JP6726316B2 - ナノポア配列決定からのac信号の定期分析 - Google Patents
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Description
本発明の実施形態の性質及び利点のより良好な理解は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照することで得られ得る。
別途定義されない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的な用語は、当業者によって一般に理解される意味と同様の意味を有する。本明細書で説明される方法、装置、及び材料と同様の又は同等のものが、開示された技術の実施で使用され得る。以下の用語は、頻繁に使用される一定の用語の理解を支援するために提供され、本開示の範囲を限定することを意味しない。本明細書で用いられる略語は、化学的及び生物学の分野でのその従来の意味を有する。
図1は、ナノポアセル150のアレイ140を備えるナノポアセンサチップ100の一実施形態の上面図である。各ナノポアセル150は、ナノポアセンサチップ100のシリコン基板上に集積化された制御回路を備える。いくつかの実施形態では、側壁136は、アレイ140に含まれ、ナノポアセル150のグループを分離し得て、その結果、各グループは、特徴づけのための異なるサンプルを受け取り得る。各ナノポアセルは、核酸を配列決定するために用いられ得る。いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ100は、カバープレート130を備え得る。いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ100は、コンピュータプロセッサなどの他の回路とインタフェースする複数のピン110も備え得る。
ナノポアセンサチップ100内のナノポアセル150は、多数の異なる方法で実施され得る。例えば、いくつかの実施形態では、異なるサイズ及び/又は化学的構造のタグが、配列決定されるために、核酸分子内の異なるヌクレオチドに取り付けられ得る。いくつかの実施形態では、配列決定されることになる核酸分子の鋳型への相補鎖が、別の仕方で重合体がタグ付けされたヌクレオチドを鋳型とハイブリッド形成することによって、合成され得る。いくつかの実施態様では、核酸分子及び取り付けられたタグは、両方ともナノポアを通り移動し、ナノポアを通過するイオン電流が、ヌクレオチドに取り付けられたタグの個々のサイズ及び/又は構造によって、ナノポア内に存在するヌクレオチドを示し得る。いくつかの実施態様では、タグだけが、ナノポア内へ移動し得る。ナノポア内で異なるタグを検出するために、多数の異なる方法も存在し得る。
図2は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを特徴づけるために使用され得る、図1のナノポアセンサチップ100内のナノポアセル150のような、ナノポアセンサチップ内の一例のナノポアセル200の一実施形態を示す。ナノポアセル200は、誘電体層201及び204から形成された凹部205と、凹部205を覆って形成された脂質二重層214と、脂質二重層214上の、脂質二重層214によって凹部205から分離された試料室215とを、含み得る。凹部205は、ある体積の電解質206を収容し得て、試料室215は、例えば、可溶性タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体(PNTMC)などのナノポア、及び対象の分析物(例えば、配列決定されることになる核酸分子)を収容するバルク電解質208を保持し得る。
ナノポアセンサチップ100内のナノポアセル150などのナノポアセンサチップ内のナノポアセルは、合成による単分子ナノポアベースの配列決定(ナノ−SBS)技術を用いる並行配列決定を可能にし得る。
