｇの比較組成物４を得た。

（評価試験）
セレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）及び比較組成物１〜４について、以下の評価試験を行った。

（１）濾過試験
実施例１及び比較例１〜４における固液分離用ふるい装置に供するスラリー２ｋｇずつを、固液分離用減圧濾過装置に吸引濾過瓶（２リットル）とブフナーロート（コスモスビード社製）を装着し、定量ろ紙（アドバンテック製定量ろ紙Ｎｏ．５、１２５ｍｍ）を用いて減圧濾過して減圧濾過に要した時間を測定した。

（２）セレン化合物含有量
本発明の組成物中のセレン化合物の含有量は、以下の条件で得た測定値に基づきセレン当量（μｇＳｅ／ｇ）として算出した。

（２−１）試料
実施例１で得られたセレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）、
比較例１で得られた比較組成物１をそれぞれ３０ｍｇ秤量し、５又は１０倍量の超純水（Ｍｉｌｌｉ-Ｑ Ｅｌｅｍｅｎｔ、ミリポア社）を加えて希釈して混和し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心した上清５μＬ又は１０μＬを後述するＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ分析の試料とした。

試料は、セレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）について２点作成し、比較組成物１について２点作成した。

（２−２）セレン化合物標準物質の調製
下記のセレン化合物標準物質１〜５をそれぞれ水溶液としたものを使用した。

セレン化合物標準物質１は以下の方法に従って精製して得たものを使用した：
（１）冷凍メカジキフィレーを５℃で一晩解凍して血合筋を切り取って集めたものを用いた。

（２）血合筋１００ｇに０．１gシステイン塩酸塩（和光純薬工業株式会社）を加え、１０倍容量のアセトニトリル（和光純薬工業社）中でポリトロンホモジナイザー（ＰＴ ＭＲ ６０００，ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ）６８００ｒｐｍで１５秒間、氷水で冷却しながら粉砕した。

（３）粉砕物を６０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄を減圧下ロータリーエバポレーターで濃縮した濃縮液１を得た。

（４）濃縮液１にアセトニトリル：テトラヒドロフラン（和光純薬工業社）（１：１、ｖ／ｖ）混合溶液を加えて濃縮液を２層に分離した。

（５）分離した２層のうち、アセトニトリル層を分離し、減圧下ロータリーエバポレーターで濃縮した濃縮液２を得た。

（６）濃縮液２に冷却水５ｍｌを加え、０．１％酢酸で平衡化したＡｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）ｄＣ_１８３００オングストロームカラム（１９×１５０ｍｍ、日本ウオーターズ社）に供し、
０−５０％直線アセトニトリルグラジエント下、溶出量４０ｍｌから５０ｍｌまでの画分１を回収した。

（７）画分１を減圧下ロータリーエバポレーターで濃縮して濃縮液３を得た。

（８）濃縮液３を０．１％酢酸３０％アセトニトリルで平衡化したＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）１２０カラム（７．８×３００ｍｍ日本ウオーターズ社）に供し、排出量７．５ｍｌから９．０ｍｌまでのセレン化合物を含む画分を集めて画分２を得た。

（９）画分２を０．１％酢酸で平衡化したＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）１２０カラム（７．８×３００ｍｍ日本ウオーターズ社）に通し、セレン化合物を含む画分を集めて減圧下ロータリーエバポレーターで濃縮してセレン化合物標準物質１を得た。

なお、上記（１）〜（９）で得られたセレン化合物標準物質１には、式（１）〜（４）で示される化合物が含まれており、式（２）で示される化合物が主成分であることが知られている（東京大学博士（農学）論文ｐｐ１７−１９（山下由美子、２０１２年））。

セレン化合物標準物質２〜５は以下のものを使用した：
セレン化合物標準物質２：グルタチオンペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）の水溶液（１００ｐｇ／μＬ）；
セレン化合物標準物質３：亜セレン酸ナトリウム（和光純薬社製）の水溶液（１００ｐｇ／μＬ）；
セレン化合物標準物質４：Ｌ−セレノシスチン（ＳＩＧＭＡ社社製）の水溶液（１００ｐｇ／μＬ）；
セレン化合物標準物質５：Ｌ−セレノメチオニン（東京化成工業株式会社）の水溶液（１００ｐｇ／μＬ）。

