JP6721947B2 - バイオフィルム形成抑制剤 - Google Patents
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Description
[1]フコイダンを有効成分として含有することを特徴とするバイオフィルム形成抑制剤。
[2]上記[1]に記載のバイオフィルム形成抑制剤を含有することを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物。
[3]フコイダンを用いることを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する方法。
また、本発明で用いられるフコイダンは天然物を原料とした場合に含まれる塩分、ヒ素、ヨウ素や夾雑たんぱく質等を低減したものでもよい。
[本発明品]
本発明品として、下記に示す本発明品1、2を用いた。
本発明品1:メカブフコイダン(商品名:理研メカブフコイダン;理研ビタミン社製、硫酸基含有量27.1質量%)
本発明品2:ヒバマタフコイダン(商品名:フコイダン Fucus vesiculosus(ヒバマタ)由来;シグマ社製、硫酸基含有量25.9質量%)
[参考例品]
参考例品として、下記に示す参考例品1を用いた。
参考例品1:ケトコナゾール(商品名:Ketoconazole;LKT Laboratories社製)
[硫酸基含有量測定法]
100mL容三角フラスコに試料(フコイダン)を1g秤量し、2N塩酸25mLを加えた後、三角フラスコに冷却管を取付け、沸騰水浴中で120分間加温した。加温した溶液をNo.5C濾紙(ADVANTEC社製)で吸引濾過し、更に三角フラスコ内部を純水で2〜3回共洗いして吸引濾過した。濾過液を200mL容三角フラスコに移し、冷却管を取付け、沸騰水浴中で10分間加温した後、三角フラスコを撹拌しながら、10%(w/v)塩化バリウム溶液8mLを1分間ほどかけてゆっくりと加え、三角フラスコに冷却管を取付けてから沸騰水浴中で120分間加温した。三角フラスコ内の溶液を室温まで放冷したのち、予め105℃で2時間乾燥して恒量にしたガラスフィルター(型式:3GP16;SIBATA社製)で吸引濾過し、更に三角フラスコ内部を純水で2〜3回共洗いして吸引濾過した。吸引濾過に使用したガラスフィルターを105℃で2時間乾燥して恒量にした吸引濾過に使用したガラスフィルターを得た。以下の計算式から硫酸基含有量(質量%)を算出した。
硫酸基含有量(質量%)= [(W1−W0)×0.412]/WS×100
WS:試料質量(g)
W0:予め恒量にしたガラスフィルターの質量(g)
W1:吸引濾過に使用したガラスフィルター質量(g)
0.412=96(SO4 2−の分子量)/233(BaSO4の分子量)
本発明品1、2、参考例品1のそれぞれを用いて、供試菌(カンジダ・アルビカンス NBRC 1594株)に由来するバイオフィルムの形成抑制効果の評価を行った。
(1)供試菌液の調整
121℃、15分間オートクレーブ滅菌したポテトデキストロース寒天培地(DIFCO社製)を滅菌済みシャーレにて加えて固化し、寒天平板を作製した。凍結保存品の供試菌をこの寒天平板に塗抹して、30℃にて2日間培養した。2%グルコース含有酵母ニトロゲンベース(DIFCO社製)を10倍希釈し、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した培地20mlをバッフル付き三角フラスコに分注し、上記寒天培地で培養した供試菌を一白金耳取り植菌した。その後、30℃、150rpmにて24時間攪拌培養し、前培養液とした。次いで、遠心分離(4700rpm、10分、20℃)をおこない集菌した。集菌した菌を生理食塩水20mlを用いて洗浄し、再び遠心分離(4700rpm、10分、20℃)をおこない集菌した。集菌した菌をサブローブドウ糖培地(ペプトン1.0質量%、ブドウ糖4.0質量%を含み、1規定の塩酸を用いてpH5.7に調整した液体培地。以下、「SG培地」という。)10mlを加え、再懸濁した。この再懸濁液をSG培地で20倍希釈したものを供試菌液として用いた。供試菌液中の菌数は、3.2×106個/mlであった。
本発明品1、2、参考例品1を被験試料とし、本発明品1、2を純水で溶解し、参考例品1をジメチルスルホキシド(DMSO)で溶解して被験試料液とし、該被験試料液2μL、供試菌液198μLを、96穴マイクロプレート(商品名:TCプレート96well(Cell+);ザルスタット社製)の各ウェル(穴)に加えた。なお、被験試料液中の被験試料濃度は、供試菌液と加えた際の濃度、即ち各ウェル中の被験試料の濃度がそれぞれ5ppm、25ppm、50ppm、100ppmとなるように調製した。その後、被験試料液及び供試菌液を加えた96穴マイクロプレートを30℃、2日間の静置培養を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