図4は、ナノポアセル200などのナノポアセル内の電気回路400(図2の電気回路222の一部分を含み得る)の一実施形態を示す。上述のように、いくつかの実施形態では、電気回路400は、ナノポアセンサチップ内の複数のナノポアセル又は全てのナノポアセル間で共有され得、それゆえ、共通電極とも称され得る対電極210を含む。共通電極は、交流電圧源420(VLIQ)に接続することによって、共通の電位を、ナノポアセル内の脂質二重層(例えば、脂質二重層214)と接触するバルク電解質(例えば、バルク電解質208)に印加するように構成されることが可能である。いくつかの実施形態では、AC非ファラデー性モードが、電圧VLIQをAC信号(例えば、方形波)で変調するために利用され、それをナノポアセル内で脂質二重層に接触するバルク電解質に印加し得る。いくつかの実施形態では、VLIQは、±200〜250mVの大きさ及び例えば25〜400Hzの周波数を有する方形波である。対電極210と脂質二重層(例えば、脂質二重層214)との間のバルク電解質は、例えば100μF以上などの大きなコンデンサ(図示せず)によってモデル化され得る。
核酸の配列決定を実行するために、積分コンデンサ(例えば、積分コンデンサ408(ncap))又はコンデンサ426(CBilayer)の電圧レベルは、タグ付けされたヌクレオチドが核酸に加えられている間に、ADC(例えば、ADC410)によってサンプリングされ変換され得る。ヌクレオチドのタグは、例えば、VLIQがVPREより低いような印加電圧のとき、対電極及び作用電極を介して印加される、ナノポアを横断する電界によって、ナノポアの筒内へと押し入れられ得る。
充填事象は、タグ付けされたヌクレオチドが、鋳型(例えば、核酸断片)に取り付けられ、タグがナノポアの筒の内外に進むときにあたる。これは、充填事象の間に複数回発生し得る。タグが、ナノポアの筒内にあるとき、ナノポアの抵抗は、より高く、より低い電流がナノポアを通り流れ得る。
ACサイクルの間、積分コンデンサでの電圧は、ADCによって複数回サンプリングされ得る。例えば、ある実施形態では、AC電圧信号が、システム全体に、例えば、約100Hzで印加され、ADCの取得速度は、セルあたり約2000Hzであり得る。このように、ACサイクル(AC波形のサイクル)毎に取得される約20のデータポイント(電圧測定値)が存在し得る。AC波形の1サイクルに対応するデータポイントは、1セットと呼ばれ得る。ACサイクル毎のデータポイントの1セット内には、例えば、明モード(期間)に対応し得る、VLIQがVPREより低いときキャプチャされるサブセットが存在し得て、このときタグは、ナノポアの筒内へと押し込まれる。別のサブセットは、暗モード(期間)に対応し得て、このときタグは、例えば、VLIQがVPREより高いとき、印加される電界によってナノポアの筒外へと押し出される。
データポイント毎に、スイッチ401が開路のとき、積分コンデンサ(例えば、積分コンデンサ408(ncap)又はコンデンサ426(CBilayer))における電圧は、例えば、VLIQがVPREより高いとき、VPREからVLIQに増大し、VLIQがVPREより低いとき、VPREからVLIQに減少するように、VLIQによる充電/放電の結果として減衰する挙動で変化していく。最終的な電圧値は、VLIQから作用電極の電荷だけずれる。積分コンデンサでの電圧レベルの変化率は、ナノポアを含み、結果としてナノポア内の分子(例えば、タグ付けされたヌクレオチドのタグ)を含み得る、二重層の抵抗の値によって支配され得る。電圧レベルは、スイッチ401が開路したあとの所定時間に測定され得る。
ナノポアセンサチップの有効なナノポアセル毎に、生成モードが、核酸を配列決定するために実行され得る。配列決定中に取得されるADC出力データは、より高い精度を提供するために、正規化され得る。正規化は、サイクル形状及びベースラインシフトなどの偏位効果を引き起こし得る。正規化の後、実施形態は、充填された経路の電圧のクラスタを決定し得て、ここで各クラスタは、異なるタグ種、及びそれゆえの異なるヌクレオチドに対応する。クラスタは、所与のヌクレオチドに対応する所与の電圧の確率を算出するために使用され得る。別の例として、クラスタは、異なるヌクレオチド(塩基)間での差別化のための分離電圧を決定するために用いられ得る。