セレン化合物標準物質１〜５の総セレン含有量は後述する方法で測定した。

溶離時間１０．３分付近にピーク（図１（Ｃ））が確認された式（１）〜（４）で示される化合物について，注入したセレン重量あたりのピーク面積を算出した。

セレン化合物標準物質１中の総セレン含有量は０．４７６μｇ／ｍＬであった。

（２−３）セレン化合物の同定と定量
各試料とセレン化合物標準物質１〜５について、ＨＰＬＣ−ＩＣＰ-ＭＳ（Ｅｌａｎ ＤＲＣＩＩ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）法で測定してクロマトグラムを得た。

得られたクロマトグラムにおけるピークの保持時間をセレン化合物標準物質のそれと比較し、セレン化合物の種類を定性的に決定した。また、ピーク面積をソフトウエア（ＴｏｔａｌＣｈｒｏｍ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて読み取り、ピーク面積から下記式（５）：

Ｘ＝（Ｓ_Ｘ／Ｓ_Ｓ）×（１０００／Ｖ）×α／１０００ （５）
（ここで、
Ｘ：各試料中のセレン化合物含有量（μｇＳｅ／ｇ）
Ｓ_Ｘ：各試料のセレン化合物標準物質1〜５にそれぞれ特有な溶離時間（セレン化合物標準物質１：１０．３分、セレン化合物標準物質２：５．４分、セレン化合物標準物質３：７．４分、セレン化合物標準物質４：７．８分、セレン化合物標準物質５：９．８分）のピーク面積。
Ｓ_Ｓ：セレン化合物標準物質１〜５それぞれのセレン重量あたりのピーク面積（／ｎｇＳｅ）
Ｖ：ＨＰＬＣ−ＩＣＰ-ＭＳにおいて注入した試料の量（μＬ）
α：試料を作成した際の超純水による希釈倍率（今回はα＝５又は１０である）。

なお、各試料においてセレン化合物標準物質２〜５に相当するピークはほとんど検出されなかったので、セレン化合物標準物質１だけを基準にして定量した。

（２−４）ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ測定条件
（２−４−１）装置構成
分離用カラム ：Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ １２０ （Ｗａｔｅｒｓ）
ＨＰＬＣポンプ ：Ｐｕ７１２（ＧＬサイエンス株式会社）
サンプルインジェクター ：９７２５ｉ（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）
ＩＣＰＭＳ ：ＥＬＡＮ ＤＲＣ ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ）

（２−４−２）ＨＰＬＣ測定条件
移動層：０．１％ＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．３）
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル注入量：０．０１ｍＬ

（２−４−３）ＩＣＰ−ＭＳ測定条件
測定元素 ：Ｓｅ
質量数 ：８２
ＲＦ出力（Ｗ） ：１２００
ネブライザーガス（Ａｒ，Ｌ／ｍｉｎ） ：１．０
補助ガス（Ａｒ，Ｌ／ｍｉｎ） ：１．３
プラズマガス（Ａｒ，Ｌ／ｍｉｎ） ：１７
メイクアップガス（Ａｒ，Ｌ／ｍｉｎ） ：０
反応ガス（Ａｒ，Ｌ／ｍｉｎ） ：０
パルスステージ電圧（ｅＶ） ：１０５０
ＲＰｑ ：２．５
滞在時間（ｓｅｃ／ａｍｕ） ：０．４

（２−５）測定結果
図１に、実施例１で得られたセレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）の試料のクロマトグラム（Ａ）及びセレン化合物標準物質１の試料のクロマトグラム（Ｂ）を示す。

クロマトグラム（Ａ）には、保持時間１０．３分のピークが観察され、
グルタチオンペルオキシダーゼ、亜セレン酸ナトリウム、Ｌ−セレノシスチン、Ｌ−セレノメチオニンに相当する保持時間のピークは検出されなかった。
従って、実施例１で得られたセレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）含まれるセレン化合物の多くは式（１）〜（４）のいずれかで表される化合物であることがわかる。

セレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）の２点の試料について、クロマトグラム（Ａ）から算出された結果は３．８μｇＳｅ／ｇと５．５μｇＳｅ／ｇであり、セレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）のセレン化合物含有量はその平均値である４．７μｇＳｅ／ｇとした。