また、本発明品1、2のコントロール(被験試料無添加)として、被験試料液2μLと供試菌液198μLをウェルに加えるのに替えて、被験試料を用いずに純水2μLと供試菌液198μLをウェルに加える以外は同様の操作を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
更に、参考例品1のコントロール(被験試料無添加)として、被験試料液2μLと供試菌液198μLをウェルに加えるのに替えて、被験試料を用いずにジメチルスルホキシド(DMSO)2μLと供試菌液198μLをウェルに加える以外は同様の操作を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
静置培養終了後、各ウェルの被験試料液及び培養液等の液部を除去し、各ウェルの付着物(菌体、分泌物及び沈着物等)をバイオフィルムとし、各ウェルに0.01質量%のクリスタルバイオレット水溶液(商品名:Becton;Dickinson and Company社製)50μLを添加し、バイオフィルムを染色した。次いで、各ウェルから添加したクリスタルバイオレット液を除き、200μLの蒸留水で2回洗浄後、エタノール200μLを加えて各ウェルからバイオフィルムを染色していたクリスタルバイオレットを溶出させることにより、マイクロプレートに固着したバイオフィルムを定量した。定量方法としては、マイクロプレートリーダー(型式:SH−9000Lab;CORONA ELECTRIC社製)を用いて、各ウェルの600nmにおける吸光度(O.D.600)を測定した。
コントロールのウェルに形成したバイオフィルムの600nmにおける吸光度を基準吸光度とし、その数値の時にバイオフィルム形成率100%とした。それぞれの被験試料の吸光度と基準吸光度と対比してバイオフィルム形成率を計算し、各被験試料のバイオフィルム形成率を縦軸、被試験試料の濃度を横軸とした対数近似曲線グラフを作成した。
上記対数近似曲線のグラフを用い、各ウェルの吸光度が、基準吸光度の50%に相当するバイオフィルム形成率、すなわちバイオフィルム形成率50%となる各試被験試料の濃度(以下、「50%阻害濃度」という。)を算出した。
被験試料のバイオフィルム形成抑制効果の判定は、各被検試料について算出された50%阻害濃度が、20ppm以下の場合にバイオフィルム形成の抑制に非常に優れているとし、20ppmを超えて30ppm以下の場合にバイオフィルム形成の抑制に優れているとし、30ppmを超える場合にバイオフィルム形成の抑制に劣ると判定した。得られた結果を表1に示す。
121℃、15分間オートクレーブ滅菌したBrain Heart Infusion寒天培地(DIFCO社製)10mlを50℃まで冷却した。そこに、本発明品1、2を純水に溶解した被験試料液、参考例品1をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した被験試料液のいずれか100μLを添加し、撹拌して均一になるように混合した後に滅菌済みシャーレに加えて平板培地を作製した。なお、該平板培地中の各被験試料の濃度は、10ppm、100ppm、300ppmとなるようにした。次いで凍結保存品の供試菌(カンジダ・アルビカンス(NBRC 1594株))を各平板培地に一白金耳塗抹して、30℃にて1日間培養した。
培養終了後の各平板培地上の菌増殖状況を目視にて確認した。平板培地上に塗抹線に沿って発育が認められなかったものは、その被験試料の濃度で静菌性があると判断した。結果を表2に示す。
一方、参考例品1は、バイオフィルム形成抑制効果の評価が、50%阻害濃度が20ppmを超えて30ppm以下でありバイオフィルム形成抑制効果に優れていた。しかし、静菌性の評価は、参考例品1は、100ppm添加区で菌の生育が認められず、静菌性を有していた。
下記表3の配合により、各成分を均一に混合し水を加えて混練りした後、乾燥させて単発式打錠機にて本発明品1を含有するタブレットを製造した。
下記表4の配合により、各成分を均一に混合し水を加えて混練りした後プラスチックフィルムに展延し乾燥させ、本発明品1を含有するフィルム状食品を製造した。
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- メカブフコイダンを有効成分として含有することを特徴とするカンジダ菌に由来するバイオフィルムの形成抑制剤。
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