図6は、いくつかの実施形態により実行された試験配列決定用のサンプルの明及び暗期間のデータを示す。明期間のデータは、図の上部分601に示され、暗期間のデータは、図の下部分603に示される。電圧データの周期性は、図4への参照で上述したように、交流(AC)電圧源、例えば、AC電圧源420によって供給される交流信号に起因する。図6で示した各データポイントは、例えば、図4のncapで、パスデバイス406の開路に対して一定の期間後に、ナノポアセル回路のノードでの電圧のADC測定によって取得される。測定毎に、ncapでの電圧は、VPREで開始し(VPREは、破線612として示される)、次に減衰し、ACサイクル内の期間(明又は暗)により+又は−のVLIQへと近づく。一定の時間遅延後に、ADCは、電圧値を測定する。図6は、これらの測定された電圧値、すなわち各々のデータポイントの集合が、VPREからVLIQへのRC減衰曲線の単一のポイントサンプルであることを示す。図6で示した実施例のデータ収集速度は、約1,976Hzである。各期間内で、ポイントからポイントの電圧の不均一性は、部分的にセル内で生成される電荷によってもたらされ、積分コンデンサ(例えば、使用される回路によりコンデンサ408又はコンデンサ426)の充電/放電の基礎をなす電圧減衰曲線内の全体のシフトへ導く。
実施形態は、上の図6に示したように、データでの周期性の利点を利用する。実施形態は、仮定又はパラメータをほとんど用いることがないので、より堅牢性を有する。この方法で、実施形態は、新らたなナノポア、脂質二重層などを有する新たなシステムと共に用いられ得て、この場合新たなセルの最小限度の特徴づけがなされた。したがって、実施形態は、使用される配列決定セルの予備知識をそれ程有することなく、広く適用可能であり得る。
差分信号を決定するために、1サイクルのデータが、別のサイクルのデータから減じられ得る。いくつかの実施形態では、対応するデータポイントは、近傍のサイクル(例えば、最近傍の、第2の近傍のなど)に基づく。
p2p_diff=left_adc−right_adc
となる。
図10は、いくつかの実施形態による充填事象の差異データの一例を示す。詳細には、図10は、例えば、配列決定装置の動作中、デジタルプロセッサ430によって生成された、時間と共に測定された差異データ1010を示す。したがって、実施形態は、基礎をなす未処理のAC信号(例えば、図6で示した信号)を示さない。それにもかかわらず、塩基分類を決定するために必要な情報は、差分データ1010自体から抽出され得る。
図11は、ある実施形態による、配列決定セルを使用する一例の方法を示すフローチャートである。より具体的には、図11は、いくつかの実施形態による、ナノポア配列決定からのAC信号の定期分析の方法を示す。
塩基分類に必要とされる物理的情報が、パルスの特性の少数のセットから抽出され得るので、このセットの特性をメモリに少数のパラメータとして格納させて、パルスのいくつかの特性の算出により、データの圧縮が可能になり得る。チップは、例えば、数十万のセル又は、数百万のセルまでも大規模で、2kHzのサンプリング速度であり得る。
したがって、全ての電圧ポイントが格納される事例では、テラバイトのデータが、発生され得て、関連する記憶装置のコストは、高額であり得る。いくつかの実施形態では、差分データに基づく充填事象パラメータのコンピュータ処理を介したデータ圧縮は、充填事象毎に格納されることになる、少数のパラメータのみを用い得て、したがって大いに記憶装置の要件及びコストを削減する。
図12〜14は、いくつかの実施形態による、未処理の配列決定データ及び処理済みの差分データを示す。
本明細書で説明したコンピュータシステムの任意のものは、任意の適切な数のサブシステムを利用し得る。そのようなサブシステムの例は、図15のコンピュータシステム10内で示した。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、ここでサブシステムは、コンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施形態では、コンピュータシステムは、各々がサブシステムであり、内部に構成要素を有する、複数のコンピュータ装置を含み得る。コンピュータシステムは、デスクトップ及びラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、並びに他の携帯機器を含み得る。