比較組成物１の２点の試料について、クロマトグラム（Ｂ）から算出された結果は１．３μｇＳｅ／ｇと２．５μｇＳｅ／ｇであり、比較組成物１のセレン化合物含有量はその平均値である１．９μｇＳｅ／ｇとした。

（３）総セレン含有量
実施例１で得られたセレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）、比較例１で得られた比較組成物１を、文献（Ｊ．Ｈ．Ｗａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ ｗｉｔｈ ２，３-ｄｉａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３８（１），９２-９７（１９６６））記載の方法で湿式分解し、セレン化合物をすべて無機態とした後、２，３−ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）と反応させ、Ｓｅ（ＩＶ）との錯体形成反応により生じる４，５−ベンゾピアセレノール（Ｓｅ−ＤＡＮ）の蛍光を測定することによって定量した
得られた測定値に基づき試料粉末重量あたりのセレン重量（μｇ／ｇ）として算出した。
具体的には、以下の条件で測定した。

（３−１）実施例１で得られたセレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）、
比較例１で得られた比較組成物１をそれぞれ１０ｍｇ秤量し、試験管中で、混酸（硝酸：過塩素酸＝２：１）１．５ｍＬとともに２１０℃で二時間湿式灰化した溶液に飽和シュウ酸アンモニウム水溶液０．２５ｍＬを加え１００℃の水浴中で５分間加熱したものを試料とした。

試料は、セレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）について２点作成し、比較組成物１について２点作成した。

（３−２）各試料を水冷した後、６Ｍ塩酸０．２５ｍＬを加え１００℃の水浴中で３０分間加熱し、水冷後０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を０．２５ｍＬ加え、６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１．０〜１．５に調整した。

（３−３）これに０．１Ｍ塩酸に溶解させた１ｍｇ／ｍＬのＤＡＮを１ｍＬ添加し、５０℃２０分加温した。水冷後、シクロヘキサン１ｍＬと振とうしてシクロヘキサン層の蛍光を励起光３７９ｎｍ蛍光波長５２１ｎｍで測定した。

（３−４）操作ブランクおよび１ｍｇ／Ｌセレン標準液を５、１０、５０、１００μＬ用いて蛍光法で検量線を作成し、試料中の総セレン含有量を算出した。

セレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）の２点の試料について算出された結果は５．０４μｇ／ｇと１１．０μｇ／ｇであり、セレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）の総セレン含有量はその平均値である８．０２μｇ／ｇとした。

比較組成物１の２点の試料について算出された結果は４．５２μｇ／ｇと４．７６μｇ／ｇであり、比較組成物１の総セレン含有量はその平均値である４．６４μｇ／ｇとした。

（４）アミノ酸組成
本発明の組成物のアミノ酸組成は、財団法人食品分析開発センターＳＵＮＡＴＥＣに依頼して図１及び２に示すフローに従って分析した。

実施例１で得た本発明の組成物のアミノ酸含有量と、比較組成物１のアミノ酸含有量とを表２に記載した。

（５）苦味（官能試験）
セレン化合物含有食品用組成物３（本発明の組成物３）及び比較組成物１〜４のそれぞれ２ｇに４５〜５０℃温湯９８ｇを加えた混合液を１００ｇずつ調整した。
８名の官能試験員（男性４名（年齢２５〜４７歳）、女性４名（年齢２２〜３０歳４名））が、混合液を飲み、苦味を５段階評価した。
５段階評価は、苦味について甚大を５、大を４、中を３、微を２、苦味なしを１とした。
混合液をそれぞれ１杯ずつ飲み、それぞれ５段階評価してその平均値を算出した。

結果を表１及び２並びに図１に示す。

サバ類を使用した酵素反応を２段階含む実施例１は、セレンが豊富に含まれ、
（１）サバ類を使用した酵素反応を含まない比較例１に比べて、セレン化合物含有量が大きい。
（２）サバ類を使用した酵素反応を１段階含む比較例２〜４に比べて、セレン化合物含有食品用組成物の濾過・濃縮を迅速に行うことができ、苦味が少ないことがわかった。

本発明の組成物は、式（１）〜（４）の化合物が遊離又は蛋白質中のアミノ酸残基として含まれること、サバ類由来の遊離のアミノ酸又は蛋白質の蛋白質分解によって生成したアミノ酸が含まれること、これらが主成分であることにより苦味が少なく、水に容易に溶解する白色の粉末を得ることができたことが考えられる。