Claims (18)
- ナノポアを含む配列決定セルであって、前記ナノポアは、ヌクレオチドに接続されているタグを受容するように構成され、それにより充填事象を作成する、配列決定セルと、
交流信号を前記配列決定セルの前記ナノポアを横断して印加する信号発生器であって、前記交流信号の各サイクルが、第1の部分及び第2の部分を備え、前記第2の部分の電圧レベルが、前記第1の部分の電圧レベルに対して、参照電圧の反対側にある、信号発生器と、
前記交流信号の複数のサイクルの前記第1の部分の間に電圧データの第1のセットを取得するアナログデジタル変換器であって、電圧データの前記第1のセットの各データポイントが、異なる時刻で前記ナノポアの抵抗の値に対応し、前記ナノポアの前記抵抗は、前記タグが前記ナノポア内部に受容されるとき、変化する、アナログデジタル変換器と、
デジタルプロセッサであって、
電圧データの前記第1のセットから電圧データの変位されたセットを決定し、電圧データの前記第1のセット及び電圧データの前記変位されたセットのデータポイントの各サイクルが、指定された数のデータポイントを含み、
電圧データの前記第1のセットのデータポイントと、対応する、電圧データの前記変位されたセットのデータポイントとの間の差分を算出することによって、差分データを算出し、
前記差分データ内の1つ又は複数のデータポイントに基づいて、前記充填事象を識別する
ように構成された、デジタルプロセッサと
を備える、システム又は器具。 - 電圧を、前記ナノポアを横断して選択的に印加するスイッチであって、前記交流信号の前記第1の部分の間に複数回、開路及び閉路するように構成された、スイッチをさらに備える、請求項1に記載のシステム又は器具。
- 電圧データの前記変位されたセットが、電圧データの前記第1のセットを表す、格納されたデータから選択されるデータポイントを含む、請求項1に記載のシステム又は器具。
- 電圧データの前記変位されたセットが、電圧データの前記第1のセットの時間変位された複製から選択されるデータポイントを含み、前記差分データを算出するステップが、電圧データの前記第1のセットと、電圧データの前記第1のセットの前記時間変位された複製との対応するデータポイント間の差分を算出するステップをさらに備える、請求項3に記載のシステム又は器具。
- 前記デジタルプロセッサが、
電圧データの前記第1のセットの第1サブセットを選択するステップと、
電圧データの前記第1のセットの第2サブセットを選択するステップであって、電圧データの前記第1のセットの前記第2サブセットのサイクルが、電圧データの前記第1のセットの前記第1サブセットのサイクルと異なるサイクルである、ステップと
によって電圧データの前記変位されたセットを決定するようにさらに構成される、請求項1に記載のシステム又は器具。 - 電圧データの前記第1のセットの前記第1サブセットから選択されるデータポイントと、電圧データの前記第1のセットの前記第2サブセットから選択されるデータポイントとが、前記対応するデータポイントである、請求項5に記載のシステム又は器具。
- 前記デジタルプロセッサが、
電圧データの前記第1のセットの複製を生成するステップと、
電圧データの前記第1のセットの前記複製に時間変位を適用することによって、電圧データの前記変位されたセットを生成するステップと、
電圧データの前記第1のセット及び電圧データの前記変位されたセットの両方をメモリ内に格納するステップと
によって、電圧データの前記変位されたセットを決定するようにさらに構成される、請求項1に記載のシステム又は器具。 - 前記デジタルプロセッサが、
前記差分データのモードを識別し、
閾値を超える前記差分データの開始パルスを決定し、前記閾値は前記モードから決定され、
前記開始パルスに追随し、反対の符号を有する、前記差分データ内の最終パルスを決定し、
前記開始パルスと、前記最終パルスとの間の時間差を決定し、
前記開始パルス及び/又は最終パルスの前記時間差及び振幅をメモリ内に格納する
ようにさらに構成された、請求項1に記載のシステム又は器具。 - 複数の配列決定セルを含む配列決定チップであって、前記デジタルプロセッサが、差分データの複数のセットを分析するようにさらに構成され、差分データの前記複数のセットのうちの各々が、前記複数の配列決定セルのうちのそれぞれ1つからくる、配列決定チップをさらに備える、請求項1に記載のシステム又は器具。
- 前記デジタルプロセッサが、前記差分データ内のパルスのレベルに基づいて、塩基分類を決定するためのカットオフ値を決定するために、差分データの前記複数のセットの値を集めるようにさらに構成された、請求項9に記載のシステム又は器具。
- 配列決定セルを用いる方法であって、
前記配列決定セルのナノポアを横断して交流信号を印加するステップであって、前記ナノポアが、ヌクレオチドに接続されたタグを受容するように構成され、それにより充填事象を作成し、前記交流信号の各サイクルが、第1の部分と第2の部分とを備え、前記第2の部分の電圧レベルは、前記第1の部分の電圧レベルに対して、参照電圧の反対側にある、ステップと、
前記交流信号の複数のサイクルの前記第1の部分の間に電圧データの第1のセットを取得するステップであって、電圧データの前記第1のセットの各データポイントが、異なる時刻で前記ナノポアの抵抗の値に対応し、前記ナノポアの前記抵抗は、前記タグが前記ナノポア内部に受容されるとき、変化する、ステップと、
電圧データの前記第1のセットから電圧データの変位されたセットを決定するステップであって、電圧データの前記第1のセット及び電圧データの前記変位されたセットのデータポイントの各サイクルが、指定された数のデータポイントを含む、ステップと、
電圧データの前記第1のセットのデータポイントと、対応する、電圧データの前記変位されたセットのデータポイントとの間の差分を算出することによって、差分データを算出するステップと、
前記差分データ内の1つ又は複数のデータポイントに基づいて、前記充填事象を識別するステップと
を含む、方法。 - 前記対応するデータポイントが、異なるサイクル内に同一の位置を有する、請求項11に記載の方法。
- 電圧データの前記変位されたセットの対応するデータポイントが、電圧データの前記第1のセットからデータポイントを選択することによって決定され、電圧データの前記変位されたセットの前記データポイントは、データポイント数が指定されたサイクルとは異なるサイクルから選択される、請求項11に記載の方法。
- 電圧データの前記変位されたセットが、電圧データの前記第1のセットの時間変位された複製から選択されるデータポイントを含み、前記差分データを算出するステップが、電圧データの前記第1のセットと、電圧データの前記第1のセットの前記時間変位された複製との対応するデータポイント間の差分を算出するステップを備える、請求項11に記載の方法。
- 電圧データの前記変位されたセットを決定するステップが、
電圧データの前記第1のセットの第1サブセットを選択するステップと、
電圧データの前記第1のセットの第2サブセットを選択するステップと
をさらに含み、電圧データの前記第1のセットの前記第2サブセットのサイクルが、電圧データの前記第1のセットの前記第1サブセットのサイクルと異なるサイクルである、請求項11に記載の方法。 - 電圧データの前記変位されたセットを決定するステップが、
電圧データの前記第1のセットの複製を生成するステップと、
電圧データの前記第1のセットの前記複製に時間変位を適用することによって、電圧データの前記変位されたセットを生成するステップと、
電圧データの前記第1のセット及び電圧データの前記変位されたセットの両方をメモリ内に格納するステップと
をさらに含む、請求項11に記載の方法。 - 前記差分データのモードを識別するステップと、
閾値を超える前記差分データの開始パルスを決定するステップであって、前記閾値は、前記モードから決定される、ステップと
をさらに含む、請求項11に記載の方法。 - 差分データの複数のセットを分析するステップであって、差分データの前記複数のセットのうちの各々が、配列決定チップの複数の配列決定セルのうちのそれぞれ1つからくる、ステップと、
前記差分データ内のパルスのレベルに基づいて、塩基分類を決定するためのカットオフ値を決定するために、差分データの前記複数のセットの複数の値を集めるステップと
をさらに含む、請求項11に記載の方法。
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