また、本発明の組成物は、室温で保管可能であり、式（１）〜（４）の化合物が他のセレン化合物に比べて，強力な抗酸化能，ラジカル消去活性および生体抗酸化作用を有することが知られていることから，セレンの機能性を高めた食品を提供することが期待できる。

実施例１の本発明の組成物のアミノ酸組成がサバ類由来のアミノ酸組成であることも確認できた。

Claims (7)

1. セレン化合物含有食品用組成物の製造方法であって、
   前記製造方法が、
   魚肉原料を粉砕混合して得た魚肉と水の混合物が有する蛋白質分解酵素を、
   前記混合物を８５〜１２０℃、１０分〜３時間加熱することで失活させて前記セレン化合物を含む魚肉由来組成物を得る工程１と、
   前記魚肉由来組成物に、細菌由来の蛋白質分解酵素（酵素１）及び微生物由来の蛋白質分解酵素（酵素２）を順次加えて前記魚肉由来組成物を酵素反応に供した後に、前記酵素１及び２を失活させて、前記セレン化合物を含むセレン化合物含有食品用組成物を得る工程２とを含み、
   前記酵素１がバチルス・サブティリス由来蛋白質分解酵素であり、
   前記酵素２がアスペルギルス・オリゼー由来蛋白質分解酵素であり、
   前記酵素１を加える際の温度が４０〜６５℃、ｐＨが５〜８であり、
   前記酵素２を加える際の温度が５５〜６５℃、ｐＨが５〜７であり、
   前記魚肉がサバ類であり、
   前記行程２において、前記魚肉由来組成物に前記酵素１を加えた後に、前記酵素１を失活させずに、前記酵素２を加えるセレン化合物含有食品用組成物の製造方法（但し、前記製造方法から、前記工程２で得られたセレン化合物含有食品用組成物をさらに逆浸透膜処理を施して濃縮する工程を含む態様を除く）。
2. 前記工程１において、前記魚肉由来組成物が、前記魚肉が有する蛋白質分解酵素を失活させて後に固液分離して得られる液相である請求項１記載のセレン化合物含有食品用組成物の製造方法。
3. 前記工程２において、前記セレン化合物含有食品用組成物が、前記酵素１及び２を失活させて後に固液分離して得られる液相である請求項１又は２記載のセレン化合物含有食品用組成物の製造方法。
4. 前記工程２において、前記セレン化合物含有食品用組成物が、前記液相を濃縮して得られる濃縮物である請求項３記載のセレン化合物含有食品用組成物の製造方法。
5. さらに、前記セレン化合物含有食品用組成物が、液体が除去された粉末である請求項１〜４のいずれか１項記載のセレン化合物含有食品用組成物の製造方法。
6. 請求項１〜５のいずれか１項記載のセレン化合物含有食品用組成物の製造方法で得られるセレン化合物含有食品用組成物。
7. アミノ酸及びセレン化合物を含む請求項６記載のセレン化合物含有食品用組成物であって、
   前記アミノ酸の組成がサバ類由来のアミノ酸組成であり、
   前記アミノ酸組成が、グルタミン酸１００質量部に対して、アルギニン（Ｒ）３０〜４０質量部、リジン（Ｋ）４０〜６０質量部、ヒスチジン（Ｈ）２０〜３０質量部、フェニルアラニン（Ｆ）１５〜２５質量部、チロシン（Ｙ）１５〜２５質量部、ロイシン（Ｌ）４０〜５０質量部、イソロイシン（Ｉ）１５〜２５質量部、メチオニン（Ｍ）１０〜２０質量部、バリン（Ｖ）２０〜３５質量部、アラニン（Ａ）４０〜５０質量部、グリシン（Ｇ）４５〜５５質量部、プロリン（Ｐ）２５〜３５質量部、セリン（Ｓ）２５〜３５質量部、トレオニン（Ｔ）２５〜３５質量部、アスパラギン酸（Ｄ）６０〜７０質量部、トリプトファン（Ｗ）３．５〜４．５質量部、及び、システイン（Ｃ）２．５〜４．５質量部であり、
   前記セレン化合物含有食品用組成物中、
   前記セレン化合物の含有量が３μｇＳｅ／ｇ以上であり、
   総セレン含有量が５μｇ／ｇ以上である、セレン化合物含有食品用組成物。